CN105695606B - 用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法 - Google Patents

用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法，所述方法包括如下步骤：(1)提取基因组；(2)采用多重PCR扩增靶基因；(3)靶基因文库构建；(4)对靶基因文库通过下一代半导体测序平台进行测序，筛查出与肥厚型心肌病发病相关的基因突变位点。本发明的方法简便快捷，成本低，且一次性检测多个样本，为肥厚型心肌病的筛查奠定了基础，为临床分子诊断开拓了道路。

Description

用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及医学分子诊断及生物技术，具体涉及用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法。
背景技术
肥厚型心肌病(HCM)为一种最常见的遗传性心脏疾病，主要表现为左心室不对称性肥厚或心肌壁增厚，较少患者表现出左室流出道梗阻、右心室肥厚或双心室肥厚。病理特征为心肌细胞弥漫性肥大、畸形、核大、深染和心肌纤维紊乱等。HCM临床表现从无征兆到呼吸困难、晕厥、胸痛甚至发生心源性猝死和致命性的心律失常。
HCM是第一个从遗传角度阐明病因的遗传性心脏疾病。1990年在一个加拿大家族性肥厚型心肌病患者中发现第一个致病基因MYH7，其遵循的是常染色体显性遗传模式。HCM的全球发病率和年死亡率分别约为1/500和1％。相关证据表明，Zou等人随机抽查中国9个省的成年人8080人，其中男性4064人，女性4016人，并对其进行超声心动图检测，结果表明中国人群患HCM的概率大约为0.8/500。实际上，超声心动图对肥厚型心肌病的检测为一种患病后的诊断方式，还存在更多潜在的HCM患者，依此推断，中国人群中至少存在200万HCM患者。该病也是是青少年和年轻运动员猝死的最主要原因之一，Morn等人对1986-2006年猝死的1886名美国年轻运动员进行统计分析发现，死亡的主要原因为心血管疾病1056名，占约56％，其中HCM的患者就占据了36％。
相关研究表明，HCM主要由肌节基因突变所致，故HCM又称为肌小节疾病。HCM主要遵循常染色体显性遗传模式，常染色体隐性遗传较少，大约有50％的HCM患者为家族性遗传，称为家族性肥厚型心肌病(FHCM)。HCM具有高度的临床遗传异质性，到目前为止，发现的与HCM发病相关的致病基因大约有30个，致病性突变位点超过1400个，但约80％的HCM患者的致病基因主要发生在编码粗肌丝、细肌丝或能量代谢蛋白的基因上，这些基因为：MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、MYH6、TPM1、ACTC1、PRKAG2、MYL2和MYL3。肌节蛋白突变导致HCM的机制还不太清楚，目前认为肌节蛋白基因突变后导致粗肌丝或细肌丝对Ca2+的亲和力和敏感性加强，过度消耗了细胞内的能量，心肌细胞供能不足，触发了心肌细胞的死亡，导致心肌细胞电传导能力受损，从而表现出心室肌肥厚。
对肥厚型心肌病患者进行基因检测和家族筛查能够为临床诊断提供重要的指导作用，主要体现为：1)产前诊断，指导优生优育；2)辅助明确诊断，进行临床干预；3)家族筛查，进行家族疾病发生风险评估及管理。
肥厚型心肌病最大特点为临床遗传异质性，致病基因较多，致病性突变位点已经接近1400个。CN 102965428A公开了及一种检测遗传性心肌肥厚相关基因突变样品制备试剂盒。该试剂盒包括a)独特设计并制备捕获探针，针对基因ACTC1、ACTN2、BRAF、CALR3、CASQ2、CSRP3、GLA、HRAS、JPH2、KRAS、LAMP2、LDB3、MAP2K1、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYOZ2、PRKAG2、RAF1、SOS1、TCAP、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、VCL全部外显子片段；b)设计带有独特标签序列的接头；c)通用引物对探针序列进行PCR扩增；d)设计独特的混合后目的片段的捕获操作。该申请采用探针捕获测序，与其他传统的DNA芯片杂交和毛细管电泳测序技术一样，不仅费时费力，而且价格昂贵，根本不能满足对肥厚型心肌病的基因检测。
下一代测序技术为最近几年生命科学领域发展最为迅速的技术之一。在遗传疾病基因检测方面，最引人注目的是下一代半导体测序平台，该平台由美国Life Technologies公司在2010年发布，是一款专门针对临床遗传疾病基因检测而开发的一款台式个体化高通量基因测序仪，其以布满微孔的高密度半导体芯片为测序基础，具有快速、经济、灵敏性好、准确率高等特点。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法，该方法利用多重PCR对靶基因进行扩增后，在下一代半导体测序平台的基础上，采用314半导体芯片对靶基因进行大规模的平衡测序，一次可检测多个病例样本，具有简便、快速、准确和经济等特点，为肥厚型心肌病的临床早期诊断和预防建立了新的方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的高通量筛查方法，包括如下步骤：
(1)提取基因组；
(2)采用多重PCR扩增靶基因；
(3)靶基因文库构建；
(4)对靶基因文库通过下一代半导体测序平台进行测序，筛查出与有肥厚型心肌病发病相关的基因突变位点。
本发明中，利用多重PCR对靶基因进行扩增后，在下一代半导体测序平台的基础上，采用314半导体芯片对靶基因进行大规模的测序，一次可检测多个病例样本，具有简便、快速、准确和经济等特点。
优选地，步骤(1)所述的基因组来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)所述靶基因包括MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、MYH6、TPM1、ACTC1、PRKAG2、MYL2和MYL3全部外显子片段的编码区及其附近不少于50bp的非编码区。
本发明中，用于扩增靶基因MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、MYH6、TPM1、ACTC1、PRKAG2、MYL2和MYL3全部外显子片段的编码区及其附近不少于50bp的非编码区的引物对如下表1所示：
Figure BDA0000959607700000041
Figure BDA0000959607700000051
Figure BDA0000959607700000061
Figure BDA0000959607700000071
Figure BDA0000959607700000081
Figure BDA0000959607700000091
优选地，步骤(2)所述多重PCR的反应体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10uL，dNTP Mixture 4uL，10uM的上下游引物各2uL，模板DNA为2uL(250ng/uL)，PrimeSTAR GXLDNA Polymerase 2uL，ddH2O为30uL，终体积为50uL。
优选地，步骤(2)所述多重PCR的反应条件为：
(a)98℃预变性3分钟；
(b)98℃变性10秒，54或57℃退火15秒，68℃延伸1-3分钟，共35个循环；
(c)68℃延伸5分钟。
优选地，所述方法还包括在步骤(2)所述多重PCR扩增靶基因后进行多重PCR产物纯化及片段化。
优选地，所述多重PCR产物纯化包括如下步骤：对每个样品各个区段的多重PCR产物进行定量，以等比例混合后，用磁珠进行纯化。
优选地，所述多重PCR产物片段化包括如下步骤：将纯化后的产物进行定量，再通过核酸超声破碎仪将片段打断到约150～250bp。
优选地，步骤(4)所述的半导体测序平台为采用314半导体芯片进行测序。
本发明中，利用Life Technologies公司不同通量的芯片，一次可检测7-96个样本的10个靶基因，大大的降低了每个样品的检测成本。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)提取基因组；
(2)采用多重PCR扩增靶基因：
A)多重PCR的反应体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10uL，dNTP Mixture 4uL，10uM的上下游引物各2uL，模板DNA为2uL(250ng/uL)，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase2uL，ddH2O为30uL，终体积为50uL；
B)多重PCR的反应条件为：(a)98℃预变性3分钟；(b)98℃变性10秒，54或57℃退火15秒，68℃延伸1-3分钟，共35个循环；(c)68℃延伸5分钟；
(3)将各个样品各个区段的多重PCR产物定量后进行等比例混合，用磁珠进行纯化，将纯化后的产物定量后再通过核酸超声破碎仪将其打断到约150～250bp；
(4)将打断后的DNA样本加上特异性的barcode序列标签接头和通用的测序接头；
(5)应用高分辨率的琼脂糖凝胶2％E-Gel将(4)中加好接头的DNA片段进行电泳回收；
(6)靶基因文库构建：应用通用引物将(5)中琼脂糖凝胶电泳回收的DNA片段进行8个循环的PCR扩增反应；
(7)对靶基因文库通过下一代半导体测序平台进行测序，筛查出与有肥厚型心肌病发病相关的基因突变位点：将(6)中的PCR产物纯化并定量后，应用下一代半导体测序技术平台对其进行测序；以人的hg19基因组为参考基因组，对测序结果进行质量评估和比对分析，找出可能的致病性变异位点。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的肥厚型心肌病相关致病基因突变的高通量筛查方法筛选得到的突变基因和/或片段。
优选地，所述突变基因和/片段为MYH7-c.2155C>T、MYH7-c.1987C>T、MYH7-c.2654A>C、MYBPC3-c.706A>G、PRKAG2-c.298G>A和TNNT2-c.887G>A中的任意一种或至少两种的组合，优选为MYH7-c.2654A>C。
本发明中，分离到的突变基因片段核苷酸的编号按照以下标准进行：以基因的编码区CDS的起始密码子ATG序列中的A为+1，例如：MYH7-c.2155C>T，表示以MYH7基因编码区CDS的起始密码子ATG中的A碱基为+1，往后一直延伸到2155位置处的碱基C突变为T。
第三方面，本发明提供一种核酸片段，所述核酸片段包括了与第二方面所述的突变基因和/或片段杂交的序列。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明利用多重PCR对靶基因进行扩增后，在下一代半导体测序平台的基础上，采用314半导体芯片对靶基因进行大规模的测序，一次可检测多个病例样本，具有简便、快速、准确和经济等特点，为肥厚型心肌病的临床早期分子诊断和预防建立了新的方法；
(2)本发明方法可用于产前诊断，指导优生优育；辅助明确诊断，进行临床干预；家族筛查，进行家族疾病发生风险评估及管理；
(3)本发明的方法简便快捷，成本低，且一次性检测7-96个样本，为肥厚型心肌病的遗传筛查奠定了基础，为临床分子诊断开拓了道路。
附图说明
图1是本发明下一代半导体芯片测序ISP热图报告；
图2是本发明下一代半导体芯片测序ISP统计分析报告；
图3是本发明下一代半导体芯片测序读长直方图报告；
图4是本发明下一代半导体芯片测序结果与参考靶基因比对分析报告；
图5是本发明下一代半导体芯片测序准确率统计分析报告；
图6为本发明实施例中与HCM发病相关的变异位点MYH7-c.2155C>T的IGV分析及其Sanger测序报告；
图7为本发明实施例中与HCM发病相关的变异位点PRKAG2-c.298G>A的IGV分析及其Sanger测序报告；
图8为本发明实施例中与HCM发病相关的变异位点MYH7-c.2654A>C的IGV分析及其Sanger测序报告；
图9为本发明实施例中与HCM发病相关的变异位点MYBPC3-c.706A>G的IGV分析及其Sanger测序报告；
图10为本发明实施例中与HCM发病相关的变异位点TNNT2-c.887G>A的IGV分析及其Sanger测序报告。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
应用本发明方法对在云南省第一人民医院心血管内科临床确诊的7例肥厚型心肌病先证者(除收集HCM患者的人口统计学资料外，还收集了其心电图及超声心动图)进行10个基因(MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、MYH6、TPM1、ACTC1、PRKAG2、MYL2和MYL3)的高通量突变筛查，寻找可能的与HCM发病相关的致病性变异位点。
一、基因组提取：对入选临床确诊的肥厚型心肌病7例先证者，抽取其外周静脉血1ml，EDTA抗凝后，采用商业化的Miniprep Kit(Axygen,美国)提取其全基因组后，进行琼脂糖凝胶电泳后、对浓度和OD值进行测定，OD260/280为1.8-2.0之间为可用。
二、靶基因的多重PCR引物设计：根据GeneBank数据库公布的基因登录号(MYH7：NG_007884.1、MYBPC3：NG_007667.1、TNNT2:NG_007556.1、TNNI3:NG_007866.2、MYH6:NG_023444.1、TPM1:NG_007557.1、ACTC1:NG_007553.1、PRKAG2:NG_007486.1、MYL2:NG_007554.1和MYL3:NG_007555.2)序列为模板进行引物设计，引物覆盖范围为：靶基因的外显子编码区及其两端不少于50bp的碱基区域。
三、多重PCR反应体系及优化条件
1.优选的PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0000959607700000131
2.优选的PCR反应条件为：
Figure BDA0000959607700000132
四、靶基因多重PCR产物纯化及片段化
1.对每个样品各个区段的多重PCR产物进行定量，以等比例混合后，用AgencourtAMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)对其进行纯化。
2.纯化产物用Life Technologies公司的Qubit 2.0定量仪对其进行定量，定量后，将500ng纯化后的PCR片段稀释到终体积为50ul体系的无核酸ddH20中，应用CoverisSystem M220对其进行超声破碎，使其片段大小约为150～250bp，冻存于-20℃。
五、靶基因文库构建：文库构建参照Life Technologies公司文库构建的标准方案进行，为实现上述技术方案，按以下操作步骤进行。
1.对用Coveris System M220超声打断的混合PCR片段进行末端修复，取200ulPCR反应管置于冰上，片段化的7份PCR产物分别按照下述体系配制：
试剂组份 每个反应管用量
片段化的DNA片段 100ng
5X末端修复缓冲液 20ul
末端修复酶 1ul
无核酸纯净水 Xul
反应总体系 100ul
配制完成后，使用微量移液器将其混合均匀并瞬时离心后，置于PCR仪上25℃孵育20分钟。
2.对修复后的PCR产物进行纯化：用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)对其进行纯化，最后加入25ul的无核酸ddH20进行洗脱。
3.连接adapters和barcode序列标签，以及缺口修复。
在一个200ul的PCR反应管中配制如下试剂组份：
试剂组份 每个反应管用量
DNA片段 ～25ul(100ng)
10Xl连接缓冲液 10ul
Ion P1adapters 2ul
Ion Xpress Barcode(1-7)序列标签 2ul
dNTP混合液 2ul
无核酸纯净水 49ul
DNA连接酶 2ul
缺口修复聚合酶 8ul
总反应体系 100ul
配制完成后，用微量移液器将其混合均匀，置于PCR仪上进行修复，反应条件如下：
反应步骤 反应温度 反应时间
1 25℃ 15分钟
2 72℃ 5分钟
3 4℃ 终止反应
4.纯化连接和修复后的DNA片段：用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)对其进行纯化，最后加入20ul的无核酸ddH20进行洗脱。
5.未扩增文库片段大小的筛选
1)使用一次性的2％E-Gel(Invitrogen公司)高分辨率电泳凝胶，取下梳子后，将其置于iBase凝胶电泳仪上；2)E-Gel凝胶的第一排为加样孔，第二排为收集孔。筛选目标片段操作过程如下：a)分别把7个修复纯化后的DNA片段约20uL加入到加样孔中，中间小孔加入4uL DNA ladder(上海捷瑞，500bp DNA ladder)，紧接着加入6uL的无核酸水ddH2O将其进行稀释。收集孔中分别加入20ul无核酸水ddH20(DNA ladder对应的收集孔中加入10uL无核酸水ddH20)。b)收集～300bp的文库片段：当300bp的DNA ladder跑到E-Gel收集孔中上边参考线时，停止电泳，再在每个收集孔中加入10uL的无核酸ddH2O后继续电泳。当目的片段进入孔中之后，用微量移液器吸取对应收集孔中的液体于200uL的PCR反应管中，再用10uL的无核酸ddH2O清洗收集孔中残留的DNA，并将其吸入对应的PCR管中。
6.未扩增文库片段的扩增及纯化
将选择的PCR文库片段进行PCR扩增，配制扩增反应体系如下：
Figure BDA0000959607700000151
Figure BDA0000959607700000161
PCR反应结束后，用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)对其进行纯化，最后加入20ul的无核酸ddH20进行洗脱。
7.文库定量：对纯化后的样品用Life Technologies公司的Qubit 2.0定量仪对其进行定量，定量后，每个样品上样量为26pM，其计算公式如下：
1.515×样品浓度(ng/uL)÷文库片段大小×1000÷26＝稀释倍数(1uL原始文库稀释倍数)
将构建好的文库稀释后，每个文库样品取10uL放置于同一个1.5mL的EP管中，混合均匀后，置于4℃待用。
六、油包水PCR反应及阳性硅胶珠富集
为实现上述目的，在Life Technologies公司的OT2和ES仪器上进行，主要步骤如下：
1.油包水PCR反应：在配制扩增反应液之前，从-20℃取出的试剂需置于冰上溶解后，震荡5秒后，轻甩2秒后重置于冰上，开始配制PCR扩增反应液，其所需试剂及其配比如下：
序号 试剂 体积
1 Ion PGM模板OT2 400混合试剂 500uL
2 Ion PGM模板OT2 400PCR反应试剂B 285uL
3 Ion PGM模板OT2 400PCR聚合酶混合物 50uL
4 Ion PGM模板OT2 400试剂X 40uL
5 1-7样品稀释后的文库混合物 25uL
6 Ion PGM模板OT2 400硅胶珠 100uL
— 总反应体系 1000uL
扩增反应液配制完成后，震荡5秒混合均匀，轻率2秒后，将其加入到反应器中后，放置到准备好油包水PCR反应的OT2仪器上进行油包水反应，约8小时后反应结束。
2.回收扩增反应后的阳性硅胶珠
油包水PCR反应结束后，在OT2仪器上按下run，将收集管中的硅胶珠离心后，缓慢吸走上清液及其悬浮物，每个收集管留下约50uL，50℃孵育2分钟，用ES仪器对含有DNA模板的硅胶珠富集和DNA解链变性后，置于4℃准备上机测序。
七、上机测序
首先对PGM仪器进行初始化，PGM初始化所配置的缓冲液和dNTP来自于LifeTechnologies公司。初始化成功后，参照Life Technologies公司的测序流程进行上机测序。
八、数据分析
1.通过Ion Torrent Server和Life Technologies公司的Ion Report进行分析。
2.致病性预测：通过人类基因突变数据库(HGMD:The Human Gene MutationDatabase,http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和美国国立生物信息技术中心(NCBI:National Center for Biotechnology Information,http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/)的SNP数据库查询是否被文献报道与HCM致病相关。若未被报道，根据生物信息学技术，将变异位点应用数据库SIFT(http://sift.jcvi.org/)，PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和MutationTaster(http:// www.mutationtaster.org/)软件对其进行预测，该变异位点是否与HCM发病相关。若与HCM发病相关，则将该变异位点进行Sanger测序验证，验证为阳性的变异位点进行不低于100个本地正常人的病例对照研究。
九、结果
通过1块314半导体芯片的测序反应，结果如图1-5所示，7个样品共获得88.4M的数据量，共计445177条序列，序列平均长度为194bp，1×覆盖度的碱基读取准确率为99％，平均测序深度为31.3×。7例HCM患者中，6例被发现致病性变异位点：MYH7-c.2155C>T、MYH7-c.1987C>T、MYH7-c.2654A>C、MYBPC3-c.706A>G、PRKAG2-c.298G>A及TNNT2-c.887G>A，其中MYH7-c.2654A>C为新发现的与HCM发病相关的变异位点如表1，其余检测结果如图6-10所示，突变检测率为85.7％，经Sanger测序验证，准确率为100％。
表1分离到的与HCM发病相关的变异位点
Figure BDA0000959607700000181
综上所述，由实施例1的结果分析可得出，本发明建立了肥厚型心肌病主要致病基因的简便、快速、准确和经济的遗传筛查方法。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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Claims (10)

1.用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的高通量筛查方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取基因组；
(2)采用多重PCR扩增靶基因，所述靶基因包括MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、MYH6、TPM1、ACTC1、PRKAG2、MYL2和MYL3全部外显子片段的编码区及其附近不少于50bp的非编码区；
(3)靶基因文库构建；
(4)对靶基因文库通过下一代半导体测序平台314半导体芯片进行测序，筛查出与肥厚型心肌病发病相关的基因突变位点，所述基因突变位点为MYH7-c.2155C>T、MYH7-c.1987C>T、MYH7-c.2654A>C、MYBPC3-c.706A>G、PRKAG2-c.298G>A和TNNT2-c.887G>A中的任意一种或至少两种的组合；
所述多重PCR的引物如SEQ ID NO:1～172所示。
2.根据权利要求1所述的高通量筛查方法，其特征在于，步骤(1)所述的基因组来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的高通量筛查方法，其特征在于，步骤(2)所述多重PCR的反应体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，10μM的上下游引物各2μL，模板DNA为2μL，所述模板DNA的浓度为250ng/μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2μL，ddH2O为30μL，终体积为50μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述多重PCR的反应条件为：
(a)98℃预变性3分钟；
(b)98℃变性10秒，54或57℃退火15秒，68℃延伸1-3分钟，共35个循环；
(c)68℃延伸5分钟。
5.根据权利要求4所述的高通量筛查方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(2)所述多重PCR扩增靶基因后进行多重PCR产物纯化及片段化。
6.根据权利要求5所述的高通量筛查方法，其特征在于，所述多重PCR产物纯化包括如下步骤：对每个样品各个区段的多重PCR产物进行定量，以等比例混合后，用磁珠进行纯化。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重PCR产物片段化包括如下步骤：将纯化后的产物进行定量后，通过核酸超声破碎仪将片段将其打断到150～250bp。
8.根据权利要求1所述的高通量筛查方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取基因组；
(2)采用多重PCR扩增靶基因：
A)多重PCR的反应体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，10μM的上下游引物各2μL，模板DNA为2μL，所述模板DNA的浓度为250ng/μL，PrimeSTAR GXL DNAPolymerase 2μL，ddH2O为30μL，终体积为50μL；
B)多重PCR的反应条件为：(a)98℃预变性3分钟；(b)98℃变性10秒，54或57℃退火15秒，68℃延伸1-3分钟，共35个循环；(c)68℃延伸5分钟；
(3)将各个样品DNA的多重PCR产物定量后进行等比例混合后，用磁珠进行纯化，最后应用核酸超声破碎仪将其打断到150～250bp；
(4)将打断后的DNA样本加上特异性的barcode序列标签接头和通用的测序接头；
(5)应用高分辨率的琼脂糖凝胶2％E-Gel将(4)中加好接头的DNA片段进行电泳回收；
(6)靶基因文库构建：应用通用引物将(5)中琼脂糖凝胶电泳回收的DNA片段进行8个循环的PCR扩增反应；
(7)对靶基因文库通过下一代半导体测序平台进行测序，筛查出与肥厚型心肌病发病相关的基因突变位点：将(6)中的PCR产物纯化并定量后，应用下一代半导体测序技术平台对其进行测序；以人的hg19基因组为参考基因组，对测序结果进行质量评估和比对分析，找出可能的致病性变异位点。
9.一种如权利要求1-8中任一项所述的用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的高通量筛查方法筛选得到的突变基因和/或片段；
所述突变基因和/片段为MYH7-c.2654A>C。
10.一种核酸片段，其特征在于，所述核酸片段包括了与权利要求9中所述的突变基因和/或片段杂交的序列。
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