CN105683760A - 用于诊断原发性醛甾酮增多症的方法 - Google Patents

用于诊断原发性醛甾酮增多症的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于诊断原发性醛甾酮增多症(PHA)的方法和试剂盒。特别地，本发明涉及由Ang？II水平(特别是稳态平衡Ang？II水平)和醛固酮水平之间的比例组成的新诊断参数在生物样品(比如例如血浆)中的用途。所述两种测量参数的比例用于诊断患者中的PHA，且具有优于目前使用的诊断方法的优点。

Description

用于诊断原发性醛甾酮增多症的方法
发明领域
本发明涉及用于诊断原发性醛甾酮增多症(PHA)的方法和试剂盒。特别地，本发明涉及由生物样品(比如例如血浆)的血管紧张素II(AngII或Ang1-8)水平(特别是稳态平衡AngII水平)和醛固酮水平之间的比例组成的新诊断参数的用途。所述两种测量参数的比例用于诊断患者中的PHA，且具有优于目前使用的诊断方法的优点。
发明背景
PHA(也称为原发性醛甾酮增多症)的特征在于盐皮质激素醛固酮的过量产生不是肾素分泌过多的结果。醛固酮引起肾脏中钠和水滞留且钾排泄的增加，导致动脉高压。由于抗高血压治疗对目前可用试验的干扰和所应用的测定的诊断效率(diagnosticpower)不足，因此伴有动脉高血压的患者中PHA的诊断是一个显著的分析挑战。PHA有很多原因，包括肾上腺增生和肾上腺癌。当其是由于单独的分泌醛固酮的肾上腺腺瘤(其是一类良性肿瘤且是PHA的最常见原因(病例的66％))而出现时，其被称为康氏综合征(Conn'ssyndrome.)。PHA的其它原因包括双侧特发性肾上腺增生症(病例的30％)、原发性(单侧)肾上腺增生病例的2％)、产生醛固酮的肾上腺皮质癌(aldosterone-producingadrenocorticalcarcinoma)(病例的<1％)、家族性醛甾酮过多症(FH)、糖皮质激素可治的醛甾酮过多症(I型FH，病例的<1％)、II型FH(病例的<2％)和异位(ectopic)产生醛固酮的腺瘤或癌(病例的＜0.1％)(Williamstextbookofendocrinology(第11版).Philadelphia:Saunders/Elsevier.2008.ISBN978-1-4160-2911-3.)。然而，由于诊断能力受限，关于PHA亚型(subforms)患病率的数据不同。最新研究表明由于双侧特发性肾上腺增生症(IAH)引起的醛甾酮过多症的患病率比之前认为的更高，多达PHA病例的75％。一旦确诊，PHA通常可以通过外科手术治愈。
单独测量醛固酮不被认为能足以诊断原发性醛固酮增多症。众所周知，与单独测量醛固酮水平相比，通过测量肾素活性或浓度和醛固酮且将这两个参数合并为算术比例：醛固酮与肾素之比(ARR)，其目前用于诊断PHA(TiuS,ChoiC,ShekC,NgY,ChanF,NgC,KongA(2005)."Theuseofaldosterone-reninratioasadiagnostictestforprimaryhyperaldosteronismanditstestcharacteristicsunderdifferentconditionsofbloodsampling".JClinEndocrinolMetab90(1):8.doi:10.1210/jc.2004-1149.PMID15483077)，可以提高检测PHA的诊断特异性和灵敏性。醛固酮与肾素之比(ARR)是血液中醛固酮的质量浓度除以肾素活性和/或肾素浓度。醛固酮与肾素之比可以以ng/dl/ng/(mL·h)给出，其为毫微克/分升的醛固酮/毫微克/(毫升×小时)的肾素。并且，其可以以pmol/L/μg/(liter·h)给出，其中醛固酮以摩尔浓度给出。前者可以通过乘以27.6转化为后者。并且，有时会给出相反值，即肾素与醛固酮之比，该值为醛固酮与肾素之比的倒数。对于所述两个参数中的任一个，醛固酮和肾素之间的比例也可以使用其它浓度参数(质量单位/ml和/或数量单位/ml)，导致所述比例的绝对值不同，然而含有类似信息。用于计算ARR的肾素的浓度也可以以μg/UIE/ml给出，其为也反映肾素浓度的临床诊断学中常用的单位。
正常个体与患有原发性醛甾酮增多症的个体基于ARR的截止值(或阈值)受测试条件比如体位和当日时间的显著影响。平均起来，23.6ng/dl/ng/mL·h)的ARR截止值，用另一个单位表示为650pmol/l/μg/(l·h)，估计具有97％的灵敏性和94％的特异性(Tiuetal，上述引用的)。高于现有技术中使用的截止值的个体中ARR值指示原发性醛甾酮增多症。
如果使用反比(即，肾素比醛固酮)，则低于截止值的值被认为指示原发性醛甾酮增多症。
然而，患有PHA的患者所显示的ARR的宽范围使原发性高血压和PHA之间有可能没有清晰可靠的辨识，从而导致假阳性和/或假阴性诊断结果和治疗决定。为了在ARR筛选之后提高验证试验过程中ARR的诊断效率，需要特殊的药物和饮食需要与包括盐水输注的复杂试验方案。
内分泌物学会建议筛选处于风险的患者群中的PHA，包括以下患者：JointNationalCommission2期(>160-179/100-109mmHg)、3期(>180/110mmHg)、或耐药性高血压；高血压和自发性或利尿剂诱发的低钾血症；伴有肾上腺意外瘤的高血压；或年轻时(<40岁)的高血压和早发性高血压或脑血管意外的家族史。患有PHA的患者的高血压一级亲属也显示出PHA风险增加。根据临床指导方针(clinicalguidelines)，诊断PHA直到决定治疗外科手术的标准方式被认为是费劲的且意味着对于患者有一些风险。
测量ARR以诊断PHA背后的合理性是负责肾上腺皮质中醛固酮分泌的生理学通路的原因。肾素是由血管紧张素原产生血管紧张素I的肾素-血管紧张素-系统(RAS)的一种关键酶，血管紧张素I经由其它肽酶被转化成AngII。已知AngII结合AT1-受体(AT1R)，引起醛固酮分泌，其产生其在肾脏及其它组织中的生理学作用。在健康情况下，RAS调节血浆醛固酮水平。在PHA条件下，醛固酮产生变成部分独立于RAS，意味着肾素不是保持醛固酮产生进一步所必需的。ARR的测量试图利用肾素和醛固酮的脱调节。PHA患者通常具有升高的血浆醛固酮水平。因此，对于PHA的阳性筛选试验(通常醛固酮>15ng/dl)，一些研究者需要除了提高的ARR之外提高的醛固酮水平。
PHA的诊断方法从上述指定患者群中ARR病例检测试验开始(JohnW.Funderetal.；JClinEndocrinolMetab.September2008,93(9):3266-3281)。在该第一测量的ARR值高于某一阈值的情况下，为了保证获得结果的正确性，患者要进行进一步的试验。值得注意的是，由于假阴性和假阳性的频繁出现，在文献中，ARR阈值的精确值仍处于讨论中。
虽然被认为仅对于测量的ARR值具有有限作用的抗高血压药物很少，但是已知很多抗高血压药物强干扰ARR试验。干扰的主要原因的代表是这些药物对于肾素浓度和肾素活性的强烈影响，导致ARR结果改变。因此，在验证试验之前，抗高血压药物的清除(washout)期通常是必需的，其对于高血压患者而言具有相当大风险。验证试验本身包括耗时且成本密集的临床过程，该过程旨在响应在该过程前后渗透或药物挑战与ARR试验的组合而降低患者的肾素水平。
一种非常常见的PHA验证试验是盐水输注试验，其中在4小时期间向患者给予两升0.9％盐水。容量增加将引起肾素活性和浓度降低。实验后的醛固酮水平低于50pg/ml被认为表明不存在PHA，而实验后的醛固酮水平高于100pg/ml被解释为PHA的可能迹象。介于50pg/ml到100pg/ml之间的值被认为是不确定的(JohnW.Funderetal.；JClinEndocrinolMetab.September2008,93(9):3266-3281)。
阳性验证试验触发进一步的临床实验，包括肾上腺成像技术，比如例如计算机断层扫描(CT)和肾上腺静脉采样(AVS)，以测定过量的且与肾素无关的醛固酮产生的来源。一旦对亚型分类，则可以进行单侧肾上腺切除术或用盐皮质激素受体拮抗剂治疗。
诊断方法的关键步骤是高风险高血压患者的病例检测。作为病例检测试验的ARR可能容易显示假阳性和阴性结果，因为在高血压患者中，PHA患者的ARR值分布显示与非PHA患者的ARR值分布一致(GaryL.SchwartzandStephenT.Turner；ClinicalChemistry51,No.2,2005)，其可能导致患者不必要的错误治疗。在假阳性的情况下，该错误治疗可导致严重的并发症，因为在高血压患者(尽管服用至少三种抗高血压药物)中几周的药物清除期具有在该血压不受控制的期间致死性心血管事件的重大风险。除此之外，验证试验通常需要住院治疗和医师持续监测，对于患者和医疗系统而言费时且费钱。在假阴性结果的情况下，PHA患者将继续忍受顽固性高血压，由于威胁生命的心血管事件如中风或心脏病发作的风险强烈增加，所述患者具有致命的预后。
本发明提供一种用于诊断受试者中的原发性醛甾酮增多症的方法，包括从受试者获得生物样品，测量醛固酮水平和AngII水平，并计算其比例(醛固酮与血管紧张素II之比，AA2R)。所述方法具有优于上述目前使用的基于ARR的诊断方法的大量优点。
发明简述
在一个方面，本发明涉及一种用于诊断受试者中的原发性醛甾酮增多症的方法，包括从受试者获得生物样品，测量醛固酮水平和AngII水平，并计算其比例(醛固酮与血管紧张素II之比，AA2R)。在第二个方面，本发明涉及一种用于诊断PHA的试剂盒，包括AngII标准品、醛固酮标准品且任选地进一步包括说明书和/或其它组分。
附图简述
图1:左图：14名健康志愿者中的AngII与PRA之比。右图：健康未处理的和ACE-抑制剂处理的健康志愿者的血浆中的AngII与PRC之比。
图2:左图：未处理的和ACE-抑制剂处理的健康志愿者(n＝14)中的AngII与PRA之比。中图：未处理的和ACE-抑制剂处理的健康志愿者(n＝14)中的PRA。右图：未处理的和ACE-抑制剂处理的健康志愿者(n＝4)中的AngII与PRC之比。
图3:在4h盐水输注验证试验前后，一名非-PHA患者和一名确认的PHA患者的ARR和AA2R的比较。左图：对于非-PHA患者，以输液前信号的百分比给出的值。右图：显示每个时间点，非-PHA和PHA患者之间ARR和AA2R特定鉴别因子的比较。
图4:抗高血压治疗对活性肾素浓度的影响。在给药单剂量的ACE抑制剂(左)、肾素抑制剂(中)或血管紧张素受体阻断剂(ARB，右)之前(预剂量)和之后4小时，从健康志愿者采集的血浆样品。5名健康志愿者的平均值+/-SEM显示在图中。
图5：给药RAS阻断剂对于ARR(上图)和AA2R(下图)的影响的比较。在给药单剂量的ACE抑制剂(左)、肾素抑制剂(中)或血管紧张素受体阻断剂(ARB，右)之前(预剂量)和之后4小时，从健康志愿者采集的血浆样品。测量血浆醛固酮浓度、平衡血管紧张素II浓度和活性肾素浓度，并计算每个样品的ARR和AA2R。对于ARR的计算，用醛固酮的浓度(ng/L)除以血浆活性肾素浓度(ng/L)。对于AA2R的计算，用醛固酮浓度(pmol/L)除以AngII浓度(pmol/L)。将5名健康志愿者的平均值+/-SEM显示在图中。
发明详述
目前可用的诊断患者中PHA的方法使用血浆肾素活性或血浆肾素浓度与血浆醛固酮浓度之间的相关性。醛固酮与肾素之比(ARR)的计算显示非-PHA和PHA患者之间可能有部分辨识(discrimination)。然而，假阳性和假阴性结果常见。已知肾素负责血管紧张素I(AngI)的产生，血管紧张素I充当由其他蛋白水解酶如糜蛋白酶或血管紧张素-转化酶(ACE)形成AngII的底物。AngII是RAS的主要效应物激素并主要负责RAS介导的生理功能，包括体液平衡和血压的调节。广泛接受的是肾素活性和浓度充当RAS活性的替代标记物(SwalesJDandThurstonHJ；ClinEndocrinolMetab.1977Jul；45(1):159-63)，其用于支持ARR作为PHA的诊断标记物的用途。
令人惊奇地，结果表明在平衡的血浆样品中测量的AngII水平(即，根据如下所述稳态平衡(SSE)方法测量的AngII水平，也称为平衡AngII水平)显示血浆肾素活性(PRA)与血浆肾素浓度(PRC)的相关性较差，其由当比较个体受试者(图1，左图和右图)时AngII与PRA和AngII与PRC之比的巨大变化性所表明。从没有接受抗高血压治疗的14名健康志愿者收集血液。通过离心分离血浆，并在37℃下血浆平衡60分钟之后，在稳定的样品中测量平衡AngII水平。测量稳态平衡中RAS水平的方法进一步描述在WO2013/182237中。对于PRA的测量，使进行所述的血管紧张素I形成测定(Bystrometal.,Clin.Chem.56(2010),1561-1569])。通过质谱定量血管紧张素I，并以(ngAngI/ml)/h计算血浆肾素活性。图显示平衡AngII与肾素活性之比。14个供体的比例介于48至1022[pgAngII/ml]/[(ngAngI/ml)/h]之间，其为所有14个供体的平均值的11％至232％。
在第二种方法中，在4名未处理的和4名ACE抑制剂处理的志愿者中，使用市售可获得的且临床应用的基于抗体的肾素测定(Diasorin)来测定血浆肾素浓度(PRC)。在37℃下60分钟的血浆平衡和样品稳定之后，通过质谱测量平衡AngII水平。计算平衡AngII与PRC之比，并显示在未处理的和ACE抑制剂处理的患者的图中。所显示比例的单位是[pgAngII/ml]/[μgUIE/ml肾素]。在研究的所有患者群组中，发现AngII与PRA之比和AngII与PRC之比高度变化。而且，ACE-抑制剂处理导致AngII与PRC之比(图2，右图)和AngII与PRA之比(图2，左图)都显著降低。
总之，类似的肾素浓度和/或活性导致个体中AngII浓度不同，表明肾素活性和/或浓度是RAS的生理活性的不良标记物。因此，ARR不足以显示与醛固酮水平相关的RAS活性，给ARR作为PHA的筛选工具的适合性打上了问号。这些理由进一步解释了在PHA病例检测中经由ARR测量的局限性，其易于产生假阳性和假阴性结果，且高度取决于患者的治疗背景(JohnW.Funderetal.；JClinEndocrinolMetab.September2008,93(9):3266-3281；,andGaryL.SchwartzandStephenT.Turner；ClinicalChemistry51,No.2,2005)。
而且，AngII与PRA之比和AngII与PRC之比受ACE-抑制剂处理的显著影响(图1，右图；图2，左图和右图)。令人惊奇地，虽然ACE-抑制剂处理提高了肾素活性和浓度，显著地降低了AngII与肾素之比(图2，中图)。
因此，我们得出结论，在不存在或存在抗高血压药物如ACE-抑制剂的情况下，肾素浓度和AngII活性的较差相关性可造成ARR用于诊断PHA的预测力有限。
相反，本发明涉及一种用于诊断受试者中的原发性醛甾酮增多症的方法，包括测量来自受试者的生物样品中的醛固酮水平和血管紧张素II(AngII)水平，并计算醛固酮水平和AngII水平之间的比例(醛固酮与血管紧张素II之比，AA2R)。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于诊断受试者中的原发性醛甾酮增多症的方法，包括从受试者获得生物样品，测量醛固酮水平和AngII水平，并将其合并为算术比例(醛固酮与血管紧张素II之比，AA2R)。
如本文使用的术语“水平”指生物样品比如例如血液、血浆或血清中物质(例如，RAS的组分，比如肾素、AngII、醛固酮等.)的浓度。所述浓度可以以mol/L、mmol/ml、μgUIE/ml、ng/ml、pg/ml或任何其他浓度单位。
在一个实施方案中，高AA2R指示原发性醛甾酮增多症，且低AA2R指示没有原发性醛甾酮增多症。在一个实施方案中，与一个或多个确认的非-PHA受试者的AA2R相比高AA2R指示原发性醛甾酮增多症，和/或与一个或多个确认的PHA受试者的AA2R相比低AA2R指示没有原发性醛甾酮增多症。在一个实施方案中，与一个或多个确认的非-PHA患者的AA2R类似的AA2R指示没有原发性醛固酮增多症，和/或与一个或多个确认的PHA患者的AA2R相似的AA2R指示有原发性醛固酮增多症。在一个实施方案中，如上使用的术语“类似的”指各自比例(即AA2R)之间的差异小于100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％,或5％。
AA2R结果显示提高的阳性与阴性比例，如通过比较盐水输注试验(SIT)前后一个非-PHA高血压患者与高血压PHA患者所示(实施例1，图3)。在左图中，对于每个个体测试(ARR和AA2R)，测试结果与pre-SIT值有关且以百分比表示。根据ARR测试标准，PHA患者显然是阳性的，盐水输注试验(SIT)前后的血浆醛固酮水平分别为471pg/ml和548pg/ml，且产生的盐水输注试验(SIT)前后的ARR(醛固酮与PRC之比)分别为588.8和421.5(SIT前PRC∶0.8μgUIE/ml；PRCpostSIT:1.3μgUIE/ml)。非-PHA患者显示SIT前后的血浆醛固酮浓度分别为190pg/ml和64pg/ml，且SIT前后的ARR分别为19.2和16.4，根据测试标准其显然是阴性的(JohnW.Funderetal.；JClinEndocrinolMetab.September2008,93(9):3266-3281)。而且，测定特异性鉴别因子计算为诊断性能(或诊断效率)的量度，并比较ARR和AA2R(图3，右图)。鉴别因子用于比较通过用两个试验测量不同样品，其中一个是真阴性样品，且另一个是真阳性样品。鉴别因子代表真阳性信号和真阴性信号之间的比例。高鉴别因子指真阴性和真阳性样品之间的差异高，其意味着与用对于类似样品获得的较低鉴别因子试验相比更好的诊断性能。当将确认的PHA患者的pre-SIT(前-SIT)ARR值与确认的非-PHA患者的pre-SIT(后-SIT)ARR值相关联时，获得确认的非-PHA患者(真阴性)和确认的PHA患者(真阳性)之间30.7的鉴别因子。当通过ARR分析时，非-PHA和PHA患者之间的post-SIT鉴别因子为25.5。
令人惊奇地，通过AA2R分析来自相同两名患者的相同样品显示对于pre-SIT样品，鉴别因子为150.8，对于post-SIT样品，非-PHA和PHA患者之间鉴别因子为325.0(图3，右图)。我们得出结论使用AA2R代替ARR强烈增加了阴性信号和阳性信号之间的因子，导致诊断性能显著增加。
在本发明的一个实施方案中，一个或多个确认的PHA阳性受试者和一个或多个确认的PHA阴性受试者之间基于AA2R的值之比(即，鉴别因子)高于相同数据组之间基于ARR的值之比。因此，在一个实施方案中，一个或多个确认的PHA阳性受试者的AA2R和一个或多个确认的PHA阴性受试者的AA2R之间的比例高于相同数据组之间基于ARR的比例。换句话说，一个或多个确认的PHA阳性受试者的AA2R和一个或多个确认的PHA阴性受试者的AA2R之间的比例高于相同的一个或多个证实的PHA阳性受试者的ARR和相同的一个或多个证实的PHA阴性受试者的ARR之间的比例。
如本文使用的术语“鉴别因子”可以指一个或多个确认的PHA受试者(或确认的PHA阳性受试者的)的诊断参数(例如ARR或AA2R)与一个或多个确认的非-PHA受试者(或确认的PHA阴性受试者)的诊断参数(例如ARR或AA2R)之间的比例，或者指这种参数的一个或多个平均值，例如确认的PHA受试者群组的ARR或AA2R的平均值和确认的非PHA受试者群组的ARR或AA2R的平均值。因此，所述鉴别因子为一个或多个确认的PHA受试者的ARR与一个或多个确认的非-PHA受试者的ARR的比例，或一个或多个确认的PHA受试者的AA2R与一个或多个确认的非-PHA受试者的AA2R的比例。所述鉴别因子是相应诊断参数或试验的诊断性能(或诊断效率)的量度。所述比例越高，则诊断效率越高，并且假阳性和/或假阴性结果的风险越低。术语“确认的PHA受试者”指如下受试者：患有PHA，且已经通过常规方法(例如，测量ARR的第一次筛选试验，和至少一种测量ARR两次或三次或更多次的验证试验，任选地在SIT之前和之后)诊断为阳性，或通过根据本发明的方法(例如，不需要任何验证试验的AA2R测量)诊断为阳性，和/或甚至可以通过外科手术和/或成像技术(例如CT和/或肾上腺静脉样品)证实。术语“确认的非-PHA受试者”指如下受试者：未患有PHA，且已经通过常规方法(例如，测量ARR的第一次筛选试验，和任选地一种或多种测量ARR两次或三次或更多次的验证试验，任选地在SIT之前和之后)诊断为阴性，或通过根据本发明的方法(例如，不需要任何验证试验的AA2R测量或其它证实的测量比如例如成像技术)诊断为阴性。来自一个或多个“确认的非-PHA受试者”或来自一个或多个“确认的PHA受试者”的一个或多个样品可以在本发明的方法中用作与研究中的样品进行比较的正常对照，即来自一个或多个"确认的非-PHA受试者"的样品可用作阴性对照，和/或来自一个或多个"确认的PHA受试者"的样品可用作阳性对照。例如，与一个或多个确认的非-PHA受试者的AA2R相比高AA2R指示原发性醛甾酮增多症，和/或与一个或多个确认的PHA受试者的AA2R相比低AA2R指示没有原发性醛甾酮增多症。如果两种或多种样品用作阴性对照和/或阳性对照，则可以确定相应样品的平均值(即算术平均值)或中值。基于这样的对照样品或其值，可以确定鉴别阈(或截止值)，高于其的受试者被诊断为PHA阳性，且低于其的受试者被诊断为PHA阴性。这样的阈值也可以基于包括PHA阳性和PHA阴性受试者的患者群组中的AA2R值分布来确定。对于不同的患者群组可以分别确定阈值(例如，对于用不同的抗高血压药物治疗的患者组可以确定不同的阈值)。可用于确定阈值(或比较水平)的任一个上述参数可以单独或与一个或多个其它参数结合使用以获得最终阈值。
虽然本发明的方法可以不需要任何验证试验，如上所述，但是仍然可以进行验证试验(例如，如果医师或患者期望的话)。此外，本发明的方法本身可以用作验证试验，即，在用基于ARR的传统方法进行第一次筛选试验之后施用。
在一个实施方案中，如基于AA2R确定的一个或多个给定数据对或数据组(例如，与一个或多个疑似或确认的非PHA受试者相比较的一个或多个疑似或确认的PHA受试者，或与疑似或确认的非-PHA受试者群组的平均值相比较的一个或多个疑似或确认的PHA受试者群组的平均值)的鉴别因子高于如基于ARR、特别是筛选试验的ARR(即，第一次测量的ARR，和/或在任何验证试验之前的ARR)和/或基于验证试验ARR(即，第二次或进一步的ARR测量和/或在任何筛选试验之后的ARR)确定的相同数据对或数据组的鉴别因子。在一个实施方案中，如基于AA2R确定的一个或多个给定数据对或数据组(例如，与一个或多个疑似或确认的非PHA受试者相比较的一个或多个疑似或确认的PHA受试者，或与疑似或确认的非-PHA受试者群组的平均值相比较的一个或多个疑似或确认的PHA受试者群组的平均值)的鉴别因子高于、特别显著地高于如基于ARR、特别是筛选试验的ARR(即，第一次测量的ARR和/或在任何验证试验之前的ARR)和/或基于验证试验ARR(即，第二次或进一步的ARR测量和/或在任何筛选试验之后的ARR)确定的相同数据对或数据组的鉴别因子。在一个实施方案中，如基于AA2R确定的一个或多个给定数据对或数据组(例如，与一个或多个疑似或确认的非PHA受试者相比较的一个或多个疑似或确认的PHA受试者，或与疑似或确认的非-PHA受试者群组的平均值相比较的一个或多个疑似或确认的PHA受试者群组的平均值)的鉴别因子高于如基于ARR、特别是筛选试验的ARR(即，第一次测量的ARR，和/或在任何验证试验之前的ARR)和/或基于验证试验ARR(即，第二次或进一步的ARR测量和/或在任何筛选试验之后的ARR)确定的相同数据对或数据组的鉴别因子至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％。在一个实施方案中，如基于AA2R确定的一个或多个给定数据对或数据组(例如，与一个或多个疑似或确认的非PHA受试者相比较的一个或多个疑似或确认的PHA受试者，或与疑似或确认的非-PHA受试者群组的平均值相比较的一个或多个疑似或确认的PHA受试者群组的平均值)的鉴别因子高于如基于ARR、特别是筛选试验的ARR(即，第一次测量的ARR，和/或在任何验证试验之前的ARR)和/或基于验证试验ARR(即，第二次或进一步的ARR测量和/或在任何筛选试验之后的ARR)确定的相同数据对或数据组的鉴别因子至少50％、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍或十倍。
术语“疑似PHA受试者”指疑似患有PHA且还没有通过常规方法(例如，测量ARR的第一次筛选试验，和至少一种测量ARR两次或三次或更多次的验证试验，任选地在SIT之前和之后)诊断为阳性，或没有通过根据本发明的方法(例如，不需要任何验证试验的AA2R测量)诊断为阳性，或者之前已经诊断但还没有明确的结果和/或之前的诊断需要进一步证实的受试者。术语“疑似非-PHA受试者”指疑似未患有PHA且还没有被通过常规方法(例如，测量ARR的第一次筛选试验，和至少一种测量ARR两次或三次或更多次的验证试验，任选地在SIT之前和之后)诊断为阴性，或还没有通过根据本发明的方法(例如，不需要任何验证试验的AA2R测量)诊断为阴性，或者之前已经诊断但没有明确的结果和/或之前的诊断需要进一步证实的受试者。
在与AA2R和ARR之间的选择性和/或灵敏性比较之前，患者群组可以接受预选标准(例如∶最低血压、最低醛固酮水平、一些药物治疗)。例如，一些研究者进行基于ARR的筛选试验要求对于阳性筛选试验结果15ng/dl的最低醛固酮水平，其可导致与非预选的患者群组相比灵敏性和/或特异性改变。
在一个实施方案中，本发明的方法在定义的患者群组中的特异性等于或高于传统的ARR方法在相同患者群组中的特异性，特别是基于筛选试验的ARR(即，第一次的ARR测量，和/或在任何验证试验之前的ARR)。特异性可以以百分比给出，其中
在一个实施方案中，本发明的方法的特异性高于传统的ARR方法，特别地显著于高于传统的ARR方法。在一个实施方案中，特异性高于93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，所述方法的特异性为至少94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，所述方法的特异性为100％。
在一个实施方案中，本发明的方法在定义的患者群组中的灵敏性等于或高于传统的ARR方法在相同患者群组中的灵敏性，特别是基于筛选试验的ARR(即，第一次测量的ARR，和/或在任何验证试验之前的ARR)。
灵敏性可以以百分比给出，其中
在一个实施方案中，本发明的方法的灵敏性高于传统的ARR方法的灵敏性，特别是显著地高于传统的ARR方法。在一个实施方案中，所述方法的灵敏性为至少93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，所述方法的灵敏性高于93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一个实施方案中，所述方法的灵敏性为100％。
在一个实施方案中，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的所有确认的PHA受试者的具有比至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的所有确认的非-PHA受试者更高的AA2R。采用本发明的方法和试剂盒，有可能清楚地区分PHA和非-PHA受试者，因为PHA和非-PHA受试者的AA2R值分布的重叠度基本上低于PHA和非-PHA受试者的ARR值分布的重叠度。在一个实施方案中，所所述重叠为10％或更小、9％或更小、8％或更小、7％或更小、6％或更小、5％或更小、4％或更小、3％或更小、2％或更小、1％或更小。
疑似患有PHA的受试者通常接受抗高血压治疗。例如，在进行PHA诊断时，受试者已经接受和/或接受一种或多种药物组合物(本文也称为药物)或治疗，特别是抗高血压药物组合物和/或治疗。抗高血压治疗干扰ARR试验代表一种诊断高血压患者中的PHA的公知的障碍。顽固性高血压患者代表PHA高风险组，并根据定义同时使用至少三种抗高血压药物治疗，但仍然具有病理性升高的血压。已知许多临床使用的抗高血压药物对肾素和醛固酮水平具有影响，但是对肾素的影响通常强于对醛固酮的影响，这引起ARR实验结果不可预测的变化，导致假阴性和假阳性诊断判定(JohnW.Funderetal.；JClinEndocrinolMetab.September2008,93(9):3266-3281)。
一种临床应用中广泛使用的抗高血压剂是RAS阻断剂组。RAS阻断剂干扰RAS以降低AngII的水平(例如肾素抑制剂、ACE抑制剂)或阻断AngII在AT1-受体的作用(例如，血管紧张素-受体-阻断剂，ARB)。除了RAS阻断剂之外，RAS活化剂可以用作抗高血压剂。例如，可以给药ACE2以治疗高血压，如例如在WO2004/000367和WO2008/151347中所述的。
影响(特别是提高)肾素活性和/或肾素浓度的药物和/或治疗影响(特别是降低)ARR。这样的药物和/或治疗降低ARR的诊断效率。用单一剂量的不同抗高血压剂(实施例2)治疗5名健康志愿者引起活性血浆肾素浓度的增加非常显著，3至10-倍(图4)。这些药物诱导的活性肾素浓度的变化深刻地影响这些个体中的ARR。
给药单剂量的ACE抑制剂(10mg依那普利)、肾素抑制剂(150mg的阿利吉伦(Aliskiren))或ARB(50mg氯沙坦)引起ARR高度显著地且深度的降低(图5，上图)，这导致在这些抗高血压药物的存在下ARR诊断效率强烈降低。由抗高血压治疗引起的低ARR值导致假阴性结果。与ARR相反，大多数抗高血压药物不会显著地影响AA2R，除了ARB(图5，下图)之外。药物给药前后AA2R的比较显示无论是给药ACE还是给药肾素抑制剂都不会导致AA2R显著变化，但ARR响应药物治疗而显著降低。ARB防止AngII结合AT1受体，因此导致AngII蓄积和活性肾素浓度增加，其是导致AA2R显著降低的唯一药物，而ARR受测试的每种抗高血压药物压药物的显著影响。
肾素活性和/或肾素浓度经由多种生理调节机制控制。任何干扰这种调节机制的药物均可能影响肾素活性和/或浓度。例如，利尿剂是常见类型的抗高血压药物，其通过增强利尿而降低血压。增强利尿导致肾素活性和/或浓度增加。因此，用利尿药治疗受试者降低了ARR。临床使用的利尿剂的实例为呋塞米(furosemide)、托拉塞米(torsemide)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、乙酰唑胺(azetazolamide)、醋甲唑胺(methazolamide)、依普利酮(eplerenone)、螺内酯(spironolactone)、阿米洛利(amiloride)和氨苯喋啶(triamterene)。
对于肾素活性和/或浓度的作用也可以通过阻断肾素下游的RAS级联的一个或多个步骤间接介导。
例如，ACE抑制剂阻断AngI向AngII的转化与ARR相关，因为其经由生理补偿机制引起肾素活性和/或浓度增加。这对于肾素有影响，因此，ARR也可以是其他药物干扰RAS的酶催化反应的情形，比如由氨基肽酶将AngI转化为Ang2-10，和/或由ACE2将AngI转化为Ang1-9。因此，影响一个或多个这些RAS步骤的一种或多种药物损害了基于ARR的诊断，并且导致假阳性和/或假阴性结果。因此，用基于ARR的方法诊断的受试者可能没有用一种或多种这样的药物或治疗进行治疗。
与基于ARR的方法相反，本发明的方法也可以施用于如上所述用一种或多种这样的影响RAS的药物和/或治疗处理的受试者，例如用导致ARR的诊断效率降低的一种或多种药物或治疗(比如例如ACE抑制剂、ACE2、肾素抑制剂等)治疗的受试者。特别地，本发明的方法也可以施用于用影响(特别是提高)肾素活性和/或浓度的试剂治疗的受试者，即，本发明方法与影响(特别是提高)肾素活性和/或浓度的这种治疗无关。在一个实施方案中，用一种或多种降低ARR的诊断效率的药物组合物治疗受试者。在一个实施方案中，用一种或多种降低ARR的诊断效率的药物组合物治疗受试者，并且所述治疗既不会降低AA2R的诊断效率也不会降低AA2R的诊断效率至更小的程度。
在一个实施方案中，受试者在接受治疗，例如，已经接受和/或接受一种或多种药物组合物或治疗。在一个实施方案中，受试者在诊断时接受所述治疗，例如，当测量AA2R时和/或从受试者采集样品时。在一个实施方案中，所述治疗是RAS干扰治疗，例如给药一种或多种干扰RAS或影响RAS的药物组合物。在一个实施方案中，受试者接受抗高血压治疗。
然而，在一个实施方案中，受试者没有用一种或多种影响AngII和醛固酮分泌之间的生理性连接(physiologiclink)(特别是经由AT1受体的信号传导)的药物组合物和/或治疗(比如例如ARB)进行治疗。因此，在本发明的一个实施方案中，受试者没有用血管紧张素受体阻断剂(ARB)进行治疗。在一个实施方案中，所述方法与一种或多种除了用血管紧张素受体阻断剂(ARB)治疗之外的抗高血压治疗受试者无关。
在一个实施方案中，受试者接受除了ARB之外的抗高血压治疗。在一个实施方案中，受试者接受除了影响醛固酮水平的药物组合物(但不排除对于醛固酮水平的AngII和/或肾素介导的影响)之外的抗高血压治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种增加肾素浓度和/或活性的药物组合物治疗。在一个实施方案中，受试者接受除了ARB之外和除了影响醛固酮水平的药物组合物(但不排除引起AngII介导的对醛固酮水平影响的组合物)之外的抗高血压治疗。
在一个实施方案中，如本文使用的术语“用...治疗”(或“没有用...治疗”)或“接受用...治疗”指在诊断时，例如当测量AA2R和/或从受试者采集样品时，用(或没有用)相应的一种或多种药物和/或治疗进行治疗的受试者(或患者)。所述诊断可以是一步诊断，比如例如在一个时间点测量AA2R，或第一次诊断或任何其它诊断，包括验证试验。在一个进一步的实施方案中，在诊断时和诊断前的某一时期，受试者用(或没有用)所述药物或治疗进行治疗。在一个实施方案中，所述时期为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和/或14天。
如本文使用的术语“影响”将指参数，比如例如活性、水平或比例受(或不受)影响、改变或变化，例如增加或降低。特别地，参数基本上受(或不受)影响。在一个实施方案中，参数受(或不受)影响超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个实施方案中，如果一个参数比另一个受(或不受)影响或多或少，则该参数比其它参数受(或不受)影响多至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个实施方案中，参数增加(或没有增加)超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一个实施方案中，参数降低(或没有降低)超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
影响ARR和/或AA2R的另一类抗高血压药物或治疗的代表是影响(特别是基本上和/或直接影响)醛固酮水平的药物组合物或治疗，例如影响醛固酮的生物合成、半衰期和/或降解，导致血浆醛固酮水平改变的药物组合物。因此，经由影响血浆醛固酮水平而改变ARR和/或AA2R的这种药物或治疗也可以从治疗用本发明的方法诊断的受试者中排除。特别地，从根据本发明的方法排除以在这种治疗下AA2R的诊断效率比在相同治疗下ARR的诊断效率更低的方式影响AA2R的药物或治疗。因此，在一个实施方案中，受试者可以用一种或多种除了ARB和/或影响醛固酮生物合成、半衰期和/或降解的药物之外的抗高血压药物或治疗进行治疗。
由于影响AngII的药物或治疗(例如ACE抑制剂)可以影响醛固酮水平，因为为了避免引起疑问，应当明确不必排除经由降低AngII的水平且因此降低其对AT1受体的作用和引起醛固酮分泌减少的这种药物或治疗。
例如，治疗性给药ACE抑制剂卡托普利导致AngII水平降低，同时肾素水平提高。因此，ACE抑制剂治疗引起醛固酮水平降低和肾素活性和/或浓度增加。这样的治疗基本上不会降低或将甚至提高AA2R的诊断效率，但是将降低ARR的诊断效率，因此，不必从本发明的方法中排除且实际上是本发明的优选的实施方案。
只有如下那些药物组合物和/或治疗可以被从根据本发明的方法排除：其以AA2R的诊断效率低于在类似的治疗条件下ARR的诊断效率的方式((以由AA2R测试的已知数据队的鉴别因子低于由ARR测试的类似数据对的鉴别因子的方式)影响或改变AA2R。
因此，在一个实施方案中，受试者用一种或多种降低ARR的诊断效率但没有降低AA2R的诊断效率的药物组合物治疗，或受试者用一种或多种降低ARR和/或AA2R的诊断效率、但以AA2R的诊断效率仍然高于ARR的诊断效率的方式(其可以由较高的鉴别因子、特异性和/或选择性指示)作用的药物组合物治疗。
在诊断时和/或在诊断前，受试者可接受或可不接受一种或多种治疗，包括抗高血压治疗(即，受试者可以接受治疗例如抗高血压治疗)。在与ARR相比，这种治疗下AA2R的诊断效率较低的情况下，受试者可以不接受一种或多种这种治疗，或者需要停止这种治疗且在基于AA2R诊断之前有这种治疗的清除期，如本文进一步描述的。在一个实施方案中，用本发明的方法诊断的受试者可以用一种或多种药物组合物和/或治疗进行治疗，除了降低AA2R的诊断效率使得其比在类似的治疗下ARR的诊断效率更低的那些治疗。在一个实施方案中，所述方法与受试者的一种或多种治疗无关(特别是与一种或多种抗高血压治疗无关)，除了用血管紧张素受体阻断剂(ARB)和/或影响醛固酮的生物合成、半衰期和/或降解的药物治疗之外。
在一个实施方案中，用本发明的方法诊断的受试者可以用一种或多种不会影响醛固酮和/或AngII的药物组合物治疗。在一个实施方案中，受试者可以用一种或多种不会显著地影响醛固酮和/或AngII的药物组合物和/或治疗进行治疗。在一个实施方案中，受试者可以不影响AA2R的一种或多种药物组合物和/或治疗进行治疗。在一个实施方案中，受试者可以用不显著地影响AA2R的一种或多种药物组合物和/或治疗进行治疗。在一个实施方案中，受试者可以用一种或多种影响AA2R的一种或多种给定参数(即，AngII和/或醛固酮水平)和/或其比例(即，AA2R)不超过5％、10％、15％或20％的药物组合物和/或治疗进行治疗。例如，用本发明的方法诊断的受试者可以用一种或多种单独和/或组合引起基于AA2R的鉴别因子(仍然)高于基于ARR的鉴别因子的抗高血压治疗(例如，用一种或多种RAS抑制剂)进行治疗。
用抗高血压药物治疗甚至可以增加AA2R，其可以导致鉴别阈变化。在本发明的另一个实施方案中，受试者用一种或多种增加AA2R的药物或治疗进行治疗。
如本文所述的，本发明的方法的一个重要的优点是AA2R比ARR更不易于受抗高血压治疗的干扰。换句话说，ARR比AA2R受到更多抗高血压药物和/或治疗的影响(并且甚至显著地改变)。即使AA2R可能受抗高血压治疗的影响，但是本发明的方法提供了在抗高血压治疗下优于ARR的改善的AA2R的诊断效率，如更高的鉴别因子所指示的。只有那些可以从基于AA2R的诊断(如在上述实施方案中所述的)排除的所定义的药物组合物和/或治疗可以在诊断之前从受试者的血液系统清除。因此，受试者可以中止这样的药物和/或治疗，或者所述一种或多种药物组合物和/或治疗可以用其它合适的药物组合物和/或治疗，特别是不会(或不会显著地)影响AA2R的其它抗高血压药物组合物和/或治疗来代替。
为了避免引起疑问，如果提及一种或多种药物组合物和/或治疗的作用，或提及影响(或不影响)参数和/或比例的一种或多种药物组合物和/或治疗，则其指该作用是由单独的一种药物组合物或治疗、或两种或多种药物组合物和/或治疗的组合产生的(或不是由其产生的)，即所述一种或多种药物组合物和/或治疗单独或组合产生(或不产生)所述作用。
在一个实施方案中，受试者用改变ARR的一种或多种药物或治疗进行治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种降低ARR的诊断效率的药物组合物治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种降低ARR的诊断效率、但不会降低AA2R的诊断效率、或降低AA2R的诊断效率比降低ARR的诊断效率的程度更小的药物组合物治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种增加ARR的诊断效率、但更大程度地增加AA2R的诊断效率的药物组合物治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种增加AA2R的诊断效率的药物组合物治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种引起AA2R的诊断效率比ARR的诊断效率更高的药物组合物治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种选自肾素抑制剂、ACE抑制剂、ACE2、利尿剂和/或钙通道阻滞剂、或其组合的药物组合物治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种ACE抑制剂治疗。在另一个实施方案中，受试者用一种或多种肾素抑制剂治疗。
在一个实施方案中，所述治疗和/或药物组合物影响ARR的一个或多个参数(即，肾素浓度和/或活性和/或醛固酮水平)和/或其比例(即，ARR)超过5％、10％、15％或20％。在一个实施方案中，所述治疗和/或药物组合物影响ARR的一个或多个参数(即，肾素浓度和/或活性和/或醛固酮水平)和/或其比例(即，ARR)超过5％、10％、15％或20％，但影响AA2R的给定参数(即，AngII和/或醛固酮水平)和/或其比例(即，AA2R)不超过5％、10％、15％或20％。在一个实施方案中，受试者没有用一种或多种与ARR相比降低AA2R的鉴别因子的药物或治疗进行治疗。在一个实施方案中，受试者用一种或多种改变ARR但未改变AA2R的药物或治疗进行治疗。
本领域技术人员可以容易地确定治疗是否影响用于诊断的一个或两个参数(例如，对于基于ARR诊断而言肾素水平和/或肾素活性、和/或醛固酮水平，和对于根据本发明的基于AA2R的诊断而言AngII和/或醛固酮水平)。例如，对于许多市售的抗高血压治疗，其对于RAS和/或一种或多种其组分的作用描述在文献中(参见，例如Funderetal.的表4，如上引用的)。此外，可以用标准方法确定所述作用，例如在治疗前和治疗期间或治疗后测量生物样品中一种或多种参数的水平或使用统计方法比较不同治疗的患者组。可选地或此外，这样的治疗作用可以由RAS指纹分析确定，即测量一种或多种RAS组分的水平，特别是处于稳态平衡下，如上和WO2013/182237中所述。
可以如本文或现有技术所述确定诊断效率。因此，本领域技术人员可以容易地确定ARR和AA2R的诊断效率，并比较这两种诊断效率。
在一个实施方案中，所述治疗包括给药除了ARB之外的至少一种影响肾素-血管紧张素系统(RAS)的药物组合物。在一个实施方案中，所述治疗包括给药除了影响醛固酮水平(但没有排除对醛固酮水平的AngII介导的作用)的药物组合物之外的至少一种影响肾素-血管紧张素系统(RAS)的药物组合物。在一个实施方案中，所述治疗包括给药除了ARB之外和除了影响醛固酮水平(但没有排除对醛固酮水平的AngII介导的作用)的药物组合物之外的至少一种影响肾素-血管紧张素系统(RAS)的药物组合物。在一个实施方案中，影响肾素-血管紧张素系统(RAS)的药物组合物直接地或间接地影响(或干扰)RAS。在一个实施方案中，影响(或干扰)肾素-血管紧张素系统(RAS)的药物组合物是直接地或间接地影响(或干扰)肾素表达和/或活性的组合物。这样的RAS干扰药物可包括一种或多种N-或C-末端ACE抑制剂、肾素抑制剂、氨基肽酶抑制剂、和/或影响RAS酶的表达和/或内源性分泌到循环中的其它化合物。在一个实施方案中，影响RAS的药物可以包括赖诺普利(lisinopril)、卡托普利(capropril)、阿利吉伦(aliskiren)、阿吗他定(amastatin)、血管紧张素转换酶2(ACE2)、中性肽链内切酶(也称为neprilysin，NEP)、和/或影响内源性RAS酶的表达和/或分泌的其它化合物、和/或其组合。在一个实施方案中，所述治疗也可以包括特定饮食，例如少盐饮食、和/或DASH饮食(DietaryApproachestoStopHypertension)。然而，至少一个用于目前基于ARR的PHA诊断的参数通常受一种或多种这种治疗的影响。
与ARR相反，AA2R不受大多数抗高血压治疗，特别是RAS阻断剂治疗的影响。在用RAS阻断剂治疗期间，因为众所周知的由AngII缺乏诱导并导致肾素分泌的调节反馈机制，肾素增加。AngII抑制进一步导致血管紧张素依赖性醛固酮分泌减少，其引起AA2R保持稳定，同时由于肾素增加而ARR下降。
例如，当比较未治疗的患者和接受ACE抑制剂治疗的患者(图2，中图)之间的PRA时，我们可以证实ACE抑制剂治疗与肾素活性和浓度增加相关。由于响应于ACE抑制剂治疗，肾素活性和浓度增加，ARR不适于筛查接受这种治疗的患者，因为ARR强烈降低，同时肾素增加，导致假阴性实验结果数较高，且因此测定灵敏性降低。由于PHA筛选主要在高血压患者中进行，因此，用抗高血压药物干扰是非常常见且熟知的(JohnW.Funderetal.；JClinEndocrinolMetab.September2008,93(9):3266-3281)。之前解释的药物干扰提高了验证试验的必要性，验证试验目的是提高试验性能，但是显然施加给患者显著的心血管风险，因为抗高血压药物必须在验证试验之前停用几周，其导致可以引起致命性心血管事件如中风和心力衰竭的重度高血压。
一种非常常见的PHA验证试验是上述生理盐水灌注试验。ARR试验用于证实在这些定义的条件下的PHA，其旨在提高ARR测定性能和诊断效率(JohnW.Funderetal.；JClinEndocrinolMetab.September2008,93(9):3266-3281)。
例如，受试者的通常治疗和影响ARR(即，目前诊断参数)描述在上述引用的Funderetal.2008的临床实践指导方针中。而且，醛固酮水平和肾素水平都可能受这种治疗的影响。因此，ARR试验导致假阳性和/或假阴性结果，造成不适合的治疗。在许多情况下，两个参数(即，肾素水平和醛固酮水平)甚至受到相反的影响，其将极度歪曲所述比例并因此歪曲诊断结果。然而，除了影响醛固酮水平的药物组合物(但不排除AngII介导的对醛固酮水平的影响)之外，和除了用血管紧张素受体阻断剂(ARB)治疗之外，本发明的方法与这样的治疗无关。这类抗高血压药(ARB)直接结合AT1-受体，因此阻止了AngII信号传导。前述解释的反馈机制引起肾素浓度和活性增加，导致AngII蓄积。这将人为降低AA2R，在将来使用AA2R进行PHA实验时必须考虑这一点。然而，在测量AA2R之前，使用ARB的患者可以容易地改变为另一种RAS阻断剂如ACE抑制剂。可选地，在施用本发明的诊断方法之前，可以清除一种或多种ARB和/或一种或多种影响醛固酮水平(但不排除AngII介导的对醛固酮水平的影响(如上进一步所述))的药物组合物。
在一个实施方案中，测量血管紧张素II的稳态平衡水平。如本文使用的术语“稳态平衡”(SSE)或“SSE方法”或“平衡水平”或“平衡浓度”指生物样品(特别是血样或来源的样品)中蛋白水解级联(例如RAS)的至少一种肽降解产物(例如，AngII)的测量，其中培养所述样品直到所述至少一种参与所述蛋白水解级联的肽降解产物达到稳态平衡，并且其中对样品中处于稳态平衡浓度(或平衡浓度)的所述至少一种肽降解产物定量。特别地，如本文使用的术语“稳态平衡”(SSE)指至少一种参与蛋白水解级联的肽降解产物的实际总降解速率等于所述肽降解产物的实际总形成速率，从而产生所述肽降解产物的稳定浓度，即在某一时期基本上不会变化的稳态平衡肽浓度，如下进一步说明的。在所述稳态平衡中，肽降解产物的实际总形成速率定义为参与所述肽降解产物形成的所有酶的实际更新率的总和，即所述肽降解产物是所述酶的直接产物。肽降解底物的实际总降解速率定义为参与所述肽降解产物降解的所有酶的实际更新率的总和，即所述肽降解产物是所述酶的直接产物。稳态平衡进一步描述在WO2013/182237中。
如本文使用的术语“实际的”指在如样品中存在的条件下，肽(比如AngII)的实际(或有效)形成速率或降解速率，或酶(比如ACE，ACE2和/或氨基肽酶)的实际或有效的更新率。
如本文使用的术语“等于”指在至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟的时期内，由任何这种相等的所述肽的形成速率或降解速率产生的肽浓度(“稳态平衡肽浓度”或“稳态平衡肽水平”)，或由任何这种相等的至少两种参与所述肽的形成或降解的酶的更新率产生的肽浓度(“稳态平衡酶更新率”)的变化不会超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。因此，参与所述肽降解的酶的实际总更新率由它们的底物肽的实际总形成速率决定，以至于任何新形成或另外形成的底物都被降解。然而，这并不一定指所述肽的净浓度为0，但是处于稳态平衡的样品中存在的净浓度没有显著地改变，如上进一步所述。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述蛋白水解级联(例如RAS)的至少一种肽降解产物(例如AngII)的浓度在稳态平衡时期保持在一个恒定的范围内，尽管形成和降解持续流动。在本发明的一个实施方案中，在至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟的时期内，所述至少一种肽降解产物在稳态平衡下的浓度变化不会超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施方案中，在60分钟之内，所述至少肽降解产物在稳态平衡下的浓度变化不会超过15％、或不超过10％。因此，在上述给定时期内，所述肽既不会显著地蓄积，也不会显著地减少。
在一个实施方案中，在对样品中处于稳态平衡浓度的至少一种肽降解产物(特别是AngII)定量之前，将样品培养至多15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或至多300分钟。在另一个实施方案中，样品可以培养超过6小时，特别地至多8小时、12小时、18小时、24小时或至多48小时。合适的培养时期主要取决于给定的蛋白水解级联、待定量的肽分析物、样品的性质和培养参数。这样的培养时期可以容易地由本领域技术人员确定。在一个实施方案中，在培养之后保存(或稳定或冷冻或淬灭)稳态平衡。如本文使用的术语“保存(conserved)”、“稳定”、“冷冻”或“淬灭”将指保存生物化学状态，例如保存肽水平，例如通过抑制蛋白水解降解来实现。稳态平衡肽水平(或体内肽水平)的稳定可以通过加入一种或多种蛋白酶抑制剂，特别是加入蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)来进行。因此，在培养直到至少一种肽降解产物(特别是AngII)达到稳态平衡之后，可以加入一种或多种蛋白酶抑制剂。合适的蛋白酶抑制剂或其组合可以由本领域技术人员选择，并且可以包括特异性或非特异性酶抑制剂的组合或其组合。一种或多种蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物确保特别地感兴趣的级联的蛋白水解步骤(即，待测量的形成和降解肽的酶，即AngII)或所述蛋白水解级联的每个酶被完全抑制。
在一个实施方案中，蛋白水解级联的每个步骤都被抑制，即参与蛋白水解级联的每个酶都被所述蛋白酶抑制剂混合物的至少一种组分所抑制。在另一个实施方案中，蛋白酶抑制剂混合物包括至少一种参与所述蛋白水解级联的每个种类蛋白酶的特异性或非特异性抑制剂。蛋白酶抑制剂混合物可以包括一种或多种抑制参与所述蛋白水解级联的一种或多种酶的抑制剂。RAS的这种抑制剂的实例为赖诺普利(ACE抑制剂)和阿利吉伦(肾素抑制剂)。蛋白酶抑制剂混合物也可包括一种或多种抑制一组或多组参与蛋白水解级联的酶的抑制剂，比如例如乙二胺四乙酸(EDTA，抑制金属蛋白酶)。而且，蛋白酶抑制剂混合物可以包括一种或多种非特异性抑制剂。在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂混合物包括至少两种前述种类的抑制剂的组合。在另一个实施方案中，蛋白酶抑制剂混合物包括一种或多种饲用酶(feedingenzyme)的抑制剂，特别是饲用酶的特异性抑制剂。
例如，将至少两种、至少三种或至少四种蛋白酶抑制剂加入到样品中。在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂混合物包括胃酶抑素A、1,10-菲咯啉、EDTA、对-羟基汞基-苯甲酸和肾素抑制剂肽Z-Arg-Arg-Pro-Phe-His-Sta-Ile-His-Lys(Z-Arg)。
可选地，或除了使用一种或多种蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物之外，可以通过加入一种或多种离液剂(chaotropicagents)保存稳态平衡，所述离液剂为比如碘化钠、高氯酸钠、高氯酸锂、氯化镁、硫氰酸胍(GTC)、氯化胍鎓盐(guanidiniumchloride)、苯酚、丙醇、丁醇、乙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、脲等。
可选地，或除了使用一种或多种蛋白酶抑制剂或蛋白酶抑制剂混合物之外，可以通过样品中酶的其他物理灭活方法保存稳态平衡，例如通过加热、盐、pH或洗涤剂诱导酶变性；或通过冷却，例如在培养之后将样品直接放置在冰上。对于样品的一个或多个其它加工步骤，例如血浆或血清分离和通过固相萃取(SPE；例如对于基质消耗和/或肽富集)分离，也可以选择相应的环境温度以确保样品中的所有酶都是非活性的。例如，在样品分析之前的任何样品预处理或样品加工都可以在4℃的环境温度(或更低)下进行，至少达到参与蛋白水解级联的酶完全变性或灭活(例如，直到从SPE柱或柱体洗脱)。
相反，典型的血浆肾素测定(PRA)旨在在采集样品之后立即完全抑制血管紧张素I(AngI)的降解途径，并且基于所述酶形成的肽的蓄积速率计算酶活性。即使在这样的PRA测定中AngI降解途径的抑制可以不完全，但是它们仍然远非根据本发明的任何稳态平衡，因为AngI的净浓度随时间显著变化。在例如Bystrometal.(Clin.Chem.56(2010),1561-1569)所述的PRA测定中，AngI浓度随时间显著地增加。而且，现有技术的测定通过基于酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫分析(RIA)方法测量血浆样品中肾素的构象活化形式来寻求评价RAS的总活性(DRGDiagnostics,http://www.drg-diagnostics.de/49-1-DRG+Renin+active+ELISA.html)。与如上所述的SSE测量相反，这些测定关键取决于所使用抗体的特异性且允许关于样品中效应肽的浓度没有结论，所述效应肽负责RAS生理作用。其原因是其中存在多种影响效应肽的水平的多种酶。可以通过SSE测量同时评价所有这些肽，而现有技术的测定仅集中于每个样品中的一种酶活性或浓度。
在本发明的一个实施方案中，处于稳态平衡下，饲用酶的实际更新率最大，即进料底物(feedingsubstrate)以比饲用酶相比巨大摩尔过量存在，并且任何加入的外部进料底物都不会进一步提高所述饲用酶的实际更新率。因此，蛋白水解级联的饲用酶是负责饲料转化反应的酶，即随后蛋白水解级联的限速步骤(或蛋白水解级联的瓶颈(bottleneck))。对于在生理条件下的RAS蛋白水解级联，饲用酶是肾素，其负责血管紧张素原转化成血管紧张素I。在生理系统中(例如，在体内、血液中、血浆或血清样品中)，作为肾素底物的血管紧张素原以肾素的巨大摩尔过量存在。然而，在本发明的一个实施方案中，RAS蛋白水解级联的一种或多种或所有其它酶，比如例如氨基肽酶(AP)、特别是氨基肽酶A(APA)和/或氨基肽酶N(APN)、二肽基氨基肽酶(DAP)、羧肽酶(特别是ACE2)、二肽基羧肽酶(特别是ACE)和/或内肽酶(特别是中性肽链内切酶，也称肾胰岛素残基溶酶(neprilysin))，以足够降解任何新形成的或另外形成的底物的浓度存在于样品中，允许在培养期间建立所述酶和肽的稳态平衡，即其实际的总更新率由其底物肽的实际总形成率决定。
根据本发明，术语“饲用酶”将指具有最大实际更新率的酶，即具有所述酶在样品中的最大可达更新率的实际更新率的酶。术语“最大可达更新率”将指样品中包含的酶的更新率，其可以在样品中在给定条件下获得，如果底物肽以与酶相比巨大摩尔过量(或实际上用不完的量)存在(或将存在)，则至少直到达到稳态平衡。因此，通过加入外部底物不能进一步提高饲用酶的实际更新率，因为进料底物已经以与饲用酶相比巨大摩尔过量存在。如果例如，在培养达到稳态平衡之前或期间，将任何外部底物肽(即，参与蛋白水解级联的肽)或这种底物的类似物加入到样品中，则根据本文的定义，这可导致蛋白水解级联的限速步骤变化，且因此，如果加入到底物肽的量足够导致至少一种参与所述底物肽降解的酶(即，在生理条件下不同于饲用酶的酶)的最大可达更新率，这也可导致蛋白水解级联的饲用酶变化。例如，如果研究中的蛋白水解级联是RAS，并且如果在培养达到稳态平衡之前或期间，将与一种或多种或所有参与AngII降解的酶相比巨大摩尔过量的AngII(或其类似物，例如载有物质标记或包括氨基酸交换的任何共价修饰的AngII)加入在样品中，则至少一种或甚至所有参与AngII降解的酶(例如，ACE2、AP和/或DAP)都将达到最大可达更新率，且因此都变成所述级联的后续蛋白水解反应的限速进料步骤(feedingstep)。
在本发明一个实施方案中，可以将饲用酶加入到样品中。加入饲用酶增加了酶级联的流通过，因此，导致肽的绝对水平增加，同时相对水平(肽比例)保持未变。因此，一种或多种肽的稳态平衡水平仍然反映生理学情况(即酶活性)，然而，总肽水平按比例增加。例如，如果在没有加入饲用酶下测量的肽水平低于用于定量肽的方法的检出限，则这将是有用的。任选地，也可以加入进料底物。这可以确保进料底物与饲用酶相比是且保持摩尔过量，并且进料底物仍然以实际上用不完的量存在，导致对于定义稳态平衡的一定时间饲用酶的更新率是稳定的，即使加入饲用酶。
在一个实施方案中，所述蛋白水解级联是RAS，并且要分析的肽是AngII。在所述实施方案中，所述AngII降解酶处于稳态平衡下的实际更新率等于ACE的实际更新率，其为AngII形成酶，只要在样品中一种酶催化的AngII降解通路是“开放的”，即仅仅一种AngII降解酶是活性的。如果在样品中超过一种AngII降解酶是活性的，则在所述实施方案中，所述活性AngII降解酶的实际更新率总和(即，AngII的实际总降解速率)等于ACE的实际更新率(即，实际总AngII形成速率)。
因此，肽例如AngII和相关酶(即，形成或降解所述肽的酶(例如AngII))达到稳态平衡。如上所述，如果在至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟的时期内，至少一种肽(特别是AngII)、两种或多种肽、或参与蛋白水解级联的所有肽的净浓度的变化不超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％，则达到稳态平衡。在培养样品15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟,210分钟、240分钟、270分钟或300分钟、或8、12、18、24或48小时之后，达到稳态平衡。稳态平衡持续至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟。
在本发明的一个实施方案中，处于稳态平衡下，至少一种参与蛋白水解级联的肽(例如AngII)的总最大可达降解速率等于或高于其实际总形成速率。根据本发明，肽的最大可达降解速率是在与降解所述肽的每种酶相比巨大摩尔过量的所述肽(或，实际上用不完量的所述肽)的存在下(即，通过加入外部肽)，在给定条件下可以获得的总降解速率。因此，肽的最大可达降解速率是参与所述肽降解的所有酶的最大可达更新率的总和。
在一个实施方案中，除了蛋白水解级联的饲用酶之外，在培养时间开始时，参与蛋白水解级联的所有酶的量超过其相应底物的量。在另一个实施方案中，除了蛋白水解级联的饲用酶之外，在整个培养时期期间，所述一种或多种酶或参与蛋白水解级联的所有酶的量超过其相应底物的量。
在另一个实施方案中，将如上所述条件(即，酶的量超过相应底物的量，和/或肽的形成速率等于稳态平衡中降解速率)至少施用于要分析的一种或多种肽(例如AngII)和/或形成或降解要分析的所述肽(例如AngII)的相应酶。
例如，如果本发明的SSE方法用于检验RAS蛋白水解级联的组分，并且要分析的肽是AngII，则这指直到达到稳态平衡，由ACE形成AngII的实际速率高于参与AngII降解的所有酶(包括但不限于ACE2、AP和/或DAP)的实际降解速率的总和。因此，AngII浓度增加，即AngII蓄积，直到达到稳态平衡。当达到稳态平衡时，AngII的实际形成速率等于参与AngII降解的所有酶的实际更新率(AngII的实际总降解速率)。
因此，在本发明的稳态平衡的一个实施方案中，对于要分析的肽例如AngII，至少一种蛋白水解降解反应必须例如被活化或“开放”至其允许实际总降解速率等于所述肽的实际总形成速率的程度，即没有被抑制或“关闭”，例如通过使用一种或多种蛋白酶抑制剂被活化或"开放"至实际总形成速率超过所述肽的实际或最大可达总降解速率的程度。
在一个实施方案中，在培养直到达到平衡之前和/或期间，没有加入例如EDTA、乙二醇四乙酸(EGTA)、8-羟基喹啉、菲咯啉和二巯基丙醇(也称为British-anti-Lewisite或BAL)，特别地不是针对RAS级联或其中金属蛋白酶参与的其它蛋白水解级联，因为螯合剂通过螯合二价离子对于金属蛋白酶具有抑制作用。
在一个实施方案中，在培养达到稳态平衡之前和/或期间，没有加入离液剂比如例如碘化钠、高氯酸钠、高氯酸锂、氯化镁、硫氰酸胍(GTC)、氯化胍鎓盐(guanidiniumchloride)、苯酚、丙醇、丁醇、乙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、脲和/或其它离液剂。
在一个实施方案中，在生理条件下所述蛋白水解级联达到稳态平衡，其指在培养达到稳态平衡之前和/或期间，所述蛋白水解级联的组分(酶和底物或产物肽)、如在从体内采集的生物样品中存在的其全部量和/或相对量以及关于组合物的基质和/或样品pH没有或基本上没有进行修饰。在一个实施方案中，在培养达到稳态平衡之前和/或期间，如从体内采集的生物样品中存在的参与蛋白水解级联的酶和/或肽的浓度没有进行修饰。
在另一个实施方案中，在培养达到稳态平衡之前和/或期间，没有加入参与所述蛋白水解级联的任何酶的底物或底物类似物，比如内标准品或降解标准品，无论是以它们的天然形式还是通过标记修饰(例如，同位素和/或荧光标记、和/或氨基酸修饰或至少一种氨基酸交换)。在本发明的一个实施方案中，所述蛋白水解级联为RAS，并且在培养达到稳态平衡之前和/或期间，既没有加入血管紧张素原、血管紧张素I和/或AngII，也没有加入其任何类似物。
在另一个实施方案中，在培养达到稳态平衡之前和/或期间，没有加入其他物质或试剂，比如例如缓冲物质(Tris、PBS、MES、HEPES、柠檬酸盐、硼酸盐、碳酸盐或碳酸氢盐(或重碳酸盐)和/或其他缓冲物质或相应的缓冲溶液)。
在仍然另一个实施方案中，在培养达到稳态平衡之前和/或期间，没有加入其他物质或试剂，比如例如EDTA、EGTA、PMSF、AEBSF、BSA、马来酸、马来酸酐、甲酸和/或水(以任何形式，例如，去离子的和/或蒸馏的等)。
然而且尽管前述，一旦达到稳态平衡可以加入一种或多种这种前述的蛋白酶抑制剂、螯合剂、离液剂、底物、标准品、BSA、缓冲剂和/或其它物质或试剂，且任选地淬灭。
特别地，一旦达到稳态平衡，可以加入一种或多种标准品例如内标准品和/或降解标准品，并冷冻。标准品为例如蛋白水解级联的肽，其被物质标记和/或化学标记(例如同位素和/或荧光标记、和/或氨基酸修饰、和/或使用物质标签、和/或至少一种氨基酸的交换)修饰。因此，内标准品为稳定的同位素标记的内标准品，例如WO03/016861A中公开的。在一个实施方案中，培养生物样品作为从受试者(离体)采集的，即样品的基质和/或要分析的蛋白水解级联组分的浓度没有改变，但是在达到稳态平衡和稳定之前和之后，任选地进一步加工(例如，获得血浆或血清)。任选地，在培养达到稳态平衡之前和/或期间，可以向生物样品中加入抗凝剂，即防止凝固(阻止血液凝结)的物质。然而，这样的抗凝剂应当基本上不会影响要分析的蛋白水解级联的蛋白酶类。一种用于根据本发明的SSE方法中合适的抗凝剂是肝素。
在分析之前，可以预处理或进一步加工样品，例如血浆或血清分离(例如，通过离心或凝固物活化接着离心)，和/或通过固相萃取法(SPE)纯化，例如对于基质消耗和/或肽富集。因此，固相萃取可以用反相色谱材料、疏水作用色谱材料、离子交换材料、亲和色谱材料例如反相色谱材料(特别是C18、C8或C6H5(苯基)材料)进行。
在一个实施方案中，在从固体表面洗脱之后，将一种或多种分析物(例如AngII)浓缩至干，并且可以在高压液相色谱(也称为高效液相色谱，HPLC)相容的溶剂中重构，所述高压液相色谱相容的溶剂指溶剂的组成不会干扰一种或多种分析物与偶联HPLC柱的MS的结合。重构溶剂为例如水溶剂，其可以补充有添加剂，包括丙醇、丁醇、2-丁醇、戊醇、2-丙醇、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、甲醇、乙醇、酸或碱，以增强分析物的溶解度和/或促进分析物结合HPLC柱。
在另一个实施方案中，根据本发明的SSE方法包括步骤∶提供用抗凝剂处理的样品；任选地，进一步加工该样品以获得血浆或血清样品；培养样品直到参与蛋白水解级联的至少一种肽降解产物达到稳态平衡；保存所述稳态平衡；任选地，一旦保存稳态平衡，加入一种或多种内标准品；用所述样品进行固相萃取；并分析该样品。可以在培养直到达到稳态平衡(和任选地稳定)步骤之前或之后，进行血浆或血清分离，取决于是否在血浆、血清或全血中研究稳态平衡。
例如，可以通过质谱(MS)；液相色谱，比如高压液相色谱(也称为高效液相色谱，HPLC)；特别地通过液相色谱-电喷射电离-质谱(LC-MS)和/或液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行至少一种肽降解产物(任选地以稳态平衡浓度)或醛固酮水平的分析。例如，Cuietal.(AnalBiochem.369(2007),27-33)公开了用于定量血管紧张素肽的液相色谱-电喷射电离-质谱和液相色谱串联质谱方法。对于每种肽或分析物和相应内标准品，可以测量不同物质跃迁。可以使用质量控制样品监测所述方法的性能。
这样的质量控制样品可以包括例如具有预定义的分析物浓度的生物样品，以及包括预定义浓度的合成肽的混合物的合成样品。例如，质量控制样品可以是具有预定义浓度的一种或多种肽的合并的血液、血浆或血清样品或合并的组织匀浆样品。可以通过将内源性肽信号与内标准品信号相关联计算血管紧张素肽浓度(例如，AngII浓度)，获得信噪比高于10。
此外，可以通过放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附(ELISA)进行分析。任选地，可以在基于RIA或ELISA定量蛋白水解级联的肽降解产物之前进行HPLC纯化步骤。在一个实施方案中，可以以多孔形式例如在96孔板上进行样品预处理、样品加工和/或样品分析。
在那个上下文中，肽(例如AngII)的稳态平衡浓度指其形成速率等于其降解速率，导致肽(例如AngII)浓度在一定时期内基本上不会随时间改变或不会显著地变化，并且其强烈取决于在给定条件下酶对其底物的亲和力而不是最大酶转化速率，如上进一步所述的。因为本发明涉及生物系统，显然术语“稳态平衡”不能被认为是要达到单个点，而是更作为肽浓度的动力学目标区域，某在一定时期内不会随时间显著地变化。直到达到这种稳态平衡浓度的更精确的时期主要取决于给定蛋白水解级联、待定量的肽分析物、样品性质和培养参数。对于每个级联，这可以容易地确定。通常，其中根据本发明可以进行定量的“稳态平衡窗”相对大一些，至少对于蛋白水解级联中的一些，特别是血液中的那些。通常，在一定培养时间之后，达到稳态平衡，其是凭经验确定的(例如，对于RAS系统是30分钟)，然后保持稳定持续一段时间(例如，对于RAS系统是6小时)。然后，稳态平衡被影响比如参与的酶的降解和灭活或样品缺乏进料底物而扰乱。可以如下计算对于给定级联的基于进料底物浓度的稳定性时间(ts)：通过进料底物(或进料前体肽)的浓度(cf)减去定义获得样品中饲用酶的最大更新率的最小底物浓度的酶-和样品-特异性常数(cmin)，除以级联的饲用酶的更新率，由此定义级联的进料速率(Vf)。
tS＝(cf-cmin)/Vf
tS基于进料底物浓度的稳定性时间[h]
cf进料底物浓度[mol/L]
cmin获得样品中饲用酶的最大更新率的样品特异性最小底物浓度[mol/L]
Vf级联的进料速率[[mol/L]/[h]]
和
cmin＝f·cE
f过量因子
cE饲用酶浓度
例如，将上述这些公式应用在RAS上，其中通过肾素进行饲用转化，基于对于PRA(血浆肾素活性)、PRC(血浆肾素浓度)的不同公布值，参见例如[Nishiyamaetal.2010,andBystrometal.,Clin.Chem.56(2010),1561-1569]，并应用例如70μg/ml血浆的AGT浓度和例如1000的过量因子，得到RAS稳态平衡的理论基于进料底物浓度的稳定性时间为约60至200小时。当然，所述理论基于进料底物浓度的稳定性时间仅仅充当粗略的理论参考点，因为样品中稳态平衡稳定性的实际时间可能显著不同。
与其中抑制剂用于立即稳定一些酶产生的肽的成功有限[Bystrometal.,Clin.Chem.56(2010),1561-1569]的现有技术的方法相反，根据本发明，对于至少一种参与蛋白水解级联的肽例如AngII，允许样品达到酶活性的定义稳态平衡。该创新性方法允许高度重现性地评价生理学样品基质中的AngII，同时整合参与AngII代谢的酶活性。优于现有技术的另一个优点是根据本发明的测定中的底物浓度通常保持在代谢酶(除了饲用酶)的浓度之下，其考虑到样品在与体外酶活性测定相反的给定条件(例如生理条件)下每种单一底物的酶亲和力，其中通过使用过量底物简化方式忽略了该重要特征。
特别地对于血样而言，对于至少一种参与蛋白水解级联的肽(例如AngII)达到稳态平衡，重要的是用本发明的SSE方法观察到所述蛋白水解级联的蛋白酶类不受向样品中加入蛋白酶抑制剂的抑制，至少没有达到如下程度(extend)：其不允许至少一种参与所述至少一种肽的降解的酶作用直到所述至少一种肽达到稳态，即至少一种所述肽的降解酶必须活化至允许所述肽稳态平衡的程度。因此，在一个实施方案中，没有向样品中加入蛋白酶抑制剂达到如下程度：使在培养达到稳态平衡之前和/或期间，参与待分析的至少一种肽(例如AngII)的形成和降解的蛋白酶类的活性被显著地抑制。根据所述实施方案，样品没有与这样的蛋白酶抑制剂混合，或者如果已经加入这样的抑制剂，则在培养达到稳态平衡之前和/或期间，抑制(利用其蛋白酶抑制作用)或除去这样的抑制剂。当然，不影响将根据本发明的SSE方法研究的相关蛋白水解级联的蛋白酶类、但抑制其它蛋白水解活性(例如如果研究RAS，血液凝固的抑制剂)的抑制剂可以加入到样品中，因为这不会影响相关蛋白水解级联(即，待分析的级联，例如RAS)达到所述级联的至少一个肽的稳态平衡的能力。
定量处于稳态平衡的一种或多种蛋白水解降解产物(例如AngII)是有利的。这基本上不同于现有技术的分析，现有技术的分析通常在从受试者采集样品(即血样)之后(即，没有处于稳态平衡中)立即应用蛋白水解级联状态中分析物的定量。通常，这样的现有技术样品在采集样品之后立即用蛋白酶抑制剂处理，以抑制级联中不需要的酶依赖性变化。然而，SSE方法通过特别地允许研究中的蛋白水解级联的蛋白酶类进行蛋白水解活性直到达到稳态平衡，将这样的酶依赖性变化应用于分析涉及所述级联的受试者的生理或生化状态。与在从受试者采集样品之后立即稳定的样品相比，这通常将导致研究中的蛋白水解级联的肽降解产物的量和组成发生变化。样品特异性蛋白水解活性引起稳态平衡，其比立即稳定的样品(直到达到稳态平衡没有培养步骤)更具有关于该级联的受试者生化状态的指示性(indicative)。
如上已经所述，根据本发明的稳态平衡不是单一、定量精确确定的且孤立的点，而是其中样品中的相对比例变化基本上减小的状态。通常，对于给定样品和研究中的级联，这样的稳态平衡可以通过施用通常培养条件来达到。如上所述，可以培养样品至多15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或至多300分钟。对于RAS和/或缓激肽系统，可以培养样品至少30分钟至至多300分钟，或至少30分钟至至多180分钟，或至少30分钟至至多120分钟，或至少30分钟至至多90分钟，或至少30分钟至至多60分钟。合适的培养温度是生理系统中存在的那些温度或其中研究中的蛋白水解级联的蛋白酶类具有其最佳作用温度的温度，例如在30至50℃、35至40℃、或特别地约37℃(特别地对于人类血液或源自血液样品)的温度下。
因为根据本发明的SSE方法应用样品中包含的蛋白水解活性，所以在达到稳态平衡之前，一种或多种样品(特别是血样)应当不含用于蛋白水解级联所加入的蛋白酶抑制剂。
在培养直到达到稳态平衡和稳定之后，可以加入这种蛋白酶抑制剂。这保证了在定量步骤期间仍然存在反映稳态平衡的肽浓度(特别是AngII浓度)(尽管稳态平衡通常在一定时期是稳定的，但是这提供给SSE方法另外的质量保证)。
SSE方法取决于肽降解产物的精确且准确的定量。因为许多样品(特别是血样)包含蛋白质、盐、酸、碱、脂质、磷脂或其它组分，其可能干扰肽定量；所以可以在定量之前施用预处理样品的方法。
在一个实施方案中，受试者为患有高血压、和/或对抗高血压治疗有抗性、和/或疑似患有PHA、和/或需要PHA阳性或阴性诊断的受试者。在一个实施方案中，受试者是人类。在一个实施方案中，受试者是动物，例如猫、狗、马、大鼠、小鼠、兔子、猪和/或牛。
如上所述，现有技术的方法通常包括一个筛选相，其中测定ARR一次，接着是验证试验，其中至少再一次测定单独的ARR或醛固酮直到可以以充足的灵敏性和特异性诊断PHA。该策略的原因是频繁出现假阳性结果。上述盐水输注验证试验甚至将包括测定ARR三次(在筛查时的第一次，在盐水输注之前的验证试验中的第二次，和在盐水输注之后的第三次)。相反，本发明的方法允许基于一次试验或步骤诊断，例如仅测量AA2R一次。
因此，在一个实施方案中，所述方法是一步诊断。在一个实施方案中，所述诊断包括仅一次测量AA2R(在一个时间点)。在一个实施方案中，仅测量血管紧张素II水平和/或醛固酮水平一次。
在一个实施方案中，所述一步诊断导致确诊。在一个实施方案中，所述一步诊断不需要验证试验，比如例如任何第二次或进一步的测量AA2R或其它参数。在一个实施方案中，不需要盐水输注试验。
在一个实施方案中，生物样品为血样或源自血液的样品。例如，血样或源自血液的样品为全血、血清、EDTA血浆、肝素血浆、柠檬酸盐血浆、肝素血液、EDTA血液或柠檬酸盐血液。在一个实施方案中，通过质谱测量至少一种水平。在一个实施方案中，通过基于抗体的定量方法比如例如ELISA测量至少一种水平。在一个实施方案中，通过质谱测量两种水平。在一个实施方案中，通过基于抗体的定量方法测量两种水平。这可以容易地进行，因为用于两种分析物的试剂盒是市售可获得的。然而，关于选择性和可重现性，质谱具有优于基于抗体的定量方法的显著优点。
在另一个方面，本发明涉及用于诊断PHA的试剂盒，包括血管紧张素II标准品和醛固酮标准品。
在一个实施方案中，所述试剂盒可以进一步包括说明书、一种或多种溶剂、一种或多种洗涤剂和/或一种或多种固相萃取柱。
在一个实施方案中，说明书包括根据本发明的方法的说明，特别是所述方法的任一种上述实施方案的说明。在一个实施方案中，所述试剂盒包括同位素标记的血管紧张素II标准品和同位素标记的醛固酮标准品。在一个实施方案中，试剂盒包括血管紧张素II抗体和/或醛固酮抗体。
进一步通过下述实施方案举例说明本发明，其可以容易地与权利要求1至15中任一项组合。
1.一种用于诊断受试者中的原发性醛甾酮增多症的方法，包括测量醛固酮水平和AngII水平，并将其合并为算术比例(醛固酮与AngII之比，AA2R)，或者如权利要求书、特别是权利要求1中所定义的方法。
2.实施方案1的方法，其中高AA2R指示原发性醛甾酮增多症，低AA2R指示没有原发性醛甾酮增多症。
3.实施方案1或2的方法，其中基于给定数据对或数据组的AA2R的鉴别因子高于基于相同数据对或数据组的ARR的鉴别因子。
4.实施方案1至3中任一项的方法，其中所述方法的特异性高于93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
5.前述实施方案中任一项的方法，其中所述方法的灵敏性为至少于93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
6.前述实施方案中任一项的方法，其中至少95％的所有确认的PHA受试者具有比至少95％的所有确认的非-PHA受试者的更高的AA2R。
7.前述实施方案中任一项的方法，其中除了ARB和除了影响醛固酮水平(但不排除AngII介导的对醛固酮水平的影响)的药物组合物之外，所述方法与受试者的任何治疗无关。
8.实施方案7的方法，其中所述治疗为RAS干扰治疗。
9.前述实施方案中任一项的方法，其中测量血管紧张素II的稳态平衡水平。
10.前述实施方案中任一项的方法，其中受试者为人类。
11.前述实施方案中任一项的方法，其中除了ARB和除了影响醛固酮水平(但不排除AngII介导的对醛固酮水平的影响)的药物组合物之外，所述受试者接受抗高血压治疗。
12.实施方案11的方法，其中所述治疗包括给药至少一种影响肾素-血管紧张素系统(RAS)的药物组合物。
13.前述实施方案中任一项的方法，其中所述方法是一步诊断且不需要任何验证试验。
14.前述实施方案中任一项的方法，其中仅测量所述水平一次。
15.前述实施方案中任一项的方法，其中不需要任何盐水输注试验。
16.前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物样品是血样或源自血液的样品。
17.前述实施方案中任一项的方法，其中所述血样或源自血液的样品为全血、血清、血浆、肝素血液、EDTA血液或柠檬酸盐血液。
18.前述实施方案中任一项的方法，其中所述水平的至少一种是通过质谱测量的。
19.前述实施方案中任一项的方法，其中所述水平的至少一种是通过基于抗体的定量方法测量的。
20.用于诊断PHA的试剂盒，包括血管紧张素II标准品，醛固酮标准品和说明书。
21.实施方案20的试剂盒，进一步包括一种或多种溶剂、洗涤剂和/或固相萃取柱。
22.实施方案20或21的试剂盒，其中所述说明书包括根据实施方案1至19中任一项的方法的说明。
23.实施方案20至22中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒用于至少一种水平的质谱定量方法，并且包括同位素标记的血管紧张素II标准品和/或同位素标记的醛固酮标准品。
24.实施方案20至23中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒用于至少一种水平的基于抗体的定量方法，并且包括同血管紧张素II抗体和/或醛固酮抗体。
实施例
实施例1∶高血压患者的血浆中AA2R的测量
盐水输注试验(SIT)和样品采集
一名非-PHA患者和一名PHA患者接受SIT。患者接受根据内分泌物学会指导方针的SIT(JohnW.Funderetal.；JClinEndocrinolMetab.September2008,93(9):3266-3281)。简而言之，在4小时期间向患者给药两升的0.9％盐水(盐水输注试验，SIT)。在4小时的盐水输注之前(pre-SIT)和之后(post-SIT)采集EDTA血样和肝素血样。将血样在冷却的离心机中以3000g离心10分钟，并在-80℃下冷冻直到通过质谱分析。
平衡AngII水平的测量
通过定量平衡的肝素血浆样品中稳态血管紧张素肽水平来确定平衡AngII水平。因此，将解冻的肝素血浆样品在水浴中于37℃下培养30分钟。在平衡之后，通过加入蛋白酶抑制剂稳定血浆血管紧张素肽水平，并且接着通过质谱定量平衡肽水平。因此，将稳定的同位素标记的AngII以200pg/ml的浓度加入到稳定的血浆样品中，用于内标准化。在C18-基固相萃取之后，使样品接受使用反相分析柱(AcquityC18,Waters)的质谱分析，用XEVOTQ-S三重四极质谱仪(Waters)以MRM方式在线操作。测量每种分析物和标准品的两个不同物质跃迁，并在考虑通过人空白血浆中的校准曲线确定的相应响应因子下，将内源信号与内标准信号相关联，计算浓度。
血浆醛固酮水平的测量
将稳定的同位素标记的醛固酮以500pg/ml的浓度加入到稳定的血浆样品中，用于内标准化。在C18-基固相萃取之后，使样品接受使用反相分析柱(AcquityC18,Waters)的质谱分析，用XEVOTQ-S三重四极质谱仪(Waters)以MRM方式在线操作。测量每种分析物和标准品的两个不同物质跃迁，并在考虑通过人空白血浆中的校准曲线确定的相应响应因子下，将内源信号与内标准信号相关联，计算浓度。
计算
得到的醛固酮浓度除以得到的每个血浆样品中AngII的浓度。
实施例2∶接受不同抗高血压治疗的健康志愿者中AA2R的测量
治疗和样品采集
在间隔一周的3个不同的治疗天，向5名健康志愿者给药单一剂量的三种不同的抗高血压药物。在给药单剂量的10mg依那普利(ACE-Inhibito)、50mg氯沙坦(ARB)或150mg的阿利吉伦(肾素抑制剂)之后4小时，通过静脉穿刺采集肝素血液并离心分离血浆。将样品冷冻在-80℃下直到分析。
平衡AngII水平的测量
通过定量平衡的肝素血浆样品中稳态血管紧张素肽水平来确定平衡AngII水平。因此，将解冻的肝素血浆样品在水浴中于37℃下培养60分钟。在平衡之后，通过加入蛋白酶抑制剂稳定血浆血管紧张素肽水平，并且接着通过质谱定量平衡肽水平。因此，将稳定的同位素标记的AngII以200pg/ml的浓度加入到稳定的血浆样品中，用于内标准化。在C18-基固相萃取之后，使样品接受使用反相分析柱(AcquityC18,Waters)的质谱分析，用XEVOTQ-S三重四极质谱仪(Waters)以MRM方式在线操作。测量每种分析物和标准品的两个不同物质跃迁，并在考虑通过人空白血浆中的校准曲线确定的相应响应因子下，将内源信号与内标准信号相关联，计算浓度。
血浆醛固酮水平的测量
因此，将稳定的同位素标记的醛固酮以500pg/ml的浓度加入到稳定的血浆样品中，用于内标准化。在C18-基固相萃取之后，使样品接受使用反相分析柱(AcquityC18,Waters)的质谱分析，用XEVOTQ-S三重四极质谱仪(Waters)以MRM方式在线操作。测量每种分析物和标准品的两个不同物质跃迁，并在考虑通过人空白血浆中的校准曲线确定的相应响应因子下，将内源信号与内标准信号相关联，计算浓度。

Claims (18)

1.用于诊断受试者中的原发性醛甾酮增多症的方法，包括测量来自受试者的生物样品中醛固酮水平和血管紧张素II(AngII)水平，并计算醛固酮水平和AngII水平之间的比例(醛固酮-与-血管紧张素II之比，AA2R)。
2.权利要求1的方法，其中与一个或多个确认的非PHA受试者的AA2R相比,高AA2R指示原发性醛甾酮增多症,和/或与一个或多个确认的非PHA受试者的AA2R相比,低AA2R指示没有原发性醛甾酮增多症。
3.权利要求1或2的方法，其中一个或多个确认的PHA阳性受试者和一个或多个确认的PHA阴性受试者之间基于AA2R的值之比(鉴别因子)高于相同数据组之间基于ARR的值之比。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中测量血管紧张素II的稳态平衡水平。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者接受抗高血压治疗。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者用一种或多种提高肾素浓度和/或活性的药物组合物进行治疗。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者用一种或多种降低ARR的诊断效率的药物组合物进行治疗。
8.权利要求7的方法，其中所述治疗未降低AA2R的诊断效率或者降低AA2R的诊断效率至较小的程度。
9.权利要求7的方法，其中所述一种或多种药物组合物选自肾素抑制剂、ACE抑制剂、ACE2、利尿药和/或钙通道阻断剂。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者没有用血管紧张素受体阻断剂(ARB)进行治疗。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法是一步诊断且不需要任何验证试验。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物样品是血样或源自血液的样品。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述水平的至少一种是通过质谱测量的。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述水平的至少一种是通过基于抗体的定量方法测量的。
15.用于诊断PHA的试剂盒，包括血管紧张素II标准品和醛固酮标准品。
16.权利要求14的试剂盒，进一步包括说明书、一种或多种溶剂、一种或多种洗涤剂和/或一种或多种固相萃取柱。
17.权利要求14或15的试剂盒，其中所述试剂盒包括同位素标记的血管紧张素II标准品和/或同位素标记的醛固酮标准品。
18.权利要求14至16中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒包括血管紧张素II抗体和/或醛固酮抗体。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770824A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法
CN109964131A (zh) * 2016-11-17 2019-07-02 美国控股实验室公司 用于测量血浆肾素活性的方法和系统
CN112014509A (zh) * 2020-09-03 2020-12-01 复旦大学附属中山医院 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10559377B2 (en) 2013-01-09 2020-02-11 Biomed Concepts Inc. Graphical user interface for identifying diagnostic and therapeutic options for medical conditions using electronic health records
EA035289B1 (ru) * 2013-10-18 2020-05-25 Аттоквант Диагностикс Гмбх Способ диагностики первичного гиперальдостеронизма
EP3405894A1 (en) * 2016-01-19 2018-11-28 Biomed Concepts Inc. Method and system for identifying diagnostic and therapeutic options for medical conditions using electronic health records
JP7067758B2 (ja) * 2017-06-30 2022-05-16 国立大学法人 新潟大学 試料中のアンジオテンシンペプチドの量を測定するための方法及びアンジオテンシンペプチドの定量キット
CN112037931B (zh) * 2020-07-15 2023-10-20 新疆维吾尔自治区人民医院 在疑似原发性醛固酮增多症中应用的醛固酮增多预测体系
AU2021325340A1 (en) * 2020-08-10 2023-04-13 Proteomedge Ab Solid mixture comprising standard protein
CN113533552B (zh) * 2021-06-02 2023-08-29 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 液相色谱串联质谱检测肾素活性过程中对影响arr药物同步检测的方法
CN118922718A (zh) * 2021-10-19 2024-11-08 菲诺米耐斯公司 使用磁珠进行简单的可自动化的蛋白质消化的系统和方法
CN117031028A (zh) * 2023-07-25 2023-11-10 深圳市科曼医疗设备有限公司 醛固酮检测用解离试剂以及醛固酮化学发光检测试剂盒
CN117554603B (zh) * 2023-11-28 2024-05-10 中国医学科学院阜外医院 一种用于原发性醛固酮增多症初筛的标志物组合及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007137980A1 (en) * 2006-05-29 2007-12-06 Nicox S.A. Nitrated heterocyclic compounds as endothelin receptor antagonist
WO2008103420A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for tranquilizing heart muscle
CN102586223A (zh) * 2012-03-08 2012-07-18 南京大学 一种基于mypt1基因敲除建立新型高血压小鼠模型的方法及其用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3919407A (en) * 1973-11-28 1975-11-11 De Castro Aurora L Fernandez Method for quantitative determination of renin activity in blood
JPH022935A (ja) * 1988-06-20 1990-01-08 Tosoh Corp アンジオテンシンの測定法
US5314804A (en) * 1992-03-24 1994-05-24 Serim Research Corporation Test for Helicobacter pylori
AU2002304965A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-12 Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy
WO2007109733A2 (en) * 2006-03-21 2007-09-27 The Johns Hopkins University Diagnostic and prognostic markers and treatment strategies for multiple sclerosis
EP2225559B8 (en) * 2007-12-28 2016-12-21 F. Hoffmann-La Roche AG Assessment of physiological conditions
US9883909B2 (en) * 2012-03-08 2018-02-06 Medtronic Ardian Luxembourg S.A.R.L. Renal neuromodulation methods and systems for treatment of hyperaldosteronism
EA035289B1 (ru) * 2013-10-18 2020-05-25 Аттоквант Диагностикс Гмбх Способ диагностики первичного гиперальдостеронизма

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007137980A1 (en) * 2006-05-29 2007-12-06 Nicox S.A. Nitrated heterocyclic compounds as endothelin receptor antagonist
WO2008103420A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for tranquilizing heart muscle
CN102586223A (zh) * 2012-03-08 2012-07-18 南京大学 一种基于mypt1基因敲除建立新型高血压小鼠模型的方法及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MASAHIKO KATO 等: "Responses of Plasma Norepinephrine and Renin-Angiotensin-Aldosterone System to Dynamic Exercise in Patients With Congestive Heart Failure", 《JOURNAL OF CARDIAC FAILURE》 *
MAX WISGERHOF 等: "Increased adrenal sensitivity to angiotension II in idiopathic hyperaldosteronism", 《JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM》 *
PITT O. LIM 等: "The neurohormonal natural history of essential hypertension: towards primary or tertiary aldosteronism?", 《JOURNAL OF HYPERTENSION》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109964131A (zh) * 2016-11-17 2019-07-02 美国控股实验室公司 用于测量血浆肾素活性的方法和系统
CN109964131B (zh) * 2016-11-17 2024-06-11 美国控股实验室公司 用于测量血浆肾素活性的方法和系统
CN106770824A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法
CN112014509A (zh) * 2020-09-03 2020-12-01 复旦大学附属中山医院 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法

Also Published As

Publication number Publication date
HUE045337T2 (hu) 2019-12-30
DK3058374T3 (da) 2019-08-26
WO2015055825A1 (en) 2015-04-23
NZ717888A (en) 2022-03-25
EP3058374B1 (en) 2019-06-26
EA201690796A1 (ru) 2016-08-31
BR112016007960A8 (pt) 2020-03-17
CA2926382C (en) 2020-06-02
BR112016007960B8 (pt) 2023-11-14
US20160266151A1 (en) 2016-09-15
ES2745099T3 (es) 2020-02-27
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