CN106916877A - 一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒 - Google Patents

一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测试剂盒，其包括用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂。本发明方案的优势在于相较其他方法可以同时获得很高的特异性和灵敏度。并且，其操作简单，适合用于大规模的临床检测。

Description

一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种结核分枝杆菌利福平耐药突变的检测试剂盒。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种危害人类健康的慢性传染病，是世界卫生组织重点控制的疾病之一。结核病(TubercuLosis,TB)是由结核分枝杆菌(MycobacteriumtubercuLosis，MTB)感染引起的以呼吸道传播为主的传染病，是单因致死率最高的慢性传染性疾病。据WHO估计，全世界约有1/3人口为结核带菌者，其中约5-10％的携带者可发展为活动性结核病，每年新发病例1000万，超过300万人死亡。我国作为全球22个结核病高负担国家之一，肺结核病人的数量仅次于印度而位居世界第二，且我国肺结核具有感染率高(占总人口的44.5％)、发病率高和耐药率高等流行特点。第五次中国结核病流行病学抽样调查(2010年)的结果显示，我国现有活动性肺结核患者总数为523万(其中传染性肺结核患者总数为134万)，总体耐药率36.8％。为控制结核危机WHO制订全程督导短程化学治疗策略作为国家结核病规划的核心内容，其重点在于化疗治疗药物的正规使用。目前一线口服抗结核药物为异烟肼，利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇及链霉素。
近几十年来，耐药结核病向全球结核病控制提出了严峻的挑战。WHO估算全球耐多药结核约有100万例，中国占26.7％。中国每年发生耐多药结核病患者为全球最高，约占全球病例的1/4。结核分枝杆菌是慢生长分枝杆菌，常规的药敏试验需3-4周，液体快速培养法也需要8-14天，因此结核患者通常不能得到及时有效的治疗，导致耐多药结核患者结核菌的增殖和传播。
目前研究的热点耐药位点主要集中在利福平耐药基因rpoB,即分枝杆菌RNA聚合酶α亚单位的编码基因，95％的结核杆菌利福平耐药与rpoB基因利福平耐药决定区突变有关，且突变无地区差异，突变点主要是516位、526位和531位密码子。
目前，利福平耐药突变检测方法有：ARMS荧光PCR法、探针熔解曲线法、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、基因芯片等方法。这些方法都有各自的优点和缺陷，尚有待改进和标准化。
1、ARMS荧光PCR法：扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出基因突变。
2、探针熔解曲线法：其原理是在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点(Tm值)，从而判读结果，其优点是闭管操作，结果判读简单，缺点是灵敏度有待提高。
3、限制性片段长度多态性方法(RFLP)：该方法成本低，对检测设备要求低，突变基因的检出限在5-10％。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和大规模临床应用。
4、基因芯片法：该方法是将探针固定于支持物上，如玻片或膜，通过PCR方法扩增出靶基因，再通过杂交手段进行芯片杂交，应用仪器进行结果判读。该方法可以进行高密度基因检测，但成本高、操作繁琐、检测流程相对较长，在市场推广上将受到一定限制。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种能在灵敏度和特异性均足够高的检测结核分枝杆菌利福平耐药突变的试剂盒。
发明首先提供了一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，包括用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂。
进一步地，发明提供了一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，包括：
a.结核分枝杆菌DNA提取试剂；
b.用于扩增利福平耐药突变相关基因的试剂；
c.用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂；
d.用于对连接产物进行探针检测的试剂。
本发明提供的方法包括：
步骤1、提取经培养的结核分枝杆菌的样本基因组DNA；
步骤2、以步骤1为模板经PCR分别扩增出耐利福平的基因片段；
步骤3、应用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应；
步骤4、连接产物经毛细管电泳法进行连接探针的片段检测。
不同于目前用于福平耐药突变检测的ARMS荧光PCR法、探针熔解曲线法、RFLP或基因芯片法等，本发明采用的是PCR扩增结合OLA法来检测福平耐药突变。
发明人经过与多种方法的比较发现，在检测福平耐药突变方面，通过本发明所筛选到的探针，采用PCR结合OLA法检测福平耐药突变可以同时获得良好的灵敏度和特异性。这在福平耐药突变检测方面是非常有利的。由于利福平耐药菌株的检测是通过检测混合菌株中的耐药菌株，在检测耐药菌株的时候，会有敏感菌株的干扰。如果耐药菌株在整个菌群中所在比例有限，既要检测出耐药菌株，同时保证不能检测出敏感菌株，基因OLA方法检测耐药菌株具有一定的优势。
本发明采用了优化的扩增引物对结核分枝杆菌DNA的目标片段进行扩增。该引物根据结核分枝杆菌利福平耐药决定区(RRDR)所在的rpob基因序列(Genbank:L27989)设计，并经过发明人的筛选最终获得最优选的引物：
rpoBSF:SEQ NO ID.11 GTCGGCATGTCGCGGATGGAGCGGGT；
rpoBSR:SEQ NO ID.12 GCA CGT CGC GGA CCT CCA GCC。
进一步地，本发明提供了进行扩增的PCR体系，包括：
5X Taq PCR Buffer：1X
dNTP：0.1mM-2mM
Mg2+：1mM-4mM
引物：0.1uM-0.5uM
Taq DNA聚合酶：0.5-5U
DNA模板：2×104菌/mL-2×107所提取的DNA。
探针组的选择在本发明方案中是十分重要的因素，因其对最终检测的灵敏度和特异性起着重要的影响作用。探针的长度也需要非常考究地选择，这由突变位点及其所处环境的特点决定，发明人发现即使碱基序列类似的探针，但因长度不同，特异性及灵敏度均受到其影响。
在本发明的一个特别优选的实施例中，采用了如下探针。
探针组1：
R516A1：SEQ NO ID.1 AGCTGAGCCAATTCATGGA；
R516A2：SEQ NO ID.2 AGCTGAGCCAATTCATGGC；
R516A3：SEQ NO ID.3 AGCTGAGCCAATTCATGGG；
R516A4：SEQ NO ID.4 AGCTGAGCCAATTCATGGT；
R516B1：SEQ NO ID.5 CCA GAA CAA CCC GCT GTCATC；
探针组2：
R526A1：SEQ NO ID.6 CTGTCGGGGTTGACCC；
R526A2：SEQ NO ID.7 CTGTCGGGGTTGACCA；
R526B1：SEQ NO ID.8 ACAGCGCCGACTGTCAATAAAA；
探针组3：
R531A1：SEQ NO ID.9 CACAGCGCCGACTGTC；
R531B1：SEQ NO ID.10 GGCGCTGGGGCCCAATAACAATG。
上述SEQ NO ID.5、SEQ NO ID.8和SEQ NO ID.10的3’端连接荧光基团。
荧光基团可选地为FAM，其他可用的荧光基团有HEX，TET，JOE，ROX，CY3，CY5，TAMRA等。
探针组1、2、3分别可针对结核分枝杆菌利福平耐药决定区(RRDR)所在的rpob相关突变位点：rpoB516、rpoB526、rpoB531进行检测。
进一步优选地，本发明提供了荧光标记探针杂交、连接反应的OLA体系，包括：
10X Taq DNA ligase Buffer：1X
探针：各100-200pM
Taq DNA ligase酶：0.1-1U
模板：PCR产物稀释15-20倍。
采用本发明试剂盒进行检测的实施步骤如下：
步骤1、提取经培养的结核分枝杆菌的样本基因组DNA；
步骤2、以步骤1为模板经PCR分别扩增出耐利福平的基因片段；
步骤3、应用寡核苷酸连接分析表型法Genotyping by Oligonucleotide Ligation Assay(OLA进行荧光标记探针杂交、连接反应)；
步骤4、连接产物经毛细管电泳法进行连接探针的片段检测。
上述步骤1中所用的样本为经培养的样本，所用煮沸法进行DNA提取。
作为一种示例性实施方案，上述步骤2中所用PCR扩增体系和扩增程序如下：
扩增体系：
扩增程序：
作为一种示例性实施方案，上述步骤3中所用的OLA连接反应条件和反应程序如下：
反应条件：
反应程序：
连接反应结束后，OLA连接产物经毛细管电泳检测，判读有无连接产物，确定耐药基因突变情况。
探针的序列和长短在本发明中是非常重要的选择之一，其对灵敏度和特异性具有重要的影响。发明在特定引物扩增出目标片段之后，针对该目标片段，摸索出针对不同突变位点的探针组合，发现探针组1、2、3分别针对rpoB516、rpoB526、rpoB531，可以获得相较其他探针更好的灵敏度和特异性(表1)。尤其是针对rpoB516的探针组1，在本发明方法中获得了高达97.6％的灵敏度和98.2％的特异性。能同时在灵敏度和特异性方面获得如此优良的性能，该方案的有益性是十分突出的。
本发明方案的优势在于相较其他方法可以同时获得很高的特异性和灵敏度。并且，其操作简单，适合用于大规模的临床检测。
附图说明
图1为以rpob516A2、B1探针检测为例，不同突变率的检测结果。本方法可以检测出低至10％的突变的耐药菌株，未突变菌株几乎没有连接产物，特异性高。
图2为对比引物的扩增结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1经培养结核分枝杆菌DNA提取
将采用酸性罗氏培养基培养的结合杆菌经水煮裂解法进行DNA提取。具体情况如下：1)经固体培养的结核分枝杆菌，用接种环收集细菌1环至500uL DNA提取液，99℃加热20-25分钟，13500rpm离心15分钟，转移上清至1.5mL离心管备用；2)经液体培养的结合分枝杆菌，取1mL在10000rpm离心15分钟，去上清，加入500uL DNA提取液，99℃加热20-25分钟，13500rpm离心15分钟，转移上清至1.5mL离心管备用。所提样本于-20℃以下保存，避免反复冻融。
实施例2 PCR扩增耐利福平基因片段
根据结核分枝杆菌利福平耐药决定区(RRDR)所在的rpob基因序列(Genbank:L27989)设计引物，所用的PCR扩增引物如下：
rpoBSF:SEQ NO ID.11GTCGGCATGTCGCGGATGGAGCGGGT
rpoBSR:SEQ NO ID.12GCA CGT CGC GGA CCT CCA GCC
所用PCR扩增体系和扩增程序如下：
扩增体系：
其中PCR反应混合液(MIX)包括5X Taq PCR Buffer、dNTP(100mM)、Mg2+(25mM)、Primer-F(10uM)、Primer-R(10uM)、Taq DNA聚合酶(5U/uL)、蒸馏水，反应用量如上表所示，采用整体配制，然后分装，按反应数每孔/管加入20uL Mix。
加模板，按顺序分别在阳性对照反应孔/管、阴性对照反应孔/管、样本反应孔/管中依次加入5uL阳性对照、阴性对照、样本DNA。
扩增程序：
上述所示引物是在实验摸索出的优选引物。其扩增效率最高，同时不会非特异性扩增。
其他引物仅示例性地列举如下：
rpoBSF2:SEQ NO ID.35 ATGTCGCGGATGGAGCGGGT
rpoBSR2:SEQ NO ID.36 TCGCGGACCTCCAGCCCGGCA
引物的实验结果对比列举如下：引物序列SEQ NO ID.35，SEQ NO ID.36其扩增效率与SEQ NO ID.11，SEQ NO ID.12相当，但在500bp位置有非特异性扩增。结果如图2所示。
实施例3 OLA连接反应
备好多种探针A、探针B(探针B连接荧光基团FAM)，如表1所示。并且进一步进行连接反应。所用的OLA连接反应条件和反应程序如下：
反应条件：
具体配制过程：OLA反应混合液(MIX)包括10X Taq DNA ligase Buffer、探针A(10uM)、探针B(10uM)、Taq DNA ligase酶(40U/uL)、蒸馏水，反应用量如上表所示，采用整体配制，然后分装，按反应数每孔/管加入20uL Mix。其中模板为PCR产物稀释15-20倍后，取5uL进行连接反应。
反应程序如下：
连接反应结束后，取1uL连接产物进行毛细管电泳检测电泳信号检测。
检测样本包括：样本编号1001-1015，合计150例标本。其中516位点突变株41例，未突变株109例，526位点突变株19例，未突变株131例，531位点突变株23例，未突变株127例。
检测结果的灵敏度及特异性分析：具体检测的型别与测序法对比检测，分析每个位点的灵敏度和特异性，计算方法参照下表：
灵敏度＝A/G×100％，特异性＝D/H×100％。
部分探针的结果显示如表1。
表1.不同探针的灵敏度及特异性
上述表格仅示例性地列出了部分探针及优选探针。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，其特征在于包括：
用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂。
2.一种结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒，其特征在于包括：
a.结核分枝杆菌DNA提取试剂；
b.用于扩增利福平耐药突变相关基因的试剂；
c.用于采用OLA方法进行荧光标记探针杂交、连接反应的试剂；
d.用于对连接产物进行探针检测的试剂。
3.如权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，包括探针组，所述探针组选自以下任意一组或多组：
探针组1：
R516A1：SEQ NO ID.1 AGCTGAGCCAATTCATGGA；
R516A2：SEQ NO ID.2 AGCTGAGCCAATTCATGGC；
R516A3：SEQ NO ID.3 AGCTGAGCCAATTCATGGG；
R516A4：SEQ NO ID.4 AGCTGAGCCAATTCATGGT；
R516B1：SEQ NO ID.5 CCA GAA CAA CCC GCT GTCATC；
探针组2：
R526A1：SEQ NO ID.6 CTGTCGGGGTTGACCC；
R526A2：SEQ NO ID.7 CTGTCGGGGTTGACCA；
R526B1：SEQ NO ID.8 ACAGCGCCGACTGTCAATAAAA；
探针组3：
R531A1：SEQ NO ID.9 CACAGCGCCGACTGTC；
R531B1：SEQ NO ID.10 GGCGCTGGGGCCCAATAACAATG。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于所述SEQ NO ID.5，SEQ NO ID.8和SEQNO ID.10的3’端连接荧光基团。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于所述荧光基团为FAM，HEX，TET，JOE，ROX，CY3，CY5或TAMRA。
6.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，包括扩增引物，所述扩增引物选自：
Primer-F:SEQ NO ID.11 GTCGGCATGTCGCGGATGGAGCGGGT；
Primer-R:SEQ NO ID.12 GCA CGT CGC GGA CCT CCA GCC。
7.一种利用如权利要求5所述试剂盒的PCR体系，其特征在于包括：
5X Taq PCR Buffer：1X
dNTP：0.1mM-2mM
Mg2+：1mM-4mM
引物：0.1uM-0.5uM
Taq DNA聚合酶：0.5U-5U
DNA模板：2×104菌/mL-2×107所提取的DNA。
8.一种利用如权利要求3所述试剂盒的OLA体系，其特征在于包括：
10X Taq DNA ligase Buffer：1X
探针：各100pM-200pM
Taq DNA ligase酶：0.1U-1U
模板：PCR产物稀释10-20倍。
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