CN106967683A

CN106967683A - 培养多能造血干细胞的方法

Info

Publication number: CN106967683A
Application number: CN201710321782.2A
Authority: CN
Inventors: 林涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Hebei Steiner Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2017-05-09
Publication date: 2017-07-21

Abstract

本发明公开了一种培养多能造血干细胞的方法，属于造血和免疫学技术领域，包括取受体的细胞膜和供体的细胞核、细胞质组合杂交成的新细胞，依次经过扩增培养、悬浮培养、增殖培养、透析培养，并经透析纯化后得到可供受体移植的细胞悬液，扩增培养、悬浮培养、增殖培养均是全程采用悬浮设置的透析袋进行培养。本发明中新细胞的生物活性和遗传稳定性都能达到受体体内生长和增殖的细胞生物活性和遗传稳定性，经透析培养的新细胞的活率为100%，可有效治疗白血病患者。

Description

培养多能造血干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种培养多能造血干细胞的方法，属于造血和免疫学技术领域。

背景技术

白血病，又称血癌，是一类多能造血干细胞恶性克隆性疾病，白血病的主要病理特征为白血病细胞在骨髓及其他造血组织中呈恶性、无限制地增长，浸润全身各组织和脏器，从而直接影响一些重要器官的功能，同时抑制正常造血，导致贫血、出血等各类并发症。在我国，白血病是十大恶性肿瘤之一，流行病学调查显示，目前至少有400万白血病患者，治疗需求巨大。

多能造血干细胞为骨髓中原始的造血干细胞，干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能的APSC多能细胞。所以多能造血干细胞是具有自我更新和分化为各种谱系造血细胞的能力。

多能造血干细胞（ Hemopoietic Stem cell ，HSC）的干，译自英文“ stem ”，意为“树”、“干”和“起源”，类似于一棵树干可以长出树杈、树叶，并开花和结果等。通俗地讲，多能造血干细胞是指尚未发育成熟的细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源，其是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，医学上称其为“万用细胞”，也是人体的始祖细胞，可以分化为各种类型的血细胞，如红细胞、白细胞和血小板等。多能造血干细胞有两个重要特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化成所有类型的血细胞。造血干细胞采用不对称的分裂方式：由一个细胞分裂为两个细胞。其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性，从而保持身体内干细胞数量相对稳定，这就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各类血细胞、前体细胞和成熟血细胞，释放到外周血中，执行各自任务，直至衰老死亡，这一过程是不停地进行着的。

多能造血干细胞移植是近30多年来临床医学重大进展之一，它是通过大剂量放化疗（即预处理），清除患者体内的恶性细胞，然后把预先采集的自体或异体造血干细胞经静脉回输给患者，使患者重建正常造血和免疫功能，从而达到根治目的的一种治疗手段。随着人们对造血干细胞特性的深入了解，移植相关技术的进展、支持治疗的大大改善，造血干细胞移植技术逐渐成熟，并得到广泛应用，现已成为治愈白血病、实体瘤、遗传性及重度免疫性疾病的可靠方法。

但是目前对于受损的多能造血干细胞进行修复、培养的方法，没有见到报道，因此亟需对于受损的多能造血干细胞进行修复、培养进行研究，以有效治疗白血病患者。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种培养多能造血干细胞的方法，以有效治疗白血病患者。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种培养多能造血干细胞的方法，取受体的细胞膜和供体的细胞核、细胞质组合杂交成的新细胞，依次经过扩增培养、悬浮培养、增殖培养、透析培养，并经透析纯化后得到可供受体移植的细胞悬液，扩增培养、悬浮培养、增殖培养均是全程采用悬浮设置的透析袋进行培养。

本发明技术方案的进一步改进在于：包括以下步骤：

步骤A、采集受体骨髓或外周血，鉴别分离出多个受损的受体的多能造血干细胞的祖细胞；采集供体的骨髓或外周血，鉴别分离出多个供体的多能造血干细胞的祖细胞；

步骤B、使用细胞拆合技术，将受体的多能造血干细胞的祖细胞的细胞膜与供体的多能造血干细胞的祖细胞的细胞核、细胞质组合杂交成具有正常等级分化造血功能的新细胞；

步骤C、扩增培养：对步骤B获得的新细胞进行扩增，首先将新细胞放入装有经高温无菌处理的第一培养液的透析袋内，然后封闭透析袋进行新细胞的扩增培养，透析袋封闭时需留有废气排放空间；

步骤D、悬浮培养：将步骤C中的透析袋悬置于配置有自动供氧和供气系统的培养基容器中，透析袋的工作体积部分全部放入培养基容器的培养基Ⅰ中，透析袋在培养基Ⅰ中36～38℃恒温下培养8～12天，透析袋内形成细胞悬液；

步骤E、增殖培养：向经步骤D处理的透析袋内注入36～38℃的第二培养液，第二培养液的体积加入量为第一培养液体积加入量的3～5倍，然后更换培养基容器内的培养基Ⅰ再继续培养增殖4～6天；

步骤F、透析培养准备：取透析培养装置，将透析培养装置的培养基室和细胞培养室内分别注入培养基Ⅱ和第三培养液，培养基Ⅱ和第三培养液的注入体积比为2:1～4:1，其中培养基Ⅱ中各组分及重量百分比为：25～35%水解植物蛋白、25～35%水解动物蛋白、5～15%酵母液浸膏饱和液、25～35%人体血清，培养基ⅡpH值为7.30～7.45；

步骤G、透析培养：将步骤E得到的细胞悬液接种于透析培养装置的细胞培养室中的第三培养液内，36～38℃恒温培养4~6天，期间全自动供氧供气；

步骤H、透析纯化：收取透析培养装置的细胞培养室中的细胞悬液，经血液透析机透析纯化，并低温离心浓缩至适合移入人体的细胞密度；检测配型后即可移植。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤B中的细胞拆合技术采用物理法或化学法，获得的新细胞的个数为5个以上。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤D悬浮培养过程中，培养基Ⅰ每3～5小时搅动一次，并每隔4～6天更换一次培养基Ⅰ。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤E增殖培养过程中，培养基Ⅰ每3～5小时搅动一次。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤D和步骤E中，培养基Ⅰ为人体血清，人体血清的pH值为7.30～7.45。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤C中的第一培养液、步骤E中的第二培养液、步骤F中的第三培养液均为pH7.30～7.45、重量百分比0.85～0.95%的氯化钠溶液。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤F中，培养基Ⅱ中的人体血清需要待培养基Ⅱ中的水解植物蛋白、水解动物蛋白、酵母液浸膏饱和液经高温无菌冷却后再加入。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤F中，人体血清具体加入步骤为：将装配好并注入水解植物蛋白、水解动物蛋白、酵母液浸膏饱和液和第三培养液的透析培养装置，经121℃、15ib【b是bar的缩写】、20min高温灭菌，待透析培养装置冷却至36～38℃后将除菌过滤的pH值为7.30～7.45的人体血清加入培养基室内。

本发明技术方案的进一步改进在于：步骤F和步骤G中，透析培养装置为不锈钢材质。

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：

使用细胞拆合技术，组合杂交成具有正常等级分化造血功能的新细胞，新细胞可以为若干个，此举可使新细胞的HLA与受体患者的HLA保持不变，又恢复了受体患者多能造血干细胞正常的等级分化造血功能，从而解决了造血干细胞移植因HLA不同造成的难题，从而使白血病患者都能享受造血干细胞移植祖细胞的方法。

组合杂交成具有正常等级分化造血功能的新细胞，在封闭式透析培养方式中，经扩增培养、悬浮培养、增殖培养进行生长、增殖的目的在于，新细胞在移入受体后能尽快适应体内生长环境，与受体尽快融合，排异反应小，新细胞经血液透析机透析纯化后完全可以达到人体血液的纯化标准，小分子杂质和小分子有害代谢物全部剔除。

透析培养过程中，新细胞可不断地受到培养基Ⅱ中营养的补给，同时也不断地排出老朽废物，因此可以延长对数期的增殖，增大静止期的细胞数。另外通过培养基Ⅱ中的变化，可使微生物的营养环境慢慢发生改变，，具有细胞生长良好，能获得较纯净的培养产物，减少营养物质损失，使培养基能被高效利用的特点。

经透析培养的新细胞，细胞生物活性和遗传稳定性都能达到受体体内生长和增殖的细胞生物活性和遗传稳定性，新细胞活率为100%。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：

包括以下步骤：

步骤A、采集受体骨髓或外周血，鉴别分离出多个受损的多能造血干细胞之受体的多能造血干细胞的祖细胞；采集供体的骨髓或外周血，鉴别分离出多个多能造血干细胞之供体的多能造血干细胞的祖细胞；

步骤C、扩增培养：对步骤B获得的新细胞进行扩增，首先将若干个新细胞放入装有经高温无菌处理的第一培养液的透析袋内，然后封闭透析袋进行新细胞的扩增培养，透析袋封闭时需留有废气排放空间，以使新细胞在扩增培养过程产生的废气有排放空间；同时在注入新细胞前，透析袋和透析袋内的第一培养液经高温无菌处理在无菌条件下操作；

步骤D、悬浮培养：将步骤C中的透析袋悬置于配置有自动供氧和供气系统的培养基容器中，透析袋的工作体积部分全部放入培养基容器的培养基Ⅰ中，透析袋在培养基Ⅰ中36～38℃（如37℃）恒温下培养8～12天（如10天），透析袋内形成细胞悬液；

步骤E、增殖培养：向经步骤D处理的透析袋内注入36～38℃（如37℃）的第二培养液，第二培养液的体积加入量为第一培养液体积加入量的3～5倍（如4倍），然后更换培养基容器内的培养基Ⅰ再继续培养增殖4～6天（如5天）；

步骤F、透析培养准备：取透析培养装置，将透析培养装置的培养基室和细胞培养室内分别注入培养基Ⅱ和第三培养液，培养基Ⅱ和第三培养液的注入体积比为2:1～4:1（如可以为3:1），其中培养基Ⅱ中各组分及重量百分比为：25～35%水解植物蛋白、25～35%水解动物蛋白、5～15%酵母液浸膏饱和液、25～35%人体血清，培养基ⅡpH值为7.30～7.45；

步骤G、透析培养：将步骤E得到的细胞悬液接种于透析培养装置的细胞培养室中的第三培养液内，36～38℃（如37℃）恒温培养4~6天（如5天），期间全自动供氧供气；

步骤H、透析纯化：收取透析培养装置的细胞培养室中的细胞悬液，经血液透析机透析纯化，并低温离心浓缩至适合移入人体的细胞密度；检测配型后（检测该细胞的HLA是否与受体HLA一致能否配型，卫生指标是否达标）即可移植。

步骤B中的细胞拆合技术采用物理法或化学法，获得的新细胞的个数为5个以上。

步骤D悬浮培养过程中，及时排除透析袋中的气体，培养基Ⅰ每3～5（如4小时）搅动一次，并每隔4～6天（如5天）更换一次培养基Ⅰ，更换时培养基Ⅰ温度为36～38℃（如37℃），同时密切观察新细胞的生长状态。

步骤E增殖培养过程中，更换培养基Ⅰ时温度为36～38℃（如37℃），培养基Ⅰ每3～5小时（如4小时）搅动一次，同时根据细胞的生长情况进行供氧供气。

步骤D和步骤E中，培养基Ⅰ为人体血清，人体血清的pH值为7.30～7.45（如为7.4）。

步骤C中的第一培养液、步骤E中的第二培养液、步骤F中的第三培养液均为pH7.30～7.45（如pH为7.4）、重量百分比0.85～0.95%（如为0.9%）的氯化钠溶液，第二培养液的体积加入量为第一培养液体积加入量的4倍。

步骤F中，培养基Ⅱ中的人体血清需要待培养基Ⅱ中的水解植物蛋白、水解动物蛋白、酵母液浸膏饱和液经高温无菌冷却后再加入，人体血清加入前需经除菌过滤。

步骤F中，人体血清具体加入步骤为：将装配好并注入水解植物蛋白、水解动物蛋白、酵母液浸膏饱和液和第三培养液的透析培养装置，经121℃、15ib【b是bar的缩写，15ib也就是15Ib/in2，相当于0.1Mpa】、20min高温灭菌，待透析培养装置冷却至36～38℃（如37℃）后将除菌过滤的pH值为7.30～7.45（如pH为7.4）的人体血清加入培养基室内。

步骤F和步骤G中，透析培养装置为不锈钢材质。

具体实施方案包括以下步骤：

实施例1

步骤A、通过手术采集受体患者髂骨骨髓0.5~1ml，或外周血5ml，进行鉴别分离出多个多能造血干细胞的受体的多能造血干细胞的祖细胞；通过手术采集供体髂骨骨髓0.5~1ml，或外周血5ml，进行鉴别分离出多个多能造血干细胞的供体的多能造血干细胞的祖细胞（供体首选为身体健康、造血功能正常的同胞或父系近缘亲属，次之为母系近缘亲属，再之为陌生远缘供体）。

步骤B、使用细胞拆合技术，细胞拆合技术采用物理法或化学法，将受体的多能造血干细胞的祖细胞的细胞膜与供体的多能造血干细胞的祖细胞的细胞核、细胞质组合杂交成具有正常等级分化造血功能的新细胞，若仅移细胞核则采用物理法为佳，不但移植细胞核，还要更换细胞质，则应采用化学法。经细胞拆合技术重新组合的新细胞数量不能少于5个，以保证后续的扩增培养、悬浮培养和增殖培养的周期不能过长。新细胞的细胞膜必须保持受体的细胞膜不变，以确保移入时HLA与受体HLA的一致。

步骤C、扩增培养：对步骤B获得的新细胞进行扩增，首先将若干个（5个以上）新细胞放入装有第一培养液（20ml、pH7.4的0.9%氯化钠溶液）的透析袋内，然后用透析袋夹封闭透析袋以进行新细胞的扩增培养，透析袋封闭时需留有一定空间，以使新细胞在扩增培养过程产生的废气有排放空间；同时在注入新细胞前，透析袋和透析袋内的第一培养液经高温无菌处理在无菌条件下操作；

步骤D、悬浮培养：将步骤C中的透析袋悬置于配置有自动供氧和供气系统的培养基容器中，透析袋的工作体积部分全部放入培养基容器的培养基Ⅰ中，培养基Ⅰ为人体血清，培养基ⅠpH值为7.4，以保证达到全方位透析的效果；透析袋在培养基Ⅰ中36～38℃（本实施例为37℃）恒温下培养8～12天（本实施例为10天），期间培养基Ⅰ每3～5小时（本实施例为4小时）搅动一次，并每隔4～6天（本实施例为5天）更换一次培养基Ⅰ，更换时培养基Ⅰ温度为36～38℃（本实施例为37℃），同时密切观察拆合技术杂交成的新细胞的生长状态，并注意及时排除透析袋中的气体；

步骤E、增殖培养：将配制好的第二培养液（80ml pH7.4、浓度0.9%的氯化钠溶液）加温至37℃注入已经10天透析悬浮培养的含有细胞悬液的20ml的透析袋内，第二培养液的体积加入量为第一培养液体积加入量的3～5倍，本实施例为4倍，然后更换培养基容器内的培养基Ⅰ（培养基Ⅰ为pH值7.4的人体血清）再增殖培养4～6天（本实施例为5天），更换培养基Ⅰ（培养基Ⅰ为pH值7.4的人体血清）时温度为37℃，增殖培养的5天中每3～5小时（本实施例为4小时）搅动一次培养基Ⅰ，也就是加上步骤D的悬浮培养，一共培养了15天，同时根据细胞的生长情况进行供氧供气；

步骤F、透析培养准备：取不锈钢透析培养装置，将不锈钢透析培养装置的培养基室和细胞培养室内分别注入培养基Ⅱ和第三培养液（生理盐水），培养基Ⅱ和第三培养液的注入体积比为2:1～4:1，优选为2.8:1～3.5:1，进一步优选 3:1，或者接近3:1，比如培养基Ⅱ和第三培养液的注入体积分别为5000ml、1600ml，其中培养基Ⅱ中各组分及重量百分比为：30%水解植物蛋白、30%水解动物蛋白、10%酵母液浸膏饱和液、30%人体血清，培养基ⅡpH值为7.4；

培养基Ⅱ中的人体血清需要待培养基Ⅱ中的水解植物蛋白、水解动物蛋白、酵母液浸膏饱和液经高温无菌冷却后再加入，人体血清加入前需经除菌过滤。

人体血清具体加入步骤为：将装配好并注入的30%水解植物蛋白、30%水解动物蛋白、10%酵母液浸膏饱和液和第三培养液的不锈钢透析培养装置，经121℃、15ib（相当于0.1MPa）、20min高温灭菌，待不锈钢透析培养装置冷却至37℃后将除菌过滤的pH7.4的30%人体血清加入培养基室内。

步骤G、透析培养：将经15天的悬浮培养+增殖培养完成后的100ml细胞悬液，接种于不锈钢透析培养装置的细胞培养室中的第三培养液内，37℃恒温培养5天，期间全自动供氧供气；

步骤H、透析纯化：收取不锈钢透析培养装置的细胞培养室中的细胞悬液，经血液透析机透析纯化，并低温离心浓缩至适合移入人体的细胞密度，然后检测HLA是否与受体HLA一致，卫生指标是否达标（无菌、无病毒污染），合格后供移入使用。

步骤D中的第一培养液、步骤F中的第二培养液、步骤G中的第三培养液均为pH7.4、重量百分比0.9%的氯化钠溶液（也就是生理盐水），第二培养液的体积加入量为第一培养液体积加入量的4倍。

受体的多能造血干细胞的祖细胞和供体的多能造血干细胞的祖细胞经拆合重组后得到的新细胞，从扩增培养、悬浮培养到增殖培养均是全程采用悬浮设置的透析袋进行培养，具有细胞生长良好，能获得较纯净的培养产物，减少营养物质损失，使培养基能被高效利用的特点。

实施例2

本实施例与实施例1的区别为：

步骤F中的培养基Ⅱ中各组分及重量百分比为：25%水解植物蛋白、25%水解动物蛋白、15%酵母液浸膏饱和液、35%人体血清，培养基Ⅱ和第三培养液的注入体积比为2:1。

实施例3

本实施例与实施例1的区别为：

步骤F中的培养基Ⅱ中各组分及重量百分比为：35%水解植物蛋白、35%水解动物蛋白、5%酵母液浸膏饱和液、25%人体血清，培养基Ⅱ和第三培养液的注入体积比为3:1。

Claims

1.一种培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：取受体的细胞膜和供体的细胞核、细胞质组合杂交成的新细胞，依次经过扩增培养、悬浮培养、增殖培养、透析培养，并经透析纯化后得到可供受体移植的细胞悬液，扩增培养、悬浮培养、增殖培养均是全程采用悬浮设置的透析袋进行培养。

2.根据权利要求1所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤A、采集受体骨髓或外周血，鉴别分离出多个多能造血干细胞的受体的多能造血干细胞的祖细胞；采集供体的骨髓或外周血，鉴别分离出多个多能造血干细胞的供体的多能造血干细胞的祖细胞；

步骤H、透析纯化：收取透析培养装置的细胞培养室中的细胞悬液，经血液透析机透析纯化，并低温离心浓缩至适合移入人体的细胞密度。

3.根据权利要求2所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：步骤B中的细胞拆合技术采用物理法或化学法，获得的新细胞的个数为5个以上。

4.根据权利要求2所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：步骤D悬浮培养过程中，培养基Ⅰ每3～5小时搅动一次，并每隔4～6天更换一次培养基Ⅰ。

5.根据权利要求2所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：步骤E增殖培养过程中，培养基Ⅰ每3～5小时搅动一次。

6.根据权利要求2所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：步骤D和步骤E中，培养基Ⅰ为人体血清，人体血清的pH值为7.30～7.45。

7.根据权利要求2所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：步骤C中的第一培养液、步骤E中的第二培养液、步骤F中的第三培养液均为pH7.30～7.45、重量百分比0.85～0.95%的氯化钠溶液。

8.根据权利要求2所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：步骤F中，培养基Ⅱ中的人体血清需要待培养基Ⅱ中的水解植物蛋白、水解动物蛋白、酵母液浸膏饱和液经高温无菌冷却后再加入。

9.根据权利要求8所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：步骤F中，人体血清具体加入步骤为：将装配好并注入水解植物蛋白、水解动物蛋白、酵母液浸膏饱和液和第三培养液的透析培养装置，经121℃、15ib、20min高温灭菌，待透析培养装置冷却至36～38℃后将除菌过滤的pH值为7.30～7.45的人体血清加入培养基室内。

10.根据权利要求2所述的培养多能造血干细胞的方法，其特征在于：步骤F和步骤G中，透析培养装置为不锈钢材质。