CN106932371A - 一种细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法。该方法采用的是一种基于可控释放技术的荧光传感器用于细胞内谷胱甘肽的荧光成像。所采用的荧光传感器包括金纳米笼、荧光染料和谷胱甘肽识别探针，具有结构简单、设计巧妙、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对谷胱甘肽选择性好、在细胞内分散性好等诸多优点。通过采用该荧光传感器，能够方便、快捷地实现细胞内谷胱甘肽的高灵敏、高清晰的荧光成像，具有响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点。基于本发明的可控释放技术为肿瘤细胞靶向治疗、药物输送、细胞成像与实时监测提供了新的技术和方法。

Description

一种细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法

技术领域

本发明涉及一种基于可控释放技术的谷胱甘肽(GSH)的荧光成像方法，具体涉及一种可在医疗卫生、生物医学、生命科学等领域应用的生物体内、细胞及组织当中谷胱甘肽的荧光成像方法。

背景技术

谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸构成的三肽化合物，来自于半胱氨酸残基中的巯基使它成为具有重要意义的生物活性物质。GSH广泛存在于动、植物细胞，是细胞内含量最丰富的非蛋白巯基物。GSH在人体各种组织及细胞中的含量以及与各种疾病的关系备受关注，至今一直是广泛研究的热点。GSH参与生物体内多种生化反应，具有非常重要的生理作用，如氨基酸的转运，蛋白、核酸的合成，抗氧化作用等等。作为机体中广泛存在的重要抗氧化剂，GSH在防卫机体免受自由基伤害、抗肿瘤及抗衰老等方面发挥了重要作用。特别是GSH所具有的抗突变作用，有利于抑制诱发癌症基因的突变，对肝癌、肺癌、皮肤癌、前列腺癌等多种癌细胞病变有一定的抑制作用，据称，GSH是人体内最有效的抗癌物。

生物体内细胞及组织当中GSH及相关巯基物浓度的改变与多种重大疾病相关联。因此，GSH的含量是衡量机体内抗氧化能力大小的重要指标。报道称，如果GSH在体内的含量低于正常水平，将导致像糖尿病、酒精肝中毒、白内障、癌症、帕金森综合征、心血管疾病、阿耳茨海默氏病(Alzheimer，早老性痴呆)等一系列病症在人体的发生。因此，常规诊断利用GSH及相关巯基物的浓度检测作为某些疾病诊断的重要依据。由此可见，建立高效、灵敏、经济的GSH及相关巯基化合物的检测方法不仅有助于重大疾病的临床诊断与治疗，同时，对于生物、医学、生命科学、食品、医药等诸多领域的研究与应用均具有重要意义。

目前，发展了多种测定GSH的检测技术，包括化学的、仪器的，诸如紫外/可见分光光度法、荧光法、酶循环法、电化学法、化学发光法、电致化学发光法、高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等多种方法，每种方法在灵敏度、选择性、稳定性、检测时间、成本、仪器等方面都各有其优缺点，目前还没有一种既快速、稳定、特异，又十分灵敏、经济的测定方法。影响了它们在高通量的常规临床检测及生物研究中的应用。根据GSH检测技术的发展趋势来看，迫切需要提高检测灵敏度以实现微量样品的高灵敏、高特异性的检测要求。

近年来，现代分子生物学技术及纳米技术的快速发展为GSH的高灵敏、特异性生物传感检测技术提供了新的思路和技术。作为金纳米颗粒家族中的新材料，金纳米笼一经问世便得到了广泛的关注和研究。研究表明，作为还愿型物质的GSH能够与含有双硫键(—S—S—)的物质发生特异性反应，可将其中的双硫键切断并分别将其还原为巯基(—SH)，同时，自身被氧化，生成氧化型产物GSSG。本发明根据GSH的这一反应特性，将其巧妙地应用到基于纳米材料的生物传感的设计与应用领域，为GSH的高灵敏检测提供了新型、特异、高效的检测平台。采用金纳米笼作为纳米载体，利用含有双硫键的生物识别分子构建基于可控释放的荧光传感器用于GSH的检测及荧光成像技术还未见文献报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，针对基于可控释放技术的荧光传感器用于生物体内或细胞内GSH的检测及荧光成像技术未见报道，因此，本发明的目的：提供一种基于可控释放技术的荧光传感器进行生物体内或组织、细胞内GSH的荧光成像方法，该方法所采用的荧光传感器包括谷胱甘肽识别探针、荧光染料和金纳米笼，具体是利用中空多孔的金纳米笼作为纳米载体，并将含有双硫键的谷胱甘肽识别探针组装到其表面，一方面起到分子生物门的作用用以封堵金纳米笼孔内荧光染料的外泄，另一方面作为分子识别探针与待测靶分子发生特异性的分子识别反应。当该纳米荧光传感器通过细胞内吞作用进入细胞后，组装在金纳米笼表面的GSH识别探针将会与细胞内的GSH发生特异性的分子识别反应，导致双硫键被切断，含有双硫键的识别探针从金纳米笼表面脱离，从而使封堵笼孔的分子门被打开，笼内的荧光染料得以释放出来，实现荧光信号的增强与成像检测。因此，可通过荧光信号的强弱指示细胞内GSH的存在及其浓度大小。本发明采用的荧光传感器具有设计巧妙、结构简单、性能稳定、无细胞毒性、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对GSH选择性好、在细胞内分散性好等诸多优点，将其作为生物体内或组织、细胞内GSH荧光成像的纳米传感器，能够方便、快捷地实现细胞内GSH的高灵敏、高清晰的荧光成像，具有选择性好、响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点，可在生物体内或组织、细胞内GSH的检测、成像领域发挥重要作用。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的基于可控释放技术的荧光传感器是以金纳米笼作为纳米载体，利用其空心多孔的结构特性，在其内部装载客体分子如荧光染料，为了防止荧光染料的外泄，利用含双硫键的生物分子在金纳米笼表面组装具有可生物响应的分子门，实现对金纳米笼孔的封堵，防止孔内物质的释放；本发明的核心技术是对分子门的特别设计，除了具有封堵笼孔的作用以外，还赋予它分子识别和分子响应的特性，因此，本发明采用的是经过特别设计的、具有一定碱基长度的含有双硫键的核苷酸分子，其碱基序列为5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’，该生物分子作为待测靶分子的识别探针被组装到金纳米笼表面形成具有防止笼内物质释放的分子门。具有分子识别作用的探针分子门是通过在金纳米笼表面修饰正电荷的方法而将其组装到金纳米笼表面，优选地采用聚二烯丙基二甲基氯化铵作为正电荷修饰剂在金纳米笼表面修饰一层聚阳离子。

优选地，上述的GSH荧光传感器，所述的荧光染料是罗丹明B。

一种制备本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)在金纳米笼的悬浮液中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，37℃恒温振荡12h；

(2)在上述溶液中加入荧光染料溶液，37℃恒温振荡12h后加入谷胱甘肽识别探针溶液，37℃振荡12h，离心分离，清洗，即制得GSH荧光传感器；

其中，所述的荧光染料是罗丹明B；所述的谷胱甘肽识别探针是含有双硫键的核苷酸分子，其碱基序列为5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’。

本发明的有益效果：本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器是将金纳米笼与含有双硫键的GSH识别探针相结合，通过静电组装作用在金纳米笼表面形成具有可生物响应的分子门，利用识别探针与靶分子GSH之间发生的特异性的分子识别反应，导致双硫键被切断，含有双硫键的生物分子从金纳米笼表面脱离，从而使封堵笼孔的分子门被打开，并将金纳米笼内的客体分子如荧光染料释放出来，实现了荧光信号的增强与检测。该荧光传感器具有设计巧妙、结构简单、无细胞毒性、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、在细胞内的分散性好等诸多优点，作为活细胞内的荧光成像传感器，可实现细胞内GSH的特异性成像检测。利用本发明提出的荧光传感器进行生物体内或细胞内GSH的荧光成像，不但能够方便、快捷地实现细胞内GSH的高灵敏、高清晰的荧光成像，同时还具有选择性好、响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点，可在生物体内或细胞内GSH的成像检测领域发挥重要作用，同时也为肿瘤细胞荧光成像的研究和应用提供新的方法和技术。

附图说明

图1 Hela细胞中谷胱甘肽的荧光成像照片。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实验仪器：THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；KDC-160HR高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Leica TCS SP5II激光共聚焦扫描仪(德国莱卡公司)。

实验试剂：聚二烯基丙二甲基氯化铵(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；罗丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；含有双硫键的GSH识别探针的碱基序列为：5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’(上海生工生物工程股份有限公司)，PBS缓冲溶液为0.01M(pH 7.4,Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)。

实施例1：

一种制备本发明提出的基于可控释放技术的GSH荧光传感器的方法，包括如下步骤：

(1)将200μL聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液(11.664mg/mL)加入到400μL的金纳米笼溶液中，37℃恒温振荡12h，磁分离，清洗；

(2)加入100μL罗丹明B溶液(1.0×10^-5mol/L)，37℃恒温振荡12h后加入10μL GSH识别探针溶液(1.0×10^-5M)，37℃振荡12h，磁分离，清洗，即制得GSH荧光传感器；

其中，所述的GSH识别探针是含有双硫键的核苷酸分子，其碱基序列为5’-ACG AGTCA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’；所述的金纳米笼按文献方法获得(G.D.Moon,S.W.Choi,X.Cai,W.Y.Li,E.C.Cho,U.Jeong,L.V.Wang andY.N.Xia.J.Am.Chem.Soc.2011,133,4762–4765)。

实施例2:

一种采用本发明提出的基于可控释放技术的细胞内GSH的荧光成像方法，包括如下步骤：

(1)以3000转/min离心Hela细胞悬浮液5min，移除上清液；

(2)加入制备好的荧光传感器的PBS溶液，37℃恒温孵育20min后进行激光共聚焦扫描成像实验；

(3)将孵育好的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上，激发波长：559nm；接收波长：580-630nm。

图1所示为Hela细胞中GSH的荧光成像照片。

本发明将分子识别技术、可控释放技术与纳米技术相结合，通过特异性的分子识别反应，可实现对细胞内非蛋白巯基物GSH的高灵敏、高选择性的荧光成像。具体是将中空多孔的金纳米笼与含有双硫键的GSH识别探针相结合，使该荧光传感器具有可生物响应的分子门，一旦有待测靶分子GSH的存在，则发生识别探针与GSH之间的特异性的分子识别反应，导致双硫键被切断，含有双硫键的识别探针从金纳米笼表面脱离，从而使封堵笼孔的分子门被打开，金纳米笼内的荧光分子罗丹明B得以释放，实现荧光信号的增强与检测。该荧光传感器具有设计巧妙、结构简单、无细胞毒性、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、在细胞内的分散性好等诸多优点，作为活细胞内的荧光成像传感器，可实现细胞内GSH的特异性荧光成像检测。利用本发明提出的荧光传感器进行生物体内或细胞内GSH的荧光成像，不但能够方便、快捷地实现细胞内GSH的高灵敏、高清晰的荧光成像，同时还具有选择性好、响应时间短、易于直接观测、便于实时监测等优点，可在生物体内或细胞内GSH的成像检测领域发挥重要作用，同时也为肿瘤细胞荧光成像的研究和应用提供新的方法和技术。

Claims (9)

1.一种细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于：该方法采用了一种基于可控释放的荧光传感器。

2.一种如权利要求1所述的细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于：所述的荧光传感器包括谷胱甘肽识别探针、荧光染料和金纳米笼。

3.一种如权利要求2所述的细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于：所述的谷胱甘肽识别探针是含有双硫键的核苷酸。

4.一种如权利要求2所述的细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于：所述的谷胱甘肽识别探针的碱基序列为5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTCTTA-3’。

5.一种如权利要求2所述的细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于：所述的谷胱甘肽识别探针是通过静电作用被组装到金纳米笼表面。

6.一种如权利要求2所述的细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于：所述的谷胱甘肽识别探针是通过采用正电荷修饰剂被组装到金纳米笼表面。

7.一种如权利要求2所述的细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于：所述的谷胱甘肽识别探针是通过采用聚二烯丙基二甲基氯化铵被组装到金纳米笼表面。

8.一种如权利要求2所述的细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于：所述的荧光染料是罗丹明B。

9.一种如权利要求2所述的细胞内谷胱甘肽的荧光成像方法，其特征在于步骤如下：

(1)取适量细胞悬浮液，离心分离，移除上清液；

(2)加入稀释后的所述的荧光传感器进行孵育，10-50min后进行激光共聚焦扫描成像；

其中，所述的荧光传感器的制备方法，步骤如下：

(1)在金纳米笼中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，37℃恒温振荡12h；

(2)在上述溶液中加入荧光染料溶液，37℃恒温振荡12h后加入谷胱甘肽识别探针溶液，37℃振荡12h，离心分离，清洗，即制得GSH荧光传感器；

其中，所述的荧光染料是罗丹明B；所述的谷胱甘肽识别探针是含有双硫键的核苷酸分子，其碱基序列为5’-ACG AGT CA S-S TTT TGT TTG TTC CCC CCT TCT TTC TTA-3’。