CN106967741B - 一种体外酶反应生产l(+)-乙偶姻的方法 - Google Patents
一种体外酶反应生产l(+)-乙偶姻的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106967741B CN106967741B CN201710215961.8A CN201710215961A CN106967741B CN 106967741 B CN106967741 B CN 106967741B CN 201710215961 A CN201710215961 A CN 201710215961A CN 106967741 B CN106967741 B CN 106967741B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acetoin
- concentrate
- butanediol
- pet28a
- butanediol dehydrogenase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- ROWKJAVDOGWPAT-VKHMYHEASA-N (S)-Acetoin Chemical compound C[C@H](O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 title claims abstract description 11
- OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diol Chemical compound CC(O)C(C)O OWBTYPJTUOEWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims abstract description 16
- 101150050729 bdhA gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- OWBTYPJTUOEWEK-ZXZARUISSA-N meso-butane-2,3-diol Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](C)O OWBTYPJTUOEWEK-ZXZARUISSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 101150038999 yodC gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 11
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 6
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008676 import Effects 0.000 abstract 1
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl propionaldehyde Natural products CCC(=O)CO GFAZHVHNLUBROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 14
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ARXKVVRQIIOZGF-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-butanetriol Chemical compound OCCC(O)CO ARXKVVRQIIOZGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-propanediol Substances OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 2-Butanone Chemical compound CCC(C)=O ZWEHNKRNPOVVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010002731 D-xylo-aldonate dehydratase Proteins 0.000 description 2
- QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N Diacetyl Chemical compound CC(=O)C(C)=O QSJXEFYPDANLFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- ROWKJAVDOGWPAT-GSVOUGTGSA-N (R)-Acetoin Chemical compound C[C@@H](O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- ASVYXWZOBCRSFB-UHFFFAOYSA-N C(C)S(=O)(O)=S.OCCN1CCNCC1 Chemical compound C(C)S(=O)(O)=S.OCCN1CCNCC1 ASVYXWZOBCRSFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- -1 dephosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000000769 gas chromatography-flame ionisation detection Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000008204 material by function Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007269 microbial metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01004—R,R-butanediol dehydrogenase (1.1.1.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01076—(S,S)-Butanediol dehydrogenase (1.1.1.76)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
- C12Y106/03—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with oxygen as acceptor (1.6.3)
- C12Y106/03001—NAD(P)H oxidase (1.6.3.1), i.e. NOX1
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种体外酶反应生产L(+)‑乙偶姻的方法，步骤为：(1)将载体pET28a与2,3‑丁二醇脱氢酶编码基因bdhA连接得到pET28a‑bdhA并导入大肠杆菌，发酵，纯化，浓缩，得到2,3‑丁二醇脱氢酶浓缩液；将载体pET28a与NADH氧化酶编码基因yodC连接得到pET28a‑yodC并导入大肠杆菌，发酵，纯化，浓缩，得到NADH氧化酶浓缩液；(2)将2,3‑丁二醇脱氢酶浓缩液、NADH氧化酶浓缩液、meso‑2,3丁二醇、NAD+和FAD+混合均匀，反应，得到L(+)‑乙偶姻。本发明以廉价的meso‑2,3‑丁二醇为底物，实现附加值高的L(+)‑乙偶姻的体外生产，产量和纯度高。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法。
背景技术
乙偶姻，化学名为3-羟基-2-丁酮，又叫甲基乙酰甲醇，是一种无色或淡黄色液体，单体为无色或淡黄色液体，呈奶香气，二聚体为白色结晶粉末，能自燃，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇、微溶于乙醚，几乎不溶于植物油。乙偶姻是常用的食品级香料，添加到食物中，提升食物中的奶香味。作为美国能源部优先开发的平台化合物之一，乙偶姻广泛应用于功能材料，医药生产和化学合成等领域。
目前，乙偶姻工业化生产的主要方法是化学合成法，包括2,3-丁二醇的氧化、丁酮的氯化水解法和丁二酮的部分加氢等方法。这些生产工艺操作较简便，但是能耗大，得率低且对环境有一定的污染。关键的问题是化学法制得的乙偶姻多为两种手性异构体的混合物。
近年来发展起来的利用微生物发酵法生产化学品成为热点，尤其是结合合成生物学、代谢工程、进化工程等方法，乙偶姻也不例外。目前有许多研究者将目光转向既经济又环保的微生物发酵法生产手性乙偶姻。目前生产乙偶姻的菌株有大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、谷氨酸棒杆菌等。利用微生物法合成乙偶姻的报道很多，产量较高，但微生物代谢复杂，体内合成不易调控。Xiao等[1]利用新的全细胞催化技术，在大肠杆菌中共表达2，3-丁二醇脱氢酶和水合NADH(还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又作还原型辅酶Ⅰ)氧化酶，以2,3-丁二醇为底物，在实现NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶Ⅰ)再生的情况下，实现手性乙偶姻的生产，最终，43g/L的meso-2,3丁二醇生成36.7g/L L(+)-乙偶姻，但此体系存在严重的底物抑制，meso-2,3-丁二醇浓度大于43g/L时，转化率和乙偶姻产量迅速下降。
相比之下，体外酶反应法可控，转移性强，且对反应条件的要求低，使此方法在重要化学品合成领域中具有广泛的应用潜力。通过无细胞的体外反应，可以控制反应体系各组分用量，精确的控制反应。所以，一部分研究者将目光转向将细胞生长和代谢生产分来的无细胞体外酶反应上。Rieckenberg等[2]利用甘油脱氢酶、丙二醇氧化还原同工酶、氢化酶Ⅰ，成功的将甘油转化为1,3-丙二醇，转化率几乎接近于1，在3g/L的底物浓度下1,3-丙二醇的产量为0.24mmol，虽然转化率很高，但存在底物抑制效应，酶稳定性低等问题，产率低。中国科学院青岛生物能源与过程研究所发明了一种体外酶生产1,2,4-丁三醇，发明利用D-木糖酸脱水酶，2-丙酸脱羧酶和醇脱氢酶，以D-木糖酸为底物，生产1,2,4-丁三醇，体系放大到100mL,30℃，反应24h后，产量达到了5.98g/L，但此发明利用粗酶液催化反应，副产物多(咸漠，蒋昱东，刘炜等，一种体外酶反应生成1，2，4-丁三醇的方法，申请号：201410682463.O)。Jennifer E.Kay[3]等在大肠杆菌中引入合成2,3-丁二醇的外源途径，将工程菌株的细胞提取物中加入底物，ATP和NAD+，30h的补料分批培养，最终2,3-丁二醇的产率达到11.3g L-1h-1。这个研究首次引进外源途径并证明了细胞提取物有辅因子再生的能力，进一步证明了细胞提取物即无细胞代谢工程能够高效实现小分子转化，克服生物转化率低，产量低，细胞内毒性物质限制工业生产等困难。但是此反应的副产物多，影响下游的分离。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法，包括如下步骤：
(1)将蛋白质表达载体pET28a与2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA连接得到质粒pET28a-bdhA，将所述质粒pET28a-bdhA导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到菌株BL21-1，对菌株BL21-1培养发酵表达2,3-丁二醇脱氢酶，纯化，浓缩，得到2,3-丁二醇脱氢酶浓缩液；将蛋白质表达载体pET28a与NADH氧化酶编码基因yodC连接得到质粒pET28a-yodC，将所述质粒pET28a-yodC导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到菌株BL21-2，对菌株BL21-2培养发酵表达NADH氧化酶，纯化，浓缩，得到NADH氧化酶浓缩液；
(2)将2,3-丁二醇脱氢酶浓缩液、NADH氧化酶浓缩液、meso-2,3丁二醇、NAD+和FAD+混合均匀，反应，得到L(+)-乙偶姻。
本发明的方法，能够以较为廉价的meso-2,3-丁二醇为底物，实现附加值较高的L(+)-乙偶姻的体外生产，产量为6.35g/L，且手性纯度达95％。双酶体系的核心成分为2，3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶，通过两种酶的合理搭配，实现了辅因子NAD+的有效再生以及L(+)-乙偶姻的生产。
附图说明
图1为构建的pET28a-bdhA质粒载体的图谱。
图2为构建的pET28a-yodC质粒载体的图谱。
图3为2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶的SDS-PAGE电泳胶图。
图4为手性乙偶姻的气相色谱检测，其中，A为两种手性乙偶姻的混合物在气相色谱中的峰图；B为反应样在气相色谱中的峰图。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所选用的2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA，Genebank登陆号为939490。由其编码的2,3-丁二醇脱氢酶，可催化meso-2,3-丁二醇生成L(+)-乙偶姻同时有辅因子NAD+的参与，其反应式为：
本发明所选用的NADH氧化酶编码基因yodC，Genebank登陆号939506。由其编码的水合NADH氧化酶，可催化氧气生成水，同时有辅因子NADH的参与，其反应式为：
原始质粒pET28a来源为biovector(http://www.biovector.net/)；
原始菌株B.subtilis 168来源为BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)；
E.coli BL21(DE3)感受态来源为NEB(http://www.neb-china.com/)；
所用meso-2,3-丁二醇和乙偶姻标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。
所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等、分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。
所用其他生化试剂(如胰蛋白胨，酵母抽提物，NaCl，HEPES，TRIS，咪唑、NAD+、FAD+等)从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
实施例1 使用商业化蛋白质表达载体pET28a过表达2,3-丁二醇脱氢酶(bdhA)
以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，以引物p-bdhA1和p-bdhA2用于扩增基因bdhA片段(约1.0kp)。将bdhA片段和pET28A质粒使用Thermo Fast digest NheI/BamHI双酶切，经连接、转化后得到bdhA基因的表达载体pET28a-bdhA(见图1),测序检测无误。将测序结果正确的质粒通过传统氯化钙法转入商业化感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到2,3-丁二醇脱氢酶(bdhA)过表达的BL21-1。
实施例2 使用商业化蛋白质表达载体pET28a过表达NADH氧化酶(yodC)
以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168基因组为模板，以引物p-yodC1和p-yodC2用于扩增基因yodC片段(609bp)。然后将yodC片段和pET28a质粒使用Thermo Fast digest NdeI/XhoI双酶切，经连接、转化后得到yodC基因的表达载体pET28a-yodC(见图2),测序检测无误。将测序结果正确的质粒通过传统氯化钙法转入商业化感受态大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到NADH氧化酶(yodC)过表达的BL21-2。
表1 菌株构建所用引物序列
实施例3 2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶的纯化浓缩
1、2,3-丁二醇脱氢酶的纯化浓缩具体步骤为：
1)将大肠杆菌BL21-1接种到400mL LB培养基中，摇床37℃，220rpm培养至OD600为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，16℃培养12h，4℃，4200rpm离心20min收集菌体，并用20mL buffer A悬浮。
2)收集步骤1)得到的BL21-1的悬浮液，在高压细胞破碎机的作用下破碎细胞，在4℃，1200bar，油压18Kg/cm3条件下处理3次，破碎后4℃，8000rpm离心30min，收集上清得到粗酶液。
3)将步骤2)中得到的粗酶液，利用重力镍柱纯化方法，纯化蛋白。在4℃条件下，将粗酶液全部流穿装有镍填料的柱子，再用buffer A和buffer B配制的不同的咪唑浓度(20mM，50mM，100mM，150mM，200mM，250mM，500mM)的洗脱液洗脱，收集流出液，得到高纯度的2,3-丁二醇脱氢酶溶液。
4)收集步骤3)得到的目的蛋白溶液，利用孔径10KD的超滤管浓缩蛋白。将收集的流出液，在4800rpm，4℃离心。最后用5mL HEPES-NaCl缓冲液洗涤2次，继续离心至剩余量为2mL，分装。得到高浓度的2，3-丁二醇脱氢酶溶液。再利用Bradford法[4]测定2,3-丁二醇脱氢酶浓度，其终浓度为：18.6mg/mL。
5)将步骤4)得到的2,3-丁二醇脱氢酶溶液进行SDS-PAGE电泳，确认2,3-丁二醇脱氢酶大小正确(见图3，泳道1，M:Marker；1:2,3-丁二醇脱氢酶(40.6kDa))
2、NADH氧化酶的纯化浓缩具体步骤为：
1)将大肠杆菌BL21-2接种到400mL LB培养基中，摇床37℃，220rpm培养至OD600为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mM，16℃培养12h，4℃，4200rpm离心20min收集菌体，并用20mL buffer A悬浮。
2)收集步骤1)得到的BL21-2悬浮液，在高压细胞破碎机的作用下破碎细胞，在4℃，1200bar，油压18Kg/cm3条件下处理3次，破碎后4℃，8000rpm离心30min，收集上清得到粗酶液。
3)将步骤2)中得到的粗酶液，利用重力镍柱纯化方法，纯化蛋白。在4℃条件下，将粗酶液全部流穿装有镍填料的柱子，再用buffer A和buffer B配置的不同的咪唑浓度(20mM，50mM，100mM，150mM，200mM，250mM，500mM)的洗脱液洗脱，收集流出液，得到高纯度的NADH氧化酶溶液。
4)收集步骤3)得到的目的蛋白溶液，利用超滤管浓缩蛋白。将收集的流出液，在4800rpm，4℃离心。最后用5mL HEPES-NaCl缓冲液洗涤2次，继续离心至剩余量为2mL，分装，得到高浓度的2，3-丁二醇脱氢酶溶液。再利用Bradford法测定NADH氧化酶浓度，其终浓度为：13.6mg/mL。
5)将步骤4)得到的NADH氧化酶溶液进行SDS-PAGE电泳，确认NADH氧化酶大小正确(见图3，泳道2，M:Marker；2:NADH氧化酶(24.4kDa))
LB培养基配方为：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L NaCl，调节pH至7.5。0.1Mpa压力下灭菌20min。
HEPES-NaCl buffer配方为：20mM HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)，50mM NaCl，调节PH至7.5。
buffer A配方为：25mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑，调节PH至7.5。
buffer B配方为：25mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，调节PH至7.5。
实施例4 2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶比酶活的测定
1.2,3-丁二醇脱氢酶的比酶活测定，具体步骤为：2，3丁二醇的脱氢反应在37℃下进行，通过测定340nm下NADH的增加量，即NAD+的还原量，来表征2，3丁二醇脱氢酶的酶活。反应体系组分：0.5M meso-2,3-丁二醇，10m M NAD+，0.1mg/mL 2,3-丁二醇脱氢酶,HEPES-NaCl buffer补齐至200μL。1U 2,3-丁二醇脱氢酶定义为每分钟1μmol NAD+转化为NADH所需的酶量。结果测得2,3-丁二醇脱氢酶的比酶活为0.312U/mg。
2.NADH氧化酶的比酶活测定，具体步骤为：NADH的氧化反应在37℃下进行，通过测定340nm下NADH的减少量，来表征NADH氧化酶的酶活。反应体系组分：10mM NAD+，0.1mg/mLNADH氧化酶,HEPES-NaCl buffer补齐至200μL。1U NADH氧化酶定义为每分钟1μmol NADH转化为NAD+所需的酶量。结果测得NADH氧化酶的比酶活为0.415U/mg。
实施例5 体外双酶体系生产手性乙偶姻
利用2,3-丁二醇脱氢酶和NADH氧化酶所催化的两个反应的耦合，设计出体外酶反应体系生产L(+)-乙偶姻。其具体参数如表2所示,在30℃、500rpm条件下反应12h后终止反应。
表2.反应体系
注：HEPES-NaCl Buffer PH＝8.5配方为：100mM HEPES，50mM NaCl，调节PH至8.5。
使用GC-FID检测乙偶姻的手性纯度，使用手性柱HP-chiral 20b column(AgilentTechnologies)。手性L(+)-乙偶姻的色谱检测见图4，其中，A图为两种手性乙偶姻的混合物的峰图(依次为D-(-)-乙偶姻，L-(+)-乙偶姻)；B图为反应样的检测峰图。
从发酵结果可以看出，乙偶姻的总产量为6.35g/L，手性L(+)-乙偶姻纯度为95％，本发明所构建的体外双酶反应体系能够实现体外手性乙偶姻的生产和辅因子的再生，手性纯度较高，具有良好的应用前景。
参考文献：
[1]Xiao,Z.,et al.,A novel whole-cell biocatalyst with NAD+regeneration for production of chiral chemicals.PloS one,2010.5(1):p.e8860.
[2]Rieckenberg,F.,et al.,Cell-free synthesis of 1,3-propanediol fromglycerol with a high yield.Engineering in Life Sciences,2014.14(4):p.380-386.
[3]Kay,J.E.and M.C.Jewett,Lysate of engineered Escherichia colisupports high-level conversion of glucose to 2,3-butanediol.Metabolicengineering,2015.32:p.133-142.
[4]Bradford,M.M.,A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding.Analytical Biochemistry,1976.72(1-2):p.248-254.
SEQUENCE LISTING
<110> 天津大学
<120> 一种体外酶反应生产L（+）-乙偶姻的方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cgcggatcct tagttaggtc taacaagg 28
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctacgggcta gcatgaaggc agcaagatgg cataac 36
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tatccatatg atgacgaata ctctggatg 29
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ccgctcgagt tacagccaag ttgatac 27
Claims (1)
1.一种体外酶反应生产L(+)-乙偶姻的方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将蛋白质表达载体pET28a与2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA连接得到质粒pET28a-bdhA，将所述质粒pET28a-bdhA导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到菌株BL21-1，对菌株BL21-1培养发酵表达2,3-丁二醇脱氢酶，纯化，浓缩，得到2,3-丁二醇脱氢酶浓缩液；将蛋白质表达载体pET28a与NADH氧化酶编码基因yodC连接得到质粒pET28a-yodC，将所述质粒pET28a-yodC导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中得到菌株BL21-2，对菌株BL21-2培养发酵表达NADH氧化酶，纯化，浓缩，得到NADH氧化酶浓缩液；
(2)将1U/ml的2,3-丁二醇脱氢酶浓缩液、1U/ml的NADH氧化酶浓缩液、0.3M的meso-2,3-丁二醇、20mM的NAD+和50μM的FAD+混合均匀，反应，得到L(+)-乙偶姻；
所述2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA，Genbank登陆号为939490；
所述NADH氧化酶编码基因yodC，Genbank登陆号为939506。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710215961.8A CN106967741B (zh) | 2017-04-03 | 2017-04-03 | 一种体外酶反应生产l(+)-乙偶姻的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710215961.8A CN106967741B (zh) | 2017-04-03 | 2017-04-03 | 一种体外酶反应生产l(+)-乙偶姻的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106967741A CN106967741A (zh) | 2017-07-21 |
| CN106967741B true CN106967741B (zh) | 2020-02-21 |
Family
ID=59337344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710215961.8A Active CN106967741B (zh) | 2017-04-03 | 2017-04-03 | 一种体外酶反应生产l(+)-乙偶姻的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106967741B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101565685A (zh) * | 2009-01-07 | 2009-10-28 | 山东大学 | 一株基因重组菌及在手性纯乙偶姻和2,3-丁二醇生产中的应用 |
| CN102071174A (zh) * | 2010-11-24 | 2011-05-25 | 天津工业生物技术研究所 | （2r,3r）-2，3-丁二醇脱氢酶及其编码基因与应用 |
| CN102808002A (zh) * | 2011-05-31 | 2012-12-05 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的重组细胞和方法 |
| CN103725718A (zh) * | 2014-01-08 | 2014-04-16 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种生物法合成乙偶姻及其衍生物的方法 |
| CN104017764A (zh) * | 2014-06-05 | 2014-09-03 | 江南大学 | 利用Bacillus subtilis NAD+再生系统高效生物转化2,3-丁二醇生产乙偶姻 |
| CN104087602A (zh) * | 2014-07-17 | 2014-10-08 | 广西科学院 | 一种光学纯r-乙偶姻的生产方法 |
| CN104736714A (zh) * | 2012-08-20 | 2015-06-24 | 科莱恩产品（德国）有限公司 | 用于制备化学品的无细胞最小化代谢反应级联 |
| CN105200068A (zh) * | 2015-09-23 | 2015-12-30 | 江南大学 | 一种meso-2,3-丁二醇脱氢酶编码基因、重组酶及其制备方法和应用 |
| WO2016012561A1 (en) * | 2014-07-25 | 2016-01-28 | Alderys | Method for producing acetoin |
-
2017
- 2017-04-03 CN CN201710215961.8A patent/CN106967741B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101565685A (zh) * | 2009-01-07 | 2009-10-28 | 山东大学 | 一株基因重组菌及在手性纯乙偶姻和2,3-丁二醇生产中的应用 |
| CN102071174A (zh) * | 2010-11-24 | 2011-05-25 | 天津工业生物技术研究所 | （2r,3r）-2，3-丁二醇脱氢酶及其编码基因与应用 |
| CN102808002A (zh) * | 2011-05-31 | 2012-12-05 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的重组细胞和方法 |
| CN104736714A (zh) * | 2012-08-20 | 2015-06-24 | 科莱恩产品（德国）有限公司 | 用于制备化学品的无细胞最小化代谢反应级联 |
| CN103725718A (zh) * | 2014-01-08 | 2014-04-16 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种生物法合成乙偶姻及其衍生物的方法 |
| CN104017764A (zh) * | 2014-06-05 | 2014-09-03 | 江南大学 | 利用Bacillus subtilis NAD+再生系统高效生物转化2,3-丁二醇生产乙偶姻 |
| CN104087602A (zh) * | 2014-07-17 | 2014-10-08 | 广西科学院 | 一种光学纯r-乙偶姻的生产方法 |
| WO2016012561A1 (en) * | 2014-07-25 | 2016-01-28 | Alderys | Method for producing acetoin |
| CN105200068A (zh) * | 2015-09-23 | 2015-12-30 | 江南大学 | 一种meso-2,3-丁二醇脱氢酶编码基因、重组酶及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| An artificial enzymatic reaction cascade for a cell-free bio-system based on glycerol;Chao Gao等;《Green Chemistry》;20141104;第17卷(第2期);摘要，第804页右栏第3段，第805页左栏第1段 * |
| 无细胞代谢工程生产手性纯度乙偶姻;崔真真;《CNKI硕博士论文数据库》;20180501;全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106967741A (zh) | 2017-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fu et al. | Metabolic engineering of Bacillus subtilis for chiral pure meso-2, 3-butanediol production | |
| Atsumi et al. | Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde | |
| CN102272314B (zh) | 无细胞生产化学品的方法 | |
| Soma et al. | Direct isopropanol production from cellobiose by engineered Escherichia coli using a synthetic pathway and a cell surface display system | |
| US10294479B2 (en) | Candida carbonyl reductase and method for preparing (R)-lipoic acid precursor | |
| Wang et al. | Characterization of a stereospecific acetoin (diacetyl) reductase from Rhodococcus erythropolis WZ010 and its application for the synthesis of (2 S, 3 S)-2, 3-butanediol | |
| CN107686850B (zh) | 一种利用共表达重组菌株转化生产α-酮戊二酸的方法 | |
| CN109679978B (zh) | 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组共表达体系及其应用 | |
| CN104388373A (zh) | 一种共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌系统的构建 | |
| WO2020087626A1 (zh) | 一种醇脱氢酶突变体及其在辅酶再生中的应用 | |
| CN105567622A (zh) | 一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用 | |
| Gao et al. | Production of S‐acetoin from diacetyl by Escherichia coli transformant cells that express the diacetyl reductase gene of Paenibacillus polymyxa ZJ‐9 | |
| Yi et al. | A heterodimeric reduced-ferredoxin-dependent methylenetetrahydrofolate reductase from syngas-fermenting Clostridium ljungdahlii | |
| CN107653259B (zh) | 一种体外酶反应生产d-(-)-乙偶姻的方法 | |
| Gao et al. | High-yield production of D-1, 2, 4-butanetriol from lignocellulose-derived xylose by using a synthetic enzyme cascade in a cell-free system | |
| CN105331589A (zh) | 可再生辅酶nad+的水型nadh氧化酶及其编码基因与应用 | |
| Wu et al. | Construction and characterization of novel bifunctional fusion proteins composed of alcohol dehydrogenase and NADH oxidase with efficient oxidized cofactor regeneration | |
| CN102808002B (zh) | 一种生物法合成甲基乙偶姻及其衍生物的重组细胞和方法 | |
| CN104630242B (zh) | 一种羰基还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及其应用 | |
| Cui et al. | Concomitant cell‐free biosynthesis of optically pure D‐(−)‐acetoin and xylitol via a novel NAD+ regeneration in two‐enzyme cascade | |
| CN104928224B (zh) | 一种阿魏酸生产工程菌株、构建方法及生物转化方法 | |
| CN111996176A (zh) | 羰基还原酶突变体及其应用 | |
| CN104630125B (zh) | 工程菌及其在制备(3r, 5s)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯中的应用 | |
| CN105602913A (zh) | 重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut、编码基因、工程菌及应用 | |
| CN118006696B (zh) | 一种生物催化转化β-紫罗兰醇制备二氢-β-紫罗兰酮的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |