CN106190874B - 一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种提高丝状真菌生产纤维素酶、半纤维素酶或其它蛋白的方法，属于基因工程领域。所述方法包括对丝状真菌宿主进行遗传操作以过表达或缺失特定基因。本发明还涉及所述经过遗传操作修饰的宿主。本发明还是涉及在丝状真菌宿主中改善蛋白质生产，或用于生产改善的蛋白质组合物的方法，所述蛋白为纤维素酶、半纤维素酶、其它参与木质纤维素材料降解的蛋白质和其它蛋白质。

Description

一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，一种提高丝状真菌生产纤维素酶、半纤维素酶或其它蛋白的方法，涉及5个基因(五个转录因子基因分别为NCU10006、NCU06487、NCU05383、NCU05994、NCU05051)，特别是提供脉孢菌属、毁丝霉属宿主。

背景技术

木质纤维素是自然界中存在最广泛、最丰富的碳水化合物。随着地球资源的快速消耗、环境污染和能源危机的日益加剧，纤维素作为潜力巨大、环境友好的可再生能源成为研究的重点。作为地球上数量最大的可再生资源，纤维素的利用效率却远远低于社会发展的要求，若能将其高效地转化为可利用的能源、食料和化学原料等，势必将会对人类社会的健康发展起到关键作用。要利用这些储量巨大的生物质资源，需要糖化和发酵两个基本步骤。其中，糖化过程中所需要的木质纤维素水解酶(纤维素酶、半纤维素酶等)的生产成本过高已成为制约整个生物炼制产业发展的核心问题，如何高效、廉价的生产这些酶制剂或是如何低成本的将生物质高效地降解为可发酵的单体化合物(葡萄糖、木糖等)、低聚化合物(纤维寡糖、木寡糖等)已成迫切需要解决的问题。

在自然界中，多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，特别是子囊菌和担子菌等丝状真菌可以分泌多种木质纤维素水解酶，与其它微生物相比，其具有完整的纤维素酶系，这种特性使其成为研究纤维素利用和纤维素酶生产过程中的热点。在提高生物质降解效率的研究中，传统诱变技术已经取得了重大进步。尽管纤维素水解酶的产量已经达到100g/L以上水平，但在整个工艺成本中占有极大比重，不符合工业大规模生产的基本要求。近年来，研究表明丝状真菌木质纤维素水解酶的表达与转录水平密切相关。通过对相关转录因子的表达水平的调控可以大幅提高水解酶的表达水平。此外，丝状真菌是工业蛋白质最主要的生产宿主之一，其具有强大的分泌能力和高等真核细胞中的蛋白质修饰功能，而且具有发酵工艺简单经济等特点。因此，高分泌型宿主和众多强启动子(如纤维素酶CBH I启动子等)使得丝状真菌宿主在生产其它蛋白质具有很大的潜力。专利WO2011151515提供了一种在里氏木霉中通过过表达调节因子来达到提高纤维素酶表达水平的方法。参与木质纤维素水解酶基因表达的这一途径的基因众多，然而目前为止仅有数十个相关转录因子被克隆、鉴定。因此，本领域迫切需要鉴定这一途径中其它关键调控因子，从而开发能够提高纤维素酶等蛋白质生产的技术和方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高木质纤维素降解及纤维素酶、半纤维素酶表达的方法及其应用。

本发明第一方面，提供了一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，包括步骤：

强化丝状真菌的纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性。

在另一优选例中，所述的丝状真菌包括：脉孢菌(Neurospora)、或侧孢霉(Sporotrichum)。

在另一优选例中，所述的丝状真菌还包括曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)、或毁丝酶(Myceliophthora)。

在另一优选例中，所述纤维素降解相关锌指转录因子包括：

(a)SEQ ID NO:1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。

在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子还包括：

(b)与SEQ ID NO:1、3、5、7、或9所示序列同源性为50％以上，较佳地为60％以上，更佳地为65％以上的纤维素降解相关锌指转录因子。

在另一优选例中，所述强化包括过表达和/或上调所述的纤维素降解相关锌指转录因子的表达和/或活性。

在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子至少包括SEQ ID NO:1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。

在另一优选例中，所述的丝状真菌为脉胞菌，较佳地，为粗糙脉胞菌。

在另一方面，本发明提供降低一组蛋白质的生产的方法，所述蛋白质为分泌蛋白质，达到在生产例如异源蛋白质时降低不期望得到的副产品的生产。

本发明第二方面，提供了一种用于降解纤维素的工程菌，所述工程菌中纤维素降解相关锌指转录因子被强化表达。

在另一优选例中，所述的工程菌中纤维素降解相关锌指转录因子的表达和/或活性得到提高。

在另一优选例中，所述的“强化表达”指的是与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素降解相关锌指转录因子的表达量至少提高了10％，较佳地，至少提高了20-90％，更佳地，至少提高了100-600％。

在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素酶和/或半纤维素酶的表达量和/或活性至少提高了20％，较佳地，至少提高了50-80％，更佳地，至少提高了100-500％。

在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子包括选自SEQ ID NO:1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。

在另一优选例中，所述工程菌包括改造自以下野生菌的菌株：脉孢菌(Neurospora)、或侧孢霉(Sporotrichum)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)、或毁丝酶(Myceliophthora)。

本发明第三方面，提供了一种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，在纤维素原料的存在下，培养本发明第三方面所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素酶和/或半纤维素酶。

在另一优选例中，所述的诱导物即纤维素原料包括木质纤维素、结晶纤维素、木聚糖、木质纤维素水解物、木寡糖、纤维寡糖、木糖、或阿拉伯糖。

本发明第四方面，提供了一种降解纤维素并获得纤维素降解产物的方法，在木质素原料的存在下，培养本发明第三方面所述的工程菌，从而降解木质素并获得木质素降解产物。

本发明第五方面，提供了本发明第三方面所述工程菌的用途，用于制备纤维素酶和/或半纤维素酶、和/或用于提高纤维素的降解。

该方法是利用强化锌指转录因子基因表达的微生物菌株降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶的方法，所述微生物为脉孢菌(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)或侧孢霉(Sporotrichum)。

所述锌指转录因子基因包括NCU10006、NCU06487、NCU05383、NCU05994和NCU05051，过表达其中的任意转录因子，或突变任意一个转录因子的部分碱基提高其活性。

所述锌指家族转录因子基因NCU10006的核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码序列表中序列1所示蛋白；所述锌指家族转录因子基因NCU06487的核苷酸序列如序列表中序列4所示，编码序列表中序列3所示蛋白；所述锌指家族转录因子基因NCU05383的核苷酸序列如序列表中序列6所示，编码序列表中序列5所示蛋白。所述锌指家族转录因子基因NCU05994的核苷酸序列如序列表中序列8所示，编码序列表中序列7所示蛋白。所述锌指家族转录因子基因NCU05051的核苷酸序列如序列表中序列10所示，编码序列表中序列9所示蛋白。

具体的，该方法利用以下任一菌株：以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建过表达转录因子NCU10006基因的菌株；以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建过表达转录因子NCU06487基因的菌株；以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建过表达转录因子NCU05383基因的菌株；以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建过表达转录因子NCU05994基因的菌株；以脉孢菌(Neurospora)为出发菌株构建过表达转录因子NCU05051基因的菌株。

本发明提供的提高木质纤维素降解和纤维素酶、半纤维素酶表达的方法，是以微生物为出发菌株，过表达其中锌指家族转录因子基因而得到，或是提高任意锌指家族转录因子的活性而得到。所述微生物为脉孢菌(Neurospora)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)或侧孢霉(Sporotrichum)。所述过表达基因是针对锌指家族转录因子基因NCU10006、NCU06487、NCU05383、NCU05994和NCU05051。

本发明方法的应用是广泛的，其为高效表达生产纤维素酶、半纤维素酶或其它蛋白质。其中：

生产纤维素酶的方法，是以木质纤维素、结晶纤维素、经过预处理的木质纤维素、纤维寡糖为诱导物，发酵所述的方法得到纤维素酶。

生产半纤维素酶的方法，是以木质纤维素、木聚糖、经过预处理的木质纤维素、阿拉伯糖、木寡糖、木糖为诱导物，发酵所述方法得到半纤维素酶。

生产其它蛋白的方法，包括将编码蛋白功能片段的基因导入所述受体菌中形成工程菌，再发酵该工程菌生产蛋白的过程。

因此，本发明还涉及这些转录因子基因在构建功能性工程菌中的应用。该应用是将编码蛋白功能片段的基因导入所述的出发菌株中形成的工程菌。

由此形成的高效表达蛋白的工程菌也属于本发明的技术内容。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

所述五个转录因子的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸残基序列如下：

1)来源于粗糙脉孢菌的NCU10006氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

2)来源于粗糙脉孢菌的NCU10006核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

3)来源于粗糙脉孢菌的NCU06487氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；

4)来源于粗糙脉孢菌的NCU06487核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；

5)来源于粗糙脉孢菌的NCU05383氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；

6)来源于粗糙脉孢菌的NCU05383核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；

7)来源于粗糙脉孢菌的NCU05994氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；

8)来源于粗糙脉孢菌的NCU05994核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；

9)来源于粗糙脉孢菌的NCU05051氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示；

10)来源于粗糙脉孢菌的NCU05051核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.10所示。

附图说明

图1：NCU10006和NCU06487过表达菌株在2％微晶纤维素培养基上培养7天，取发酵液上清液，测量蛋白浓度、木聚糖酶活和纤维素内切酶酶活。

图2：NCU10006和NCU06487过表达菌株在2％微晶纤维素培养基上培养7天，发酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析(1和4为出发菌株，2为TCG-10006，3为TCG-6487)。

图3：NCU05383和NCU05994过表达菌株在2％微晶纤维素培养基上培养4天，取发酵液上清液，测量蛋白浓度、木聚糖酶活和纤维素内切酶酶活。

图4：NCU05383过表达菌株在2％微晶纤维素培养基上培养4天，发酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析。

图5：NCU05994过表达菌株在2％微晶纤维素培养基上培养4天，发酵液上清液中蛋白SDS-PAGE分析。

图6：NCU05051在2％微晶纤维素培养基上培养7天后，取发酵液上清液，测量蛋白浓度、纤维素内切酶酶活以及木聚糖酶活。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，丝状真菌中存在一系列与纤维素降解酶表达调控相关的锌指转录因子。实验证明，当这些锌指转录因子的表达提高时，丝状真菌中的纤维素酶或半纤维素酶的表达量会上升，从而能够提高菌株对木质纤维素的利用，并增强木质纤维素的降解。在此基础上，完成了本发明。

纤维素降解相关锌指转录因子

如本文所用，术语“纤维素降解相关锌指转录因子”、“本发明转录因子”、“本发明锌指蛋白”均指在丝状真菌中属于锌指家族且具有调控(半)纤维素酶表达或活性从而与纤维素降解相关的蛋白或其编码基因。

实验证明，当过表达本发明转录因子后，能够有效地提高丝状真菌中(半)纤维素酶的表达，并进一步提高丝状真菌对木质纤维素的利用从而加强其降解。

优选地，本发明转录因子指的是在脉胞菌中的锌指转录因子，例如，如SEQ ID NO:1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。编码这些转录因子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2、4、6、8、或10所示。

此外，本发明转录因子还包括来自多种丝状真菌的锌指家族的转录因子。例如，所述的丝状真菌包括曲霉、木霉、青霉、镰刀霉或毁丝酶。在这些丝状真菌的转录因子中，可以找到与本发明SEQ ID NO:1、3、5、7、或9所示序列具有一定同源性的转录因子。优选地，这些转录因子中与本发明SEQ ID NO:1、3、5、7、或9所示序列同源性大于30％，较佳地大于50％，更佳地大于65％的转录因子与纤维素降解有密切的相关性。

同时，本领域技术人员可以根据本发明在其他丝状真菌中找到同源性较高且与纤维素降解相关的锌指家族转录因子。

过表达基因

通过向真菌宿主中引入另一份或多份拷贝的目标基因，或通过另一个启动子使所述基因的表达增加，或将宿主进行遗传操作使基因表达水平更高或基因产物的活性提高。

纤维素、纤维素酶、半纤维素酶

纤维素是自然界中存在最广泛、最丰富的碳水化合物。多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，其可以分泌多种纤维素水解酶。

纤维素酶是一种多酶体系，由多种组份组成。按底物特异性可将纤维素酶分为以下组分：(1)外切β-1,4-葡萄糖酶(exo-beta-1,4-glucanase，EC.3.2.1.91)简称为外切酶，又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases)。纤维二糖水解酶可以水解纤维素结晶区，从纤维素链的非还原端/还原端开始水解并释放纤维二糖。(2)内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-beta-1,4-glucanase，EC3.2.1.74)简称内切酶。纤维素内切酶能够在纤维素多糖链上无定形部分随机切断糖苷键，产生新的糖链末端和长度不一的纤维寡糖。(3)β-1,4-葡萄糖苷酶(beta-1,4-glucosidase，EC3.2.1.21)简称纤维二糖酶。纤维二糖水解酶水解可溶性的纤维糊精和纤维二糖生成葡萄糖。(4)其它组分，除了以上三大组分外还有纤维二糖脱氢酶、纤维二糖醌氧化还原酶、磷酸化酶、纤维素酶小体等都会参与纤维素降解过程。

半纤维素具有与纤维素一样的负责结构，其降解需要多种半纤维素酶的共同作用。其中主要有两种：β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。前者从半纤维素主链内部作用于木糖苷键，分解成低聚木糖，后者作用于低聚木糖的末端，释放出单糖。除此之外，降解半纤维素还需要多种侧链裂解酶的共同作用，主要有乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶等。

宿主菌

本发明“宿主菌”、“突变体”可互换使用，均是指将出发菌株中纤维素降解相关锌指转录因子过表达后获得的具有(增强的)降解纤维素活性的工程菌株。其中，本发明宿主菌在改造后，纤维素降解相关锌指转录因子表达显著提高。

本领域技术人员应理解，当获得了锌指转录因子的序列后，可以通过多种常规技术使某出发菌株中的锌指转录因子的表达得到提高。通常，可采用随机整合的方法，采用某标记(或抗性)基因将锌指转录因子基因整合至出发菌株基因组中一个或多个位点上。

应用

通过过表达本发明锌指蛋白，可以人为地提高丝状真菌中(半)纤维素酶的表达量和/或活性，从而增加菌株对纤维素(尤其是木质纤维素)的利用。

例如，当获得了本发明的工程菌后，可以通过加入纤维素原料的诱导，对所述的工程菌进行培养。此时，所述的菌株会分泌纤维素酶和半纤维素酶，对其进行分离并提纯后，就可以获得较纯的纤维素酶和半纤维素酶。

由于产生纤维素酶和半纤维素酶的过程中，纤维素原料受其降解，形成降解产物。因此当进一步对培养物进行分离时，就可以获得纤维素的多种降解产物，例如多种单体化合物：葡萄糖、木糖等。

本发明有益效果

本发明通过改造丝状真菌在纤维素降解的调控因子及调控网络，增强了丝状真菌对纤维素的利用，提高了生物质降解，从而成为能量利用中的新途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明所采用的原始出发菌株商购于美国Fungal Genetics Stock Center(FGSC)，其余所用材料均为商购。

实施例1 NCU10006和NCU06487过表达菌株的构建

以粗糙脉胞菌组氨酸营养缺陷型菌株(FGSC#6103)(购自FGSC)出发，根据同源重组的原理，将NCU10006的整个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)整合至his-3位点。

开放阅读框特异性引物:

NCU10006F:TCTAGAATGCTGAGCTCACAGAACCCG(SEQ ID NO:11)；

NCU10006R:TTAATTAACGAAGCCAATCGCGCC(SEQ ID NO:12)

NCU06487F：TCTAGAATGAGTACGACGGCCGCTT(SEQ ID NO:13)

NCU06487R：TTAATTAAGCTTGGCCCACCTCTTCGT(SEQ ID NO:14)

扩增NCU10006和NCU06487的开放阅读框；然后分别通过酶切插入质粒pMF272中Xba I和Pac I酶切位点间，得到质粒pMF272-10006和pMF272-6487。将10μg pMF272-10006电击转化至组氨酸营养缺陷型菌株(FGSC#6103，A)，通过平板筛选阳性转化子。提取转化子基因组DNA，以其为模板，利用引物Pccg1-F和NCU10006R或进行扩增，如果可以扩增得到目的片段，则说明目标基因的开放阅读框已整合到基因组中。引物如下所示：

Pccg1-F：GTCCTCCCACCTCCCCAAT(SEQ ID NO:15)

将10μg pMF272-6487电击转化至组氨酸营养缺陷型菌株(FGSC#6103，A)，通过平板筛选阳性转化子。提取转化子基因组DNA，以其为模板，利用引物Pccg1-F和NCU06487R或进行扩增，如果可以扩增得到目的片段，则说明目标基因的开放阅读框已整合到基因组中。

将上述所获得的转化子与野生型菌株杂交(FGSC#4200，a)，将杂交得到的子囊孢子热激(60℃,45min)后，稀释涂布在平板上，萌发后挑至斜面上，生长7天后，提取基因组，利用PCR进行鉴定，从而获得过表达菌株的纯合子TCG-10006和TCG-6487。

实施例2 NCU05383和NCU05994过表达菌株的构建

NCBI Database搜索粗糙脉胞菌全基因组序列，设计引物扩增组成型强启动子tef片段，以及扩增NCU05383和NCU05994开放阅读框所需引物，引物如下所示：

NCU05383F：GCTCTAGAATGTCCAATCATCATGAGAATCCTG(SEQ ID NO:16)

NCU05383R：GGACTAGTAACGGGTGCGAAAACCGCAG(SEQ ID NO:17)

NCU05994F：GCTCTAGAATGTCCGTTCCCAGTGCCGTC(SEQ ID NO:18)

NCU05994R：GGACTAGTGTCCGCCAGCCCAGCCATTC(SEQ ID NO:19)

tef-F：GAATGCGGCCGCTCATCAACAGTCGCTTGTCCAC(SEQ ID NO:20)

tef-R：TGCTCTAGATTTGACGGTTGATGTGCTGACTG(SEQ ID NO:21)

利用引物tef-F和tef-R扩增粗糙脉孢菌tef启动子片段，将其插入至质粒pMF272的Xba I和Not I酶切位点之间，替换原有ccg-1启动子片段，得到质粒pMF272-tef。扩增NCU05383和NCU05994的开放阅读框；然后分别通过酶切插入质粒pMF272-tef中Xba I和PacI酶切位点间，得到质粒pMF272-tef-5383和pMF272-tef-5994。

将10μg质粒电击转化至组氨酸营养缺陷型菌株(FGSC#6103，A)，通过平板筛选阳性转化子。提取转化子基因组DNA，以其为模板，利用引物tef-F/NCU05383R和tef-F/NCU05994R进行扩增，如果可以扩增得到目的片段，则说明目标基因的开放阅读框已整合到基因组中。引物如下所示：

将上述所获得的转化子与野生型菌株杂交(FGSC#4200，a)，将杂交得到的子囊孢子热激(60℃,45min)后，稀释涂布在平板上，萌发后挑至斜面上，生长7天后，提取基因组，利用PCR进行鉴定，从而获得过表达菌株的纯合子TCG-5383和TCG-5994。

实施例3 NCU05051过表达菌株的构建

以粗糙脉胞菌组氨酸营养缺陷型菌株(FGSC#6103)(购自FGSC)出发，根据同源重组的原理，将NCU05051的整个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)整合至his-3位点。

开放阅读框特异性引物:

NCU05051F:TCTAGAATGCTGAGCTCACAGAACCCG(SEQ ID NO:22)；

NCU05051R:CCTTAATTAATTGATAGCCTGGCATCTGAGGGTTG(SEQ ID NO:23)

扩增NCU05051的开放阅读框；然后分别通过酶切插入质粒pMF272中Xba I和Pac I酶切位点间，得到质粒pMF272-5051。将10μg pMF272-5051电击转化至组氨酸营养缺陷型菌株(FGSC#6103，A)，通过平板筛选阳性转化子。提取转化子基因组DNA，以其为模板，利用引物Pccg1-F和NCU05051R或进行扩增，如果可以扩增得到目的片段，则说明目标基因的开放阅读框已整合到基因组中。

引物如下所示：

Pccg1-F：GTCCTCCCACCTCCCCAAT(SEQ ID NO:15)

将上述所获得的转化子与野生型菌株杂交(FGSC#4200，a)，将杂交得到的子囊孢子热激(60℃，45min)后，稀释涂布在平板上，萌发后挑至斜面上，生长7天后，提取基因组，利用PCR进行鉴定，从而获得过表达菌株的纯合子TCG-5051。

实施例4过表达菌株产纤维素酶、半纤维素酶实验

转录因子工程菌和野生型粗糙脉孢菌分别在2％结晶纤维素培养基上培养7天，取培养基上清，离心后进行一系列验证试验。

4.1方法：

4.1.1蛋白浓度测定：

1.标准蛋白溶液蛋白标准曲线制定：于1mL去离子水中加入10mg牛血清蛋白，得到10mg/mL标准贮液。以标准贮液稀释浓度为0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL，1.0mg/mL，1.2mg/mL的标准蛋白溶液，取20μL标准蛋白溶液于1mL Bradford溶液中，混匀，室温静置5min，测其OD₅₉₅，得到纵坐标值，作为横坐标值为BSA标准蛋白溶液浓度，以此制作标准曲线。

2.待测蛋白溶液准备：吸取丝状真菌发酵不同时间的发酵液于1.5mL离心管，14000rpm离心5min，取上清置于新离心管中。

3.蛋白浓度测定：1mL Bradford中加入上述20μL发酵液，对照为1mL Bradford加入20μL超纯水。上下颠倒混匀后静置反应5min，在OD₅₉₅条件下测定吸光度值。

4.1.2 CMCase(内切β-1,4-葡聚糖酶)酶活测定方法：

1.反应酶液准备：根据蛋白浓度测定值，待测定发酵酶液以0.1M pH 4.6醋酸钠缓冲液稀释至合适范围。

2.酶液与底物反应：0.2mL稀释的发酵液酶液与0.2mL AZO-CMC底物分别于45℃预热5min。

3.酶液与AZO-CMC底物混匀，45℃条件下水浴10min，取1mL沉淀剂，剧烈震荡10s终止酶和底物的反应，常温静置10min，振荡混匀，常温下1000g离心10min。

4.取上清于比色皿中OD₅₉₀测定吸光度值Abs。空白对照采用灭活的发酵酶液。

5.内切β-1,4-葡聚糖酶酶活(U/mL)计算公式:Units/mL＝milli U/assay＝(412.5×Abs-6)×2×1/1000×N

4.1.3 XYLANase(木聚糖酶)酶活测定方法：

1.反应酶液准备：根据蛋白浓度测定值，待测定发酵酶液以0.1M pH 4.6醋酸钠缓冲液稀释至合适范围。

2.酶液与底物反应：0.2mL稀释的发酵液酶液与0.2mL AZO-XYLAN底物分别于45℃预热5min，酶液与AZO-XYLAN底物混匀，45℃温度下反应10min。

3.取1mL无水乙醇于上述离心管，剧烈振荡10s终止酶和底物的反应，室温静置5min，振荡混匀，常温下1500g离心10min。

4.取上清于比色皿中OD₅₉₀测定吸光度值Abs。空白对照采用灭活的发酵酶液。

5.木聚糖酶酶活(U/mL)计算公式:Units/ml＝milli U/assay＝(66.6×Abs²+105×Abs+3.9)×2×1/1000×N。

4.1.4蛋白质SDS-PAGE实验:

实验中所用的蛋白预制胶均购自Life technologies公司，样品制备操作如下：等体积上样量(60μL体系)蛋白电泳中所有样品都取相同体积，

RLDS SampleBuffer添加15μL，NuPAGE Reducing Agent添加6μL，剩余体积用超纯水补齐。混匀后的蛋白上样液体置于70℃条件下10min。

1×SDS Runing Buffer电泳缓冲液配置如下：取50mL

RMES RunningBuffer于950mL超纯水中混合均匀，向电泳槽中加入600mL电泳缓冲液，取200mL电泳缓冲液中加入500μL

RAntioxidant，混合均匀后加入上层电泳槽中。上样完成后采用电压200V，电泳45min。

上述使用蛋白胶快速染色液考马斯亮蓝购自Solarbio公司，具体染色方法如下：

(1)溶液B100mL，与溶液A 2mL充分混匀，染色液制备完成。

(2)将电泳完成后的蛋白胶置于容器中，加入100mL超纯水微波加热至沸腾1min，脱色摇床放振荡5min，弃液体。

(3)用双蒸水轻轻冲洗两次，加入适量染色液，微波至沸腾后持续1min，脱色摇床振荡5min。弃染色液。

(4)双蒸水冲洗两次，加入50mL双蒸水加热至沸腾1min，置脱色摇床上振荡10min，弃液体，用双蒸水冲洗两次，再加入双蒸水，置脱色摇床上振荡过夜。

(5)蛋白胶置于凝胶成像仪中白光观察，拍照。

4.2结果：

在2％结晶纤维素条件下培养7天，Pc-10006过表达菌株TCG-10006培养基上清液中的蛋白浓度、纤维素酶酶活以及木聚糖酶酶活显著提高，分别为出发菌株的2.4倍、1.5倍和1.7倍(图1)。而Pc-6487过表达菌株TCG-6487培养基上清液中的蛋白浓度、纤维素酶酶活及木聚糖酶活也显著升高，分别为出发菌株的1.8倍、1.2倍和1.7倍(图1)。SDS-PAGE分析显示，过表达菌株与出发菌株相比，蛋白条带有所加深，尤其是72kDa左右的纤维素酶CBH I和CBH II条带变化最为明显(图2)。

NCU05383过表达菌株TCG-5383和NCU05994过表达菌株TCG-5994的摇瓶发酵实验表明，在以2％结晶纤维素为碳源的条件下发酵4天后，其发酵液中蛋白含量分别提高了85％和120％。与出发菌株相比，TCG-5383和TCG-5994的纤维素酶酶活分别提高了90％和105％，并且其木聚糖酶活分别提高了150％和200％(图3)。SDS-PAGE分析也证实了这一现象，与出发菌株相比，过表达菌株在72KD处外切纤维素酶CBH I和CBH II的条带加深(图4-图5)。

另外，在2％结晶纤维素条件下培养7天，与出发菌株相比较，NCU05051过表达菌株TCG-5051培养基上清液中的蛋白浓度和纤维素酶酶活分别提高了20％和80％，而木聚糖酶酶活显则无明显差异(图6)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种强化丝状真菌蛋白质生产的方法

<130> 2015-5

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 293

<212> PRT

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 1

Met Leu Ser Ser Gln Asn Pro Ala Val Thr Gln Pro Pro Thr Ala Gly

1 5 10 15

His Gly Ser Ser Leu Pro Ser Leu His Asp Phe Gly Asn Phe Arg Thr

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Ser Ser Ser Gln Asn Ser Tyr Tyr Pro Ser Ala Thr Gln Gln Ser Gln

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Ser Ser Thr Gln Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Gln Gln

50 55 60

Gly Ser Tyr Pro Gly Phe Gln Gly Val Pro Thr Ser Gln Leu Ser Pro

65 70 75 80

Thr Ser Tyr Ser Pro Ser Thr Ser Gln Gly Asn Ala Pro Arg Ala Leu

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Gly Ser Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Leu Gln Tyr Val

100 105 110

Thr Gly Ser Arg Pro Gln Gln Tyr Ser Leu Gln Ser Gln His His Tyr

115 120 125

Ser Leu Asn Gly His Gly His Gly Pro Val Leu Ser Asn Met His Gln

130 135 140

Pro Gly Thr Pro Leu Ala Met Val Gly Met Ser Gly Met His Tyr Gly

145 150 155 160

Thr His His Pro Met Pro Gln Tyr His Arg Tyr Gly Ala Gly His Asp

165 170 175

Gln Leu Gly Pro Arg Gln Gly Asp Arg Pro Tyr Lys Cys Asp Gln Cys

180 185 190

Thr Gln Gly Phe Asn Arg Asn His Asp Leu Lys Arg His Lys Arg Ile

195 200 205

His Leu Ala Thr Lys Pro Tyr Pro Cys Gly Asn Cys Glu Lys Ser Phe

210 215 220

Ser Arg Lys Asp Ala Leu Lys Arg His Arg Leu Val Lys Gly Cys Gly

225 230 235 240

Lys Asn Asp Gln Val Asn Gly Asn Asn Thr Lys Pro Gly Thr Ala Gly

245 250 255

Asp Asn Asn Thr Arg Pro Pro Gly Asp Tyr Ser Val Gly Ser Arg Thr

260 265 270

Ser Pro Met Glu Arg Ile Asp Glu Thr Ala Ser Asp Asp Ala Ala Val

275 280 285

Ala Arg Leu Ala Ser

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<210> 2

<211> 951

<212> DNA

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 2

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ccatctgcga cccaacaatc acaaagctcg acccaaagta gttactaccc atcaccatcg 180

acaccacaac agggctcata tcctgggttt caaggggtac caacatcgca gttatccccg 240

acaagttact caccttcaac atcgcaagga aatgcgccac gcgcattggg atcgatatcg 300

agcagcggca gcagcggatc cgggctacag tacgtgacgg gcagcagacc tcagcaatat 360

tctctccagt ctcagcatca ctactcgctt aacgggcatg gacacggtcc cgtgctgagc 420

aacatgcacc agcccggcac accgttggcc atggtgggta tgtcaggcat gcattatggc 480

acccaccatc cgatgcctca gtaccatcgg tatggagctg gccacgacca attgggacct 540

cgtcaagggg accgaccata caagtgtgat cagtgcacac agggcttcaa caggaatcat 600

gacttgaagc gccacaagag gatacatttg gctacgaagc catatccttg tggcaactgt 660

gagaagtctt tctcgaggaa ggatgcgctg aaggtaggct gcctaattcc cctgcgatca 720

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aataacacac ggccaccggg tgattactcg gtaggctcca ggacttcgcc catggaacgc 900

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<210> 3

<211> 532

<212> PRT

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 3

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Arg Tyr Asp Pro Asp Glu Val Leu Leu Ala Gln Asn Ser Pro Leu Met

20 25 30

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35 40 45

Phe Ser Tyr Pro Lys Val Ser Pro Pro Ser Ser Pro Ser Asn Lys Arg

50 55 60

Ser Asp Arg Arg Phe Lys Ser Lys Pro Ser Gln Gly Asp Ala Val Leu

65 70 75 80

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85 90 95

Gly Leu Glu Ala Leu Pro Ser Glu His Ser Asp Ser Asp Arg Asp Asp

100 105 110

Ser Leu Glu Pro Asp Thr Ala Ser Ser Met Asp Gly Asn Glu Ile Ile

115 120 125

Gln Ser Pro His Phe Asn Gly Glu Asp His Asp Asp Ile Glu His Leu

130 135 140

His Leu Ser Leu Arg Arg Arg Asn Met Ser Ala Glu Pro Ser Arg Glu

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Ile Asn Thr Gly Gly Gly Phe Asp Ser Leu Gln Ser Leu Ala Ala Gly

165 170 175

Ala Leu Gly Val Val Gln Asn Leu Ser Ala Pro Ser Val Lys Gln Glu

180 185 190

Glu Ala Asp Ala Gly Pro Thr Pro Pro Ile Thr Glu His Asp Thr Ala

195 200 205

Thr Val Gln Ser Thr Ile Ala Ala Arg Arg Ala Glu Ala Asp Lys Asp

210 215 220

Thr Asp Arg Ala Thr Gln Pro Ala Met Leu Thr Pro Tyr Ser Pro Arg

225 230 235 240

Gly Ile Thr Phe Ser Pro Arg Glu Pro Gly Ser Ile Pro Ser Ile Ala

245 250 255

Ser Pro Thr Asn Pro Leu Thr Pro Asn Ser Leu Ser Glu Gly Leu Pro

260 265 270

Pro Ile His Pro Thr Ser Pro Val Phe Glu Gly Ala Ser Gln Gln Thr

275 280 285

Leu Pro Ser Ile Arg Asp Ser Leu Gly Val Ala Asp Leu Asn Gln Leu

290 295 300

Ser Arg Pro Ile Ile Glu Arg Ser Pro Leu Gln Pro Tyr Pro Gly Ser

305 310 315 320

Pro Pro Gly Phe Pro Thr Ser Leu Leu Ser Tyr Thr Asn His Ala Ser

325 330 335

Pro Pro Gln Ser Ala Ser Asp Pro Tyr Arg Arg Glu Pro Val Ser Pro

340 345 350

Tyr Phe Phe Ser Gln Gly Asn Gly Leu Gln Arg Pro His Asp Tyr Ala

355 360 365

Ser Gly Pro Glu Pro Ser Ala Pro Asp His Ser Arg Ser His Met Asn

370 375 380

Ala Ser Ala Thr Ser Pro Gly Ser Ile Ala Asp Arg Met Ser Ile Asp

385 390 395 400

Gly Leu Thr Ser His Thr Gly Thr Tyr Val Cys Lys Phe Gln Gly Cys

405 410 415

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Val His Ser Ser Ala Arg Pro His Tyr Cys Pro Val Pro Gly Cys Ser

435 440 445

Arg Gly Glu Gly Gly Arg Gly Phe Lys Arg Lys Asn Glu Met Ile Arg

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His Gly Leu Val His Asp Ser Pro Gly Tyr Val Cys Pro Phe Cys Pro

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Asp Arg Glu His Lys Tyr Pro Arg Pro Asp Asn Leu Gln Arg His Val

485 490 495

Arg Val His His Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asp Pro Leu Leu Arg Glu

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Val Leu Ala Gln Arg Pro Asp Gly Pro Ser Arg Gly Arg Arg Arg Arg

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Gly Gly Pro Ser

530

<210> 4

<211> 1664

<212> DNA

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 4

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gatgaggtac tacttgccca gaatagcccg ttgatgaagc cctatcaccc ccagcttggg 120

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tttgaaggag cctcacagca gacacttcca tccattaggg attctctagg ggtggcggat 900

ctcaatcaac tgtcccgtcc cataattgag cgaagtccac ttcaacctta tcccggctct 960

cctccaggtt ttccgacaag tctgttgtca tacacgaacc atgcgtcgcc gccacaatcg 1020

gcctctgacc cataccgtcg ggaacctgtt tcgccctact ttttctctca agggaatggc 1080

ctacaacggc cgcacgatta tgccagcggt ccagaaccct ccgccccaga tcattcacgc 1140

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ggcctaacca gccacacggg tacttatgtg tgcaaattcc agggctgcaa cgccgcgccg 1260

tttcagacgc agtacttgct aaactcacac gcaaatgttc actcatccgc gcgacctcat 1320

tactgtcccg taccagggtg ttctcgaggc gaaggtggaa gaggattcaa gcgcaagaac 1380

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gaccgagagc acaaatatcc tcgtcctgac aacctccaaa ggtaggcatg agtaaacaag 1500

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<210> 5

<211> 1004

<212> PRT

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 5

Met Ser Asn His His Glu Asn Pro Val Tyr Thr Ser Asp Ser Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Asn Ala Pro Pro Thr Thr Arg Val Pro Leu Pro Ser Tyr Pro Ser

20 25 30

Gln Gln Ile Asn Ala Gln Gln Tyr His Gln Pro Pro Gln His Val Gln

35 40 45

His Val Glu Pro Val Gln Gln Leu Pro Gln Phe Gln His Ser Gln Ile

50 55 60

Gln Gln Gln Ala Tyr Ala Ser Arg Ser Gln Ser Ser Gln Ser Asn Pro

65 70 75 80

Gln Gln Gln Gln Tyr Gly Val Gln Gly Gln Gly Gln Leu Asp Gln Gln

85 90 95

Gln Gln Pro Gln Gln Pro Gln Ser Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

100 105 110

Gln Gln Gln His Gln His Gln Gln His Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ser

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Gln Glu Arg Gln Ala Pro Glu Glu Pro Ser Glu Asp Arg Pro Ala Lys

130 135 140

Lys Lys Gln Arg Ile Thr Arg Ala Cys Asp Ala Cys His Gly Arg Arg

145 150 155 160

Gln Lys Cys Gln Gly Phe Gln Pro Cys Ala Asn Cys Ile Lys Lys Gly

165 170 175

Val Glu Cys Thr Tyr Asn Asn Pro Tyr Tyr Arg Gly Arg Ala Arg Thr

180 185 190

Pro Pro Pro Pro Pro Asn Asp Pro Asn Thr Arg Asn Phe Ala Arg Thr

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210 215 220

Ala Cys Asp Ile Cys Arg Asp Gly Arg His Pro Cys Ser Gly Thr Leu

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Arg Asn Ser Arg Asn Arg Tyr Glu Asp Leu Pro Asn Pro Glu Leu Arg

260 265 270

Gly Pro Tyr His Lys Pro Ala Leu Val Asp Ala Val Leu Gly Pro Asp

275 280 285

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Gln Asp Tyr Leu Ser Leu Lys Leu Asp Arg Arg Tyr Gly Glu Asp Asp

325 330 335

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His Thr Val Arg Asn Trp Leu Glu Gln Val Glu Lys Asn Tyr Val Ala

405 410 415

Arg Gln Glu Leu Trp His Gly Val Gly His Ala Arg Ala Ala Val Ala

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Leu Met Thr Met Ala Leu Gly Ser Leu Phe Arg Asp Ala Pro Lys Ser

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Leu Leu Asn Thr Ala Leu Asn Leu Thr Asp Ala Glu Lys Gly Asp Pro

485 490 495

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Ser Thr Cys Arg Leu Asn Lys Ala Trp Tyr Thr Phe Gly Asn Thr Leu

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Arg Asn Leu Lys Pro Thr Leu Leu Leu Pro Leu Phe Gln Arg Gln Met

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Gly Val Ser Pro Asp Asp Gln Leu Leu Glu Asp Ala Leu Arg Ala His

885 890 895

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<212> DNA

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 6

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<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 7

Met Ser Val Pro Ser Ala Val Pro Arg Thr Ala Pro Ile Ala Ile Ala

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Pro Lys Pro Pro Pro Arg Phe Pro Pro Ser Arg Gln Ala Ser Ile Asn

20 25 30

Tyr Ser Asp Ser Phe Ser Gly Phe Arg Ser Gly Ile Asn Thr Pro Asp

35 40 45

Thr Asp Ser Leu Ser Gly Gln Pro Ala Ser Pro Cys Glu Ala Cys Leu

50 55 60

Arg Arg Arg Leu Glu Cys Val Met Ser Asp Asp Glu Glu Ser Cys Val

65 70 75 80

Ala Cys Gln Thr Asn Gly Ala Glu Cys Ser Leu Gly Glu Ser Pro Pro

85 90 95

Pro Arg Lys Arg Lys Leu Asn Gly Asp Ala Glu Glu Ser Gly Ser Lys

100 105 110

Arg Ser Ser Pro Ala Arg Phe Asp Asn Arg Lys Arg Arg Gln Asn Pro

115 120 125

Pro Ser Leu Ser Ser Thr Val Thr Thr Gly Met Ser Leu Ile Glu Glu

130 135 140

Met Ala Asn Phe Gly Gly Pro Thr Leu Leu Lys Arg Thr Leu Gly Leu

145 150 155 160

Gln Ser Asp Arg Tyr Ser Gln Tyr Ile Gly Pro Thr Thr Asp Phe Glu

165 170 175

Pro Ser Leu Ile Asn Leu Ser Pro Phe Asp Pro His Asp Glu Ser Leu

180 185 190

Leu Ala Arg Gly Thr Leu Arg Lys Val Gly Asp Glu Asp Thr Phe Leu

195 200 205

Met Leu Pro Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Ala His Ile Ile Glu Asp

210 215 220

Val Asp Glu Ile Glu Ser Ile Val Ala Pro His Gly Arg Lys Leu Ile

225 230 235 240

Asp Leu Tyr Phe Arg Ile Val His Pro Gly Phe Pro Ile Val Gln Lys

245 250 255

Ser Val Phe Tyr Glu Lys Tyr Asp Arg Ser His Arg Glu Phe Ser Pro

260 265 270

Pro Leu Leu Ala Ala Ile Tyr Ile Leu Ala Ile Asn Trp Trp Asp His

275 280 285

Ser Glu Glu Leu Ala Ser Leu Pro Arg Pro Asn Val Arg Glu Leu Glu

290 295 300

Arg Leu Val Arg Val Thr Leu Ala Asp Ala Met Tyr Arg Pro Lys Leu

305 310 315 320

Ser Thr Ile Gln Ala Gly Leu Leu Leu Ser Gln Arg Pro Glu Gly Asp

325 330 335

Gln Trp Ala Pro Thr Ala Gln Leu Val Ala Ile Gly Gln Glu Leu Gly

340 345 350

Leu His Leu Asp Cys Ser Ser Trp Lys Ile Pro Pro Trp Glu Arg Gly

355 360 365

Leu Arg Lys Arg Leu Ala Trp Ala Leu Tyr Met Gln Asp Lys Trp Gly

370 375 380

Ala Leu Ala His Gly Arg Pro Ser His Ile Phe Ser Ser Asn Trp Ala

385 390 395 400

Val Pro Val Leu Thr Pro His Asp Phe Pro Asp Ile Asp Trp Glu Glu

405 410 415

Ser Asp Ala Glu Ala Arg Ile Glu Thr Glu Arg Gly Arg Thr Leu Phe

420 425 430

Cys Gln Met Val Gln Leu Ser Gln Ile Leu Ala Glu Ile Leu Glu Thr

435 440 445

Phe Tyr Thr Leu Gln Ala Thr Arg Ala Val Ala Asn Ala Gly Pro Gln

450 455 460

Gly Thr Gln Leu Val Leu Ser Leu Ala Lys Pro Ile Gln Leu Lys Leu

465 470 475 480

Lys Glu Trp Tyr Ser Gly Leu Pro Asp Ser Val Arg Met Asp Ser Thr

485 490 495

Phe Gln Ser Ala Thr Leu Ser Gln Ser Asn Ser Ser Asn Asn Asn Asn

500 505 510

Asn Asn Arg Leu Ser Ser Ile Gly Tyr Leu His Leu Ala Tyr Phe Ala

515 520 525

Thr Glu Ile Thr Leu His Arg Arg Ile Ile Arg Ser Ile Asp Ala Ser

530 535 540

Cys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val

545 550 555 560

Asn Ser Thr Thr Ser Ser Asn Pro Ser Ser Thr Ala Ser Asn Ile Asp

565 570 575

Pro Tyr Ile Gln His Ile Cys Arg Ser Ala Ala Lys Ala Arg Leu Ile

580 585 590

Ser Ala Met Asp Phe Val Asn Arg Leu Thr Pro Ser His Leu Arg Ala

595 600 605

Phe Trp Tyr Phe Ala Ser Lys Thr Asn Phe Ala Leu Ile Gly Thr Phe

610 615 620

Gly Ser Leu Leu Trp Ala Thr Ser Pro Gly Arg Glu Glu Ala Asp Trp

625 630 635 640

Tyr Arg Arg Arg Leu Gly Glu Tyr Arg Trp Thr Leu Ser Val Ser Ser

645 650 655

Lys Pro Gly Glu Gly His Lys Gly Leu Thr Glu Phe Ala Met Gly Met

660 665 670

Leu Asp Ile Ser Thr Gly Leu Leu Lys Gln Leu Pro Glu Lys Pro Leu

675 680 685

Leu Ser Arg Ser Gly Ser Ala Val Asn Val Gly Val Gly Val Asn Ala

690 695 700

Glu Val Met Arg Ser Gln Ser Leu Leu Ala Leu Gly Thr Gly Thr Gly

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Ser Ala Gln Arg Gly Gly Tyr Gly Val Gly Ser Pro Ala Ser Ser Gly

725 730 735

Phe Gly Arg Met Gly Ser Met Ser Gly Phe Asn Glu Ser Tyr Val Arg

740 745 750

Gly Gly Pro Asp Arg Arg Tyr Gln Gln Pro Ala Arg Gly Asp Ala Ser

755 760 765

Gly Val Gln Ser Pro Arg Ser Ile Ser Ser Asp Ser Ser Asp Glu Gly

770 775 780

Gly Tyr Gly Asn Phe Ser Val Thr Ala Gly Met Ala Gly Leu Ala Asp

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<210> 8

<211> 5164

<212> DNA

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 8

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gagatacgta ctggtgtcaa gagagcgata aggctgcttc tccttcctct ccggtcatcg 120

ttctcctgct gctgccagcc gtgcaaaaca cacggagccc ctgttgtgtt gccgcaaagg 180

caggtgaaca aacagacaga cagacagaca gtggccaggc agtcggcgac caggtgtgcg 240

tttcacccca tcggttatcc tggggacttg tggcagggat tcaacctccc gagcctcaaa 300

taatctgtcc gcagttgtgc cgtcaacgag catcaacctt atctgcggtt cgctcttgct 360

tatcaaccct cggagacaag cgacaagtac ccccaaacgt aaccagtctt tcgatccatc 420

caggccggcc catccacctg cagcgtttct cgcgggtcct cctgtcagca gggctcaatc 480

cggggaacgc taacgtcctt gaaaagattc cgaaatccca gaatcatccc ccgggggcgt 540

tcgattgccc gtggaccctg tcgcctcctc gtccccagag tctcgaagac accattctgt 600

tctggttcca cacgggggcg cacgccacta cctcacccac ctccccgtgg ggctgaccat 660

tcagtaagct gtatcaacca cttggacttg tccatatctt cctcctgcct cttcctggtt 720

gggggtggca gcgttacccg catacgactt cagaaatact tggtcacagc atcagtcccc 780

cagtcacctg cggcactgct cctggcctga tcacagagca gattttgaat aggaaagtag 840

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tctgggacaa catttagggt aaatccggcc gcgatcgatc gtctctgtat cccccaaatc 960

gttatcatgt ccgttcccag tgccgtccca aggacggctc ccattgccat tgcgcccaaa 1020

cctcccccac gctttcctcc cagtcgacaa gcaagcatca actatagcga ctccttctcc 1080

ggtttccgaa gcggcatcaa caccccggac acagactctc taagtggaca accagcaagt 1140

ccctgtgaag cttgtctacg ccgtaggctt gagtgcgtca tgagtgatga cgaagagagc 1200

tgtgttgctt gccagacgaa tggtgcagaa tgttcgttgg gcgagagccc tccgccacgg 1260

aaacgcaagt tgaacggtga tgcagaggag agtggcagta aaagaaggtg cgaatgataa 1320

cttacctgca cacctccttc atcacacatg gcatcatcca tgagcggcgg cagccaacct 1380

cacgtgtctg cctcgtgtca tgctcttact tccctcccac caccttccgc tctcttcgag 1440

tttccccagc ttatctcaca aaccccataa ccccatctca gcttgagaca atcgttgatg 1500

tgcgtgttct gacatctgat tggttgttag cagttcccca gcacgatttg ataataggaa 1560

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ggagatggcg aactttggcg gcccaacctt gctaaagcgt acccttggtc ttcaatcaga 1680

caggtatagt cagtacatag ggccgacgac cgactttgag ccctcgctca tcaacctctc 1740

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ctttcgtata gtacatcccg gatttcccat tgtccaaaaa tcggtctttt atgaaaaata 1980

cgaccgatca catcgagaat tttcgccgcc gctccttgct gccatataca tcttggccat 2040

caactggtgg gatcattcgg aggaactggc gtcactgccg cgacccaatg ttcgggaact 2100

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gatgaacttg catgaaagtg tctgttgtag ttcaggcgga ggaaggctct gagtacatca 3660

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aggcggctgt ggctgggagg cgggggttgt ttttaattcc cgttgttcag gacaaccgca 3840

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cgtgcgaaag cacgcgatgc tattccccca aaatgggtgc cgatgacgtg ctaagaaagg 4020

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<211> 821

<212> PRT

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

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Met Asp Thr Pro Pro Thr Ala Phe Arg Gly Ser Glu Asp Glu Arg Ser

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Asp Gln Gln Arg Lys Arg Asn Arg Ile Arg Phe Ser Cys Thr Thr Cys

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Arg Glu Lys Lys Leu Lys Cys Asn Arg Gln Ser Pro Cys Asp Gln Cys

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Ile Lys Arg Asn Val Ala Ala Thr Cys Asn Phe Ile Pro Tyr Ala Gln

50 55 60

Asn Glu Pro Arg Pro Pro Pro Ser Val Ser Gly Thr Thr Pro Gly Ser

65 70 75 80

Gln Asn Ala Gly Ser Arg Asn Arg Arg Gly Ala Leu Gln Asp Met Thr

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Ala Ala Ala Arg Leu Arg His Leu Glu His Met Val Gln Val Leu Lys

100 105 110

Ala Gln Met Arg Arg Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Asp Val

115 120 125

Pro Val Ser Ser Ser Arg Ala Ile Ser Pro Val Pro Pro Ser Pro Ser

130 135 140

Ala Gln Asp Thr Gln Pro Asp Ala Glu Ser Ser Ala Pro Ser Lys Gly

145 150 155 160

Thr Ala Gly Ala Met Ala Asp Gln Thr Arg Tyr Val Glu Val Ile His

165 170 175

Trp Glu Ala Val Tyr Asp Glu Leu Thr Thr Leu Thr Lys Asn Leu Lys

180 185 190

Ala Ser Asp Glu Ser Asp Gln Glu Glu Glu Glu His Trp Ser Pro Arg

195 200 205

Ser Asn Met Pro Glu Arg Gln Pro Val Ser Val Leu Phe Ala Gly Gly

210 215 220

Tyr Ala Pro Val Ser Pro Ala Asp Leu Phe Arg Arg Met Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Val Cys Asp Arg Leu Leu Ser Ile Phe Phe Gln Val Lys Asp Ala

245 250 255

Ala Trp Ser Val Phe His Leu Pro Thr Leu Trp Arg Tyr Tyr Asp Ala

260 265 270

Leu Trp Gln Glu Asp Ala Glu Leu Thr Tyr Thr Asp Leu Ala Phe Phe

275 280 285

Phe Leu Leu Tyr Ala Asn Ser Ala Leu Phe Cys Ile His Thr Gly Glu

290 295 300

Glu Val Pro Gly Asn Leu Gly Ser Pro Met Gln Ala Tyr Ser Met Leu

305 310 315 320

Lys Ala Thr Gly Ala His Ala Leu Ala Leu Ser Asp Tyr Ser Thr Pro

325 330 335

Gly Lys Asn Lys Leu Glu Ala Leu Tyr Val Tyr Phe Ile Ala Glu Phe

340 345 350

Ile Gly Gln Pro Asp Ala Pro Leu Ser Thr Ser Ile Ile Phe Ala Asn

355 360 365

Ile Val Arg Leu Ala Met His Met Gly Leu His Arg Asp Pro Lys His

370 375 380

Tyr Pro Asn Met Ser Pro Phe Glu Gly Glu Met Arg Arg Arg Leu Trp

385 390 395 400

Leu Gln Phe Val Glu Val Asp Gln Ile Val Ala Phe Gln Phe Gly Leu

405 410 415

Pro Ser Asn Ile Gln Ser Arg Phe Tyr Asp Thr Glu Ile Pro Arg Asn

420 425 430

Leu Leu Asp Thr Asp Phe Asp Glu Asn Thr Lys Glu Leu Pro Pro Ser

435 440 445

Arg Pro Glu Ser Glu Met Thr Ser Val Leu Leu Asn Ile Val Lys Ser

450 455 460

Arg Met Ile Cys Ala Phe Ala Asp Ile Thr Ala Ala Met Cys Ser Arg

465 470 475 480

Asn Pro Ile Ser Tyr Ala Glu Val Ile Arg Leu Asp Lys Gln Leu Glu

485 490 495

Asp Ala His Asn Ser Leu Pro Pro Leu Leu Gln Phe Arg Asn Phe Ala

500 505 510

Glu Ser Lys Asp Asp Pro Ile Asp Val Val Met Gln Arg Phe Trp Met

515 520 525

Glu Leu Met Tyr Gln Lys Ala Arg Ile Val Leu His Arg Arg Tyr Met

530 535 540

Gly Ile Gly Arg Thr Asp Lys Arg Tyr Ala His Ser Gln Gln Val Cys

545 550 555 560

Leu Asp Ala Ala Thr Lys Thr Leu Arg Gly Gln Phe Asp Leu Tyr Cys

565 570 575

Glu Arg Gln Pro Gln Gly Arg Leu Ala Ser Glu Lys Asn Gly Gln Phe

580 585 590

Phe Arg Ala Ser Ile Thr Thr His Asp Phe Leu Leu Ala Gly Met Ile

595 600 605

Leu Cys Leu Glu Leu Ser His Ile Arg Ala Arg Glu Lys Arg Glu Ala

610 615 620

Ser Pro Cys Gly Thr Arg Pro Ser Ala Val Glu Asn Asp Val Ile Ser

625 630 635 640

Lys Asp Ala Leu Met Gln Met Leu Glu Thr Ser Arg Gln Ile Trp Gln

645 650 655

Ser Thr Arg Lys Glu Ser Thr Glu Ala Asn Arg Ala Phe Lys Ile Leu

660 665 670

Ser Lys Met Leu Cys Leu Ser Thr Gly Ala Val Phe Glu Ser Ser Pro

675 680 685

Glu Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Asp Ser Thr Gln Ala Ser Ile Tyr Thr

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Asn Pro Gln Pro Ala Thr Ala Val Met Gly Ala Asn Pro Tyr Tyr Tyr

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Thr Gln Pro Gln Ala Pro Thr Ala Met Ser Gln Thr Val Pro Val Ala

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Ile Pro Ile Val Met Pro Pro Thr Thr Thr Ile Pro His Pro Glu Gln

740 745 750

Met Gln Tyr Pro Leu Ala Trp Gln Pro Asp Leu Pro Pro Pro Ile Gly

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Pro Val Asp Leu Ser Pro Tyr Asn Thr Met Asp Gln Phe Met Asp Pro

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<210> 10

<211> 2641

<212> DNA

<213> 粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)

<400> 10

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cgcggccacc aagacgttgc gaggccagtt cgatctttat tgtgagcggc agccccaggg 1800

gcgattggct tcggagaaaa acgggcaatt tttccgagcc agtattacca ctcacgactt 1860

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ggaggcatct ccttgtggca cgcggcctag cgccgttgag aacgacgtca tctcgaaaga 1980

cgcattgatg cagatgctcg agacgtcgcg gcaaatttgg cagtcgacac ggaaggagtc 2040

aactgaagca aatagggcct ttaagattct gtccaagatg ctctgtttat caacaggagc 2100

cgtgttcgag agcagtcctg aatcgtcggg aagcgcatac gactcgaccc aggcgtctat 2160

ttataccaac ccccagccag gtaagcaacc tttttcgtga tgtttgtgca gcctaccgag 2220

actaatactg ctcacggaag cgacggcagt gatgggtgca aatccctatt actacacgca 2280

gccccaggct cccaccgcca tgagccagac cgtacccgtt gctataccca tagtcatgcc 2340

accaacaacc acaattccac accccgagca gatgcaatat cctctggcgt ggcagccgga 2400

cctcccccct ccgataggac ccgtggacct ttccccttac aacacaatgg accagttcat 2460

ggatccgagc ttgacagccg actgggtaag caaaaggaag ctggttggtg cgggcagtaa 2520

caagaagcta acatggatac aacagaactt ctgggacaat caggtccaca acacgaacgc 2580

tgacgagctc caaataccgt ggaatacgtt tttcaaccct cagatgccag gctatcaata 2640

a 2641

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 11

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<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 12

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 15

gtcctcccac ctccccaat 19

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 16

gctctagaat gtccaatcat catgagaatc ctg 33

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 17

ggactagtaa cgggtgcgaa aaccgcag 28

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 18

gctctagaat gtccgttccc agtgccgtc 29

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 19

ggactagtgt ccgccagccc agccattc 28

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 20

gaatgcggcc gctcatcaac agtcgcttgt ccac 34

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 21

tgctctagat ttgacggttg atgtgctgac tg 32

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 22

tctagaatgc tgagctcaca gaacccg 27

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 寡核苷酸

<400> 23

ccttaattaa ttgatagcct ggcatctgag ggttg 35

Claims (7)

1.遗传操作丝状真菌宿主用于改善蛋白质生产的方法，其是通过遗传操作使丝状真菌宿主中基因表达水平提高，其中，所述基因选自编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因；编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因；编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的基因；编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的基因；或者编码氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的基因的一种或多种，所述的丝状真菌为脉孢菌(Neurospora)；其中所述改善蛋白质生产是指改善纤维素酶和/或木聚糖酶的生产。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的丝状真菌为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述丝状真菌宿主经遗传操作后提高下述组的基因的表达水平：(1)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因和编码氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示的基因；或者(2)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的基因和编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的基因。

4.一种重组丝状真菌宿主，其中通过遗传操作使所述重组丝状真菌宿主中的基因表达水平得到提高，其中，所述基因选自编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因；编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因；编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的基因；编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的基因；或者编码氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的基因中的一种或多种；其中，所述的丝状真菌为脉孢菌(Neurospora)。

5.根据权利要求4所述的重组丝状真菌宿主，其中所述的丝状真菌为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。

6.根据权利要求4至5任一项所述的重组丝状真菌宿主，其中所述的重组丝状真菌宿主经遗传操作后下述各组的基因表达水平得以提高：(1)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因和编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因；(2)编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的基因和编码氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的基因；或者(3)编码氨基酸序列如SEQID NO:9所示的基因。

7.利用如权利要求4至6任一项所述的重组丝状真菌宿主降解木质纤维素材料的方法，其特征在于，在木质纤维素原料存在下，培养权利要求4至6任一项所述重组丝状真菌宿主，从而降解木质纤维素。

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