CN107753473A - 一种全反式维甲酸注射剂与应用 - Google Patents
一种全反式维甲酸注射剂与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种全反式维甲酸注射剂与应用。所述全反式维甲酸注射剂包括全反式维甲酸和助溶分子，本发明所制备的全反式维甲酸注射剂将全反式维甲酸的表观溶解度由现有技术中的0.01mg／ml，提升至0. 1mg／ml以上，提高了至少10倍。应用该制剂可以降低肿瘤病人血液中和肿瘤组织中浸润的免疫抑制细胞群的活性，提高针对肿瘤的免疫清除机制的效果，单独使用或联合其他药物应用可以抑制肿瘤生长和肿瘤复发，因此具有极大的医疗实用性。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种全反式维甲酸注射剂与应用。
背景技术
维甲酸为体内维生素A代谢产物。全反式维甲酸(ATRA)作为药物被用来治疗粉刺，同时也是临床上治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的重要药物，目前临床上的应用均通过口服制剂给药。
全反式维甲酸(ATRA)通过结合至细胞内的特定受体(RARs，RXRs和RORs)从而影响基因表达，在急性早幼粒细胞白血病治疗中，可以促进APL细胞分化和PML/RARαgene的降解，达到治疗的效果(Effectiveness and Pharmacokinetics of Low-Dose All-transRetinoic Acid(25mg/m2)in Acute Promyelocytic Leukemia。Blood 82,12,1993.P.3560)。也有文献提示，ATRA能够促进肿瘤病人体内的髓样抑制性细胞的分化，下调肿瘤组织中各类髓样抑制性细胞的数量(All-trans-Retinoic Acid ImprovesDifferentiation of Myeloid Cells and Immune Response in CancerPatients.Cancer Res 2006；66:(18).September 15,2006)。髓样抑制性细胞最初发现于20世纪80年代。其主要由处于不同分化程度的相对未成熟细胞组成。在荷瘤小鼠的骨髓、血液、淋巴器官和肿瘤浸润部位发现有大量标志为CD11b和Gr-1的髓样细胞。在人体中这些细胞为CD34+CD33+CD13+，并且与髓样前体细胞一样，能在琼脂上形成克隆。在肿瘤微环境中，髓样抑制细胞通过分泌精氨酸酶、ROS和IL-6，下调效应T细胞的杀伤活性，抑制DC细胞成熟。此外，ATRA还被报道具有促进肿瘤干细胞分化的作用(Targeting cancer stem cellsin glioblastoma multiforme using mTOR inhibitors and the differentiatingagent all-trans retinoic acid.ONCOLOGY REPORTS 30:1645-1650,2013。
然而，全反式维甲酸的药物的临床应用受到以下几个方面的限制：1全反式维甲酸的水溶性极低(4.77e-03g/l)；2全反式维甲酸血浆半衰期较短，而发挥其药效需要在一个较长的时间内维持一定的血药浓度，和在靶器官中的药效浓度。而目前几乎所有研究都使用的是口服制剂，其生物利用度只有30％以下。研究发现ATRA只在维持在一定的血药浓度以上才具有诱导分化的能力。因此，发现一种具有较高全反式维甲酸表观浓度的液体制剂尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种全反式维甲酸注射剂与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种全反式维甲酸注射剂，所述全反式维甲酸注射剂包括全反式维甲酸和助溶分子。
优选地，所述助溶分子选自脂质、聚氧乙烯蓖麻油、PVP、HPMC、Pluronic嵌段共聚物、环糊精或PEG中的任一种或多种的组合。
优选地，所述助溶分子与全反式维甲酸之间的质量比例范围是(10～80)：1。
优选地，所述脂质选自磷脂、胆固醇或聚乙二醇化的磷脂中的任一种或多种的组合。
优选地，所述脂质与全反式维甲酸之间的质量比例范围是：(20～80)：1。
优选地，所述磷脂选自PC磷脂。进一步优选地，所述磷脂选自EPC、HSPC或DPPC中任一种或多种的组合。
优选地，所述聚乙二醇化的磷脂的分子量范围是50～10000。
优选地，所述全反式维甲酸注射剂为溶液型注射剂、混悬型注射剂、乳剂型注射剂、或注射用无菌粉针剂。
进一步优选地，当所述全反式维甲酸注射剂为溶液型注射剂、混悬型注射剂或乳剂型注射剂时，所述全反式维甲酸注射剂中含有溶剂，所述溶剂中含有等渗调节剂。
优选地，所述等渗调节剂为：氯化钠。所述氯化钠在溶剂中的质量体积百分浓度是0.5～0.9％。
优选地，所述溶剂中还含有保护剂。所述保护剂为蔗糖。所述蔗糖在溶剂中的质量体积百分浓度是2～5％。
质量体积百分浓度是指每100ml溶剂中含有的溶质的质量g。
优选地，所述全反式维甲酸注射剂中，所述全反式维甲酸的浓度大于等于0.1mg/ml。进一步优选地，所述全反式维甲酸注射剂中，所述全反式维甲酸的浓度大于等1.0mg/ml。更优选地，所述全反式维甲酸注射剂中，所述全反式维甲酸的浓度范围是1～5mg/ml。
进一步优选地，所述注射制剂的给药途径选自皮内注射、皮下注射、肌内注射剂、静脉注射。
本发明的第二方面，提供前述全反式维甲酸注射剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。
优选地，所述肿瘤治疗药物为针对肿瘤病人中异常的髓系抑制性细胞、诱导髓系抑制性细胞分化、抑制肿瘤增殖和复发的药物。
进一步优选地，所述髓系抑制性细胞为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、基底细胞癌、黑色素瘤、滤泡性淋巴癌或小淋巴细胞瘤的髓系抑制性细胞。
本发明的第三方面，提供前述全反式维甲酸注射剂在制备药物中的用途，所述药物起到以下作用的任一种或多种：
(1)降低肿瘤浸润细胞中的髓系抑制细胞(MDSCs)的数量；
(2)诱导肿瘤浸润CD33+HLA-DR-细胞的分化；
(3)促进肿瘤患者外周血单核细胞(PBMC)中CD33+细胞的表型变化；
(4)降低外周血单核细胞(PBMC)中CD33+HLA-DR-细胞对T细胞的抑制作用；
(5)延缓肿瘤生长。
本发明的第四方面，提供一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：给患者施用前述全反式维甲酸注射剂。具体给药剂量在本领技术人员所熟知的范围内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)通过长期实验发现并证明本发明所制备的全反式维甲酸注射剂将全反式维甲酸的溶解度由现有技术中的0.01mg/ml，提升至少0.1mg/ml以上，提高了至少10倍。
(2)应用该制剂可以有效调节肿瘤发展的微环境，并可以有效地诱导肿瘤部位相关巨噬细胞的分化。通过静脉注射或静脉滴注给药时，该发明的血浆终末半衰期可达到8-12h。通过本发明治疗以后，可促进肿瘤中的40％～70％的髓系抑制性细胞分化或凋亡，并诱导成熟树突状细胞(DCs)的形成。通过本发明治疗后髓系抑制性细胞分泌的白细胞介素6(IL-6)发生显著水平下降。单独使用或联合应用均有免疫治疗的效果，可以应用于抑制肿瘤细胞增值和肿瘤复发，因此具有极大的医疗实用性。
附图说明
图1：EPC脂质体在小鼠中的血药浓度曲线。
图2：全反式维甲酸注射剂对小鼠肿瘤部位细胞MDSC抑制实验。
图3：全反式维甲酸注射剂促进头颈部黏膜鳞状细胞癌病人血液中MDSCs的分化。
图4：全反式维甲酸注射剂使瘤病人MDSC中的iNOS表达明显降低。
图5：全反式维甲酸注射剂作用于肿瘤病人体内的肿瘤组织，可以明显减少膀胱癌肿瘤浸润髓源细胞中CD33+HLA-DR-MDSC表型细胞的数量。
图6：全反式维甲酸注射剂使瘤病人MDSC对T细胞的抑制作用降低。
具体实施方式
全反式维甲酸注射剂
本发明的全反式维甲酸注射剂包括全反式维甲酸和助溶分子。
所述助溶分子选自脂质、聚氧乙烯蓖麻油、PVP、HPMC、Pluronic嵌段共聚物、环糊精或PEG中的任一种或多种的组合。
所述助溶分子与全反式维甲酸之间的质量比例范围是(10～80)：1。
所述脂质选自磷脂、胆固醇或聚乙二醇化的磷脂中的任一种或多种的组合。
所述脂质与全反式维甲酸之间的质量比例范围是：(20～80)：1。所述脂质与全反式之间的质量比例范围也可以是：(20～50)：1。
所述磷脂可选自PC磷脂。进一步地，所述磷脂选自EPC、HSPC或DPPC中任一种或多种的组合。
所述聚乙二醇化的磷脂的分子量范围是50～10000。
本发明一实施例中，列举了所述聚乙二醇化的磷脂的是2000。
本发明一实施例中，所述聚氧乙烯蓖麻油采用Cremophor RH40。
所述全反式维甲酸注射剂为溶液型注射剂、混悬型注射剂、乳剂型注射剂、或注射用无菌粉针剂。
进一步地，当所述全反式维甲酸注射剂为溶液型注射剂、混悬型注射剂或乳剂型注射剂时，所述全反式维甲酸注射剂中含有溶剂，所述溶剂中含有等渗调节剂。
所述等渗调节剂可选用氯化钠。所述氯化钠在溶剂中的质量体积百分浓度是0.5～0.9％。
所述溶剂中还可含有保护剂。所述保护剂为蔗糖。所述蔗糖在溶剂中的质量体积百分浓度是2～5％。
质量体积百分浓度是指每100ml溶剂中含有的溶质的质量g。
所述全反式维甲酸注射剂中，所述全反式维甲酸的浓度大于等于0.1mg/ml。进一步地，所述全反式维甲酸注射剂中，所述全反式维甲酸的浓度大于等1.0mg/ml。更进一步地，所述全反式维甲酸注射剂中，所述全反式维甲酸的浓度范围是1～5mg/ml。
进一步地，所述注射制剂的给药途径选自皮内注射、皮下注射、肌内注射剂、静脉注射。
全反式维甲酸注射剂的用途
本发明中，所述用途可以是：全反式维甲酸注射剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。
所述肿瘤治疗药物为针对肿瘤病人中异常的髓系抑制性细胞、诱导髓系抑制性细胞分化、抑制肿瘤增殖和复发的药物。
所述髓系抑制性细胞为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、基底细胞癌、黑色素瘤、滤泡性淋巴癌或小淋巴细胞瘤的髓系抑制性细胞。
所述用途还可以是在制备药物中的用途，所述药物起到以下作用的任一种或多种：
(1)降低肿瘤浸润细胞中的髓系抑制细胞(MDSCs)的数量；
(2)诱导肿瘤浸润CD33+HLA-DR-细胞的分化；
(3)促进肿瘤患者外周血单核细胞(PBMC)中CD33+细胞的表型变化；
(4)降低外周血单核细胞(PBMC)中CD33+HLA-DR-细胞对T细胞的抑制作用；
(5)延缓肿瘤生长。
治疗肿瘤的方法
本发明治疗肿瘤的方法，包括步骤：给患者施用前述全反式维甲酸注射剂。具体给药剂量在本领技术人员所熟知的范围内。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989andThird edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS INENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
本实施例采用以下三种方法考察不同助溶分子对ATRA增溶后的饱和溶解度。
(1)乳化法：将适量助溶分子溶于1ml超纯水中，作为水相；将1mg药物溶解于1ml有机溶剂中，作为有机相；在搅拌的条件下将有机相加入水相中，搅拌过夜，使有机溶剂挥发或通过旋转蒸发法除去有机溶剂，得到含有药物的溶液。
(2)透析法：将药物与助溶分子一起溶于有机溶剂中，再与1ml超纯水混合，将得到的溶液在纯水中透析，得到含有药物的溶液。
(3)冷冻干燥法：将适量助溶分子溶于1ml纯水中，加入适量冻干保护剂，作为水相；将药物溶解于有机溶剂(叔丁醇,TBA)中，作为有机相；将有机相与水相按一定的比例混合均匀，放入冻干机中冻干，24小时后取出，加入1ml超纯水复溶，得到药物的溶液。
筛选获得以下含有以下助溶分子的注射剂：
将20％Cremophor RH40与5％甘露醇溶于1ml纯水中，作为水相；将3mg药物ATRA溶解于1.5ml叔丁醇中，作为有机相；将有机相与水相混合均匀，装入5ml西林瓶中，放入冻干机中冻干，24小时后取出，封盖。给药前，加入1ml注射用水复溶，得到含有药物的混悬液。测定其中全反式维甲酸的饱和溶解度为0.1mg/ml。用动态激光散射方法测量，混悬液中的粒子平均粒径为274nm±42nm，并且可以在室温下放置10小时保持粒径不变，具有特别好的稳定性和分散性。
实施例2
分别选用EPC、HSPC、DPPC作为主要脂质材料。按照PC：Chol:DSPE-PEG2000＝2:1:0.125的摩尔比混合，加入ATRA(其中脂质/ATRA质量比分别为20:1、40:1、50:1)，水合时加入5-7颗小玻璃珠，旋转水合30min。依次挤压通过孔径为400nm,200nm,100nm聚碳酯膜各15次。得到全反式维甲酸脂质体的平均粒径在100nm±30nm范围内,PDI约为0.1。通过葡聚糖凝胶G-50微柱除去游离全反式维甲酸(ATRA),在全反式维甲酸的标准曲线线性范围内，通过除去包封到脂质体内的ATRA紫外吸收值峰面积与未除前ATRA紫外吸收峰面积的比值，即得到ATRA脂质体的包封率，分别为EPC脂质体：94％；HSPC脂质体：91％；DPPC脂质体：76％。三种脂质体制剂中ATRA的浓度均在0.3mg/ml以上。
以上制备的全反式维甲酸脂质体通过静脉注射给药，在小鼠体内的ATRA的半衰期在4～12小时之间。其中EPC脂质体在小鼠中的血药浓度曲线如图1中红色曲线所示，经计算半衰期其为247min。
实施例3
称取0.097克氢化豆磷脂(HSPC)、0.031克聚乙二醇化磷脂1，2-一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)及0.031克胆固醇，用1.6毫升的乙醇溶解并于70摄氏度水浴锅中水浴以溶解混合。将乙醇混合物加入6.4毫升的乙酸钙缓冲液(pH为9.0)。并置于70摄氏度中水浴30分钟。将所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为400nm，200nm，100nm，50nm聚碳酯膜各8次，最终得到平均粒径约为90nm左右的脂质体。
将上一步所制得的脂质体通过10000孔径透析膜透析将水相置换为10％质量分数，pH为6～7的蔗糖溶液中，加入4mg/ml的全反式维甲酸的混悬液，并于60摄氏度中孵育45分钟，孵育结束后再次用10000孔径透析膜将未载入脂质体的游离全反式维甲酸去除，最终得到全反式维甲酸脂质体注射液，其中ATRA的浓度在2.0mg/ml。
通过静脉注射或静脉滴注给药时，在小鼠中ATRA的血浆终末半衰期可达到8-12h。
实施例4、全反式维甲酸注射剂体外诱导肿瘤髓系抑制性细胞分化
1.Balb/c小鼠的肿瘤模型建立
(1)CT-26细胞培养至对数生长期时使用胰酶消化，将消化下的细胞收集并于离心机中以300g转速离心5min，倒去上清液，并用无菌PBS重悬细胞，细胞计数，并调整细胞浓度为1*107个细胞/毫升；
(2)购买6周大小的Balb/c白鼠，将皮下接种的一侧皮毛事先剃干净，用4％的水合氯醛200μl腹腔注射麻醉小鼠，麻醉后于右侧腋下部位皮下注射消化下来的CT-26悬液，细胞接种量为5*105-1*106/只，接种后继续饲养；
(3)大约饲养2-3周后，使用游标卡尺测量肿瘤长径及短径，通过肿瘤体积计算公式计算肿瘤大小：V＝1/2*长径*短径2，肿瘤体积约生长至100mm3时即可进行实验。
2.肿瘤相关淋巴细胞MDSC表征和分选
(1)断颈处死小鼠，使用镊子与剪刀从皮下去除肿瘤，并于40μm细胞滤网上剪碎，注意剪碎肿瘤组织时应小心避免剪切力对肿瘤细胞的损伤，同时在剪碎组织的过程中用含有5％的PBS不断冲洗组织；
(2)剪碎组织后将所有组织及冲洗PBS液一起离心，盗去上清后将所有组织一起转移至含1ml肿瘤组织消化液的15ml离心管中，于37℃、200rpm/min的摇床条件下消化1h；
(3)消化后的细胞再次通过40μm细胞滤网，使用PBS清洗细胞以去除残留的肿瘤组织消化液及细胞碎片与死细胞(清洗后离心时的条件为转速:1000rpm离心时间:5min)，清洗2-3遍。最终使用PBS重悬，此时得到肿瘤单细胞悬液。
(4)以每107个细胞/90μl体积的比例加入分选buffer并以每107个细胞/10μl体积的比例加入CD11b磁珠；
(5)将磁珠与细胞充分混匀，于4℃避光条件下孵育30min；孵育结束后按每107个细胞/1ml体积的比例加入90μl Buffer，1000rpm条件下离心5min，离心结束后使用Buffer继续清洗2遍；
(6)最终加入500μl Buffer重悬制得孵育磁珠的肿瘤单细胞悬液；
(7)将MS柱放入配套的磁铁中，预先使用Buffer进行润洗，使MS柱得到充分饱和；
(8)润洗结束后将孵育磁珠的肿瘤单细胞悬液从MS柱上方加入，并用1ml Buffer冲洗MS柱以将未结合磁珠的细胞冲洗下柱子；
(9)反复冲洗3-5遍后取下MS柱，放入15ml离心管中，加入1ml Buffer并用MS柱配套仪器将其快速推下，此时收集到的是停留在MS柱上的CD11b阳性细胞。
(10)将上一步得到的CD11b阳性细胞悬液进行细胞计数，将细胞浓度调整至107/ml，制备流式细胞术样品；
(11)流式细胞样品分为:阴性组、Gr-1单阳性组、CD11b单阳性组、待测样品组。每组设置2-3个平行管。其中阴性组不加任何荧光抗体以设置阴性条件，2个单阳性分别加入单一荧光抗体以便后续荧光补偿，待测样品组加入待测的荧光抗体；
(12)所有流式管中各加入100μl体积使用流式Staining Buffer重悬的细胞(约106个)，阴性对照组中不加入任何荧光抗体，Gr-1单阳性组加入Gr-1抗体，CD11b单阳性组加入CD11b抗体，待测样品组同时加入Gr-1与CD11b抗体；
(13)于4℃避光条件下孵育30min，孵育结束后加入1ml Staining Buffer离心以洗去未结合至细胞上的抗体，并接着使用Staining Buffer清洗细胞2次，最后用500μl体积Staining Buffer进行细胞重悬；流式细胞仪检测。
3.全反式维甲酸注射剂对外周血中淋巴细胞及肿瘤部位淋巴细胞的诱导分化作用
(1)按实施例1，2，3的方法，制备全反式维甲酸注射剂；
(2)分选肿瘤组织的中的MDSC细胞，细胞计数后将细胞浓度调整为调整107/ml，将分选后的收集到的细胞接种到24孔版中，使得每孔最终细胞浓度为106/孔；
(3)向铺好细胞的孔板中依次加入20μl PBS、20μl全反式维甲酸注射剂、50μl全反式维甲酸注射剂，37℃中孵育24h；
(4)孵育1天后使用Gr-1及CD11b、CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ抗体对细胞进行孵育，并通过流式细胞仪以观察细胞中MDSC及DC的变化，在流式样品处理过程中注意加入同型对照及做好荧光补偿。
对于，实施例3所制备的全反式维甲酸注射剂，如图2所示，通过给予不同剂量的药物我们可以观察到，Gr-1hi细胞数发生了显著的下降，在高剂量给药组(+50μl全反式维注射剂)中Gr-1hi细胞比例从对照组中17.5％下降至9.10％，而Gr-1int细胞在比例上变化看起来并不明显，可能是由于高表达的Gr-1在全反式维甲酸的诱导作用下转变为了中低表达。而Gr-1low细胞比例随着给药剂量的增加而上升，进一步说明全反式维甲酸诱导MDSC发生分化，从而导致Gr-1表达量下降。由于肿瘤部位大部分浸润的MDSC具有Gr-1hi或Gr-1int的表征，因此我们可以推断全反式维甲酸注射剂能够诱导肿瘤部位MDSC发生分化从而导致MDSC数量的减少。
对于实施例1和实施例2中的其他全反式维甲酸注射剂，也得到了同样的实验结论，亦即，能够诱导肿瘤部位MDSC发生分化从而导致MDSC数量的减少。
实施例5、全反式维甲酸注射剂促进头颈部黏膜鳞状细胞癌病人体内PBMC中CD33+细胞表型变化
取头颈部黏膜鳞状细胞癌病人外周血2ml加入2ml PBS稀释一倍，将4ml稀释血液沿试管内壁缓缓加入3ml人淋巴细胞分离液内，使稀释血液标本叠加在人淋巴细胞分离液上。室温每分钟300g离心力30min(加速2,减速1)，用吸管将单个核细胞层全部吸出，用PBS液稀释至10ml，300g离心洗涤2次。弃上清后加入少量PBS，得到大量PBMC，4℃备用。参照磁珠分离设备操作手册，用CD33抗体标记的磁珠分离获得PBMC细胞中的髓源性细胞。按照每孔5x105个细胞，用RPMI1640完全培养基(添加10％FBS)培养细胞至12孔细胞板，加入实施1或实施例2或实施例3制备获得的全反式维甲酸注射剂培养24小时,运用流式细胞仪检测HLA-DR+CD11c+表型DC细胞群在髓源性细胞中所占百分比。
如图3所示，对于实施例3所制备的全反式维甲酸注射剂，运用流式细胞仪检测HLA-DR+CD11c+表型DC细胞群在髓源性细胞中所占百分比，发现其数量显著增加。此外，如图4所示，这些细胞的iNOS的表达也显著下降。此外，Arg-1,IL-6等的表达水平也显著下降。
对于实施例2中的其他各全反式维甲酸注射剂，也得到了同样的实验结论，亦即，采用了其全反式维甲酸注射剂后，能够使得HLA-DR+CD11c+表型DC细胞群在髓源性细胞中所占百分比显著增加，这些细胞的Arg-1,iNOS,IL-6等的表达水平也显著下降。
实施例4、全反式维甲酸注射剂明显减少膀胱癌肿瘤浸润髓源细胞中的
CD33+HLA-DR-MDSCs数量
取膀胱癌病人肿瘤样本，无菌盐水冲洗干净后放入4℃含10％胎牛血清的RPMI1640(含青霉素100μg/ml,链霉素100μg/ml)细胞培养液中，送入实验室处理。将肿瘤置于2ml培养基中冰上切碎组织，转移至含2ml酶消化液(胶原蛋白酶I和IV消化液,0.6～1mg/ml)的15ml离心管中，轻轻的涡旋混匀。37℃恒温摇床，200rpm，2h。然后用无菌PBS缓慢冲洗，过40μm膜至50ml离心管。300g离心10min后用PBS重悬细胞并计数。参照磁珠分离设备操作手册，用CD33抗体标记的磁珠分离获得肿瘤组织浸润细胞中的髓源性细胞。按照每孔5x105个细胞，用RPMI1640完全培养基(添加10％FBS)培养细胞至12孔细胞板，加入实施例1或实施例2或实施例3制备好的全反式维甲酸注射剂药物培养24小时。然后运用流式细胞仪检测CD33+HLA-DR-MDSCs细胞群在髓源性细胞中所占百分比。
结果，如图5所示，本发明实施例3制备的全反式维甲酸注射剂作用于肿瘤病人体内的肿瘤组织，可以明显减少膀胱癌肿瘤浸润髓源细胞中CD33+HLA-DR-MDSC表型细胞的数量。如图6所示，本发明实施例3制备的全反式维甲酸注射剂能够使瘤病人MDSC对T细胞的抑制作用降低。
对于实施例2所制备的各全反式维甲酸注射剂，也得到了同样的实验结论。亦即，作用于肿瘤病人体内的肿瘤组织，可以明显减少膀胱癌肿瘤浸润髓源细胞中CD33+HLA-DR-MDSC表型细胞的数量。且，所述全反式维甲酸注射剂能够使瘤病人MDSC对T细胞的抑制作用降低。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (13)
1.一种全反式维甲酸注射剂，所述全反式维甲酸注射剂包括全反式维甲酸和助溶分子。
2.根据权利要求1所述的全反式维甲酸注射剂，其特征在于，所述助溶分子选自脂质、聚氧乙烯蓖麻油、PVP、HPMC、Pluronic嵌段共聚物、环糊精或PEG中的任一种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的全反式维甲酸注射剂，其特征在于，所述助溶分子与全反式维甲酸之间的质量比例范围是(10～80)：1。
4.根据权利要求2所述的全反式维甲酸注射剂，其特征在于，所述脂质选自磷脂、胆固醇或聚乙二醇化的磷脂中的任一种或多种的组合。
5.根据权利要求2所述的全反式维甲酸注射剂，其特征在于，所述脂质与全反式维甲酸之间的质量比例范围是：(20～80)：1。
6.根据权利要求2所述的全反式维甲酸注射剂，其特征在于，所述磷脂选自EPC、HSPC或DPPC中任一种或多种的组合。
7.根据权利要求1所述的全反式维甲酸注射剂，其特征在于，所述全反式维甲酸注射剂为溶液型注射剂、混悬型注射剂、乳剂型注射剂、或注射用无菌粉针剂。
8.根据权利要求1～7任一权利要求所述的全反式维甲酸注射剂，其特征在于，所述全反式维甲酸的浓度大于等于0.1mg/ml。
9.根据权利要求1～7任一权利要求所述的全反式维甲酸注射剂，其特征在于，所述注射制剂的给药途径选自皮内注射、皮下注射、肌内注射剂、静脉注射。
10.如权利要求1～7任一权利要求所述全反式维甲酸脂注射剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述反式维甲酸制剂可以降低肿瘤病人中异常的髓系抑制性细胞的活性、诱导髓系抑制性细胞分化、抑制肿瘤增殖和复发。
12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述髓系抑制性细胞为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、大肠癌、基底细胞癌、黑色素瘤、滤泡性淋巴癌或小淋巴细胞瘤病人体内的髓系抑制性细胞。
13.如权利要求1～7任一权利要求所述全反式维甲酸注射剂在制备药物中的用途，所述药物起到以下作用中的任一种或多种：
(1)降低肿瘤浸润细胞中的髓系抑制细胞(MDSCs)的数量；
(2)诱导肿瘤浸润CD33+HLA-DR-细胞的分化；
(3)促进肿瘤患者外周血单核细胞(PBMC)中CD33+细胞的表型变化；
(4)降低外周血单核细胞(PBMC)中CD33+HLA-DR-细胞对T细胞的抑制作用；
(5)延缓肿瘤生长。
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