CN105648043A - 试剂盒及其在检测矮小相关基因中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种试剂盒、试剂盒在检测矮小症基因中的用途，一种检测矮小相关基因的方法以及一种检测矮小相关基因的装置。利用本发明试剂盒、方法和/或装置，能够一次性的全面的捕获矮小相关基因区域，检测矮小相关基因的变异情况。

Description

试剂盒及其在检测矮小相关基因中的用途

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别地，涉及试剂盒及其在检测矮小相关基因中的用途，更特别地，本发明涉及一种试剂盒，试剂盒在检测矮小相关基因中的用途，检测矮小相关基因的方法以及一种检测矮小相关基因的装置。

背景技术

身材矮小(矮小)是指在相似生活环境下，身高较同种族、同性别、同年龄健康儿童身高均值低2个标准差(-2SD)以上或处于第3百分位数以下。矮小是儿科常见的临床主诉表征之一，人群中总体发生率为3％左右，其导致因素包括生理性原因和病理性原因。其中，病理性矮小症(矮小症)约占矮小总体的30％-40％，其病因包括慢性疾病、染色体异常、综合征、骨骼发育不良、生长激素缺乏和受体不敏感等等[KantSG,WitJM,BreuningMH.Geneticanalysisofshortstature.HormRes.2003；60(4):157-65]。遗传缺陷(包括单基因突变)是引起矮小症的一个重要的因素。传统的矮小症基因检测方法依靠精确的临床诊断以及Sanger验证的方法[SeaverLH1,IronsM；AmericanCollegeofMedicalGenetics(ACMG)ProfessionalPracticeandGuidelinesCommittee.GenetMed.2009Jun；11(6):465-70]，由于矮小症具有高度的临床和遗传异质性，多种综合征的临床表征重叠，传统的矮小症基因检测方法需要消耗大量的时间与成本。因此，开发高效、快捷、经济、可同时对多个已知矮小致病基因进行突变检测的方法对矮小症的研究发展和临床诊断非常重要。

发明内容

依据本发明的一方面，提供一种试剂盒，其包括芯片，所述芯片由探针固定在固相基质上构成，所述探针能够特异性识别以下25个基因的外显子区域：FMR1,BRCC3,WDR81,SATB2,VRK2,LSM14A,HOXD3,LHX1,RIMS1,MBP,HMX2,GJA8,MBD5,ELN,CHRM3,RPS7P5,FMN2,USP9Y,SRY,UTY,CHL1,LBR,RAI1,FGFR3和RUNX2。这25个基因可作为染色体微缺失微重复的标识来标记17种由染色体的微缺失微重复导致的矮小症。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下53个基因的外显子区域：PHEX,ENPP1,FGF23,CLCN5,SLC34A3,VDR,CYP2R1,CYP27B1,SLC37A4,AGL,PFKM,PHKA1,PHKB,PHKA2,ALDOA,PGAM2,G6PC,GALNS,IDUA,IDS,ARSB,HYAL1,GUSB,GLB1,GNPTG,GNPTAB,MAN2B1,MGAT2,SLC35C1,TMEM165,GPD1，GBA，SMPD1，MLYCD,CTSA,UROC1,FUCA1,PIGO,AGA,GK,CTNS,PHGDH,HGD,ATP7A,SLC17A5,MPO,MVK,ADA,PCCB,PLOD3,SLC6A19,ACADS和SUMF1。这53个基因的单核苷酸变异可导致53种与矮小症相关的代谢系统疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下44个基因的外显子区域：SOX3,GHSR,GHRHR,GHR,BTK,GH1；SHH,SLC29A3,NDN,CEP57,ALMS1,SNRPN,NKX2-5,TSHB,THRA,PAX8,TSHR,IYD,TPO,TG,DUOXA2,DUOX2,SLC26A4,SLC5A5,GCM2,SECISBP2,THRB,TRHR,TRH,PROP1,OTX2,POU1F1,HESX1,LHX4,LHX3,PCNT,RNU4ATAC,IGF1R,GNAS,HSD11B2,B3GALTL,INSR,CYP11B1和CASR。这44个基因变异可导致47种与矮小症相关的内分泌系统疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下113个基因的外显子区域：TRIP11,COL2A1,ARSE,PTH1R,IMPAD1,EBP，GNPAT,PEX7,AGPS，BMPR1B,RMRP,EXT1,PDE4D,PRKAR1A,GDF5,NPR2,ROR2,NOG,PTHLH,HOXD13,IHH,BMPR1B，HDAC4，SOX9,NEK1,WDR35,DYNC2H1,PIK3R2,AKT3,COL9A3,COL9A2,COL9A1,COMP,MATN3,SLC26A2,MMP13,COL10A1,MMP9,SERPINH1,CRTAP,BMP1,FKBP10,LEPRE1,IFITM5,SERPINF1,PPIB,COL1A1,SP7,MMP13,PAPSS2,MATN3,TRAPPC2,KIF22,ACP5,DDR2,ACAN,COL2A1,CHST3,HES7,DLL3,MCPH1,ASPM,MYH3,TPM2,TNNT3,IFT43,SOST,COL11A1,SEC23A,MMP2,ESCO2,RIN2,LMX1B,GHR,SLC35D1,EFNB1,DYM,LIFR,GORAB,SH3BP2,FGFR1,TBX15,CANT1,TFAP2A,TMCO1,CHRNA1,CTSK,FLNB,EVC,FBN1,B3GAT3,EFTUD2,EIF2AK3,EVC2,CHRNG,CHRND,SMAD4,POC1A,TBX3,WNT7A，ERCC6,ERCC2，FBN1,ADAMTSL2，EXT2，TRPV4，SF3B4，CA2，WDR19，GDF6，FAM123B，TNFRSF11B和TNNI2。这113个基因变异以及前述的微缺失微重复会致矮小症的FGFR3和RUNX2基因，可导致124种与矮小症相关的骨骼系统疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下5个基因的外显子区域：ATP8B1,ABCB11,BUB1B,CASP8和CCBE1。这5个基因可导致5种与矮小症相关的消化系统疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下17个基因的外显子区域：ATP6V0A2,LTBP4,PYCR1,ALDH18A1,DKC1,TERT,TINF2,ERCC3,GTF2H5,EXT1,TRPS1,PLEC1,PORCN,SLC39A4,C16orf57,IKBKG和ZMPSTE24。这17个基因任一单核苷酸变异可导致与矮小症相关的皮肤疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下36个基因的外显子区域：SLC9A6,SMS,HCFC1,NSUN2,RAB40AL,CASK,KDM5C,RPS6KA3,CUL4B,CHMP1A,EXOSC3,AP4S1,AP4E1,AP4B1,GRM1,ZNF592,SEPN1,LARGE,SEPT9,RAPSN,COL6A2,RTTN,SOX3,NAA10,NF1,LRP5,ATM,SHROOM4,SIL1,SLC6A8,IGBP1,SHH,NDE1,IKBKAP,KIF1A和VLDLR。这36个基因可导致36种与矮小症相关的神经肌肉系统疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下11个基因的外显子区域：BCOR,STRA6,OTX2,SMOC1,HCCS,SOX2,FOXI1,KCNJ10,SLC26A4,LTBP3和CLCN5。这11个基因可导致11种与矮小症相关的耳、鼻、喉五官系统疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下18个基因的外显子区域：FANCE,FANCC,FANCA,FANCG,FANCF,RAD51C,FANCD2,SLX4,HBB,HBA1,SLC19A2,RPS19，KLF1,GATA1,RARA,ATRX,RBM8A和UROS。这18个基因加上前述的发生微缺失微重复会导致矮小症的LBR基因的变异可导致19种与矮小症相关的血液系统疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下6个基因的外显子区域：LAMTOR2,LRBA,BTK,WISP3,ITCH和SMARCAL1。这6个基因的异常可导致6种与矮小症相关的免疫系统疾病。

任选地，试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别以下145个基因的外显子区域：CUL7，CCDC8,KCNJ1,SLC12A2,ERCC8,ERCC6,SMC1A,NIPBL,SMC3,HDAC8,RAD21,ADAMTS2,SLC39A13,COL1A2,B4GALT7,COL3A1,COL1A1,COL5A2,COL5A1,MYCN,MIR17HG,ORC6,ORC1,CDT1,CDC6,ORC4,KRAS,RAF1,BRAF,SOS1,PTPN11,OFD1,TCTN3,WNT5A,ROR3,CREBBP,EP300,LIFR,HSPG2,ATR,RBBP8,CEP152,NIN,CEP63,CENPJ,ADAMTS17,FBN1,LTBP2,ADAMTS10,RAB3GAP1，RAB3GAP2，RAB18,FOXG1,MECP2,LRP2,NKX2-1,FGD1,KCNJ2,SBDS,L1CAM,AAAS,TWIST1,NBAS,SEMA3E,PQBP1,SPG20,G6PC3,HYLS1,NBN,IGF2,UBR1,OCRL,CHD7,GLA,CD96,LMNA,PHF6,HRAS,IFT140,SRCAP,CTC1,OTX2,ASXL1,FTO,ANKRD11,HSD17B4,MED12,KIF7,DHCR7,CTDP1,MYH8,DDX11,POR,KAT6B,ALDH3A2,TP63,SDHA,ALPL,MLL,WRN,MAP2K1,NSDHL,FAM20C,NSD1,H19,RECQL4,TRIM37,ZEB2,FOXE1,KANSL1,BANF1,BLM,VPS13B,RAB23,TBX1,HPRT1,SLC16A2,SMARCA2,COX4I2,MAP2K2,NOTCH2,CRLF1,WFS1,ZBTB16,ARX,DLX5,MGP,FGFR2,TAZ，PITX2，ACTB，PLOD2，SLC34A1，MBTPS2，TMEM237，TBCE，MKS1，GPC6，RIPK4，FLNA，GJB6，ERCC3，MPV17，ATPAF2和AQP2。这145个基因以及前述的发生微缺失微重复会导致矮小症的BAI1基因的异常可导致153种与矮小症相关的综合征。

任选地，所述试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针能够特异性识别以下438个基因的外显子区域：AAAS、ABCB11、ACADS、ACAN、ACP5、ACTB、ADA、ADAMTS10、ADAMTS17、ADAMTS2、ADAMTSL2、AGA、AGL、AGPS、AKT3、ALDH18A1、ALDH3A2、ALDOA、ALMS1、ALPL、FAM123B、ANKRD11、AP4B1、AP4E1、AP4S1、AQP2、ARSB、ARSE、ARX、ASPM、ASXL1、ATM、ATP6V0A2、ATP7A、ATP8B1、ATPAF2、ATR、ATRX、AVPR2、B3GALTL、B3GAT3、B4GALT7、BANF1、BCOR、BLM、BMP1、BMPR1B、BRAF、BTK、BUB1B、CA2、CANT1、CASK、CASP8、CASR、CCBE1、CCDC8、CD96、CDC6、CDSN、CDT1、CENPJ、CEP152、CEP57、CEP63、CHD7、CHMP1A、CHRNA1、CHRND、CHRNG、CHST3、CLCN5、COL10A1、COL11A1、COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2、COL6A2、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COLEC11、COMP、COX4I2、CREBBP、CRLF1、CRTAP、CTC1、CTDP1、CTNS、CTSA、CTSK、CUL4B、CUL7、CYP11B1、CYP27B1、CYP2R1、DDR2、DDX11、DHCR7、DHODH、DKC1、DLL3、DLX5、DUOX2、DUOXA2、DYM、DYNC2H1、EBP、EFNB1、EFTUD2、EIF2AK3、ENPP1、EP300、ERCC2、ERCC3、ERCC6、ERCC8、ESCO2、EVC、EVC2、EXOSC3、EXT1、EXT2、FAM20C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FBN1、FGD1、FGF23、FGFR1、FGFR2、FKBP10、FLNA、FLNB、FOXE1、FOXG1、FOXI1、FTO、FUCA1、G6PC、G6PC3、GALNS、GATA1、GBA、GCM2、GDF5、GDF6、GH1、GHR、GHRHR、GHSR、GJB6、GK、GLA、GLB1、GLI2、GNAS、GNPAT、GNPTAB、GNPTG、GORAB、GPC6、GPD1、GRM1、GTF2H5、GUSB、GYS2、H19、HBA1、HBA2、HBB、HCCS、HCFC1、HDAC4、HDAC8、HES7、HESX1、HGD、HOXD13、HPRT1、HRAS、HSD11B2、HSD17B4、HSPG2、HYAL1、HYLS1、IDS、IDUA、IFITM5、IFT140、IFT43、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IHH、IKBKAP、IKBKG、IMPAD1、INSR、ITCH、IYD、KANSL1、KAT6B、KCNJ1、KCNJ10、KCNJ2、KDM5C、KDM6A、KIF1A、KIF22、KIF7、KLF1、MLL、MLL2、KRAS、L1CAM、LAMTOR2、LARGE、LEPRE1、LHX3、LHX4、LIFR、LMNA、LMX1B、LRBA、LRP2、LRP5、LTBP2、LTBP3、LTBP4、MAN2B1、MAP2K1、MAP2K2、MASP1、MATN3、MBTPS2、MCPH1、MECP2、MED12、MGAT2、MGP、MIR17HG、MKS1、MLYCD、MMP13、MMP2、MMP9、MPO、MPV17、MVK、MYCN、MYH3、MYH8、NAA10、NBAS、NBN、NDE1、NDN、NEK1、NF1、NIN、NIPBL、NKX2-1、NKX2-5、NOG、NOTCH2、NPR2、NSD1、NSDHL、NSUN2、OCRL、OFD1、ORC1、ORC4、ORC6、OTX2、PAPSS2、PAX8、PCCB、PCNT、PDE4D、PEX7、PFKM、PGAM2、PHEX、PHF6、PHGDH、PHKA1、PHKA2、PHKB、PIGO、PIK3R2、PITX2、PLEC、PLOD2、PLOD3、POC1A、POR、PORCN、POU1F1、PPIB、PQBP1、PRKAR1A、PROP1、PTH1R、PTHLH、PTPN11、PYCR1、RAB23、RAB3GAP1、RAB3GAP2、RAB40AL、RAD21、RAD51C、RAF1、RAPSN、RARA、RBBP8、RBM8A、RECQL4、RIN2、RIPK4、RMRP、RNU4ATAC、ROR2、RPS19、RPS6KA3、RTTN、SBDS、SDHA、SEC23A、SECISBP2、SEMA3E、SEPN1、SEPT9、SERPINF1、SERPINH1、SF3B4、SH3BP2、SHH、SHROOM4、SIL1、SLC12A1、SLC16A2、SLC17A5、SLC19A2、SLC26A2、SLC26A4、SLC29A3、SLC34A1、SLC34A3、SLC35C1、SLC35D1、SLC37A4、SLC39A13、SLC39A4、SLC5A5、SLC6A19、SLC6A8、SLC9A6、SLX4、SMAD4、SMARCA2、SMARCAL1、SMC1A、SMC3、SMOC1、SMPD1、SMS、SNRPN、SOS1、SOST、SOX2、SOX3、SOX9、SP7、SPG20、SRCAP、STRA6、SUMF1、TAZ、TBCE、TBX1、TBX15、TBX3、TCTN3、TERT、TFAP2A、TG、THRA、THRB、TINF2、TMCO1、TMEM165、TMEM237、TNFRSF11B、TNNI2、TNNT3、TP63、TPM2、TPO、TRAPPC2、TRH、TRHR、TRIM37、TRIP11、TRPS1、TRPV4、TSHB、TSHR、TWIST1、UBR1、UROC1、UROS、USB1、VDR、VLDLR、VPS13B、WDR19、WDR35、WFS1、WISP3、WNT5A、WNT7A、WRN、ZBTB16、ZEB2、ZMPSTE24和ZNF592。这438个单基因突变可导致471种与矮小症相关的单基因疾病，再加上前述选取的用以标记17种由染色体的微缺失微重复导致的矮小症的25个基因。这463个基因是发明人经过收集、多次筛选和组合试验获得的，能够全面展现或代表矮小症相关基因。这463个基因与488种矮小症相关的疾病相关，参照前述，463个基因中，53个基因的SNP变异可导致53种与矮小症相关的代谢系统疾病，44个基因中发生的SNP可导致47种与矮小症相关的内分泌系统疾病，115个基因的SNP可导致124种与矮小症相关的骨骼系统疾病，17个基因的SNP可导致17种与矮小症相关的皮肤疾病，146个基因可导致153种与矮小症相关的综合征，36个基因可导致36种与矮小症相关的神经肌肉系统疾病，19个基因可导致19种与矮小症相关的血液系统疾病，11个基因可导致11种与矮小症相关的耳、鼻、喉五官系统疾病，6个基因可导致6种与矮小症相关的免疫系统疾病，5个基因可导致5种与矮小症相关的消化系统疾病。

任选地，所述试剂盒包含的芯片或者芯片上的探针还能够特异性识别上述其能特异性识别的各个基因的外显子区域的上下游各30bp的内含子区域。这样有利于提高芯片或探针捕获时的特异性和效率。

依据本发明的另一方面，还提供上述试剂盒在检测矮小相关基因中的用途。在检测矮小相关基因时，试剂盒可以用以特异性识别捕获矮小相关基因区域，以获得目标区域的的相关数据信息。

依据本发明的再一方面，提供一种检测矮小相关基因的方法，所述方法包括：(1)获取受检者的核酸，所述核酸为基因组核酸和/或游离核酸片段；(2)捕获所述核酸，获得矮小相关基因区域；(3)对所述矮小相关基因区域进行序列测定，获得序列信息；(4)基于所述序列信息检测所述矮小相关基因；其中，(2)是利用本发明一方面及各个实施方式中的任一试剂盒进行的。前述关于本发明一方面的试剂盒或试剂盒的用途的优点及技术特征，同样适用本发明这一方面的方法。在本发明的一个实施例中，(4)包括基于所述序列信息同时检测所述矮小相关基因的SNP和微缺失微重复(INDEL)变异，具体地，同时检测这两种变异包括：将所述序列信息与参考序列进行第一比对，获得第一比对结果；将所述第一比对结果与所述参考序列的一部分进行第二比对，获得第二比对结果；基于所述第一比对和所述第二比对结果，同时检测所述矮小相关基因的SNP和微缺失微重复变异。这里，所说的第一比对为全局比对，第二比对为局部比对，第一比对为常规比对，可利用但不限于SOAP或BWA等软件依照其默认设置进行，获得第一比对结果，第一比对结果包括序列信息在参考序列上的匹配位置及匹配情况信息，在本发明的一个实施例中，所说的参考序列为hg19，第二比对中所说的参考序列的一部分包括与所捕获的矮小相关基因区域对应的参考序列中的每个已知INDEL位点，及所述每个已知INDEL位点上下游各1000bp的参考序列，进行第二比对即基于第一比对的结果对与所捕获的矮小相关基因区域对应的参考序列中的所有已知INDEL附近的所有序列信息(reads)进行局部重新比对，能够消除第一比对中的错误，提高后续变异检测的准确率，第二比对可利用GATK重比对软件(https://www.broadinstitute.org/gatk/)进行。在本发明的一个实施例中，同时检测所述SNP和INDEL变异，是通过GATKUnifiedGenotyper软件进行的，按照该软件检测出的INDEL有较多的假阳性，利用前面的第二比对即局部重比对有利于减少假阳性INDEL。本发明的这一方面的方法是基于目标区域捕获结合第二代高通量测序技术，能够对矮症小相关的463个基因的编码区及侧翼±30bp区域进行捕获测序，然后对这些基因变异进行检测和分析，是一种高效、快捷、经济的矮小症基因检测方法。可检测的突变范围包括点突变和小片段插入缺失。本发明的基于二代测序的矮小症基因检测方法，通过对测序检出的异常变异进行分析解读，明确受检者的致病突变，实现对矮小症疾病的准确诊断、针对性的治疗以及防止疾病在家族中复发。

依据本发明的又一方面，提供一种检测矮小相关基因的装置，该装置能够用以执行实现前述本发明的方法的部分活全部步骤，该装置包括：A.核酸获取单元，用于获取受检者的核酸，所述核酸为基因组核酸和/或游离核酸片段；B.捕获单元，与A单元相连，用于捕获来自A单元中的核酸，以获得矮小相关基因区域；C.序列测定单元，与B单元相连，用于对来自B单元的矮小相关基因区域进行序列测定，以获得序列信息；D.检测单元，与C单元相连，用于基于来自C单元的序列信息检测所述矮小相关基因；其中，B单元中的捕获是利用前述本发明一方面的以及各个实施方式中的任一芯片进行的。图1是本发明的一个实施例中的装置结构示意图。对本发明的方法的优点及技术特征的描述，同样适用本发明的装置，而且，本领域人员可以理解，本发明的装置中的全部或部分单元，可选择的、可拆卸的包含一个或多个子单元以执行或实现前述本发明方法的各个具体实施方式。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本发明的一个具体实施方式中的检测矮小相关基因的装置的示意图；

图2是本发明的一个具体实施方式中的检测矮小相关基因的流程图。

具体实施方式

本申请描述中的基因名称均采用NCBI-Gene里的官方命名(OfficialSymbol)。另外，描述中出现的错义突变(missense)是指，编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后,变成编码另一种氨基酸的密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。某些错义突变能使多肽链丧失原有功能，许多蛋白质的异常就是由错义突变引起的。

依据一般方法，实现本发明的方法主要包括矮小相关基因检测芯片的设计，目标区域捕获测序技术以及分析流程的开发。

(1)矮小症基因检测芯片设计

染色体变异与单基因都可以导致矮小症，染色体变异又包括染色体数目、结构的改变，单亲二倍体与嵌合现象也可以导致矮小症。以下仅示例利用本发明方法检测单基因以及部分染色体的微缺失与微重复导致的身材矮小。通过对OMIM数据库以及相关文献的查找，获得438个单基因导致的471种与矮小症相关的单基因疾病，选取了25个基因作为染色体微缺失微重复的marker来标记17种由染色体的微缺失微重复导致的矮小症。其中，53个基因的SNP变异可导致53种与矮小症相关的代谢系统疾病，44个基因中发生的SNP可导致47种与矮小症相关的内分泌系统疾病，115个基因的SNP可导致124种与矮小症相关的骨骼系统疾病，17个基因的SNP可导致17种与矮小症相关的皮肤疾病，36个基因可导致36种与矮小症相关的神经肌肉系统疾病，19个基因可导致19种与矮小症相关的血液系统疾病，11个基因可导致11种与矮小症相关的耳、鼻、喉五官系统疾病，6个基因可导致6种与矮小症相关的免疫系统疾病，5个基因可导致5种与矮小症相关的消化系统疾病，以及146个基因可导致153种与矮小症相关的其它综合征。在这些基因中会出现1个基因导致多种疾病，这样，选取的基因共计463个，所对应488种疾病，具体如表1所示，表1中粗体显示的基因表示与多类疾病相关的基因，表2显示基因数目与对应的疾病数目信息。

根据人类基因组HG19，选取上述463个基因的外显子序列以及侧翼±30bp区域进行探针芯片设计，可以这样设计探针序列：从hg19上获取上述463个基因的外显子序列以及侧翼±30bp区域的各段参考序列，对每一段参考序列，都从一段参考序列的一端开始，依次拷贝预定长度的参考序列获得探针序列，使得最后总的探针能够覆盖该段参考序列至少一次，相邻探针序列之间可以重叠或不重叠，这边，预定长度为探针的长度，可为50-250nt，接着按照合成仪说明书或者委托厂家合成探针制备芯片。获得的芯片大小约为2.5M，该芯片上覆盖了丰富的捕获探针，探针覆盖区域达98.83％，可以从复杂的基因组中富集目标DNA片段，在同一张芯片上以高特异性和高覆盖率捕获约为2.5M的基因组区域。

表1

表2

(2)目标区域捕获测序及分析流程

如图2试验及分析流程所示，从受检者全血中提取基因组DNA，并将检测合格的DNA同时进行SNP质谱检测和文库制备。文库制备是将1μg基因组DNA打断成主带为200-300bp小片段DNA，然后将打断后DNA片段进行末端补平，在3'端加碱基“A”，使得DNA片段能与3'端带有“T”碱基的特殊接头连接，经Non-CapturedPCR(未捕获前扩增)构建完成的文库，通过矮小症基因检测芯片将选取的特定基因的Exon及及侧翼±30bp区域进行富集，再通过PCR扩增富集后产物，最后通过杂交前后PCR产物QPCR检测获得序列捕获杂交效率。QPCR检测合格后，将一定数量的文库进行上机测序，例如利用Hiseq2000/2500，对下机数据进行质控，然后对数据进行分析和解读。其中，文库制备一个样品周期为5-7天。信息分析采用自主开发的信息分析流程进行数据处理，分析流程包含的未特别交待的软件、脚本等可通过深圳华大基因公开的网页或数据库来获取，或者定制深圳华大基因的服务来进行该数据处理，数据处理主要包括过滤、比对、去重复、重比对、质控、SNV(SNP)+INDEL检测、注释等步骤。注释结果的解读，主要基于HGMD、BGIGap以及各大耳聋致病突变数据库及文献搜索查阅进行，同时结合多个功能预测软件结果及受检者临床表征进行综合解读，基本规则参考美国医学遗传学和基因组学学院(AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics，ACMG)相关指南进行。

传统的矮小症基因检测方法依赖临床医生的精确诊断，通过对候选基因的Sanger验证来探寻患者的致病原因。若候选基因的Sanger验证为阴性，需要重新对临床表征进行评估来寻找新的候选基因，浪费大量的时间和成本。示例的本发明的方法基于二代测序技术的矮小症基因检测可以灵活挑选基因集，而且性价比更高、针对性更强，适合大规模的临床基因检测服务。本方法提供的矮小症基因检测基本上涵盖了目前已报道的单基因导致的矮小症，可以对受检者进行准确诊断、针对性的治疗以及防止疾病在家族中复发。而且，随着矮小症新相关基因的发现，此芯片可以不断地升级，加入新的基因，从而不断提升矮小症芯片的检出率。

以下结合具体个体样本对依据本发明的具体检测方法的运行结果进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者公开的，比如购自Illumina公司的hiseq2000测序平台建库相关试剂盒来进行文库构建等。

实施例

对1例非匀称性矮小，骨骼异常(先天性脊椎后凸、四肢短小)，面部特征异常，先天性肝动脉门静脉瘘，先天性脑积水的患者进行检测，患者来自天津残疾人联合会。该患者在临床上无法确诊为哪种疾病，经过上述结合矮小症相关基因芯片新一代目标区域捕获测序(NGSPanel)检测后，发现在与软骨发育不良的FGFR3基因上发现了一个热点有害突变c.1138G>A(p.Gly380Arg)，最终患者确诊为软骨发育不良。

用盐析法提取标本DNA,大片段DNA进行超声打断，目前使用样品打断方法为Covaris打断法，将样品DNA打碎至100-700bp范围的片段。(注：打断效果一般以所要求制备文库Insert片段主带位置在200-250bp位置较为理想，若打断效果不理想则需要进行重新打断。)

1.文库制备

1.1末端修复和纯化

将配置好的mix震荡混匀后，每个反应加入25μL酶反应混合液。反应条件：20℃，30min。

使用180μLAmpureBeads进行产物纯化，回收的DNA溶于30μL(其中1.9μL为损耗)的水中。

1.2末端加“A”(A-Tailing)

将配置好的mix震荡混匀后，每管加入6.9μL酶反应混合液。反应条件：20℃，30min。需要说明的是，末端加“A”后可以不用纯化。

1.3Adapter的连接和纯化

将配置好的mix震荡混匀，每个反应加入15μL酶反应混合液。反应条件：16℃，12-16h(过夜)。使用75μLAmpureBeads进行产物纯化，回收的DNA溶于35μL(其中2μL为损耗)的水中。

1.4Non-Captured样品Pre-LM-PCR

PCR程序：

94℃2min；

94℃15s,62℃30s，72℃30s，4cycles；

72℃5min；

4℃forever

2.芯片杂交，目标区域捕获富集

本实验中参照NimbleGen使用说明书进行杂交洗脱，获取目的基因并PCR富集。

3.上机测序

本实验采用hiseq2000或hiseq2500PE101+8+101程序进行上机测序。

4.信息分析

4.1从测序仪获取原始数据(FASTQ数据)。

4.2过滤：对原始FASTQ数据进行质量控制，去除常规所说的低质量值数据。

4.3比对：利用SOAP软件及其默认参数设置，使用Hg19参考序列进行比对，并行化处理任务。

4.4去重复：基于Picard的read去重复算法，并行化地从比对结果中找出重复reads并以SAM/BAM文件的tag方式进行标记。

4.5重比对：使用基于GATK重比对模型，进行重比对。即，在上一比对结果的基础上，对INDEL附近的所有reads进行局部重新比对，以消除比对的错误，提高变异检测的准确率。

4.6检测SNVINDEL：使用在GATKUnifiedGenotyper基础上开发的基于Hadoop平台的并行化变异检测模块，同时进行SNP和Indel的检测。比对完成后利用更完备的错误模型计算基因型似然值，考虑了PCR、碱基质量(BaseQuality)和比对质量(MappingQuality)等多种因素。UnifiedGenotyper是集合多种变异检测方法而成的一种变异识别软件(VariantsCaller)，UnifiedGenotyper使用贝叶斯最大似然模型，同时估计基因型和基因频率，最后对每一个样本的每一个变异位点和基因型都会给出一个精确的后验概率。该软件能将输入bam文件中的样本进行变异检测，最后生成一个vcf文件，vcf文件中会包含所有样本的变异位点和基因型信息。从vcf文件得到的结果是最原始的、没有经过任何过滤和校正的Variants集合。这一步产生的变异位点会有很高的假阳性，尤其是indel，因此，我们在前面进行重比对以尽量减少该突变检测中的假阳性结果。

4.7注释：使用人类基因组数据库NCBI104，频率数据库dbSNP135、1000human、ESP6500，以及BGI内部频率数据库进行注释；使用HGVS对变异进行标准命名，同时使用OMIM、HGMD疾病数据库，CGD临床基因组数据库进行突变及疾病注释，确定突变位点发生的基因、坐标、氨基酸改变等。生成与矮小症基因相关的突变数据列表。

5.结果分析

表3是测序数据统计结果，表4显示目标区域覆盖度统计信息，表5显示检测结果。

表3

表4

表5

如表5所示，本次基因检测在与软骨发育不良(Achondroplasia，ACH；OMIM：100800)相关的FGFR3基因编码区检测到一个杂合已知致病突变c.1138G>A(p.Gly380Arg)。FGFR3基因编码区的杂合错义突变c.1138G>A(p.Gly380Arg)为最常见的软骨发育不良的致病突变，99％的软骨发育不良患者都是由FGFR3基因的突变所导致。Bellus等1995年对193例软骨发育不良患者的研究中发现187例患者是由突变c.1138G>A导致，占患者的96.9％，5例患者是由该位置的另一突变c.1138G>C导致，占患者的2.6％[Bellus,G.A.,Hefferon,etal.AchondroplasiaisdefinedbyrecurrentG380RmutationsofFGFR3.Am.J.Hum.Genet.1995(56):p.368-373]。软骨发育不良为常染色体显性遗传病，杂合突变即可致病。因此，c.1138G>A(p.Gly380Arg)应是受检者骨骼异常相关病症的原因。

另外，限于篇幅，列出本次检测出的部分其它变异的信息，如表6所示，表6中的变异都是数据库中频率＜5％，且可能影响蛋白功能和mRNA剪接的变异类型(包括非同义突变、蛋白编码区的插入、缺失突变及剪接±10bp以内的变异)。

表6

*hom/het:hom表示此突变位点为纯合突变，het表示此突变位点为杂合突变。

*Fr.1：dbSNP数据库中收录的关于此SNP的频率信息。

*Fr.2：千人计划中全部测序样本中关于此SNP在亚裔人种中的频率信息。

*Fr.3：ESP6500数据库中收录的关于此SNP的频率信息。

*Fr.4：本地数据库中关于此SNP的频率信息。

*Condel：Condel数据库预测结果。

Claims (12)

1.一种试剂盒，其包括芯片，所述芯片由探针固定在固相基质上构成，所述探针能够特异性识别以下25个基因的外显子区域：FMR1,BRCC3,WDR81,SATB2,VRK2,LSM14A,HOXD3,LHX1,RIMS1,MBP,HMX2,GJA8,MBD5,ELN,CHRM3,RPS7P5,FMN2,USP9Y,SRY,UTY,CHL1,LBR,RAI1,FGFR3和RUNX2；

任选地，所述探针能够特异性识别以下53个基因的外显子区域：PHEX,ENPP1,FGF23,CLCN5,SLC34A3,VDR,CYP2R1,CYP27B1,SLC37A4,AGL,PFKM,PHKA1,PHKB,PHKA2,ALDOA,PGAM2,G6PC,GALNS,IDUA,IDS,ARSB,HYAL1,GUSB,GLB1,GNPTG,GNPTAB,MAN2B1,MGAT2,SLC35C1,TMEM165,GPD1，GBA，SMPD1，MLYCD,CTSA,UROC1,FUCA1,PIGO,AGA,GK,CTNS,PHGDH,HGD,ATP7A,SLC17A5,MPO,MVK,ADA,PCCB,PLOD3,SLC6A19,ACADS和SUMF1；

任选地，所述探针能够特异性识别以下44个基因的外显子区域：SOX3,GHSR,GHRHR,GHR,BTK,GH1；SHH,SLC29A3,NDN,CEP57,ALMS1,SNRPN,NKX2-5,TSHB,THRA,PAX8,TSHR,IYD,TPO,TG,DUOXA2,DUOX2,SLC26A4,SLC5A5,GCM2,SECISBP2,THRB,TRHR,TRH,PROP1,OTX2,POU1F1,HESX1,LHX4,LHX3,PCNT,RNU4ATAC,IGF1R,GNAS,HSD11B2,B3GALTL,INSR,CYP11B1和CASR；

任选地，所述探针能够特异性识别以下113个基因的外显子区域：TRIP11,COL2A1,ARSE,PTH1R,IMPAD1,EBP，GNPAT,PEX7,AGPS，BMPR1B,RMRP,EXT1,PDE4D,PRKAR1A,GDF5,NPR2,ROR2,NOG,PTHLH,HOXD13,IHH,BMPR1B，HDAC4，SOX9,NEK1,WDR35,DYNC2H1,PIK3R2,AKT3,COL9A3,COL9A2,COL9A1,COMP,MATN3,SLC26A2,MMP13,COL10A1,MMP9,SERPINH1,CRTAP,BMP1,FKBP10,LEPRE1,IFITM5,SERPINF1,PPIB,COL1A1,SP7,MMP13,PAPSS2,MATN3,TRAPPC2,KIF22,ACP5,DDR2,ACAN,COL2A1,CHST3,HES7,DLL3,MCPH1,ASPM,MYH3,TPM2,TNNT3,IFT43,SOST,COL11A1,SEC23A,MMP2,ESCO2,RIN2,LMX1B,GHR,SLC35D1,EFNB1,DYM,LIFR,GORAB,SH3BP2,FGFR1,TBX15,CANT1,TFAP2A,TMCO1,CHRNA1,CTSK,FLNB,EVC,FBN1,B3GAT3,EFTUD2,EIF2AK3,EVC2,CHRNG,CHRND,SMAD4,POC1A,TBX3,WNT7A，ERCC6,ERCC2，FBN1,ADAMTSL2，EXT2，TRPV4，SF3B4，CA2，WDR19，GDF6，FAM123B，TNFRSF11B和TNNI2；

任选地，所述探针能够特异性识别以下5个基因的外显子区域：ATP8B1,ABCB11,BUB1B,CASP8和CCBE1；

任选地，所述探针能够特异性识别以下17个基因的外显子区域：ATP6V0A2,LTBP4,PYCR1,ALDH18A1,DKC1,TERT,TINF2,ERCC3,GTF2H5,EXT1,TRPS1,PLEC1,PORCN,SLC39A4,C16orf57,IKBKG和ZMPSTE24；

任选地，所述探针能够特异性识别以下36个基因的外显子区域：SLC9A6,SMS,HCFC1,NSUN2,RAB40AL,CASK,KDM5C,RPS6KA3,CUL4B,CHMP1A,EXOSC3,AP4S1,AP4E1,AP4B1,GRM1,ZNF592,SEPN1,LARGE,SEPT9,RAPSN,COL6A2,RTTN,SOX3,NAA10,NF1,LRP5,ATM,SHROOM4,SIL1,SLC6A8,IGBP1,SHH,NDE1,IKBKAP,KIF1A和VLDLR；

任选地，所述探针能够特异性识别以下11个基因的外显子区域：BCOR,STRA6,OTX2,SMOC1,HCCS,SOX2,FOXI1,KCNJ10,SLC26A4,LTBP3和CLCN5；

任选地，所述探针能够特异性识别以下18个基因的外显子区域：FANCE,FANCC,FANCA,FANCG,FANCF,RAD51C,FANCD2,SLX4,HBB,HBA1,SLC19A2,RPS19，KLF1,GATA1,RARA,ATRX,RBM8A和UROS；

任选地，所述探针能够特异性识别以下6个基因的外显子区域：LAMTOR2,LRBA,BTK,WISP3,ITCH和SMARCAL1；

任选地，所述探针能够特异性识别以下145个基因的外显子区域：CUL7，CCDC8,KCNJ1,SLC12A2,ERCC8,ERCC6,SMC1A,NIPBL,SMC3,HDAC8,RAD21,ADAMTS2,SLC39A13,COL1A2,B4GALT7,COL3A1,COL1A1,COL5A2,COL5A1,MYCN,MIR17HG,ORC6,ORC1,CDT1,CDC6,ORC4,KRAS,RAF1,BRAF,SOS1,PTPN11,OFD1,TCTN3,WNT5A,ROR3,CREBBP,EP300,LIFR,HSPG2,ATR,RBBP8,CEP152,NIN,CEP63,CENPJ,ADAMTS17,FBN1,LTBP2,ADAMTS10,RAB3GAP1，RAB3GAP2，RAB18,FOXG1,MECP2,LRP2,NKX2-1,FGD1,KCNJ2,SBDS,L1CAM,AAAS,TWIST1,NBAS,SEMA3E,PQBP1,SPG20,G6PC3,HYLS1,NBN,IGF2,UBR1,OCRL,CHD7,GLA,CD96,LMNA,PHF6,HRAS,IFT140,SRCAP,CTC1,OTX2,ASXL1,FTO,ANKRD11,HSD17B4,MED12,KIF7,DHCR7,CTDP1,MYH8,DDX11,POR,KAT6B,ALDH3A2,TP63,SDHA,ALPL,MLL,WRN,MAP2K1,NSDHL,FAM20C,NSD1,H19,RECQL4,TRIM37,ZEB2,FOXE1,KANSL1,BANF1,BLM,VPS13B,RAB23,TBX1,HPRT1,SLC16A2,SMARCA2,COX4I2,MAP2K2,NOTCH2,CRLF1,WFS1,ZBTB16,ARX,DLX5,MGP,FGFR2,TAZ，PITX2，ACTB，PLOD2，SLC34A1，MBTPS2，TMEM237，TBCE，MKS1，GPC6，RIPK4，FLNA，GJB6，ERCC3，MPV17，ATPAF2和AQP2。

2.权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述探针能够特异性识别以下438个基因的外显子区域：AAAS、ABCB11、ACADS、ACAN、ACP5、ACTB、ADA、ADAMTS10、ADAMTS17、ADAMTS2、ADAMTSL2、AGA、AGL、AGPS、AKT3、ALDH18A1、ALDH3A2、ALDOA、ALMS1、ALPL、FAM123B、ANKRD11、AP4B1、AP4E1、AP4S1、AQP2、ARSB、ARSE、ARX、ASPM、ASXL1、ATM、ATP6V0A2、ATP7A、ATP8B1、ATPAF2、ATR、ATRX、AVPR2、B3GALTL、B3GAT3、B4GALT7、BANF1、BCOR、BLM、BMP1、BMPR1B、BRAF、BTK、BUB1B、CA2、CANT1、CASK、CASP8、CASR、CCBE1、CCDC8、CD96、CDC6、CDSN、CDT1、CENPJ、CEP152、CEP57、CEP63、CHD7、CHMP1A、CHRNA1、CHRND、CHRNG、CHST3、CLCN5、COL10A1、COL11A1、COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2、COL6A2、COL9A1、COL9A2、COL9A3、COLEC11、COMP、COX4I2、CREBBP、CRLF1、CRTAP、CTC1、CTDP1、CTNS、CTSA、CTSK、CUL4B、CUL7、CYP11B1、CYP27B1、CYP2R1、DDR2、DDX11、DHCR7、DHODH、DKC1、DLL3、DLX5、DUOX2、DUOXA2、DYM、DYNC2H1、EBP、EFNB1、EFTUD2、EIF2AK3、ENPP1、EP300、ERCC2、ERCC3、ERCC6、ERCC8、ESCO2、EVC、EVC2、EXOSC3、EXT1、EXT2、FAM20C、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FBN1、FGD1、FGF23、FGFR1、FGFR2、FKBP10、FLNA、FLNB、FOXE1、FOXG1、FOXI1、FTO、FUCA1、G6PC、G6PC3、GALNS、GATA1、GBA、GCM2、GDF5、GDF6、GH1、GHR、GHRHR、GHSR、GJB6、GK、GLA、GLB1、GLI2、GNAS、GNPAT、GNPTAB、GNPTG、GORAB、GPC6、GPD1、GRM1、GTF2H5、GUSB、GYS2、H19、HBA1、HBA2、HBB、HCCS、HCFC1、HDAC4、HDAC8、HES7、HESX1、HGD、HOXD13、HPRT1、HRAS、HSD11B2、HSD17B4、HSPG2、HYAL1、HYLS1、IDS、IDUA、IFITM5、IFT140、IFT43、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IHH、IKBKAP、IKBKG、IMPAD1、INSR、ITCH、IYD、KANSL1、KAT6B、KCNJ1、KCNJ10、KCNJ2、KDM5C、KDM6A、KIF1A、KIF22、KIF7、KLF1、MLL、MLL2、KRAS、L1CAM、LAMTOR2、LARGE、LEPRE1、LHX3、LHX4、LIFR、LMNA、LMX1B、LRBA、LRP2、LRP5、LTBP2、LTBP3、LTBP4、MAN2B1、MAP2K1、MAP2K2、MASP1、MATN3、MBTPS2、MCPH1、MECP2、MED12、MGAT2、MGP、MIR17HG、MKS1、MLYCD、MMP13、MMP2、MMP9、MPO、MPV17、MVK、MYCN、MYH3、MYH8、NAA10、NBAS、NBN、NDE1、NDN、NEK1、NF1、NIN、NIPBL、NKX2-1、NKX2-5、NOG、NOTCH2、NPR2、NSD1、NSDHL、NSUN2、OCRL、OFD1、ORC1、ORC4、ORC6、OTX2、PAPSS2、PAX8、PCCB、PCNT、PDE4D、PEX7、PFKM、PGAM2、PHEX、PHF6、PHGDH、PHKA1、PHKA2、PHKB、PIGO、PIK3R2、PITX2、PLEC、PLOD2、PLOD3、POC1A、POR、PORCN、POU1F1、PPIB、PQBP1、PRKAR1A、PROP1、PTH1R、PTHLH、PTPN11、PYCR1、RAB23、RAB3GAP1、RAB3GAP2、RAB40AL、RAD21、RAD51C、RAF1、RAPSN、RARA、RBBP8、RBM8A、RECQL4、RIN2、RIPK4、RMRP、RNU4ATAC、ROR2、RPS19、RPS6KA3、RTTN、SBDS、SDHA、SEC23A、SECISBP2、SEMA3E、SEPN1、SEPT9、SERPINF1、SERPINH1、SF3B4、SH3BP2、SHH、SHROOM4、SIL1、SLC12A1、SLC16A2、SLC17A5、SLC19A2、SLC26A2、SLC26A4、SLC29A3、SLC34A1、SLC34A3、SLC35C1、SLC35D1、SLC37A4、SLC39A13、SLC39A4、SLC5A5、SLC6A19、SLC6A8、SLC9A6、SLX4、SMAD4、SMARCA2、SMARCAL1、SMC1A、SMC3、SMOC1、SMPD1、SMS、SNRPN、SOS1、SOST、SOX2、SOX3、SOX9、SP7、SPG20、SRCAP、STRA6、SUMF1、TAZ、TBCE、TBX1、TBX15、TBX3、TCTN3、TERT、TFAP2A、TG、THRA、THRB、TINF2、TMCO1、TMEM165、TMEM237、TNFRSF11B、TNNI2、TNNT3、TP63、TPM2、TPO、TRAPPC2、TRH、TRHR、TRIM37、TRIP11、TRPS1、TRPV4、TSHB、TSHR、TWIST1、UBR1、UROC1、UROS、USB1、VDR、VLDLR、VPS13B、WDR19、WDR35、WFS1、WISP3、WNT5A、WNT7A、WRN、ZBTB16、ZEB2、ZMPSTE24和ZNF592。

3.权利要求1或2的试剂盒，其特征在于，所述探针还能够特异性识别其能特异性识别的各个基因的外显子区域的上下游各30bp的内含子区域。

4.权利要求1或2的试剂盒在检测矮小相关基因中的用途。

5.一种检测矮小相关基因的方法，其特征在于，包括：

(1)获取受检者的核酸，所述核酸为基因组核酸和/或游离核酸片段；

(2)捕获所述核酸，获得矮小相关基因区域；

(3)对所述矮小相关基因区域进行序列测定，获得序列信息；

(4)基于所述序列信息检测所述矮小相关基因；

其中，(2)是利用权利要求1-3任一试剂盒进行的。

6.权利要求5的方法，其特征在于，(4)包括基于所述序列信息同时检测所述矮小相关基因的SNP和微缺失微重复变异。

7.权利要求6的方法，其特征在于，同时检测所述矮小相关基因的SNP和微缺失微重复变异，包括：

将所述序列信息与参考序列进行第一比对，获得第一比对结果；

将所述第一比对结果与所述参考序列的一部分进行第二比对，获得第二比对结果；

基于所述第一比对结果和所述第二比对结果，同时检测所述矮小相关基因的SNP和微缺失微重复变异。

8.权利要求7的方法，其特征在于，所述第一比对为全局比对，所述第二比对为局部比对。

9.权利要求7的方法，其特征在于，所述参考序列为hg19。

10.权利要求7的方法，其特征在于，所述参考序列的一部分包括与所述矮小相关基因区域对应的所述参考序列中的每个已知微缺失微重复位点，以及所述每个已知微缺失微重复位点上下游各1000bp的参考序列。

11.权利要求7的方法，其特征在于，利用GATKUnifiedGenotyper软件同时检测所述矮小相关基因的SNP和微缺失微重复变异。

12.一种检测矮小相关基因的装置，其特征在于，包括：

A.核酸获取单元，用于获取受检者的核酸，所述核酸为基因组核酸和/或游离核酸片段；

B.捕获单元，与A单元相连，用于捕获来自A单元中的核酸，以获得矮小相关基因区域；

C.序列测定单元，与B单元相连，用于对来自B单元的矮小相关基因区域进行序列测定，以获得序列信息；

D.检测单元，与C单元相连，用于基于来自C单元的序列信息检测所述矮小相关基因；其中，B单元中的捕获是利用权利要求1-3任一试剂盒进行的。