CN105219829A - 一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法，以植物甾醇为底物，利用分枝杆菌<i>Mycobacterium</i>（CICC？21097）和玫瑰色红球菌<i>Rhodococcus？rhodochrous</i>（CGMCC？4.1480）两种微生物混菌发酵制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。本发明还通过在发酵培养基中添加复合促溶剂，使植物甾醇向9α-OH-ADD的最高摩尔转化率达到84.3%。同时减少了两步法制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法的提纯步骤，降低了溶媒的使用量。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药领域，涉及一种9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮，具体来说是一种采用混菌生物转化植物甾醇制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法。
背景技术
甾体化合物(Steroids)又称类固醇，是一类含有环戊烷多氢菲母核的化合物。其基本结构如下所示，由三个六元环和一个五元环组成，分别称为A、B、C、D环，一般在甾体母核的第10和13位上有角甲基(-CH3)，第3、9、11位可能有羟基(-OH)或酮基(-C＝O)，A环或B环存在部分双键，第17位上有长短不同的侧链。由于甾体母核上取代基、双键位置或立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。
甾体化合物结构通式
甾体类药物是医药行业中产量仅次于抗生素的第二大类药物，甾体类药物具有抗过敏、抗休克、抗炎症、抗变态反应等多种功效，被广泛用于治疗支气管哮喘、风湿性关节炎、湿疹、贫血以及促进骨折和伤口的愈合，也被用于治疗艾迪森氏等内分泌疾病，对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有重要的作用。甾体类药物对激素依赖型肿瘤的治疗有一定的疗效。随着甾体化学的迅速发展,甾体激素类药物己成为医药领域的重要门类，在临床上的应用非常广泛。
目前，关于微生物法转化甾体药物的新菌种及新技术研究发展态势良好。9α-OH-ADD及9α-OH-ADD作为合成甾体类药物的重要原料和关键中间体，受到较多研究者的青睐。
国内外研究工作在相关领域主要集中在利用植物甾醇制备雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)或雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，及运用诺卡氏菌或红球菌等菌种对4-AD或ADD进行C9α羟基化制备9α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)或9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(9α-OH-ADD)。
(1)甾醇制备4-AD或ADD
用于甾醇侧链降解的微生物主要有分枝杆菌(Mycobacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、节杆菌(Arthrobacterium)、短杆菌(Brevibacterium)等。众多文献及专利中显示，在利用植物甾醇进行侧链降解过程中都会同时生成4-AD和ADD，两者的生成质量比根据菌种及生产工艺的不同具有一定差异。如专利CN104403974A中采用解淀粉芽孢杆菌对植物甾醇进行边链降解，4-AD与ADD生成的质量比为18:1；专利CN1544618A中利用Mycobacteriumsp.NRRLB3683对胆固醇进行边链切除，生成的4-AD和ADD质量比为1:10。转化时间一般均在100-120h。
(2)4-AD或ADD制备9α-OH-AD或9α-OH-ADD
用于甾体9α-羟基化反应的微生物主要有红球菌(Rhodococcus)、棒杆菌(Corynebacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)等。如专利CN103667126A介绍了一种利用耻垢分枝杆菌制备9α-OH-AD的方法；专利CN103343155A中公布了一种利用偶发分枝杆菌制备9α-羟基雄烯二酮的方法。转化时间一般在96-100h左右。
综上所述，就目前文献及专利来看，利用植物甾醇生物法制备9α-OH-ADD，需要通过两步发酵来完成(即两步法)，目前未见利用植物甾醇一步法制备9α-OH-ADD的文献报道。两步法一般先利用分枝杆菌将植物甾醇转化为ADD，再经提取、精制得到ADD，之后再利用诺卡氏菌或红球菌等菌株对ADD进行9α-羟基化得到9α-OH-ADD。但上述的两步法存在如下不足：①植物甾醇向ADD方向转化时，植物甾醇的利用效率偏低。②侧链降解发酵过程生成的产物均同时含有4-AD及ADD，由于4-AD与ADD的结构相近，因此很难进行分离纯化。③产物ADD后期提取纯化需要利用大量的合适的有机溶剂进行提取精制，以得到纯度较高的ADD，才能作为后续的9α-羟基化的底物。所以，开发更加高效省时的工业化生物法制备9α-OH-ADD的方法具有很高的应用价值和前景。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法，所述的这种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法解决了现有技术中采用两步发酵来制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法转化率低、分离纯化困难的技术问题。
本发明提供了一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法，以植物甾醇为底物，利用分枝杆菌Mycobacterium和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous两种微生物混菌发酵制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。
进一步的，所述的方法包括如下步骤：
1)一个配制含有植物甾醇的发酵培养基的步骤；
2)在所述的发酵培养基中加入复合促溶剂，所述的复合促溶剂由乙醇和聚乙二醇组成，在所述的发酵培养基中，所述的乙醇的浓度为10.0-50.0g/L，所述的聚乙二醇的浓度为5.0-20.0g/L；
3)一个分别接种分枝杆菌Mycobacterium和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous的步骤，所述的分枝杆菌Mycobacterium的接种量为10.0-15.0％，转化培养0-48h后，再接入10.0-20.0％玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous，发酵温度为28-32℃，发酵时间为72-120h，发酵培养基pH在6.5-7.5之间；
4)一个产物提取精制的步骤，发酵结束后，将发酵液70-90℃灭活，冷却到20-30℃后，板框压滤，取滤饼进行萃取，再经过滤、脱色、蒸馏、精制，得到9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。进一步的，所述发酵培养基的配方如下：葡萄糖10.0-30.0g/L，磷酸二氢铵2.0-4.0g/L，柠檬酸铁铵0.03-0.08g/L，七水硫酸镁1.5-3.5g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，甜菜糖蜜5.0-9.0g/L，植物甾醇30.0-40.0g/L。
进一步的，所述的分枝杆菌Mycobacterium的保藏号为CICC21097，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心；所述的玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous的保藏号为CGMCC4.1480，来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本发明以植物甾醇为底物，利用分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)两种微生物混菌发酵制备9α-OH-ADD，还通过在发酵培养基中添加复合促溶剂，对植物甾醇进行生物转化，使植物甾醇侧链降解与C9α位羟基化一步完成，使植物甾醇向9α-OH-ADD的最高摩尔转化率达到84.3％。
本发明的方法与两步法(即先使植物甾醇生物转化为ADD，再以ADD为底物，在其C9α位羟基化得到9α-OH-ADD)相比有如下优点：(1)一步法混菌转化植物甾醇制备9α-OH-ADD，其羟基化过程更加有利于植物甾醇向ADD方向转化，提高植物甾醇的利用效率。(2)减少提纯步骤，去掉了两步法中ADD的提取纯化过程，使两步提纯变为一步，降低溶媒使用量。(3)减少副产物4-AD及9α-OH-AD的产生，提高植物甾醇向9α-OH-ADD的生物转化率，缩短生物发酵周期。
本发明利用两菌株之间协同作用的优点，促使植物甾醇更多的向9α-OH-ADD进行转化，减少副产物4-AD和9α-OH-AD的产生，提高植物甾醇向9α-OH-ADD的生物效率，缩短生物发酵周期，较大程度降低生产成本的效果。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明采用一步法转化，减少了提纯步骤，即去掉了两步法中ADD的提取纯化过程，使两步提纯变为一步，大大降低溶媒使用量，降低了生产成本。
附图说明
图1显示了混菌生物转化植物甾醇制备9α-OH-ADD的过程。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明采用的分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)是公开销售的微生物，来自，中国工业微生物菌种保藏管理中心，该机构的地址为：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼(100015)，可以通过电话购买，也可以通过网站订购(http://www.china-cicc.org)，任何人只要支付相关的费用均可以购买。
本发明采用的玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)是公开销售的微生物，来自，中国普通微生物菌种保藏管理中心，该机构的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，可以通过电话购买，也可以通过网站订购(http://www.cgmcc.net)，任何人只要支付相关的费用均可以购买。
实施例1
分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)通过斜面培养和种子培养，得到发酵所需要的菌种。一、分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)斜面菌种及种子液制备
(1)斜面培养
斜面培养基：蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂20.0g/L，29℃条件下培养5-7天。
(2)种子培养
种子培养基：葡萄糖15.0g/L,蛋白胨5.0g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，七水硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢铵3.5g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH7.0，121℃湿热灭菌30min。
将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接种2环于装有50mL种子培养基的250mL的摇瓶中，30℃条件下，旋转式摇床200r/min培养48h，制得种子液。
二、玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)斜面菌种及种子液制备
(1)斜面培养
斜面培养基：葡萄糖10.0g/L，胰蛋白胨15.0g/L，大豆蛋白胨5.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20.0g/L，30℃条件下培养5-6天。
(2)种子培养
种子培养基：葡萄糖10.0g/L，酵母膏20.0g/L，鱼蛋白胨5.0g/L，玉米淀粉9.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，pH7.0，121℃湿热灭菌30min。
将步骤(1)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接种1环于装有50mL种子培养基的250mL的摇瓶中，30℃条件下，旋转式摇床200r/min培养30h，制得种子液。
三、发酵培养
发酵培养基：植物甾醇35.0g/L，葡萄糖21.0g/L，磷酸二氢铵3.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸氢二钾1.2g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，甜菜糖蜜6.0g/L，pH7.0。
将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
培养初始在培养基中加入复合促溶剂：乙醇30.0g/L，聚乙二醇10.0g/L。再进行接种，分枝杆菌MycobacteriumCICC(21097)的接种量为12.0％，在分枝杆菌接种的同时接种玫瑰色红球菌，玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)的接种量为17.0％，使用5L发酵罐进行生物转化，装液量为70％，通气量为1.0v/v·min，温度控制在30℃，转速为300r/min，转化期间每隔12h取样TLC监测。发酵培养96h，取样TLC分析，无植物甾醇斑点，转化基本完成。样品用乙酸乙酯萃取，离心收集上清液采用高效液相色谱法分析上述所得的发酵液中9α-OH-ADD的含量为17.5g/L，9α-OH-AD的含量为0.25g/L，植物甾醇摩尔转化率为72.4％。
发酵结束后，将发酵液85℃灭活，冷却到25℃后，板框压滤，滤饼用二氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到9α-OH-ADD粗品，粗品再用甲苯打浆精制，最终得到9α-OH-ADD精品。高效液相色谱法分析纯度为98.7％。
实施例2
将分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：植物甾醇35.0g/L、乙醇31.0g/L，聚乙二醇9.0g/L，葡萄糖20.0g/L，磷酸二氢铵3.0g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，七水硫酸镁2.5g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，甜菜糖蜜6.0g/L，pH7.0。
将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
培养初始在培养基中加入复合促溶剂：乙醇31.0g/L，聚乙二醇9.0g/L。再进行接种，分枝杆菌MycobacteriumCICC(21097)的接种量为12.0％，在分枝杆菌转化培养24h后接种玫瑰色红球菌，玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)的接种量为18.0％，使用5L发酵罐进行生物转化，装液量为70％，通气量为1.0v/v·min，温度控制在30℃，转速为300r/min，转化期间每隔12h取样TLC监测。发酵培养96h，取样TLC分析，无植物甾醇斑点，转化基本完成。样品用乙酸乙酯萃取，离心收集上清液采用高效液相色谱法分析上述所得的发酵液中9α-OH-ADD的含量为20.4g/L，9α-OH-AD的含量为0.19g/L，植物甾醇摩尔转化率为84.3％。
发酵结束后，将发酵液85℃灭活，冷却到25℃后，板框压滤，滤饼用二氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到9α-OH-ADD粗品，粗品再用甲苯打浆精制，最终得到9α-OH-ADD精品，高效液相色谱法分析纯度为99.1％。
实施例3
分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：植物甾醇35.0g/L，葡萄糖22.0g/L，磷酸二氢铵3.0g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，七水硫酸镁2.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，甜菜糖蜜6.0g/L，pH7.0。
将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
培养初始在培养基中加入复合促溶剂：乙醇30.0g/L，聚乙二醇9.0g/L。再进行接种，分枝杆菌MycobacteriumCICC(21097)的接种量为13.0％，在分枝杆菌转化培养48h后接种玫瑰色红球菌，玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)的接种量为17.0％，使用5L发酵罐进行生物转化，装液量为70％，通气量为1.0v/v·min，温度控制在30℃，转速为300r/min,转化期间每隔12h取样TLC监测。发酵培养96h，取样TLC分析，无植物甾醇斑点，转化基本完成。样品用乙酸乙酯萃取，离心收集上清液采用高效液相色谱法分析上述所得的发酵液中9α-OH-ADD的含量为18.3g/L，9α-OH-AD的含量为0.31g/L，植物甾醇摩尔转化率为75.7％。
发酵结束后，将发酵液85℃灭活，冷却到25℃后，板框压滤，滤饼用二氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到9α-OH-ADD粗品，粗品再用甲苯打浆精制，最终得到9α-OH-ADD精品，高效液相色谱法分析纯度为98.6％。
实施例4
分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：植物甾醇30.0g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氢铵2.0g/L，柠檬酸铁铵0.08g/L，七水硫酸镁3.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，甜菜糖蜜9.0g/L，pH7.5。
将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
培养初始在培养基中加入复合促溶剂：乙醇10.0g/L，聚乙二醇5.0g/L。再进行接种，分枝杆菌MycobacteriumCICC(21097)的接种量为10.0％，在分枝杆菌转化培养24h后接种玫瑰色红球菌，玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)的接种量为10.0％，使用5L发酵罐进行生物转化，装液量为70％，通气量为1.0v/v·min，温度控制在28℃，转速为300r/min,转化期间每隔12h取样TLC监测。发酵培养72h，取样TLC分析，无植物甾醇斑点，转化基本完成。样品用乙酸乙酯萃取，离心收集上清液采用高效液相色谱法分析上述所得的发酵液中9α-OH-ADD的含量为17.1g/L，9α-OH-AD的含量为0.20g/L，植物甾醇摩尔转化率为82.5％。
发酵结束后，将发酵液85℃灭活，冷却到25℃后，板框压滤，滤饼用二氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到9α-OH-ADD粗品，粗品再用甲苯打浆精制，最终得到9α-OH-ADD精品，高效液相色谱法分析纯度为98.8％。
实施例5
分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基：植物甾醇40.0g/L，葡萄糖30.0g/L，磷酸二氢铵4.0g/L，柠檬酸铁铵0.03g/L，七水硫酸镁1.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，甜菜糖蜜5.0g/L，pH6.5。
将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
培养初始在培养基中加入复合促溶剂：乙醇50.0g/L，聚乙二醇20.0g/L。再进行接种，分枝杆菌MycobacteriumCICC(21097)的接种量为15.0％，在分枝杆菌转化培养24h后接种玫瑰色红球菌，玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)的接种量为20.0％，使用5L发酵罐进行生物转化，装液量为70％，通气量为1.0v/v·min，温度控制在32℃，转速为300r/min,转化期间每隔12h取样TLC监测。发酵培养120h，取样TLC分析，无植物甾醇斑点，转化基本完成。样品用乙酸乙酯萃取，离心收集上清液采用高效液相色谱法分析上述所得的发酵液中9α-OH-ADD的含量为21.5g/L，9α-OH-AD的含量为0.24g/L，植物甾醇摩尔转化率为77.8％。
发酵结束后，将发酵液85℃灭活，冷却到25℃后，板框压滤，滤饼用二氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到9α-OH-ADD粗品，粗品再用甲苯打浆精制，最终得到9α-OH-ADD精品，高效液相色谱法分析纯度为98.1％。
对比实施例1
分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基如实施例2所述，将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
培养初始在培养基中加入复合促溶剂：乙醇31.0g/L，聚乙二醇9.0g/L。再进行接种，分枝杆菌Mycobacterium(CICC21097)的接种量为12.0％，使用5L发酵罐进行生物转化，装液量为70％，通气量为1.0v/v·min，温度控制在30℃，转速为300r/min，转化期间每隔12h取样TLC监测。发酵培养96h，取样TLC分析，转化停滞。样品用乙酸乙酯萃取，离心收集上清液采用高效液相色谱法分析上述所得的发酵液中ADD的含量为16.7g/L，4-AD的含量为0.87g/L，植物甾醇摩尔转化率为72.9％。
发酵结束后，将发酵液85℃灭活，冷却到25℃后，板框压滤，滤饼用二氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到ADD粗品，粗品再用甲苯打浆精制，最终得到ADD精品，高效液相色谱法分析纯度为98.5％。
对比实施例2
玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)的菌株制成种子液(方法同实施例1)，然后进行发酵培养。
发酵培养基如实施例2所述，底物由35.0g/L的植物甾醇换成24.0g/L的ADD。将装有发酵培养基的发酵罐于121℃高压蒸汽灭菌15min。
培养初始在培养基中加入复合促溶剂：乙醇31.0g/L，聚乙二醇9.0g/L。再进行接种，玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous(CGMCC4.1480)的接种量为18.0％，使用5L发酵罐进行生物转化，装液量为70％，通气量为1.0v/v·min，温度控制在30℃，转速为300r/min，转化期间每隔12h取样TLC监测。发酵培养72h，取样TLC分析，无ADD斑点，转化基本完成。样品用乙酸乙酯萃取，离心收集上清液采用高效液相色谱法分析上述所得的发酵液中9α-OH-ADD的含量为22.6g/L，ADD摩尔转化率为93.8％。
发酵结束后，将发酵液85℃灭活，冷却到25℃后，板框压滤，滤饼用二氯甲烷萃取，再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到9α-OH-ADD粗品，粗品再用甲苯打浆精制，最终得到9α-OH-ADD精品，高效液相色谱法分析纯度为99.1％。
通过实施例可知，一步法与两步法相比，一步法具有以下优势：
①有助于提高植物甾醇的转化效率。如对比实施例1和2所述，两步法生物转化植物甾醇制备9α-OH-ADD，植物甾醇终摩尔转化率为72.9％×93.8％＝68.4％；而如实施例2所述，一步法生物转化植物甾醇制备9α-OH-ADD，植物甾醇摩尔转化率高达84.3％。
②有助于缩短发酵周期。如对比实施例1和2所述，两步法微生物转化时间约为168h，而如实施例2所述，一步法混合发酵生产9α-OH-ADD生物转化时间约为96h，一步法的生物转化时间比两步法缩短了约72h。
③降低溶媒使用量。一步法去掉了两步法中ADD的提取纯化过程，使两步提纯变为一步，减少溶剂用量，降低了生产成本。
④减少主要副产物4-AD及9α-OH-AD的产生。通过实施例2与对比实施例1的比较可以看出，利用分枝杆菌对植物甾醇进行单菌生物转化时，同时会有ADD和4-AD的生成，且两者的质量比约为19:1。而利用两种菌混合发酵生产9α-OH-ADD时，同时会有9α-OH-ADD与9α-OH-AD的生成，且两者的质量比约为107:1。即一步法混菌转化植物甾醇生产9α-OH-ADD可以有效的减少副产物4-AD及9α-OH-AD的产生，其羟基化过程更加有利于植物甾醇向ADD方向转化，提高植物甾醇的利用效率。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法，其特征在于：以植物甾醇为底物，利用分枝杆菌Mycobacterium和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous两种微生物混菌发酵制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。
2.根据权利要求1所述的一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）一个配制含有植物甾醇的发酵培养基的步骤；
2）在所述的发酵培养基中加入复合促溶剂，所述的复合促溶剂由乙醇和聚乙二醇组成，在所述的发酵培养基中，所述的乙醇的浓度为10.0-50.0g/L，所述的聚乙二醇的浓度为5.0-20.0g/L；
3）一个分别接种分枝杆菌Mycobacterium和玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous的步骤，分枝杆菌Mycobacterium的接种量为10.0-15.0%，转化培养0-48h后，再接入10.0-20.0%的玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous，发酵温度为28-32℃，发酵时间为72-120h，发酵培养基pH在6.5-7.5之间；
4）一个产物提取精制的步骤，发酵结束后，将发酵液70-90℃灭活，冷却到20-30℃后，板框压滤，取滤饼进行萃取，再经过滤、脱色、蒸馏、精制，得到9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。
3.根据权利要求1所述的一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法，其特征在于所述发酵培养基的配方如下：葡萄糖10.0-30.0g/L，磷酸二氢铵2.0-4.0g/L，柠檬酸铁铵0.03-0.08g/L，七水硫酸镁1.5-3.5g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，甜菜糖蜜5.0-9.0g/L，植物甾醇30.0-40.0g/L。
4.根据权利要求1所述的一种制备9α-羟基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮的方法，其特征在于：所述的分枝杆菌Mycobacterium的保藏号为CICC21097，来自中国工业微生物菌种保藏管理中心；所述的玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous的保藏号为CGMCC4.1480，来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
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