CN108431237A

CN108431237A - 用于包括确定样品的异常状况，特别是健康状况和/或致病状况的基于核酸的诊断方法的方法和装置

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Publication number: CN108431237A
Application number: CN201680052836.3A
Authority: CN
Inventors: K·佐恩; S·格鲁马兹; P·史蒂文斯; A·冯·黑泽勒
Original assignee: Medizinische Universitaet Wien; Universitaet Wien; Universitaet Stuttgart; Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Medizinische Universitaet Wien; Universitaet Wien; Universitaet Stuttgart; Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2015-09-10
Filing date: 2016-09-08
Publication date: 2018-08-21
Also published as: CA2998253A1; WO2017042287A1; EP3347488A1; EP3347488B1; US10910088B2; EP3141612A1; US20180307795A1; JP2018527938A; KR20180083303A

Abstract

本发明涉及用于包括确定样品的异常状况的基于核酸的诊断方法的方法和装置，其中异常状况优选为健康状况和/或致病状况。

Description

用于包括确定样品的异常状况，特别是健康状况和/或致病状况的基于核酸的诊断方法的方法和装置

样品中的异常状况，特别是健康或致病状况的可靠且快速检测和表征，对于受试者有需要的预防疾病发作或治疗疾病而言是至关重要的。样品的健康或致病状况代表了发展中或已经确定的疾病(例如复杂的疾病或感染)的指标。

感染仍然是重症监护医学面临的挑战。在过去的几十年中，感染的发病率显示持续增加。尽管在研究方面进行了大量努力，但新的治疗方法很少见，感染患者的死亡率仍然高得令人无法接受。除了早期的重点控制外，最近的指导还建议在诊断败血症后尽早开始经验性抗生素治疗，最好在1小时内开始。然而，致病体的鉴定及其耐药模式对于抗微生物治疗方案的早期优化至关重要。在这种情况下，基于培养的诊断程序，例如血液培养，已知是护理的黄金标准，尽管已知它们与相关缺点有关，特别是(i)取决于微生物生长，它经常占用多达5天，直到结果可用，以及(ii)基于培养的诊断过程由于施用经验性抗生素治疗经常显示假阴性结果。

因此，患有感染的患者由于广谱抗生素不恰当和长期使用而处于抗微生物过度治疗，抗生素相关毒性以及多重耐药病原体选择的高风险中。在这种情况下，已经引入了免培养的分子诊断过程，例如基于PCR的技术，用于鉴定感染患者中的致病体。WO2012/135815公开了用于检测受试者中源自病原体的靶核酸的方法。该方法包括(a)扩增靶核酸的核酸序列，其从受试者血液样品的无细胞部分获得，和(b)检测双链DNA。双链DNA的存在表明受试者中存在靶核酸。

然而，这些基于PCR的诊断方法的众所周知的弱点是存在模糊结果以及限制患者样品中的细菌负荷的定量测量和抗生素抗性标记检测。仍然无法确定，所鉴定的生物体是否是感染的病因，或者是否可能存在混合感染。虽然有各种有针对性的分子测试可用于鉴定感染，但费时的血液培养方法仍然是黄金标准。

因此，受试者中的快速且有效的定性和定量检测和确定异常状况，尤其是病原体(例如微生物或病毒)的存在，是微生物分析和诊断中的一大挑战。对于全面涵盖病原体的受试者的完全健康或致病状况的检测的分析和诊断来说更是如此，这可以防止分别对于多种特定病原体进行的耗时分析。

因此，仍然强烈需要一种快速有效的诊断方法，其对于特别是在与疾病有关的生物样品中感染微生物和病毒的识别具有足够的灵敏度。

本发明的基本技术问题是提供一种用于定量和定性地确定受试者中的异常状况(尤其是健康或致病状况)，特别是相关病原体的方法，其克服了上述缺点和不足，特别地其是一种用于在受试者中的相关病原体的定量和定性测定的快速、高效、可靠、精确和灵敏的方法。

本发明的技术问题特别通过独立权利要求的主题来解决。

本发明特别涉及用于确定样品的异常状况的方法和装置，其包括以下步骤，特别是由以下步骤组成：

a)提供样品，其包括来自样品源的至少一个特定核酸，

b)提供数据库，其包括与特定核酸有关的至少一个数据集，该数据集指示在对照组中特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率，

c)对样品中的至少一个核酸进行测序以确定样品中至少一个特定核酸的标识和丰度，

d)将步骤c)中确定的至少一个特定核酸的标识分配到步骤b)中提供的数据库的数据集，该数据集与步骤c)中确定的相同的特定核酸有关，

e)基于根据步骤c)确定的样品的至少一个特定核酸的丰度和在步骤b)中提供的相同特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率，计算指示样品的异常状况的显著性分数。

优选地，处理步骤的顺序是a)，b)，c)，d)和e)，或者在另一个实施方式中是b)，a)，c)，d)和e)。在进一步优选的实施方式中，在步骤c)之后提供根据步骤b)的数据库。

优选地，异常状况是健康状况和/或致病状况。

优选地，异常状况是致病状况。本发明还优选涉及一种用于确定样品的致病状况的方法，其包括以下步骤：

a)提供样品，其包括来自样品源的至少一个特定核酸，

e)基于根据步骤c)确定的样品的至少一个特定核酸的丰度和在步骤b)中提供的对照组中的相同的特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率，计算指示样品的致病状况的显著性分数。

因此，本发明提供了用于确定样品的异常状况(优选致病状况)的方法，根据该方法至少一个特定核酸存在于样品中，所述特定核酸的出现、丰度或出现和丰度是所述样品的异常状况(优选致病状况)的潜在指示，被测序、分配到数据库的数据集，该数据集包括关于在与对照组中特定核酸有关的核酸中的相同特定核酸和/或与对照组中特定核酸有关的核酸的相同特定核酸的出现和丰度的数据，并且其中与来自对照组的所述特定核酸相关的数据集用于计算显著性分数，其中所述显著性分数指示样品的异常状况，优选样品的致病状况。

因此，在步骤c)中测序和鉴定的样品中存在的至少一个特定核酸的出现、丰度或这两者与根据步骤b)关于存在于对照组中的所述特定核酸或与特定核酸相关的核酸的出现、丰度或这两者由数据库提供的信息计算结合，以指示异常，优选致病状况，优选对样品中病原体的出现指示。步骤b)中提供的数据库提供至少一个数据集，其包括的数据优选地通知关于在对照组中所述特定核酸和/或与特定核酸有关的核酸的出现和丰度以及由此得出的特定丰度(优选任何丰度)出现的概率。步骤b)中提供的至少一个数据集优选使在步骤c)中鉴定的特定核酸能够在步骤d)中分配到相应的，即相同的或至少相似的核酸，或到与在对照组中鉴定的特定核酸相关的核酸，特别地允许其将步骤c)中鉴定的核酸的标识分配到相同或至少相似的核酸或到与对照组中的特定核酸相关的核酸，并且从而分配到数据集，数据集包括关于对照组中的所述核酸的出现、丰度(也称为数量或量)或这两者的数据。

在本发明的优选实施方式中，涉及特定核酸的至少一个数据集是指特定核酸或类似于特定核酸的核酸或衍生自相同来源的核酸。

在优选的实施方式中，来自步骤c)中鉴定的样品的特定核酸在步骤d)中被分配到对照组中鉴定的核酸的数据集，其具有至少73％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％的相似性，更优选完全相同。在优选的实施方式中，步骤c)中鉴定的特定核酸在步骤d)中被分配到相同物种的步骤b)中提供的数据集。

作为选择，步骤b)中提供的至少一个数据集优选使得能够优选地在步骤d)中将步骤c)中鉴定的特定核酸分配到与步骤c)中鉴定的特定核酸相关的至少一个核酸。

步骤b)中提供的至少一个数据集与步骤c)中鉴定的特定核酸有关。这意味着步骤b)中提供的至少一个数据集提供了关于来自步骤c)中鉴定的样品的特定核酸的数据，关于类似核酸的数据和/或关于与在步骤c)中鉴定的特定核酸相关的至少一个核酸的数据。

与步骤c)中鉴定的特定核酸相关的核酸优选为具有相同来源的核酸，尤其是相同的特性和相关的来源，即两者都源自相同的来源，例如，相同的微生物、病毒、真菌生物或癌细胞类型。

数据库优选提供关于步骤c)中鉴定的特定核酸的来源的信息。此外，数据库优选提供至少一个数据集，该数据集指示在对照组中特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率。该数据集基于关于步骤c)中鉴定的特定核酸的信息，和/或关于类似核酸的信息和/或关于与步骤c)中鉴定的特定核酸有关的核酸的信息。

所述分配允许使样品中发现的至少一个特定核酸的标识和丰度与对照组中所述鉴定的特定核酸的所述鉴定的丰度出现的概率进行比较，并且反过来，允许提供指示用于异常状况的样品中的鉴定和定量测定核酸的显著性的显著性分数。在优选的实施方式中，数据库是核酸数据库，优选数据库提供在对照组中的至少一个特定核酸的概率分布。在优选的实施方式中，数据库提供关于特定核酸的异常或致病相关性的信息。

因此，本发明使用关于样品中至少一个特定核酸的出现、丰度和/或出现和丰度，由测序步骤c)提供的数据以确定异常状况，优选致病状况，其中所述测定进一步使用步骤b)中提供的数据库，其包括至少一个与特定核酸有关的数据集，该数据集指示在对照组中特定核酸的至少一个特定丰度，优选多个丰度，优选任何丰度出现的概率。确定样品中特定核酸的出现和丰度，并将所述数据与包括在源自对照组的数据集中的上述鉴定的数据进行比较，数据集包括有关在样品中发现的所述特定核酸序列的大量丰度的出现的概率的数据，包括在步骤c)中鉴定的样品中鉴定的特定核酸的鉴定的丰度出现的概率，数据集允许计算显著性分数，即允许推断在样品中提供的所述核酸的出现、丰度或出现和丰度与异常(例如致病状况)是否有关。测序和鉴定的至少一个核酸的出现、丰度或出现和丰度与在对照组中的所述核酸或与所述核酸相关的核酸的出现、丰度或出现和丰度相比越显著，越是可能存在异常状况。

在优选的实施方式中，本发明提供了用于确定样品的异常状况，优选致病状况的方法，其中来自样品源的至少一个，优选至少两个，优选至少三个，优选至少四个，优选至少五个，优选至少六个，优选至少10个，优选至少20个，优选至少30个，优选至少50个，优选至少100个或优选至少200个或更多或许多核酸，优选至少500个，优选至少1000个，优选至少5000个，优选至少10000个，优选至少50000个，优选至少100000个在步骤c)中测序，分配到数据库的至少一个数据集，特别是包括至少相应数量的数据集的数据库，其中每个数据集与对应于来自步骤d)中样品的鉴定的特定核酸的对照组的特定核酸有关，并且在步骤e)中计算显著性分数。

在进一步优选的实施方式中，本发明方法在步骤c)中测序样品中的所有核酸，优选样品中非人源的所有核酸，然后将所述核酸的标识分配到来自数据库的数据集，数据库包括至少相应数量的数据集，每个数据集与存在于对照组中的与来自步骤d)中样品的鉴定的特定核酸相一致的核酸有关，并且在步骤e)中计算显著性分数。

因此，本发明的方法有利地能够对样品的所有核酸进行测序和分配标识。

有利的是，本发明的方法使样品中至少一个核酸的定量检测(即确定样品中其丰度)与所述至少一个核酸的丰度的概率解释结合，该丰度优选地指示样品中的至少一个微生物、病毒和/或癌细胞，与对照组(优选健康对照组)相比优选地该丰度增加。可以将样品中不同种类(优选病原体)的丰度与对照组进行比较，并且因此对于异常状况(优选致病状况)的定义的物种(优选病原体)的相关性可以被确定，因为仅存在病原体并不总是不可避免地有责任的或者由疾病引起。该方法还提供关于样品中所有微生物、病毒和/或癌细胞，优选病原体的量的信息，并且指示异常状况的反常，优选特定病原体的反常，由反常出现或反常丰度的出现表示。

根据本发明的工作流程，基于不需要特定引物设计的数据分析，有利地识别没有预先迹象的受试者的状况，并提供在单一化验中检测微生物、病毒和/或癌细胞以及受试者的异常状况的机会。

根据本发明的工作流程，基于不需要特定引物设计的数据分析，特别地识别没有预先迹象的受试者的状况，并提供在单一化验中检测病原体(优选细菌、真菌和病毒病原体)，以及受试者的健康状况的机会。因此，本发明的方法优选通过在样品中组合核酸的定性和定量分析和分配其显著性来确定异常状况，特别是相关病原体。

有利地，该方法通过基于核酸的无偏序列分析提供完整的诊断工作流程，允许快速、有效且灵敏地确定受试者中的异常状况，特别是相关病原体，优选感染性病原体。在优选的实施方式中，该方法允许确定样品中的异常状况，该异常状况的特征在于样品中若干不同病原体的出现，这允许鉴定混合感染。

本方法提供的信息如下：通过包括定量结果来确定所鉴定的微生物、病毒和/或优选病原体是否与感染或污染相关，定量结果通过将其与从对照组获得的结果进行比较而评估，并且其中确定了与感染或污染相关的生物体。对至少一个病原体的这种有效和具体的鉴定不依赖于培养微生物几天，因此更快。由于选择不适当的生长条件，没有潜在的病原体不能被检测和识别的风险。此外，本发明方法不仅考虑出现，意指定性出现(即病原体是否可检测)，而且还考虑了病原体的丰度，其允许评估这种病原体出现的丰度是否实际上表明潜在的异常状况，优选潜在的致病状况。一系列潜在病原体的覆盖也允许确定了同时发生在受试者中的几种疾病，例如，混合感染。这对于诊断没有可靠症状指征因此还不清楚在开始时要寻找哪种微生物、病毒或疾病的受试者特别重要。

根据本发明，提供了一种基于来自患者(例如感染的患者)的样品(优选血浆样品)的核酸(优选游离循环的DNA(cfDNA))的无偏序列分析，优选通过测序，更优选通过高通量测序(例如下一代测序(NGS))，用于确定异常状况的改进的方法(优选诊断方法)和装置，异常状况例如由感染性微生物引起。本文描述了与基于血液培养的分析过程相比，本教导用于早期检测和监测七名感染患者，六名未接受上腹部手术的非感染患者以及作为对照的十二名健康志愿者的菌血症的适用性。此外，显示了本教导用于检测抗生素抗性标记的能力。从样品制备到物种鉴定报告的完整工作流程可以在约30小时内完成，使得本发明的方法成为患有感染的危重症患者的强大诊断工具。该方法的结果可以在可靠性和时间方面得到改进，与测序方法的改进和可用数据集的数量相一致。令人惊讶地发现，在感染患者和未感染的手术后对照中，核酸(优选游离循环的DNA)的水平显著较高，但在健康对照中不显著。该方法允许在一个样品中发现的不同微生物物种之间的绝对比较。因此，除了数据驱动的临床标本中病原体的鉴定之外，该方法在监测受试者的细菌负荷和对靶向治疗的响应和补充标准临床微生物学方面也非常有用。

图5示意性地概述了用于确定样品的异常状况的本方法，其包括在步骤a)中提供至少一个含特定核酸的样品，在步骤b)中提供数据库，其包括关于特定核酸丰度的数据，尤其是如步骤c)中鉴定的相同核酸出现的概率，特别是所鉴定的丰度出现的概率，以及可选地用于所述核酸的其他参数，并且在步骤c)中测序在包括确定其丰度的样品中的至少一个特定核酸，并且在步骤d)中将步骤c)中确定和量化的至少一个特定核酸的标识分配给包括在在步骤b)中提供的数据库的对应相同的核酸的对应数据集，并且由此在步骤c)中的显著性分数，即表示在样品中的测序的核酸的出现和丰度的显著性使用概率计算的值，特别是使用互惠累积分布函数的对数，以便优选地提供导致SIQ分数(显著性识别量化指标)的SIQ分数计算。

在优选的实施方式中，在方法步骤d)期间或之后，本发明的方法可以包括分析样品中测序的至少一个特定核酸的特性的方法步骤和/或在步骤c)中至少一个鉴定的核酸被映射(mapped)到人类参考基因组上的方法步骤和/或所获得的关于核酸序列的数据复杂性过滤的方法步骤和/或所鉴定的至少一个特定核酸的分类学分类的进一步可选的方法步骤。

在优选实施方式中，在步骤e)中计算统计估计量，优选最大似然估计量(MLE)，用于潜在指示步骤c)中鉴定的特定病原体的每种特定核酸，其优选地估计在对照组或对照样品中检测特定病原体(优选其丰度)的概率，其中优选地计算具有病原体-特定参数的分布，最优选泊松分布，优选来自健康个体，并与在步骤c)中测序的存在于样品中的特定核酸的丰度比较。

在优选的实施方式中，步骤e)中提供的本测定方法的结果包括对样品中发现的优选所有微生物、病毒、癌细胞和/或病原体的结果的解释和可选地可视化，并且作为显著性分数，优选SIQ分数。显著性分数的计算是整合样品中特定核酸的丰度和所有微生物、病毒、癌细胞和/或病原体的特定核酸的丰度的显著性，优选在对照组中所述特定核酸出现的概率，其中关于鉴定的核酸的量的标准化数据与受试者和对照之间的每种微生物、病毒、癌细胞和/或病原体进行比较。显著性分数表示样品的异常状况，优选表示样品中的相关病原体。

定义：

在本发明的上下文中，术语“异常状况”意指健康状况和/或致病状况，优选状况具有的特征不同于被认为是标准的或正常的特征，优选其与对照组不同。在优选的实施方式中，异常状况的特征在于特定核酸的出现或者在于特定核酸的异常或反常的量，例如，特定核酸致病的量。

在本发明的上下文中，术语“致病状况”是指指示特定疾病的发展或/和出现的状况，特别是与特定疾病的发展或/和出现相关的状况。在本发明的上下文中，术语“致病状况”特别意指指示样品中特定核酸的出现、丰度或出现和丰度的状况，其出现、丰度或出现和丰度是指示特定疾病的发展或出现，即总是、经常或可能与特定疾病相关，并且在对照组中未发现或发现的频率显著较低。

在优选的实施方式中，致病状况的特征在于至少一个特定核酸的出现或在于至少一个特定核酸的致病的量。

在本发明的上下文中，术语“健康状况”特别是指指示样品中特定核酸的出现、丰度或出现和丰度的状况，其出现、丰度或出现和丰度是指示微生物状况、环境状况和/或生活方式状况，优选不引起或产生疾病的状况，优选没有致病状况。在另一个实施方式中，健康状况指示复杂疾病或致病性疾病。

在本发明的上下文中，术语“生活方式”是指习惯，态度，品味(tastes)，道德标准，经济水平等，其共同构成个人或群体的生活方式。

在本发明的上下文中，“复杂疾病”是一种疾病，优选诸如心脏病、糖尿病、癌症和肥胖症，其与多种基因的作用相关，并且有时与生活方式和环境因素相结合。

在本发明的上下文中，“疾病”是受试者的异常状况，特别是结构或功能的紊乱，影响生物体的部分或全部。该疾病可能是由源于外部来源(如传染病)的因素引起的，或者其是由内部功能障碍(如自身免疫疾病或家族遗传疾病)引起的。在优选的实施方式中，疾病是以病原体的核酸出现为特征的疾病，特别是以病原体的出现为特征。这种疾病也被称为传染病。

在本发明的上下文中，术语“病原体”优选是指感染介质，优选是引起疾病的介质，例如病毒、细菌、真菌、类病毒或寄生虫。

在本发明的优选实施方式中，疾病可以是感染性疾病，特别是由活性介质引起的疾病，优选由细菌、真菌和/或寄生虫引起的疾病，或者由病毒或类病毒引起，特别是败血症。在另外优选的实施方式中，疾病是复杂疾病，例如癌症。

在优选的实施方式中，感染性疾病可以由感染介质，特别是活性介质引起，活性介质包括但不限于细菌、真菌、寄生虫、酵母菌、原生动物(protozoa)，蠕虫(helminths)和昆虫幼虫阶段(insect larval stages)以及其他含有包括病毒和类病毒的介质的核酸。

在优选的实施方式中，疾病选自自身免疫紊乱，气道炎症，炎性疾病，哮喘，关节炎，移植排斥，感染性疾病，癌症，莱姆病，眼部感染，皮肤病，牛皮癣，硬皮病，心血管疾病，动脉粥样硬化，慢性疲劳综合征，类肉状瘤病或其他疾病。

在优选的实施方式中，异常状况的特征在于指示复杂疾病，特别是癌症的特定核酸的出现，特别是指示癌细胞，或者在于指示癌症或癌细胞的核酸的相关量的出现。

在本发明的优选实施方式中，其中所确定的异常状况指示例如由病原体引起的感染性疾病，从受试者中分离总的核酸，优选DNA，其以步骤a)中的样品形式提供，并在步骤c)中测序，其中从测序结果中去除人DNA，例如在映射到人类基因组后，在步骤d)中进一步处理未映射的(unmapped)核酸。在优选的实施方式中，步骤a)中提供的特定核酸在步骤c)之前或在步骤c)之后富集(enrich)，优选在步骤c)和d)之间富集。

如果使用富集步骤，则对照组的核酸优选通过相同的富集步骤进行处理。

在优选的实施方式中，从未映射的核酸，优选病原体，对引起感染性疾病的介质(例如微生物种类)进行分类，并且将核酸按其丰度标准化，计数并分类，然后在步骤d)中处理。对于在受试者中鉴定的每种特定核酸，在步骤d)和e)中将结果与未受感染的对照的同样处理的样品进行比较，其中在样品以及未感染的对照中鉴定的微生物种类被认为与发病机理无关。如果仅在样品中发现微生物种类具有高丰度并且在未感染的对照中没有发现任一个微生物种类具有高丰度，则指定高显著性，并且因此具有高SIQ分数，由SIQ图(图2A和E)中其数据点的半径表示。对于不常见的病原体，SIQ分数将高于对照组中通常所检测出的SIQ分数。

在优选的实施方式中，异常状况的特征在于表明抗生素抗性的核酸(特别是基因)的致病量的出现或存在。因此，本发明认为表明抗生素抗性的核酸的出现，特别是特定的丰度，是一种异常状况。

在本发明的上下文中，术语“抗生素抗性”是指细菌对杀死丧失敏感性、或抗生介质的生长抑制特性。它还涉及微生物对最初对治疗由其引起的感染有效的抗微生物药物的抗性。包括细菌、真菌、病毒和寄生虫在内的耐药微生物能够抵抗诸如抗菌药物、抗真菌药物、抗病毒药物和抗疟疾药物等抗微生物药物的攻击，因此标准治疗变得无效且感染持续存在。

在本发明的上下文中，术语“健康”意指不显示任何特定疾病的迹象的受试者，并且优选目前没有发展所述疾病的受试者，优选地受试者被认为是健康的。

在本发明的上下文中，对照组是来自健康或认为健康的一组受试者的一组样品。对照组包括来自至少一个受试者的至少一个样品，优选大量样品来自大量受试者，例如至少10个、至少20个、至少30个、至少50个、至少100个、至少1000或至少5000个样品来自相应数量的健康受试者。优选地，一个对照样品来源于一个健康受试者。对照组中对照样品的更多数量和更高多样性提高了捕获所有可能的物种的概率，这些物种对通过污染引入的变异性具有影响。通常，通过使用相关基因组和尽可能捕获健康个体的微生物组中的小品种和/或排除受污染的生物体的大对照组的最完整的数据库来增加目前提供的显著性分数(优选SIQ分数)的可靠性。

因此，术语“对照组”是指来自处于健康状况的未患有疾病的受试者的至少一个对照样品，优选对照组包括来自健康个体的一组对照样品，其与患者组在各方面相匹配，例如，他们可能具有相似的年龄和性别、相同的社会阶层或相同的民族。本发明优选涉及一种方法，其中对照组的特征在于没有致病状况。本发明优选涉及一种方法，其中对照组的特征在于指示特定状况。

术语“受试者”是指哺乳动物生物体，哺乳动物通常包括但不限于人类、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、猫、狗、马、牛、猪、绵羊和兔。在优选的实施方式中，该受试者是人。

在本发明的上下文中，术语“样品源”是指以纯化或未纯化形式的至少一个核酸的任何来源，优选样品源是生物体，优选人体有机体，优选地筛选异常状况的样品或筛选患有异常状况的样品。

在本发明的上下文中，术语“核酸”包含核酸或核酸片段，例如包括信使RNA的DNA或RNA，其中DNA或RNA可以是单链或双链或其混合物，优选核酸是一种游离循环的DNA或RNA。在一个实施例中，术语“核酸”也被理解为意指“核酸序列”。

在本发明的上下文中，术语“测序”是指确定无支链生物聚合物的一级结构，优选地确定至少一个核酸的序列，它包括用于在至少一个核酸的链中确定碱基顺序的任何方法，优选高通量测序。

在本发明的上下文中，术语“高通量测序”意指使测序过程并行的测序技术，优选意指在单次运行中同时测序大量序列，优选下一代测序(NGS)、Ilummina、IONTorrent或NanoPore测序。步骤c)中的测序优选通过分子高通量测序(优选下一代测序)来进行。

在本发明的上下文中，术语“数据库”涉及有组织的数据集合，其包括至少一个数据集，优选地作为电子归档系统，优选地从医疗记录、科学实验、公开文献、临床研究、高通量实验技术和计算分析收集。根据步骤b)的数据库优选地从临床研究中检索，优选地从定义的对照组收集。在优选实施方式中，数据库针对定义的适应症生成，优选地来自公布的数据，优选地来自特征为特定状况的选定对照组。在另一优选的实施方式中，数据集表明在对照组中特定核酸或其片段的至少一个的特定丰度出现的概率。

在优选实施方式中，数据库因此包括至少一个，特别是多于10个，特别是多于20个，特别是多于50个，或者特别是多于100个，特别是多于200个，或者特别是多于1000个数据集，由此将每个单个数据集分配给具有特定标识的特定核酸，例如表征特定物种、品种或突变体。

在优选的实施方式中，数据库包括至少5个，至少10个，至少20个，至少30个，至少40个，至少50个，至少60个，至少70个，至少80个，至少90个，至少100个，至少200个，至少300个，至少500个，至少1000个，至少10000个，至少100000个或甚至更多的特定核酸的数据集，优选用于来自确定来源的特定核酸的数据集。

在本发明的上下文中，术语“数据集”是指与特定核酸有关的数据，并且其中这些数据通知出现，即存在、丰度，即频率、数量或量，或通知对照组中特定核酸的出现和丰度。在优选的实施方式中，关于出现、丰度、出现和丰度的这些数据是关于在对照组中所述特定核酸的至少一个、优选更多、优选许多丰度出现的概率的数据。优选地，数据集包括指示对照组中特定核酸的全部可能的丰度出现的概率的数据。在优选实施方式中，至少一个数据集相对于指示特定的对照组被标准化。

在本发明的上下文中，术语“丰度”是指存在于样品中的(优选在样品中鉴定的)特定核酸的数量，特别是量或频率。

在本发明的上下文中，术语“出现概率”是指在对照组中发现特定核酸的特定丰度的概率。

在本发明的上下文中，术语“显著性分数”意指定量指示样品的异常状况的可能性的值，优选地通过组合样品中特定核酸的确定丰度和对照组中相同特定核酸的至少一个确定的特定丰度出现的概率。在优选的实施方式中，显著性分数(SIQ分数)即显著性识别量化指标，对可能致病的、负责异常状况或由于异常状况而产生的核酸进行排序和选择。优选地，SIQ分数指示特定疾病，并且更优选地，SIQ分数指示一个或几个疾病的特定异常状况(特别是病原体)的相关性。SIQ分数优选地区分可能与由污染物或共生物种引起的噪音相关的至少一个特定核酸，并且定量评估该至少一个特定核酸。在优选实施方式中，显著性分数(SIQ分数)是败血症指示分数。

在本发明的上下文中，术语“测定序列(read)”是指通过测序确定了核苷酸序列以及优选地分配给生物体，优选地映射到相应生物体的基因组的特定核酸。在优选的实施方式中，测定序列被分类为特定生物体，优选地分类为特定微生物，优选地通过其丰度标准化和寻找。

本发明在另一个实施方式中涉及用于诊断受试者中的异常状况或疾病的方法，其中进行了根据本发明的用于确定所述受试者中样品的异常状况的方法。

在优选的实施方式中，本发明提供了用于监测受试者的感染状况的方法，优选用于在治疗期间和对治疗的反应期间监测受试者，其中进行了根据本发明的用于确定所述受试者中样品的异常状况的方法。

这样的方法优选涉及鉴定患有疾病的受试者，优选涉及筛查疾病，优选涉及预防医学分析。在优选的实施方式中，这样的方法鉴定在受试者中病原体的出现和疾病的发展的相关性。

本发明优选涉及一种方法，其中样品从样品源获得，样品源选自由全血，血清(serum)，血浆(blood plasma)，溶液(liquor)，尿，组织，唾液(sputum)，粪便和灌洗液所组成的组，优选血浆的无细胞部分。可以使用本领域已知的任何标准方法收集样品。

根据本发明，样品是从人体或动物体获得的。根据本发明，所述样品根据本发明方法进行分析，并且在所述方法期间或之后不返回至人体或动物体。根据本发明，用于确定异常状况的本方法或用于诊断异常状况的本方法因此仅使用从个体获得的样品并且不需要人体或动物体的存在。

在优选的实施方式中，样品是血浆。在优选的实施方式中，样品可以直接从样品源获得。目前使用的血浆优选无细胞，优选主要无细胞。样品，(优选血浆)可含有游离循环核酸，其包含人核酸和非人核酸。

在优选的实施方式中，样品可以被稀释或浓缩。在另一优选的实施方式中，在测序之前处理样品，优选在测序之前纯化样品。样品可以包含多于一个期望的特定核酸序列，其可能相同或不同。

在本发明的一个实施方式中，除了至少一个特定核酸之外，样品还可以含有其他物质，例如，其他核酸，尤其是不指示异常状况的核酸。

本发明优选涉及一种方法，其中致病状况的特征在于至少一个病毒、细菌、真菌或寄生生物的核酸反常的，特别是致病的量。

本发明优选涉及一种方法，其中异常状况的特征在于植入物的排斥细胞的异常数量。

本发明优选涉及一种方法，其中异常状况的特征在于存在至少一个指示抗生素抗性的基因，优选至少一个抗生素抗性基因。在优选实施方式中，这种异常状况与受试者的其他异常状况同时确定。

在优选的实施方式中，步骤c)中鉴定的至少一个特定核酸序列的质量在进一步的处理步骤中，优选地在步骤c)中，优选地在步骤c)之后，更优选地在步骤c)和d)之间进行分类。

因此，在本发明的优选实施方式中，本发明方法进一步采用分类步骤，特别是允许将指示疾病的特定核酸与本方法中不感兴趣的核酸分开的分类步骤。

在优选的实施方式中，在可选的分类步骤中，至少一个特定核酸通过其来源分类，优选地分类为生物体，优选地分类学分类的，优选地分类为人类或非人类，优选地分类为异常或非异常，优选地分类为指示病原体或非病原体。

本发明优选在可选的分类步骤中，优选地在步骤c)或d)中，或在步骤c)和d)之间进行，在源自非相关的核酸(例如，人类来源)和源自所有其他生物体的核酸(优选为细菌、病毒、真菌和寄生虫)之间区分。通过计算偏差的显著性，该方法可以在源自异常状况相关来源的核酸(例如，来自参与感染的微生物的核酸)和正常人类菌群的核酸之间区分。

本发明优选地在可选的分类步骤中，优选地在步骤c)或d)中，或在步骤c)和d)之间进行，在源自非相关的核酸(例如，非致病生物体，例如，来自正常皮肤菌群)和源自相关的核酸(例如，致病生物体)之间区分，优选该方法在源自感染的核酸和来自人类菌群的微生物的核酸之间区分。

本发明优选在可选的分类步骤中，优选在步骤c)之前，在步骤c)或d)中，或在步骤c)和d)之间进行，在源自非相关起源的核酸(例如人类核酸)和相关核酸(例如源自微生物、病毒或癌细胞的核酸)之间区分。

在优选的实施例中，通过将其序列与核酸序列，优选地与已知的核酸序列比对(align)来分类至少一个核酸，该核酸序列提供在另外的，即第二数据库中。核酸序列的分类可以通过本领域已知的任何方法完成。在优选的实施例中，通过将其序列映射到参考基因组，优选地映射到人类基因组来分类特定核酸。

在本发明的一个实施方式中，样品除了至少一个特定核酸之外还可以含有其他核酸，特别是那些不指示异常状况的核酸。在本发明的优选实施方式中，不指示异常状况(优选致病状况)的核酸被去除，即从样品移除，优选在步骤a)之后和步骤c)之前或在步骤c)期间。

在本发明进一步优选的实施例中，从样品中去除不指示异常状况的核酸序列，特别是经过分类步骤，表明该核酸不指示异常状况。

在优选的实施例中，步骤c)中获得的核酸序列在步骤d)中处理，优选地在生物信息学工作流程中处理，其预先选择不相关的核酸，优选地分类剩余的核酸并指示哪些核酸与异常状况潜在相关。最后，在步骤e)中以显著性分数(SIQ分数)的形式获得结果，优选地通过指示专有分数来表明所鉴定的核酸对异常状况的相关性。在优选的实施例中，显著性分数，优选地SIQ分数，并且优选地对应的SIQ图，是如图2A和2E中示意性表示的那样获得。

用于富集或去除的合适的生物技术步骤是本领域技术人员已知的。

在优选的实施例中，存在于样品中的核酸被去除或富集，优选地核酸在样品和对照组中优选地在步骤c)之后，优选在步骤e)之前，优选地通过使用生物信息学方法被去除或富集。在优选的实施例中，存在于样品中的核酸在步骤c)之前，优选通过使用生物技术处理步骤被去除或富集。在优选的实施例中，存在于样品中的核酸(其是特定的核酸并且指示特定的异常状况)，如果需要，则被富集。

在优选的实施例中，至少一个特定核酸，优选地分类的特定核酸，优选地人类或非致病性核酸被去除或富集，优选地从步骤c)的样品中鉴定的特定核酸中分离出来，优选地人类或非致病性特定核酸被分离出来，其中至少一个特定核酸在样品和对照组中被去除或富集。在优选的实施例中，不同特定核酸的量被去除或富集，优选地去除步骤c)中获得的特定核酸的丰度，优选地降低所鉴定的特定核酸的复杂性。

在本发明的优选实施例中，优选地通过使用生物技术处理步骤或使用生物信息学方法来富集或去除核酸。在优选的实施例中，核酸通过移除非相关物种或人类来源的核酸而被去除。在优选的实施例中，基于步骤b)中提供的至少一个数据集，通过过滤至少一个特定核酸来去除或富集至少一个特定核酸。

本发明优选涉及在步骤c)之前富集核酸的方法。

本发明优选涉及一种方法，其中可能指示异常状况的核酸在步骤c)之前被富集。

本发明优选涉及一种方法，其中可能不指示异常状况的核酸在步骤c)之前被去除。

在优选的实施例中，存在于样品中的核酸没有用生物技术处理步骤被去除或富集。有利地，用于去除或富集的这样的生物技术处理步骤在根据本发明的方法中不是强制性的。

如果使用富集或去除步骤，则对照组的核酸优选通过相同的富集或去除步骤处理。

本发明还涉及用于实施根据本发明教导的方法的装置，其中由装置的中央处理单元基于根据步骤c)确定的至少一个特定核酸的丰度以及在步骤b)中提供的对照样品中的相同特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率来计算表明样品的异常状况的显著性分数。

在优选实施例中，在测序装置的处理单元中计算样品中至少一个核酸的显著性分数。

因此，本发明基于对核酸(特别是游离循环DNA)的无偏序列分析，提供了用于确定样品中的传染性生物体的完整诊断工作流程。该方法有利地提供了不用预测可疑物种的数据驱动的诊断，不需要特定的引物(primer)设计，并且提供了在单次测定中检测细菌、真菌和病毒病原体的机会。

本发明的方法优选不限于确定特定病原体。在一个实施例中，本发明方法确定潜在病原体的总和，例如，病毒、细菌、真菌或寄生虫。

因此，本发明提供了用于在短时间内识别受试者中的疾病及其相应的医疗原因的有用方法。

因此，可以在短时间内选择针对所识别的异常状况的适当治疗。

因此，这种方法对于临床标本中病原体的数据驱动的鉴定和对于监测受试者的细菌负荷和对靶向治疗的响应和补充标准临床微生物学非常有用。

本发明的优选实施例是从属权利要求的主题。

序列表显示如下：

Seq ID 1：阴沟肠杆菌的核酸序列mecA

Seq ID 2：来自人血浆样品1的核酸序列SX2_r1

Seq ID 3：来自人血浆样品2的核酸序列SX2_r2

Seq ID 4：来自人血浆样品3的核酸序列SX2_r3

通过以下附图和实施例来说明本发明。

附图显示：

图1：显示不同患者组和时间点的cfDNA浓度的分布。

(A)比较健康志愿者(V)，败血症发作时的败血症患者(S T0)和上腹部手术后未感染患者(P)的cfDNA浓度。(B)在试验观察期间收集的败血症患者血浆样品的cfDNA浓度的改变。样品在败血症发作时(T0)，24小时后(T1)，4天后(T2)，7天后(T3)，14天后(T4)和28天后(T5)获得。请注意，对于患者S60T5指第21天，以及T6指败血症发作后第28天。(C)进行上腹部手术但没有感染迹象的患者中cfDNA浓度的比较。手术前(T0)，手术结束后立即(T1)和24小时后(T2)采集术后组的血样。

图2：显示了SIQ分数和SIQ图的基本原理。

(A)用于获得SIQ分数和SIQ图的概要。总cfDNA从患者血浆中分离并测序。映射人类cfDNA后从测序结果移除人类cfDNA，并且只有未映射的测定序列(reads)进一步被处理。从这些未映射的测定序列中，微生物物种被分类，并且测定序列按其丰度被标准化、计数并排序。对于从患者获得的每种物种，将结果与未受感染对照的同样处理的样品进行比较。在这个实施例中，微生物物种X在患者样品和大多数对照样品中被发现，因此其代表了污染物或常见人类微生物组的成员。

然而，仅在患者样品中发现高丰度的物种Y，并且对照组中都没有发现，因此得到高显著性以及因此地高SIQ分数，由SIQ图中其数据点的半径表示。

(B)在败血症发作(T0)时在患者S9的血浆样品中发现的每种物种的标准化计数的分布。只有最丰富的物种阴沟肠杆菌被标记。

(C)分析所有样品中阴沟肠杆菌的标准化计数的分布。黑色：败血症患者，灰色：对照(选择性手术和健康志愿者)。只有具有最丰富的阴沟肠杆菌测定序列的样品S9被标记。

(D)所有样品中痤疮丙酸杆菌的标准化计数的分布。黑色：败血症患者，灰色：对照(选择性术和健康志愿者)。

(E)败血症发病时(T0)患者S9中指示所有物种的丰度和显著性的SIQ图。数据点(物种)的坐标是x轴上的相对丰度(log2)，y轴上表示为1-p值的显著性。虚线表示0.05的p值。标记log2>0和p值<0.05的数据点。将相应样品中物种的SIQ分数整合作为数据点的半径。

图3：显示包括两名患者的NGS数据和常规临床微生物学数据的临床时间进程(clinical time courses)。

(A)时间进程患者S10。一名68岁男性患者因胃部肿瘤需要进行胃切除术。手术后，患者因重症肺部感染而出现感染性休克，没有任何吻合术不足的证据。已显示金黄色葡萄球菌是不同分泌物中的优势生物体(例如气管分泌物，腹部伤口拭子，血液培养物等)。基于它的甲氧西林敏感性，患者接着用氟氯西林治疗两周。另外，显示肺炎伴随(分别增加)气管分泌物中单纯疱疹病毒1型(HSV1)的再活化，因此患者接受阿昔洛韦11天。在延长的撤机阶段(weaning phase)后，患者在感染性休克发作六周后能够回到普通病房。在该图中，抗生素治疗方案，用于通过NGS/SEPseq鉴定物种的SIQ分数和相应血浆样品的cfDNA浓度在患者S10的试验期的时间线上作图。相关(临床微生物学)实验室结果由箭头标记至临床标本获得的当天。使用以下缩写：血液培养(BC)，中心静脉导管(CVC)，气管分泌物(TS)，单纯疱疹病毒(HSV)，环丙沙星(ciproflocaxine)(CIP)，甲硝唑(MTZ)，美罗培南(MEM)，万古霉素(VAN)，卡泊芬净(CFG)，氟氯西林(FLX)，氟康唑(FLC)，阿昔洛韦(ACV)，阿尼芬净(AFG)，替加环素(TGC)。抗感染药分别以浅灰色，黑色和深灰色显示抗菌抗生素，抗真菌药和抗病毒药。常规临床微生物学发现的细菌的相对数量用大量(p)，中等(m)或稀少(s)表示。有关抗感染药缩写的详细清单，请参见图18。

(B)时间进程患者S60。在一个复杂的穿孔乙状憩室炎进程后，一位70岁的女性患者提出重建肠道连续性。在术后阶段，患者由于肠泄漏需要外科修补术而出现感染性休克。腹部伤口拭子显示对大肠杆菌和屎肠球菌呈阳性。因此，利用亚胺培南和利奈唑胺的经验性抗生素治疗被证明是适当的。一天后，由于结肠穿孔患者再次受到感染，需要外科结肠切除术和由Hartmann建造一个残端。大肠杆菌和屎肠球菌再次被确定为腹部伤口拭子中的主要生物。此外，摩根氏菌(Morganella sp.)以及假丝酵母菌可以被识别。因此，在接下来的十四天内开始用卡泊芬净进行治疗。相反，由于患者的重复恢复(reconvalescence)，7天后亚胺培南和利奈唑胺的给药停止。然而，三天后，由于Hartmann残端的不足，患者再次遭受了感染。因此，进行了一次进一步的探查性剖腹手术并开始了强化腹腔灌洗。对于普通变形杆菌、摩根氏菌、大肠杆菌、肠球菌以及脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)，腹部伤口拭子显示为阳性。因此，亚胺培南和利奈唑胺给药另外的12次，分别10天。同时，患者在气管分泌物中发现单纯疱疹病毒1型(HSV1)的再激活，因此患者接受阿昔洛韦14天。在感染性疾病的进一步过程中，患者由于由大肠杆菌、寡养单胞菌以及克雷伯氏肺炎菌引发的呼吸机相关肺炎而发展出第四次感染。因此，抗生素治疗逐步转向哌拉西林/他唑巴坦、复方新诺明以及环丙沙星。然而，延长的撤机阶段之后，患者在ICU治疗3个月后能够转入中间护理病房。最终，患者能够在2周后出院。在该图中，抗生素治疗方案，对于通过相应血浆样品的NGS和cfDNA浓度鉴定的物种的SIQ分数在患者S60的试验期的时间线上作图。相关(临床微生物学)实验室结果由箭头标记至临床标本获得的当天。使用以下缩写：血液培养(BC)，中心静脉导管(CVC)，气管分泌物(TS)，支气管肺泡灌洗(BAL)，单纯疱疹病毒1型(HSV1)，亚胺培南(IPM)，利奈唑胺(LZD)，卡泊芬净(CFG)，阿昔洛韦(ACV)，哌拉西林-他唑巴坦(TZP)，复方新诺明(CTX)，头孢他啶(CAZ)。抗菌抗生素用浅灰色着色。常规临床微生物学发现的细菌的相对的量用大量(p)，中等(m)或稀少(s)表示。有关抗感染药缩写的详细清单，请参见图18。

图4：显示了患者S9中阴沟肠杆菌的基因组覆盖率和抗性图谱(resistanceprofile)

(A)约1个阴沟肠杆菌基因组的平均基因组覆盖率(5.2MB)。(B)来自分类为阴沟肠杆菌的所有测定序列命中CARD数据库的表。列出CARD/Genbank登录号，别名基因名称，从测定序列与基因长度的比例计算基因覆盖率，映射到该基因的测定序列的数目以及该序列分配给的相应生物体。(C)3个测定序列的序列比对被映射到从市售血浆样品SX2鉴定的mecA。

图5：示出了包括过程步骤a)至e)的本发明过程的示意图。

图6：从败血症患者、未感染的(术后)手术对照和健康志愿者分离的cfDNA的生物分析仪图谱。(A)在具有高灵敏度DNA芯片的Agilent生物分析仪上运行的cfDNA图谱的凝胶样可视化。(B)相应的电泳图，其中两个最外面的峰是内部尺寸标准。

图7：基于NGS的病原体鉴定和血液培养的工作流程和时间分配。

单个步骤的流程图和条形图以及导致菌血症的物种的基于NGS的鉴定和传统血液培养所需的时间。由于达到阳性的时间差异很大，给出24至120小时的时间范围用于血液培养。

图8：对于败血症环境中主要病原体在败血症患者和对照中物种特异性标准化测定序列计数的分布。(黑色：败血症患者，灰色：对照(选择性手术(时间点T0)和健康志愿者)。

图9：对于潜在的污染物种类在败血症患者和对照中物种特异性标准化测定序列计数的分布。(黑色：败血症患者，灰色：对照(选择性手术(时间点T0)和健康志愿者)。

图10：时间进程患者S9

一名82岁男性患者出现胆管肿瘤，需要扩大的右侧半肝切除术(hemihepatectomy)。手术后，患者因奥格尔维氏综合征(ogilvie syndrome)而出现败血性休克，因此必须进行右侧半结肠切除术(hemicolectomie)。感染性休克与阴沟肠杆菌的重复阳性血液培养并行。更多的是，阴沟肠杆菌被证明是败血症发作后一周呼吸机相关性肺炎的原因。在抗生素治疗后，可以观察到两种不同的阴沟肠杆菌的生物型，这两种生物型均符合多重耐药的标准。患者在感染性休克发作9周后死亡。在该图中，抗生素治疗方案，通过相应血浆样品的NGS和cfDNA浓度鉴定的物种的SIQ分数在患者S9的试验期的时间线上作图。相关的临床微生物学实验室结果在临床标本获得当天用箭头标出。使用以下缩写：血液培养(BC)，中心静脉导管(CVC)，气管分泌物(TS)，非溶解(non-lysing)(NL)，环丙沙星(CIP)，甲硝唑(MTZ)，亚胺培南(IPM)，利奈唑胺(LZD)，氟康唑(FLC)，万古霉素(VAN)，抗感染药分别用浅灰色、黑色和深灰色显示抗菌抗生素、抗真菌药和抗病毒药。常规临床微生物学发现的细菌的相对量用大量(p)、中等(m)或稀少(s)表示。有关抗感染药缩写的详细清单，请参见图18。

图11：时间进程患者S11

一名62岁男性患者出现多房性肝细胞癌(multilocular hepatocellularcarcinoma)，需要进行左侧半肝切除术。手术过程后，患者由于作为血液培养和气管分泌物中的主要生物体的克雷伯氏肺炎菌引起的严重肺部感染而患有感染性休克。根据敏感性结果，用亚胺培南进行经验性抗生素治疗，然后转用莫西沙星。在该疾病的进一步病程中，克雷伯氏肺炎菌显示出多药耐药性。尽管抗生素治疗根据敏感性试验的结果进行了调整，但是肺脓毒症病灶仍未能充分消除。最后，患者在入选研究两个月后由于感染克雷伯氏肺炎菌的肺炎引起的持续感染性休克而死亡。此外，通过基于PCR的诊断程序评估，败血症显示与不同分泌物中的单纯疱疹病毒1型(HSV1)以及巨细胞病毒(CMV)的再活化伴随。这些发现与血浆的NGS非常一致。在该图中，抗生素治疗方案，通过相应血浆样品的NGS和cfDNA浓度鉴定的物种的SIQ分数在患者S11的试验期的时间线上作图。相关(临床微生物学)实验室结果由箭头标记至临床标本获得的当天。使用以下缩写：血液培养(BC)，中心静脉导管(CVC)，气管分泌物(TS)，革兰氏阴性葡萄球菌(GNST)，单纯疱疹病毒1型(HSV1)，亚胺培南(IPM)，万古霉素(VAN)，莫西沙星(MXF)，环丙沙星(CIP)，替加环素(TGC)，头孢他啶(CAZ)。抗菌抗生素显示为浅灰色。常规临床微生物学发现的细菌的相对量用大量(p)、中等(m)或稀少(s)表示。有关抗感染药缩写的详细清单，请参见图18。

图12：时间进程患者S23

一名77岁男性患者由于急腹症而出现感染性休克。具有西格玛(sigma)穿孔和严重腹膜炎的缺血性结肠炎被确定为败血症病灶，因此患者接受了外科结肠切除术。在纳入研究队列之前两天，腹部伤口拭子以及相应的血液培养物显示对屎肠球菌呈阳性。因此，经亚胺培南和利奈唑胺的经验性抗生素治疗被证明是适当的。此外，该患者还发现气管分泌物中单纯疱疹病毒1型(HSV1)的再激活。这些基于PCR的发现也可以由血浆的NGS证实。抗生素治疗方案，通过各自血浆样品的NGS和cfDNA浓度鉴定的物种的SIQ分数在患者S23的试验期间的时间线上作图。相关的(临床微生物学)实验室结果用箭头标记至临床标本获得的当天。使用以下缩写：血液培养(BC)，气管分泌物(TS)，凝固酶阴性葡萄球菌(CoNST)，亚胺培南(IMP)，利奈唑胺(LZD)，他唑巴坦(TZP)，克林霉素(CLI)，氟康唑(FLC)。抗感染药物分别以浅灰色和黑色着色为抗菌抗生素和抗真菌剂。常规临床微生物学发现的细菌的相对量用大量(p)、中等(m)或稀少(s)表示。有关抗感染药缩写的详细清单，请参见图18。

图13：手术后患者P1-T1和P2T1的SIQ图

图14：队列统计。在目前的队列中，不同亚组之间明显的倾向是可辨别的。对照组V得到最低的cfDNA浓度，然后是手术组P T0。术后组P(T1，T2)和败血症组S中检测到更高的浓度，特别是在败血症发作时。在P组中，患者P2(其有趣地在所有时间点也具有升高的PCT，CRP和IL-6水平(数据未显示))平均值强烈增加。没有患者P2的P组的平均值更接近健康志愿者组(P T0没有P2平均值68.8ng/ml)，表明剩余的差异可能与年龄有关。对于七名患者中的六名患者，在败血症发作当天或24小时后测量最高的cfDNA浓度。七名败血症患者中的五名(S9、S10、S19、S23、S60)在败血症发作后2天内接受上腹部手术，这可能导致cfDNA浓度升高。通过比较S T0和P T0之间的分类的测定序列，可以证明，对于败血症患者，cfDNA更高的份额可以归属于微生物来源，表明从细菌直接释放DNA或从吞噬细胞的细胞共同释放。

图15：包含在kraken数据库中的真菌参考基因组列表，用于鉴定非人类测定序列中的微生物测定序列

图16：患者特征，包括完整数据集的标准化病菌测定序列计数和SIQ分数的测序统计数据

图17：从水质控制中确定的污染物种名单

图18：抗感染药的缩写

图19：合并的人感染性血浆中的生物体列表

实施例

实施例1

人类数据结果来自参与RAMMSES试验(德国临床试验注册：DRKS00000505)的患者亚组的二级分析。这项观察性临床研究于2009年6月8日首次得到当地伦理委员会(试验-编码-Nr.:S123-2009)的批准。对于所提交的NGS程序，修订已提交给当地伦理委员会，最终于2014年11月28日获得批准。

观察性临床研究在德国海德堡大学医院的外科重症监护室进行。研究和对照患者或其法定代表人签署书面知情同意书。从2009年8月到2010年7月，共有三组120位患者入选本研究。这三组包括：(1.)根据国际脓毒症定义会议[2]标准，60例感染性休克患者，由于根据国际脓毒症论坛共识会议关于重症监护病房(ICU)感染定义[3]的标准记录或怀疑感染，(2.)30名术后对照在上腹部大手术后没有任何感染迹象，和(3.)30名健康志愿者。在败血症发作(T0)、和24小时(T1)、4天(T2)、7天(T3)、14天(T4)和28天(T5)后收集患有感染性休克的患者的血浆样品。手术前(T0)、手术结束后立即(T1)和24小时后(T2)收集术后组血浆标本。志愿者组的血浆样品收集一次(T0)。

对于这种二次分析，对患者的电子病历进行回顾性筛查，以了解败血症期间来自血液培养检测的结果。在海德堡大学医院，血液培养检测按照前述常规进行[4]：应用无菌技术通过直接静脉穿刺获得全血样品，例如肘前静脉，将10mL血液分别接种到好氧和厌氧液体培养基中(BACTEC PLUS，BD Biosciences，德国海德堡)。将培养物培育5天(BACTEC，BDBiosciences，德国海德堡)，根据批准的内部医院标准技术分析阳性培养物，包括通过VITEK2(Biomerieux，德国纽廷根)或MALDI TOF(Bruker，美国威斯康辛州麦迪逊市)和自动化的抗菌药敏试验(VITEK 2)鉴定。

如先前所述的通过定量实时PCR对来自血浆或气管分泌物的HSV1DNA和CMV DNA进行定量[5]。如先前公开的那样培养伤口拭子和粪便样品[6,7]。

通过在292×g(1,200rpm)和4℃下离心10分钟从血液样品制备血浆，快速冷冻并储存在-80℃直至进一步处理。根据制造商的方案，用循环核酸试剂盒(Qiagen)以1,000×g，5分钟的离心步骤后，从解冻的血浆中分离核酸，但有以下例外：从130μl至790μl的离心后采用无菌磷酸盐缓冲盐水将血浆体积调节至1ml。从离心柱的核酸的最终洗脱用30μl分子生物学级水(5Prime，德国)进行。用Qubit dsDNA HS检测试剂盒(Life Technologies)定量cfDNA，并用生物分析仪(Agilent)上的高灵敏度DNA试剂盒评估特性。根据制造商的方案，NGS信息库从具有Nextera XT信息库制备试剂盒(Illumina)的1ng cfDNA制备，除了在34μl再悬缓冲液(Illumina)中进行珠清理后的最终洗脱之外。在具有每个样品2500-3000万个100bp单端测定序列的深度的HiSeq2500(Illumina)上进行信息库的测序。由于样品V6、V22和P6最初的测序具有相当多的测定序列，因此这些样品在计算机上随机减少至3000万个代表性子样品测定序列。

将测定序列从潜在的适配污染物中清除，质量控制并且如有必要使用BBDuk[https://sourceforge.net/project/bbmap/]进行修整。为了通过质量过滤器，测定序列质量需要超过20的Phred分数并且在低质量和适配基础(adapter bases)修整之后达到50bp的最小长度。随后，NextGenMap[8]将质量控制测定序列与人参考基因组[hg19]进行比对，这需要在测定序列与参考基因组之间80％的最小同一性。映射到人类参考基因组的测定序列被排除在进一步分析之外。由于映射算法不能可靠地将含有低复杂性区域的测定序列(包括二核苷酸或三核苷酸重复序列)映射到人类基因组[9]，因此删除了相应的测定序列。排除低复杂性测定序列减少了下游分析过程中的假阳性分类。最后，对于通过复杂性过滤的测定序列，Kraken[10]使用RefSeq释放(版本68)分配其系统位置，RefSeq释放(版本68)包括由作为参考数据库的12个选定的真菌基因组(图15)补充的35,749个细菌和4,340个病毒基因组。这导致来自样品的分类测定序列分布到分类树的节点。换句话说，测定序列识别细菌/真菌/病毒分支(clades)。然而，由于将几种黄单胞菌属物种描述为所有样品的污染物，所有这些物种以及Illumina测序激增PhiX[11]都被排除在外。

为了定量比较不同样品之间映射到不同微生物分类学分类的测定序列的数量，测定序列计数通过样品信息库大小而被标准化。然后通过n×(s+1)维计数矩阵D进一步分析每种识别物种的剩余测定序列，其中n是对照样品的数量，s是所有样品中检测到的所有物种的数量。因此，D_ij定义了物种j的对照样品i中发现的测定序列的数量。D_i，(s+1)定义了不能分配给任何物种的测定序列的数量。

由于一个物种的测定序列通常较少，安全的是假设物种j(j＝1，...，s)的测定序列计数是带参数的泊松分布

(1)为了测试每个物种的这种假设，执行标准x²拟合优度检验。

对于从患者血浆测序的测定序列，应用相同的数据处理流水线，其产生测定序列计数矢量C＝(C₁，...，C_s，C_s+1)。基于具有物种特异性参数λ_j的泊松分布，观察患者样品中至少C_j测定序列计数的p值被计算为

(2)p值直接取决于零分布(null distribution)的大小(即对照样品的数量)。如果p值小，那么就会拒绝假设患者样品中物种j的测定序列计数遵循源自健康个体的泊松分布，并且可以得出结论，即各个物种在患者中经常出现。

为了允许对患者样品中发现的所有物种的结果的不同的解释和可视化，物种j的SIQ分数(败血症指示量化指标)引入为

(3) SIQ_j＝C_j*-(log₁₀(P(X≥C_j|λ_j)))

为了鉴定可能的抗性基因，使用具有以下参数的NextGenMap将在患者S9中归类为最可能感染物(阴沟肠杆菌)的测定序列映射到下载的CARD抗性基因数据库[12]：灵敏度(-s)，最小同一性(-i)和映射残基(-R)的最小数量为0.9。

结果

败血症患者cfDNA升高的水平显示微生物DNA片段

为了检测cfDNA在败血症患者中鉴定感染微生物的诊断潜力，本研究共分析了62个血浆样品。败血症组(S，n＝7)包括从败血症发作开始的一个(T0)至六个(T6)血浆试样(32个样品)。健康的志愿者和接受上腹部大手术的患者作为未感染的对照。健康志愿者(V；n＝12)提供了一个血浆样品(T0)，术后对照组的患者(P；n＝6)贡献了三个血浆试样(T0-T2)。S、V和P组的平均年龄分别为70.5岁，26.4岁和64.2岁(图14)。

图14：患者特征，cfDNA浓度和测序统计数据。

患者被分组为败血症患者(S)、健康志愿者(V)和上腹部手术后未感染患者(P)。在总测定序列(测序深度)中，映射到人类参考基因组hg19的所有测定序列被分类为人类测定序列，其余测定序列被表示为未映射。分类到使用Kraken的任何物种的未映射测定序列的比例在这里被指定为分类。

通过全面的临床微生物学检查来监测败血症患者，包括定期血液培养，其他分泌物或导管尖端、拭子的培养，以及如果指示的真菌和病毒检测。在28天的试验期中，七名患者中有五名幸存。最初招募患者和对照用于评估作为感染性休克的生物标志物的甲基乙二醛[1]，并且该试验随后被修改用于基于NGS的诊断。从患者和对照血浆中分离cfDNA显示出特征性的、主要是细胞凋亡相关的大小模式[13,14]，预期为核小体DNA(图6)。在cfDNA分离后，计算洗脱DNA的浓度作为输入血浆体积的函数并标准化至1ml。感染性休克患者中cfDNA浓度显著增加(平均S 197.23ng/ml)，尤其是败血症发作时(平均S T0 377.30ng/ml)(图1)。

与手术前未感染对照组和健康志愿者(P T0平均149.33ng/ml；V平均55.43ng/ml)相比，测得术后患者血浆中浓度升高(P T1-T2平均451.63ng/ml)。从分离的cfDNA，制备测序信息库并通过Illumina高通量测序进行分析，其长度为100bp，平均覆盖约2600万个测定序列。使用本发明的工作流程来定量识别患者血浆中的非人核酸(图7)，从血浆开始的总周转时间大约为30小时，其中最耗时的步骤是测序，其在HiSeq2500上以快速运行模式在16小时内完成。这与24-120小时的直到阳性的标准血液培养具有高度竞争性。在自动化系统中，血液培养常规地需要培养五天[17]。

图14总结了人类测定序列、未映射测定序列和未映射测定序列的分类比例的测序统计数据。尽管所有比较组的cfDNA浓度存在差异，但人类测定序列的平均比例相似(在组ST0、V和P T0中分别为96.36％、96.52％和96.21％)，相应地测定序列的未映射比例也是如此。败血症发作时败血症患者的平均分类测定序列更高(在组S T0、V和P T0中为9.82％、3.50％和2.64％)。在每组的所有纵向样品中，这种作用降低(分别在组S、V和P中，人类测定序列：97.79％、96.52％和97.22％；分类测定序列：4.24％、3.50％和2.31％)。在术后对照(T1和T2)中，升高的cfDNA量(451.63ng/ml)与人类测定序列的最高比例(97.72％)和非人类分类测定序列的最低比例(2.14％)相关。然而，应该注意的是，分类测定序列的比例包括污染物PhiX测定序列和归类于野油菜黄单胞菌的测定序列，其在下游分析中作为污染物被丢弃。

标准化到信息库大小后，基于败血症患者的微生物cfDNA部分与未感染对照相比，分类测定序列用于诊断致病病原体。

作为病原体召唤(pathogen calling)的定量分数的显著性指示量化指标(SIQ)的建立

与未感染对照相比，定量评估患者微生物测定序列的原理如图2A所示。该原理以来自一位患者的数据进一步举例说明(图2B-2E)。从每个血浆样品计算分类的非人类测定序列物的标准化测定序列的计数，这导致了几种物种的分类。对于败血症发作时阴沟肠杆菌血液培养阳性的患者S9，与一组具有非常低丰度标准化测定序列的物种(图2B)相比，发现了明显更高的丰富的阴沟肠杆菌测定序列。为了评估所有物种分类的测定序列丰度的显著性，对所有败血症患者和对照之间的每种物种的标准化测定序列进行比较。除了患者S9的时间点T0(1,907.33，图2C)以外，患者和对照的阴沟肠杆菌标准化测定序列的丰度均匀分布接近零。相反，普通皮肤共生例如痤疮丙酸杆菌的标准化测定序列计数随机分布在所有样品上，特别是从未感染对照组获得的样品中检测到更高的丰度(图2D)。对于许多可能普遍存在的污染物种，观察到了这种效果(图17)。因此，对微生物来源的核酸片段进行计数的纯定量方法是误导性的，并且是当前分子诊断方法中的主要缺陷。为了有助于临床决策，因此在一致性可视化中在样品中发现的每个物种的观察的测定序列计数的丰度和不可能性相结合。标准化测定序列的log2比率绘制在x轴上，而1-p值绘制在y轴上(图2E)。与对照相比，p值<0.05的样品中显著表现的物种被认为是显著的(图2E)。为了进一步区分这些物种，单个SIQ分数由数据点的半径表示。因此，在败血症发作时在患者S9的cfDNA中发现的具有最高丰度和显著性的物种是阴沟肠杆菌，具有5,000的SIQ分数。这进一步表明，如果在所有其他样品和对照中无处不在，那么具有高测定序列计数的物种将会得到低SIQ分数。相反，具有很少测定序列但低流行的物种将获得高SIQ分数。这一原理有助于从高丰度低显著性污染物测定序列突出显示低丰度但显著的病原体相关测定序列。

SIQ分数的临床相关性

SIQ分数允许在一个样品中发现的不同微生物物种之间的绝对比较。因此，除了临床标本中病原体的数据驱动的鉴定之外，这种方法在监测患者的细菌负荷和对靶向治疗的反应以及补充标准临床微生物学方面非常有用。为了评估SIQ分数在临床诊断中的相关性，将测序结果与临床微生物学数据进行比较，并在28天的试验期间补充抗感染治疗。所有具有两个以上血浆收集的患者(图10-12中7例患者中有5例)的数据被汇总，图3显示患者S10和S60。患者S10(图3A)发展为严重肺炎引起的感染性休克，在从他的胃移除肿瘤的胃切除术之后。在研究入选时，第一次血液培养和其他分泌物的后续样品对金黄色葡萄球菌呈阳性。除了金黄色葡萄球菌之外，在早期的呼吸道标本中，通过qPCR或培养分别检测到显著的病毒负荷(单纯疱疹病毒1型(HSV1)，9.87×10⁶拷贝数/ml)和低真菌负荷(白色念珠菌)。后期采样的血液培养为阴性，但从中心静脉导管(BC CVC)抽取的血液培养产生了屎肠球菌和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的阳性培养物，这表明可能的污染物共同于来自血管的血液培养物[18]。血浆样品的测序证实金黄色葡萄球菌是患者血液中的主要生物体，在所有观察时间点具有125.24、720.41、12.86、2和0.03的SIQ分数。金黄色葡萄球菌的最高SIQ分数在败血症发作后第1天观察到，之后强烈下降。在第7天，获得HSV1最高的SIQ分数(43.07)。在第14天，通过qPCR在气管分泌物中也检测到HSV1(8.5×10 ⁵个拷贝数/ml)，但在其他样品(qPCR或NGS)中没有检测到。次要的NGS发现是果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)和表皮葡萄球菌。尽管人工将基因组序列包括在数据库中，但NGS未在血浆样品中检测到白色念珠菌。同样，没有获得用于屎肠球菌的测定序列。根据金黄色葡萄球菌是临床相关的生物体及其对甲氧西林的敏感性，患者接受氟氯西林治疗，而重新激活的HSV1接受阿昔洛韦治疗。患者在感染性休克发作六周后出院至正常病房。关于cfDNA血浆浓度，可以观察到该患者从第一天具有强烈下降的初始升高水平逐步降低。除了患者S60以外，其他患者可观察到cfDNA浓度逐渐下降的类似过程，S60在第28天观察到cfDNA的最高浓度(图3B)。患者S60遭受肠道渗漏反复发作并伴有多次脓毒性感染，并接受重复性重建性腹部手术。有趣的是，在败血症过程中，该患者无法获得阳性血液培养，除了在研究入选前一天的一瓶阳性表皮葡萄球菌外。由于对大肠杆菌和屎肠球菌呈阳性的腹部伤口拭子的确认结果，继续使用亚胺培南和利奈唑胺进行最初的经验性抗生素治疗。包括腹腔灌洗和进一步的伤口拭子(在第7、11、14和21天获得)的后来的采样对大肠杆菌(和部分肠球菌)持续呈阳性。此外，还检测到变形杆菌属(寻常型)、白色念珠菌和摩根氏菌属(morganii)。此外，气管分泌物对HSV1和/或白色念珠菌测试为阳性。在感染的进一步过程中，患者由于大肠杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌和肺炎克雷伯氏菌而产生呼吸机相关性肺炎。该患者血浆cfDNA的基于NGS的结果与整个时间过程中的临床微生物学结果一致。在早期败血症阶段(第0、1、4、7、14和21天)获得的样品证实了由于大肠杆菌、屎肠球菌和脆弱拟杆菌引起的多菌体腹部感染的临床表现。对于第1天的血浆，仅获得有限的测定序列计数，仍发现大肠杆菌和脆弱拟杆菌是具有最高SIQ分数的物种。从第4天至第14天，检测到白色念珠菌cfDNA的升高量(第4天、第7天和第14天的SIQ分数为8.17、1.97和290.53)。此外，来自气管分泌物的HSV1的定量PCR的结果也可以由NGS确认(第7天)。尽管在第1天通过培养检测到摩根氏菌属细菌，但是分类到摩氏摩根氏菌的测定序列仅在第21天获得的血浆中检测到。最后，在研究结束时患者对呼吸机相关性肺炎的恶化时间同样通过在第28天获得的血浆中的脆弱拟杆菌SIQ分数为68.58和克雷伯肺炎菌SIQ分数为1341.37的测序结果确定。然而，血浆标本没有观察到寡养单胞菌(Stenotrophomonas)DNA水平升高。该患者的cfDNA水平在第2、7天升高，最高在第28天。患者在ICU治疗3个月后可转入中间护理，并最终在2周后出院。

七名患者中有七名患者接受了阳性血液培养。然而，在一名患者(S60)中，由于培养的细菌仅来自一个培养瓶中的表皮葡萄球菌(图3B)，所以血液培养物的污染似乎是可能的[19]。此外，七名患者中的三名患者在纳入研究之前已经获得了阳性培养物，其中七名中的六名在败血症发作之前已经接受了抗感染治疗。使用NGS，获得了令人信服的结果，所有患者在七个病例的六个(S60除外)中与血液培养结果相匹配。此外，在败血症发作时患者S60获得的SIQ结果(具有大肠杆菌、屎肠球菌和脆弱拟杆菌的多种微生物感染)与在腹部手术期间获得的腹腔内拭子和由肠泄漏引起的败血症的临床过程一致，表明与标准血液培养相比根据本发明的程序具有优越的灵敏度。有趣的是，血浆样品的NGS结果也与所有分析的患者的其他试样(如气管分泌物、拭子或导管培养)的数据相匹配(图10-12)。

物种特异性测定序列能够被分配到抗性基因

对患者S9的分析揭示了大量的测定序列(58,460个原始测定序列)，其可以唯一地分配给致病病原体阴沟肠杆菌。因此，各自的基因组显示了大约一个的均匀分布覆盖(图4A)。这可以被利用，使得在这种情况下可以检测到内在抗性相关基因。无错配的将各自的测定序列与CARD数据库映射，导致在0.02-0.6之间的基因覆盖率命中率很低(图4B)。在这里，鉴定的基因含有RNA聚合酶亚基B(rpoB)和转录调控子RobA的几种变体，它们作为潜在的抗生素抗性基因是数据库的一部分，但不包含抗生素抗性本身。

此外，分析了五名患有败血症的捐赠者的购买的汇集血浆样品(Seralab)。五名捐赠者中的三名被诊断为具有作为潜在病原体的金黄色葡萄球菌，一名具有非炭疽芽孢杆菌，一名患者被诊断为具有绿色链球菌(图19)。在NGS数据中确定了分类到金黄色葡萄球菌，但没有提到其他属的测定序列。对具有更高的覆盖率的330Mio测定序列的样品进行测序，其中鉴定了金黄色葡萄球菌的2150个测定序列。通过与CARD数据库进行映射来寻找抗性基因，确定了mecA的3个命中，等等。

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序列表

<110> 弗劳恩霍夫应用研究促进协会（FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT ZUR FÖRDERUNGDER ANGEWANDTEN FORSCHUNG E.V. ） / 斯图加特大学（UNIVERSITÄT STUTTGART） / 维也纳医科大学（MEDIZINISCHE UNIVERSITÄT WIEN） / 维也纳大学（UNIVERSITÄT WIEN）

<120> 用于确定样品的致病状况的方法和装置

<130> P1880194P

<140> PCT/EP2016/071219

<141> 2016-09-08

<150> 15184688.8

<151> 2015-09-10

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> DNA

<213> 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)

<400> 1

aataaattaa ccgaagataa aaaagaacct ctgctcaaca agttccagat tacaacttca 60

ccaggttcaa ctcaaaaaat attaacagca atgattgggt taaataacaa aacattagac 120

gataaaacaa gttataaaat cgatggtaaa ggttggcaaa aagataaatc ttggggtggt 180

tacaacgtta caagatatga agtggtaaat ggtaatatcg acttaaaaca agcaatagaa 240

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> 人血浆样品(human plasma sample)

<400> 2

cagattacaa cttcaccagg ttcaactcaa aaaatattaa cagcaatgat tgggttaaat 60

aacaaaacat tagacgataa aacaagttat aaaatcgatg gtaaaggttg gcaaaaagat 120

aaatcttggg gtggttacaa cgttacaaga 150

<210> 3

<211> 150

<212> DNA

<213> 人血浆样品(human plasma sample)

<400> 3

cagattacaa cttcaccagg ttcaactcaa aaaatattaa cagcaatgat tgggttaaat 60

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aaatcttggg gtggttacaa cgttacaaga 150

<210> 4

<211> 147

<212> DNA

<213> 人血浆样品(human plasma sample)

<400> 4

attacaactt caccaggttc aactcaaaaa atattaacag caatgattgg gttaaataac 60

aaaacattag acgataaaac aagttataaa atcgatggta aaggttggca aaaagataaa 120

tcttggggtg gttacaacgt tacaaga 147

Claims

1.一种用于确定样品的异常状况的方法，包括以下步骤：

a)提供样品，所述样品包括来自样品源的至少一个特定核酸，

b)提供数据库，所述数据库包括与所述特定核酸有关的至少一个数据集，该数据集指示在对照组中所述特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率，

c)对所述样品中的所述至少一个核酸进行测序以确定所述样品中所述至少一个特定核酸的标识和丰度，

d)将步骤c)中确定的所述至少一个特定核酸的标识分配到步骤b)中提供的数据库的数据集，该数据集涉及步骤c)中确定的相同的特定核酸，

e)基于根据步骤c)确定的样品的至少一个特定核酸的丰度和步骤b)中提供的相同的特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率，计算指示所述样品的异常状况的显著性分数。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异常状况是致病状况和/或健康状况，优选致病状况。

3.一种用于确定样品致病状况的方法，包括以下步骤：

e)基于根据步骤c)确定的样品的至少一个特定核酸的丰度和步骤b)中提供的对照组中相同的特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率，计算指示所述样品的致病状况的显著性分数。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述特定核酸有关的至少一个数据集是指该特定核酸或与该特定核酸相似的核酸或源于相同来源的核酸。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品源是生物体，优选人类生物体。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品从样品源获得，所述样品源选自由全血、血清、血浆、溶液、尿、组织、唾液、粪便或灌洗液所组成的组，优选血浆的无细胞部分。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是血浆。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测序通过分子高通量序列分析来进行。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述致病状况的特征在于至少一个病毒、细菌、真菌或寄生生物体的核酸的出现或致病的量。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述健康状况的特征在于至少一个癌细胞的核酸的出现或高于阈值的量。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述致病状况的特征在于植入物的排斥细胞的出现或高于阈值的量。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述致病状况的特征在于指示抗生素抗性的核酸的出现或致病的量。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中核酸在步骤c)之前不富集。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤c)之后且在步骤d)之前进行核酸序列的分类。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对照组的特征在于无异常状况、健康状况或无致病状况。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对照组的特征在于指示特定状况。

17.一种用于诊断异常或疾病的方法，其中进行根据权利要求1至16中任一项所述的方法，该方法确定样品的致病状况，从而允许诊断异常或疾病。

18.一种用于实施根据权利要求1至16的方法的装置，其中通过所述装置的中央处理单元，基于根据步骤c)确定的至少一个特定核酸的丰度和步骤b)中提供的对照样品中相同的特定核酸或至少一个第二特定核酸的至少一个特定丰度出现的概率，计算指示样品的异常和/或致病状况的显著性分数。