CN106928079A - 氟乐灵半抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

氟乐灵半抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了氟乐灵半抗原及其制备方法和应用，其具有如下结构式：其中，R为‑(CH2)n‑，n＝1‑4或‑CH＝CH‑或

Description

氟乐灵半抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及氟乐灵半抗原及其制备方法和应用。
背景技术
氟乐灵(trifluralin)是一种重要的选择性芽前二硝基苯胺类(dinitroaniline)除草剂，广泛用于大豆、大麦、蔬菜及水果等作物，防除一年生禾本科杂草及部分阔叶杂草。氟乐灵虽属低毒农药，但长期暴露实验表明会对肝脏和肾脏造成损伤，在高剂量暴露下会造成胎儿的体重和身高偏低并增加流产风险。因氟乐灵农药的广泛使用，使其在土壤和水体当中的残留普遍存在，特别是能够在水产品(鱼、虾、蟹)体内富集，从而对水产品的食用安全带来巨大隐患。
为了避免氟乐灵除草剂的潜在危害，很多国家对其使用进行了限制。欧盟2015年对氟乐灵制定新的限量标准，水果、蔬菜、谷物及动物源食品中氟乐灵的最大残留限量(MRLs)为0.01mg/kg。日本对进口水产品中氟乐灵最大残留限量为0.001mg/kg。
目前农产品中氟乐灵的检测通常使用仪器分析的方法，如紫外光谱、高效液相色谱及液质联用、气相色谱、毛细管电泳等。以上的分析方法具有准确、灵敏的特点，但由于仪器昂贵、运行成本高难以全面推广。实践证明，以快速检测方法对大量样品进行初筛，然后对其中阳性样品进行仪器确证是提高检测效率、降低成本的有效方式，符合我国国情。在现有快速检测技术中，基于抗原-抗体特异性识别的免疫检测技术由于具有灵敏、快速、准确、成本低廉且可实现现场检测等优势，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的超微量检测技术。
关于氟乐灵免疫检测的文献国外仅有数篇报道。Bruce Riggle于1991年第一尝试构建了针对氟乐灵的酶联免疫分析方法，线性范围0.1～1.0ppm(ng/mL)，同时可以检测部分氟乐灵的代谢物。Székács et al 2000年对氟乐灵免疫检测进行了再次尝试并建立了ELISA方法，检测的线性的范围有所提高(0.1～100ng/mL)，与其他结构类似物的交叉反应率≤5％，并检测了地表水和果汁中的氟乐灵含量。Székács课题组于2003年又建立了基于免疫传感器的光波介导的光谱检测(optical waveguide lightmode spectroscopicdetection，OWLS)方法，虽然此方法大大提高了检测灵敏度(2×10-7～3×10-5ng/mL)，但是此种方法因仪器条件问题难以在实际检测中应用。目前，国内未见有关氟乐灵免疫检测的相关报道。国内检测市场上更是缺少氟乐灵农药残留免疫检测试剂盒的产品。
现在大部分药物、毒素、环境污染物分子质量比较小，属于半抗原，大部分半抗原需要与蛋白质偶联后才能产生免疫原性。目前制备半抗原抗体的常规方法是选择具有毒理学意义的原形药物作为待测物，通过设计合成保留待测物分子结构特征或类似结构特征并带有活性基团的半抗原，通过半抗原与大分子蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，同时经动物免疫制备针对半抗原的特异性抗体。而半抗原的提供是免疫化学分析中最为关键的步骤，合理的半抗原设计和制备将有利于抗体的质量的提高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一系列可通用于氟乐灵检测的半抗原，所述半抗原偶连载体蛋白后能使机体产生效价高，能识别氟乐灵农药共有结构的特异性抗体。
本发明的另一个目的是提供所述半抗原的制备方法和应用。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种氟乐灵半抗原，其特征在于，具有如下结构式：
其中，R为-(CH2)n-，n＝1-4或-CH＝CH-或
本发明氟乐灵半抗原具体具有以下1c、2c、3c、4c、5c和6c所示的结构式：
以下为本发明的半抗原分子的制备过程的描述。
1.本发明半抗原合成所涉及的反应方程式表示如下：
1c：R＝-(CH2)-1
2c：R＝-(CH2)-2 n＝1
3c：R＝-(CH2)-3 n＝2
4c：R＝-(CH2)-4 n＝3
5c：R＝-(CH＝CH)-
6c：
2.本发明所涉及的六种氟乐灵半抗原合成步骤如下：
(一)氟乐灵半抗原结构为1c、2c、3c或4c时，其合成步骤包括：在催化剂存在下，将底物与烷基化试剂进行烷基化反应，纯化后获得仲胺中间体，仲胺中间体进行水解反应获得第二中间体，第二中间体再与4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯混合反应，经纯化后获得目标半抗原分子。
进一步地，将丙烯酸乙酯溶于氯仿，加入正丙胺，其中，丙烯酸乙酯和正丙胺的摩尔比为1∶1.5，40℃油浴，搅拌反应，获得含酯基的仲胺中间体；将含酯基的仲胺中间体溶解于四氢呋喃，加入氢氧化钠水溶液，室温搅拌进行水解，获得第二中间体；向上述第二中间体中加入4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯，室温搅拌，反应结束后进行酸碱倒萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得半抗原分子(1c)。
进一步地，将2-吡咯烷酮溶于DMF，依次加入60％的氢化钠溶液和正溴丙烷，其中，2-吡咯烷酮、氢化钠和正溴丙烷的摩尔比为：1∶1.2∶1.3，在氮气保护下，70℃油浴，搅拌反应；反应结束后，萃取反应混合液，合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得含酯基的仲胺中间体；向含酯基的仲胺中间体中加入4N氢氧化钠水溶液，于100℃油浴搅拌过夜进行水解，获得第二中间体；将4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯溶解于四氢呋喃，加入上述第二中间体，4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯与第二中间体的摩尔比为1∶1.5，室温搅拌反应；反应完全后加水稀释，加稀盐酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得半抗原分子(2c)。
进一步地，将戊内酰胺溶于DMF，依次加入60％的氢化钠溶液和正溴丙烷，其中，戊内酰胺、氢化钠和正溴丙烷的摩尔比为：1∶1.2∶1.2，在氮气保护下，70℃油浴，搅拌反应；反应结束后，加水稀释，并加酸调节pH至2-3，出现沉淀物，用乙酸乙酯萃取，再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得含酯基的仲胺中间体；向含酯基的仲胺中间体中加入37％盐酸和水，100℃油浴，冷凝回流进行水解，获得第二中间体；将4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯溶解于四氢呋喃，加入上述第二中间体、三乙胺和水，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯与第二中间体的摩尔比为1:1.2，室温搅拌反应；反应完全后加水稀释，加稀盐酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得半抗原分子(3c)。
进一步地，将己内酰胺溶于DMF，依次加入60％的氢化钠溶液和正溴丙烷，其中，戊内酰胺、氢化钠和正溴丙烷的摩尔比为：1:1.2:1.2，在氮气保护下，70℃油浴，搅拌反应；反应完全后加水稀释，加稀盐酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得含酯基的仲胺中间体；向含酯基的仲胺中间体中加入37％盐酸和水，100℃油浴，冷凝回流进行水解，获得第二中间体；将4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯溶解于四氢呋喃，加入上述第二中间体、三乙胺和水，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯与第二中间体的摩尔比为1:3，室温搅拌反应；反应完全后加水稀释，加稀盐酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得半抗原分子(4c)。
本发明的发明人经过多方面研究尝试发现，氟乐灵半抗原结构为1c时，通过恰当变量其制备工艺条件和参数，生成含酯基的仲胺中间体，保护羧基不与其他基团发生反应，此步骤大大提高了氟乐灵半抗原的纯度和产率。氟乐灵半抗原结构为2c、3c或4c时，发明人在众多的底物和烷基化试剂中进行选择，通过恰当变量其制备工艺条件和参数，大大提高了氟乐灵半抗原的纯度和产率。
(二)氟乐灵半抗原结构为5c或6c时，其合成步骤包括：底物与正丙胺通过酰基化反应，生成含酯基的仲胺中间体，含酯基的仲胺中间体再与4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯反应，经纯化后获得第二中间体，第二中间体再进行水解反应。
进一步地，将4-溴巴豆酸乙酯溶于乙酸乙酯，将反应器置于冰-甲醇中降温至-15℃，用注射器缓慢加入正丙胺，4-溴巴豆酸乙酯与正丙胺的摩尔比为1:3，常温搅拌反应。反应结束后，乙酸乙酯萃取反应混合液，再用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得含酯基的仲胺中间体；将含酯基的仲胺中间体溶于四氢呋喃中，加入4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯和三乙胺，室温搅拌反应，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯与含酯基的仲胺中间体的摩尔比为1:1.5；反应完全后加水稀释，加稀盐酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物经柱层析分离纯化，旋转蒸干溶剂获得半抗原分子(5c)。
进一步地，将4-溴甲基苯甲酸甲酯溶于乙酸乙酯，将反应器置于冰-甲醇中降温至-15℃，用注射器缓慢加入正丙胺，4-溴甲基苯甲酸甲酯与正丙胺的摩尔比为1:2.5。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应混合液，再用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相合并，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，获得含酯基的仲胺中间体；将含酯基的仲胺中间体溶于四氢呋喃中，加入4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯和三乙胺，室温搅拌反应，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯与含酯基的仲胺中间体的摩尔比为1:1.5；反应完全后加水稀释，加稀盐酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物经柱层析分离纯化，旋转蒸干溶剂获得半抗原分子(6c)。
本发明还提供一种氟乐灵人工免疫原和包被原，其是将上述氟乐灵半抗原与载体蛋白偶联得到。
本发明还提供一种氟乐灵抗体，所述氟乐灵抗体采用上述氟乐灵人工免疫原制备得到，所述氟乐灵抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的六种半抗原均是在氨基位点上衍生连接手臂，具有活性羧基，与载体蛋白偶联后能使机体产生效价高，能识别氟乐灵农药共有结构的特异抗体。
(2)本发明的半抗原化合物，不仅合成方法简便、纯度较高，而且能应用于合成适于动物免疫的抗原体系，弥补了国内氟乐灵免疫学检测方法技术领域的空白，为氟乐灵免疫检测方法的进一步发展奠定了基础。
(3)本发明对氟乐灵半抗原的制备方法进行改进，合成步骤简单，所需的实验条件温和，本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原的纯度和产率较高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1：氟乐灵半抗原化合物1c的合成方法如下：
(1)丙烯酸乙酯(3600mg，36mmol)溶于30mmol的氯仿，加入正丙胺(3191.94mg，54mmol)油浴40℃搅拌12h，获得含酯基的仲胺中间体1a。
(2)将1a(239mg，1.5mmol)溶解于6ml四氢呋喃，加入NaOH水溶液(120mg，3mmol)，室温搅拌，进行水解，水解后获得1b。
(3)直接往1b中加入3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)，常温搅拌。用比例为正己烷:乙酸乙酯＝2:1的层析液进行点板跟踪，待反应完成后进行酸碱倒萃取，酸萃有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，用层析液为正己烷:乙酸乙酯:乙酸＝2:1:0.015上硅胶板分离，获得目标物1c，称重，收率为75.6％。ESI-MS analysis(negative):m/z 366.2[M+H]—；1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.03(s,2H)；3.29(t,J＝6.3Hz,2H)；2.89–2.84(m,2H)；2.57–2.51(m,2H)；1.60–1.50(m,2H)；0.81(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例2：氟乐灵半抗原化合物2c的合成方法如下：
(1)2-吡咯烷酮(1000mg，11mmol)溶于10mlDMF，加入13.2mmol NaH(60％)、正溴丙烷(1758.9mg，14.3mmol)，在氮气保护下，70℃油浴搅拌过夜。反应液中加入70ml乙酸乙酯，50ml饱和氯化铵溶液进行萃取，有机相合并，无水硫酸钠干燥。40℃旋干，获得含酯基的仲胺中间体2a。
(2)将2a(846mg，6mmol)加入13ml 4N NaOH水溶液于100℃油浴搅拌过夜进行水解，获得2b。
(3)将3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)溶解于6ml四氢呋喃，加入2b(190.5mg，1.5mmol)，室温搅拌。用30ml水进行稀释，加1M盐酸调pH至2-3，沉淀物出现。用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯用量为30ml，沉淀溶解，10ml饱和食盐水进行洗涤，有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，用层析液为正己烷:乙酸乙酯＝1:1上硅胶板进行分离，获得目标物2c，称重，收率为82.4％。ESI-MS analysis(negative):m/z380.1[M+H]—；1HNMR(600MHz,CDCl3)δ8.00(s,2H)；3.07–2.98(m,2H)；2.94–2.86(m,2H)；2.34(t,J＝7.2Hz,2H)；1.89–1.79(m,2H)；1.55(dd,J＝14.9,7.5Hz,2H)；0.81(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例3：氟乐灵半抗原化合物3c的合成方法如下：
(1)戊内酰胺(2180mg，20mmol)溶于10mlDMF，加入24mmol NaH(60％)、正溴丙烷(2950mg，24mmol),70℃油浴搅拌，在氮气保护下反应4-5小时。用50ml水进行稀释，加1M盐酸调pH至2-3，沉淀物出现。用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯用量为50ml，沉淀溶解，15ml饱和食盐水进行洗涤，有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，获得含酯基的仲胺3a，称重，收率为55％。
(2)3a(846mg，6mmol)中加入2.5ml 37％盐酸、和2.5ml水，100℃油浴冷凝回流进行水解4-5小时，获得水解产物3b。
(3)将3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)溶解于6ml四氢呋喃，加入3b(235mg，1.2mmol)、三乙胺(404mg，4mmol)、和1ml水，常温搅拌过夜。用30ml水进行稀释，加1M盐酸调pH至2-3，沉淀物出现。用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯用量为30ml，沉淀溶解，用10ml饱和食盐水进行洗涤，有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，用层析液为正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝4：1：0.02上硅胶板进行分离，获得目标物3c，称重72mg，收率为65.3％。ESI-MS analysis(negative):m/z 394.3[M+H]—；1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.06(s,2H)；3.04(t,J＝6.9Hz,2H)；3.01–2.94(m,2H)；2.36(t,J＝6.8Hz,2H)；1.74–1.50(m,6H)；0.88(t,J＝7.4Hz,3H)。
实施例4：氟乐灵半抗原化合物4c的合成方法如下：
(1)己内酰胺(2260mg，20mmol)溶于10mlDMF，加入24mmol NaH(60％)、正溴丙烷(2950mg，24mmol)，70℃油浴搅拌，在氮气保护下反应2h。用50ml水进行稀释，加1M盐酸调pH至2-3，沉淀物出现。用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯用量为50ml，沉淀溶解，用15ml饱和食盐水进行洗涤，有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，获得含酯基的仲胺中间体4a，称重，收率为55％。
(2)4a(930mg，6mmol)加入2.5ml 37％盐酸、和2.5ml水，100℃油浴冷凝回流进行水解过夜，获得水解产物4b。
(3)3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(450mg，1.67mmol)溶解于15ml四氢呋喃，加入4b(1047.5mg，5mmol)、三乙胺(1686.7mg，16.7mmol)、和2ml水，常温搅拌过夜。用90ml水进行稀释，加1M盐酸调pH至2-3，沉淀物出现。用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯用量为90m，沉淀溶解，用30ml饱和食盐水进行洗涤，有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，用正己烷：乙酸乙酯＝20：1、10：1、5：1、4：1的层析液比例进行柱层析分离，40℃旋干，获得目标物4c，称重73.2mg，收率为58％。ESI-MS analysis(negative)m/z 408.3[M+H]—；1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.06(s,2H)；3.1(t,J＝7.2Hz,2H)；2.98-2.93(m,2H)；2.34(t,J＝7.2Hz,2H)；1.64-1.57(m,6H)；1.37-1.29(m,2H)；0.88(t,J＝7.8Hz,3H)。
实施例5：氟乐灵半抗原化合物5c的合成方法如下：
(1)4-溴巴豆酸乙酯(965mg，5mmol)溶于15ml乙酸乙酯，将反应器置于冰-甲醇(预先冷冻)中降温至-15℃，用注射器缓慢加入正丙胺(885mg，15mmol)，常温搅拌4-5小时。用80ml乙酸乙酯萃取，30ml水洗，10ml饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。低于30℃旋干，获得含酯基的仲胺中间体5a，称重为874mg。
(2)5a(256.5mg，1.5mmol)溶于5ml四氢呋喃中，加入3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)、三乙胺(101mg，1mmol)，室温搅拌过夜。用层析液为正己烷：乙酸乙酯＝10：1进行跟踪，反应完全后加入70ml水进行稀释，加1M盐酸调pH至2-3，沉淀物出现。用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯用量为70ml，沉淀溶解，用20ml饱和食盐水进行洗涤，有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，用正己烷:乙酸乙酯＝40:1、20:1、10:1的层析液比例进行柱层析分离，40℃旋干，获得中间体5b，称重276.6mg，收率为68.29％。
(3)5b(352mg，0.87mmol)加入10ml四氢呋喃、13ml 37％盐酸于50℃油浴锅搅拌过夜，用层析液为正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝2:1:0.01进行跟踪，反应完全后加入120ml水进行稀释，加1M盐酸调pH至2-3，沉淀物出现。用120ml*2乙酸乙酯萃取，沉淀溶解，用40ml饱和食盐水进行洗涤，有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，用层析液为石油醚:乙酸乙酯:乙酸＝10:1:0.05、10:2:0.05、10:4:0.05的顺序进行柱层析分离，旋干，称重122.9mg，收率为76.9％。ESI-MS analysis(negative)m/z 378.2[M+H]—；1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.10(s,2H)；7.12–6.72(m,1H)；6.03(d,J＝15.7Hz,1H)；3.02–2.90(m,2H)；2.17(s,2H)；1.66–1.48(m,2H)；0.86(dd,J＝15.9,8.5Hz,3H)。
实施例6：氟乐灵半抗原化合物6c的合成方法如下：
(1)4-溴甲基苯甲酸甲酯(916.28mg，4mmol)溶于12ml乙酸乙酯，将反应器至于冰-甲醇中降温至-15℃，用注射器缓慢加入正丙胺(591.1mg，10mmol)反应4-5小时。用90ml乙酸乙酯萃取，30ml水洗，10ml饱和氯化钠溶液洗涤，有机相合并，无水硫酸钠干燥。低于30℃旋干，获得含酯基的仲胺中间体6a，称重725mg，收率为87.5％。
(2)6a(310.77mg，1.5mmol)溶于6ml四氢呋喃中，加入3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)、三乙胺(101mg，1mmol)，室温搅拌过夜。反应液加入80ml水进行稀释，加1M盐酸调pH至2-3，沉淀物出现。用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯用量为80ml，沉淀溶解，用30ml饱和食盐水进行洗涤，有机相合并，用无水硫酸钠干燥。40℃旋干，用层析液为正己烷：乙酸乙酯＝40:1、20:1、10:1的顺序进行柱层析分离，旋干获得6b，称重为338.9mg，收率为76.9％。
(3)6b(150mg，0.34mmol)溶于7.5ml四氢呋喃、6.8ml 1mol/L氢氧化钠溶液，室温搅拌过夜，用层析液为正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝2:1:0.01进行跟踪，反应完成，进行酸碱倒，酸萃有机相合并，40℃旋干，获得粗产物118.8mg，进行薄层层析分离，获得目标物6c，称重105.8mg，收率为86％。ESI-MS analysis(negative)m/z 428.4[M+H]—；1H NMR(600MHzCDCl3)δ8.08(s,2H)；8.06(d,J＝8.4Hz,2H)；4.28(s,2H)；2.93–2.88(m,2H)；0.87(d,J＝7.1Hz,2H)；0.82(d,J＝7.2Hz,3H)。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种氟乐灵半抗原，其特征在于，具有如下结构式：
其中，R为-(CH2)n-，n＝1-4或-CH＝CH-或
2.如权利要求1所述的氟乐灵半抗原，其特征在于，分子结构具体为：
3.如权利要求1所述的氟乐灵半抗原，其特征在于，分子结构具体为：
4.如权利要求2所述的氟乐灵半抗原的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：在催化剂存在下，将底物与烷基化试剂进行烷基化反应，纯化后获得仲胺中间体，仲胺中间体进行水解反应获得第二中间体，第二中间体再与4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯混合反应，经纯化后获得目标半抗原分子。
5.如权利要求4所述的氟乐灵半抗原的合成方法，其特征在于，半抗原结构为1c时，底物为丙烯酸乙酯，烷基化试剂为正丙胺；半抗原结构为2c、3c、4c时，底物分别为2-吡咯烷酮、戊内酰胺、己内酰胺，烷基化试剂均为正溴丙烷。
6.如权利要求3所述的氟乐灵半抗原的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：底物与正丙胺通过酰基化反应，生成含酯基的仲胺中间体，含酯基的仲胺中间体再与4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯反应，经纯化后获得第二中间体，第二中间体再进行水解反应。
7.如权利要求6所述的氟乐灵半抗原的合成方法，其特征在于，半抗原结构为5c时，底物为4-溴巴豆酸乙酯；半抗原结构为6c时，底物为4-溴甲基苯甲酸甲酯。
8.一种氟乐灵人工抗原，其特征在于：将权利要求1-3任一项所述氟乐灵半抗原或由权利要求4-7任意所述方法直接得到的氟乐灵半抗原与载体蛋白偶联得到。
9.一种氟乐灵抗体，其特征在于：所述氟乐灵抗体采用权利要求8所述的人工抗原制备得到，所述氟乐灵抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体。
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