CN106947778A - 靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体，包括RNAi‑Ready pSIREN‑RetroQ‑ZsGreen1载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向整合素β1基因的寡核苷酸链；所述多克隆位点包括BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述寡核苷酸链由BamH I酶切位点+靶序列正义链+茎环结构+靶序列反义链+EcoR I酶切位点组成，所述寡核苷酸链正向插入所述多克隆位点中。本发明属于基因工程技术领域，本发明提供的小发夹RNA重组载体可靶向抑制整合素β1的表达，具有特异性好、高效稳定表达、转染效率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体及其构建方法。
背景技术
哮喘是呼吸系统的常见病、多发病，其致残、致死率一直呈上升趋势，已成为严重的社会健康问题。哮喘的发病机制尚未完全明了，但气道炎症和气道重塑是目前哮喘公认的两个主要特征。气道重塑会导致气道不可逆性痉挛，这是部分哮喘患者难以用哮喘药物控制症状的主要原因。
现有的大量研究证实，气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell，ASMC)才是导致气道狭窄的主要效应细胞，是哮喘发病机制中一类重要的免疫调节细胞，无论有无气道炎症存在，其异常增殖、凋亡、迁移均能引起气道壁增厚，并能通过释放多种活性介质加重气道炎症。因此，ASMC在哮喘气道重塑中处于中心地位，如能有效抑制ASMC异常增殖、凋亡及炎性分泌等，将对减轻哮喘气道重塑产生重要影响。
整合素(Integrin)作为一种异源二聚体，由α、β两个不同亚单位经由非共价键连接而成。现已发现18种不同的α亚单位(150-210kD)和9种β亚单位(90-110kD)，它们按不同组合构成20余种Integrin。Integrin内不同亚单位的功能存在显著差异：(1)α亚单位：氨基端具有结合二价阳离子的结构域，调节Integrin与配体之间的结合作用，其胞质区近膜处的保守序列(KXGFFKR)与Integrin活性调节密切相关；(2)β亚单位：β1亚单位主要介导细胞与ECM间的粘附及信号转导作用；β2亚单位主要存在于多种白细胞表面，介导细胞间的相互作用；β3亚单位主要存在于血小板表面，介导血小板聚集、参与形成血栓；β4与α6亚单位结合，参与形成半桥粒。
RNAi技术的重要成员——siRNA虽能高效、特异地抑制靶基因表达，但其易降解、作用时间短，难以发挥稳定的基因沉默作用；而小发夹RNA(smallhairpin RNA，shRNA)具有一个重要的茎环结构，与细胞内同期表达的siRNA相比较，往往具有更高的靶基因抑制效率。小发夹RNA基因载体分为非病毒载体和病毒载体两大类，其中，非病毒载体无免疫原性，但其转染效率往往较低；而病毒载体虽有较高的转染效率，但其生物安全性及免疫原性问题往往难以解决。由于转染的目的基因、表达系统及组装的空间位置不同，转染后的基因表达水平及阳性克隆筛选率也会出现较大的差异，故而构建一个合理、高效、稳定的shRNA表达载体是细胞转染成功的关键。筛选出针对特定靶基因的shRNA有望发挥靶向高效的基因抑制作用，具有理想的转染效率且不引起非特异性反应。
有报道认为Integrin的β1亚单位能介导细胞与细胞、细胞与ECM之间等的相互作用，并对包括哮喘在内的多种疾病的病理生理过程发挥重要影响，但现有技术并无能靶向高效抑制整合素β1的小发夹RNA重组表达载体。因此，提供一种靶向高效抑制整合素β1的小发夹RNA重组表达载体，有望对干预哮喘气道重塑和哮喘的基因治疗产生重要影响。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体，通过筛选RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1作为基础载体(中等大小，携带真核细胞启动子和绿色荧光基因，在固定部位进行目的基因转录，安全性好)，筛选整合素β1mRNA编码区第425位核苷酸作为干扰起始的靶位点构建寡核苷酸链(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，进而构建得到的小发夹RNA重组载体可靶向抑制整合素β1的表达，具有特异性好、高效稳定表达、转染效率高等优点。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
本发明提供一种靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体，包括RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向整合素β1基因的寡核苷酸链；所述多克隆位点包括BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述寡核苷酸链由BamH I酶切位点+靶序列正义链+茎环结构+靶序列反义链+EcoR I酶切位点组成，所述寡核苷酸链正向插入所述多克隆位点中。
优选地，所述寡核苷酸链的正义链为：GATCCGGCAGGGCCAAATTGTGGGTTTCAAGAGAACCCACAATTGGCCCTGCACGCGTG，即SEQ ID NO：1；所述寡核苷酸链的反义链为：AATTCACGCGTGCAGGGCCAAATTGTGGGTTCTCTTGAAACCCACAATTTGGCCCTGCCG，即SEQ ID NO：2。
优选地，所述抗性基因序列包括氨苄青霉素抗性基因。
优选地，所述RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体购自美国Clontech公司。
相应地，本发明还提供靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体的构建方法，包括如下步骤：
S1寡核苷酸链的设计：根据整合素β1mRNA基因序列，经同源性比对证实特异性后，应用小发夹RNA设计软件选取整合素β1mRNA靶序列，设计并合成靶向整合素β1基因的寡核苷酸链；
S2小发夹RNA重组载体的构建：将RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体进行BamHI和EcoRI酶切，将合成的靶向整合素β1基因的寡核苷酸链正向插入酶切后的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体多克隆位点中，将连接产物转化感受态细胞，过夜后挑取阳性克隆，在培养液中扩增、提取质粒，得到靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体。
优选地，所述寡核苷酸链的正义链为：GATCCGGCAGGGCCAAATTGTGGGTTTCAAGAGAACCCACAATTGGCCCTGCACGCGTG，即SEQ ID NO：1；所述寡核苷酸链的反义链为：AATTCACGCGTGCAGGGCCAAATTGTGGGTTCTCTTGAAACCCACAATTTGGCCCTGCCG，即SEQ ID NO：2。
优选地，所述感受态细胞为DH-5а感受态细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：提供一种靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体，使用RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1作为基础载体，使用SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2作为靶向抑制整合素β1基因表达的寡核苷酸链，具有特异性好、安全性好、高效稳定表达、转染效率高等优点，有望在干预哮喘气道重塑和哮喘的基因治疗中发挥重要作用。此外，本发明提供的构建方法简单、高效、重复性好。
附图说明
图1本发明小发夹RNA重组载体的构建示意图。
图2本发明小发夹RNA重组载体的部分测序图。
图3干预处理组的体外转染效率检测图。
图4RT-PCR法检测不同组别ASMC整合素β1的mRNA表达结果图；其中A为空白对照组，B为空载体对照组，C为阴性对照组，D为干预处理组。
图5Western-blot法检测不同组别ASMC整合素β1的蛋白表达结果图；其中A为空白对照组，B为空载体对照组，C为阴性对照组，D为干预处理组。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中，所涉及的载体、试剂和试剂盒均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得，如RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体购自美国Clontech公司。
实施例一 寡核苷酸链的设计与合成
根据整合素β1mRNA基因序列(NM_16412)，经BLAST同源性比对证实特异性后，排除shRNA非特异性抑制其他基因片段的可能，应用小发夹RNA设计软件选取整合素β1mRNA靶序列，筛选整合素β1mRNA编码区第425位核苷酸作为干扰起始的靶位点，由BamH I酶切位点+靶序列正义链+茎环结构+靶序列反义链+EcoR I酶切位点组成寡核苷酸链(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。
同时，建立阴性对照(错义RNA链)、空载体对照(质粒载体)及空白对照(PBS)。阴性对照的正义链：GATCCCGACTACCGTTGTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATACAACG GTAGTTTTTTTG，即SEQ ID NO：3；阴性对照的反义链：CAAAAAAACTACCGTTGTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATACAACGGTAGTCGGGATC，即SEQ ID NO：4。寡核苷酸链及阴性对照等序列均由上海舜田生物技术公司合成。
实施例二 小发夹RNA重组载体的构建
将RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体进行BamHI和EcoRI酶切使其线性化，将实施例一合成的靶向整合素β1基因的寡核苷酸链制备退火双链DNA，正向插入酶切后的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体多克隆位点中，将连接产物转化DH-5а感受态细胞，之后菌液均匀涂布在含氨苄青霉素(100μg/ml)琼脂平板上，倒置培养过夜后挑取阳性克隆，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养液中扩增菌液，取部分菌液进行测序，部分测序图如图2所示，测序结果显示插入正确。从扩增菌液中提取质粒，得到靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体。
阴性对照(错义RNA链)重组载体的构建方法同上，所有重组载体均由上海舜田生物技术公司进行酶切、PCR鉴定及测序分析，从而确定插入片段的正确性。
实施例三 ASMC体外转染
将处于对数生长期的ASMC消化、离心、去上清，用含10％胎牛血清的DMEM培养液重悬，以每孔1×105个细胞接种于6孔培养板中，待细胞融合度达80％，将培养液更换为无血清的DMEM培养液，37℃、5％CO2培养箱中培养24h，随后按Lipofectine 2000操作说明进行细胞转染，分为以下5个组并分别处理：①空白对照组：仅加入PBS；②空载体对照组：转染空质粒载体；③阴性对照组：转染错义RNA链重组载体；④干预处理组：转染本发明小发夹RNA重组载体。
细胞转染的具体过程如下：配制细胞转染A液和B液：A液为15μL重组载体加入250μL DMEM培养液，B液为10μL Lipofectine加入250μL DMEM培养液；将A、B液混匀，室温孵育20min，加入培养板各孔内，混匀，置于37℃、5％CO2培养箱中培养6h，吸去转染液，更换为含10％胎牛血清的DMEM培养液，继续置于培养箱中培养48h。
分别收集转染48h的细胞，将其接种于预先置有无菌盖玻片的12孔板内，每孔加入1mL4％多聚甲醛固定20min，吸去多聚甲醛后用PBS冲洗三遍，用5μg/mLDAPI染色2min，PBS冲洗三遍，甘油磷酸缓冲液封片，在荧光显微镜下观察。干预处理组的转染效率约为75％，如图3所示。
实施例四 RT-PCR法检测靶向抑制效果
收集待测ASMC细胞，进行RNA抽提，使用Quant cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA模板，使用2×Power Taq PCR MasterMix试剂盒进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，结果如图4所示。
整合素β1的PCR上游引物为TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG，即SEQ ID NO：5，PCR下游引物为TTCCGCCTCTGGATGACTA，即SEQ ID NO：6；β-actin的PCR上游引物为CTGGCACCACACCTTCTACAATG，即SEQ ID NO：7，PCR下游引物为AATGTCACGCACGATTTCCCGC，即SEQ ID NO：8。PCR扩增的反应体系如下所示：
从图4可知，体外干预48h后，与阴性对照组、空载体对照组及空白对照组相比，干预处理组的整合素β1mRNA表达水平显著降低，说明本发明提供的小发夹RNA重组载体能显著抑制整合素β1的mRNA表达。
实施例五 Western-blot法检测靶向抑制效果
收集待测ASMC细胞，提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜、免疫杂交后显影曝光，结果如图5所示。
从图5可知，体外干预48h后，与阴性对照组、空载体对照组及空白对照组相比，干预处理组的整合素β1蛋白表达水平显著降低，说明本发明提供的小发夹RNA重组载体能显著抑制整合素β1的蛋白表达。
综上所述，本发明提供的小发夹RNA重组载体能稳定转染，且转染效率高，可显著抑制整合素β1的mRNA表达和蛋白表达。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市人民医院
<120> 靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体及其构建方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gatccggcag ggccaaattg tgggtttcaa gagaacccac aattggccct gcacgcgtg 59
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aattcacgcg tgcagggcca attgtgggt tctcttgaaa cccacaattt ggccctgccg 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatcccgact accgttgtat aggtgttcaa gagacaccta tacaacggta gtttttttg 59
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caaaaaaact accgttgtat aggtgtctct tgaacaccta tacaacggta gtcgggatc 59
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgggggacaa aaagggggaa gg 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttccgcctct ggatgacta 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctggcaccac accttctaca atg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aatgtcacgc acgatttccc gc 22
Claims (7)
1.靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体，其特征在于：包括RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向整合素β1基因的寡核苷酸链；所述多克隆位点包括BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点，所述寡核苷酸链由BamH I酶切位点+靶序列正义链+茎环结构+靶序列反义链+EcoR I酶切位点组成，所述寡核苷酸链正向插入所述多克隆位点中。
2.根据权利要求1所述的靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体，其特征在于：所述寡核苷酸链的正义链为：GATCCGGCAGGGCCAAATTGTGGGTTTCAAGAGAACCCACAATTGGCCCTGCACGCGTG，即SEQ ID NO：1；所述寡核苷酸链的反义链为：AATTCACGCGTGCAGGGCCAAATTGTGGGTTCTCTTGAAACCCACAATTTGGCCCTGCCG，即SEQ ID NO：2。
3.根据权利要求1所述的靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体，其特征在于：所述抗性基因序列包括氨苄青霉素抗性基因。
4.根据权利要求1所述的靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体，其特征在于：所述RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体购自美国Clontech公司。
5.根据权利要求1所述的靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1寡核苷酸链的设计：根据整合素β1mRNA基因序列，经同源性比对证实特异性后，应用小发夹RNA设计软件选取整合素β1mRNA靶序列，设计并合成靶向整合素β1基因的寡核苷酸链；
S2小发夹RNA重组载体的构建：将RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体进行BamHI和EcoRI酶切，将合成的靶向整合素β1基因的寡核苷酸链正向插入酶切后的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen1载体多克隆位点中，将连接产物转化感受态细胞，过夜后挑取阳性克隆，在培养液中扩增、提取质粒，得到靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体。
6.根据权利要求5所述的靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体的构建方法，其特征在于：所述寡核苷酸链的正义链为：GATCCGGCAGGGCCAAATTGTGGGTTTCAAGAGAACCCACAATTGGCCCTGCACGCGTG，即SEQ ID NO：1；所述寡核苷酸链的反义链为：AATTCACGCGTGCAGGGCCAAATTGTGGGTTCTCTTGAAACCCACAATTTGGCCCTGCCG，即SEQ ID NO：2。
7.根据权利要求5所述的靶向抑制整合素β1表达的小发夹RNA重组载体的构建方法，其特征在于：所述感受态细胞为DH-5а感受态细胞。
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-
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