CN108431602A - 细菌快速试验 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于定量地测定细菌的方法和装置。

Description

细菌快速试验
本发明涉及用于定量地测定细菌的方法和装置。
军团菌属于革兰氏阴性细菌类别。关于其增殖的最佳条件是在水中在25-50℃的温度范围内。它们可以存在于用于热水产生和分配的设备中，存在于具有长的停用时间的游泳池、用于空调设备的空气净化器、冷却塔、水箱和水管中。吸入以气溶胶形式的含军团菌的水，例如在淋浴的情况下、在空调设备的情况下、通过草地喷水器或在涡流式沐浴器中，可以在人中导致感染，其可以引起一种危险的、在多数情况下致命的疾病，“军团菌病”。
因此，德国饮用水条例规定了对于军团菌的定期检验义务，这涉及具有用于饮用水加热的大型设备的饮用水设施的所有者，如果从该饮用水设施给出水并且与此同时发生其雾化，例如在淋浴中。该规定尤其适用于医院、学校、幼儿园、旅馆和护养院。这些机构有义务每年一次进行对于军团菌的检验。最近以来，多户住宅的业主或房东、住房建筑公司和物业管理部门也必须以各自三年的间隔进行相应的检验。
在饮用水条例中，对于军团菌规定了100个菌落形成单位(CFU)/100ml的技术措施值。如果在检验时确定超过了该值，那么必须立即向主管卫生局报告。
检验义务范围内的分析借助于常规的微生物学检测方法来进行。将待检验的饮用水样品在实验室中分配开，并且以两份平行的批料按照ISO 11731(1998)和DIN EN ISO11731-2(2008)进行检验。将起始样品的一部分作为直接批料和将另一部分在过滤后涂布在具有琼脂培养基的培养皿中。将来自所述两种批料的琼脂平板在36±2℃的恒定温度下在培养箱中温育十天。然后，对在温育期间生长处的军团菌菌落进行计数和评价。定量结果以关于100ml样品而言的“菌落形成单位(CFU)”来给出。
为了证实独特的军团菌菌落，将至少五个菌落不仅在含半胱氨酸的培养基上而且还在不含半胱氨酸的培养基上平行地传代培养至少两天。由于氨基酸半胱氨酸对于军团菌来说是必需的，如果菌落在含半胱氨酸的培养基上生长，但在不含半胱氨酸的培养基上不生长，那么该检测被认为得到证实。
上面所提及的分析的一个缺点在于，所述微生物学检测方法是昂贵的和耗时的。所述方法的另一个缺点在于，由此获得的结果具有在大约15％和35％之间的不准确性。
因此，作为本发明基础的任务在于，提供经改善的用于定量地测定军团菌和其他细菌的方法，其中可以至少部分地避免现有技术的缺点。特别地，所述方法应当允许具有高精确性的明显更快速的测定。
为了解决该任务，提供了新的用于定量地检测细菌的方法和装置。本发明基于测量经标记的细菌，其中所获得的测量信号与在样品中存在的细菌的总数目相关。细菌的检测可以例如通过发光辐射、荧光辐射或拉曼辐射来进行。
本发明的第一个方面涉及用于定量地测定样品中的细菌的方法，其包括下列步骤：
(a)将待检验的样品与能与待测定的细菌相结合的标记试剂一起进行温育，所述标记试剂优选地选自荧光标记试剂、发光标记试剂和拉曼标记试剂，
(b)通过对于所述待测定的细菌来说不可渗透而对于所述标记试剂来说可渗透的膜，从细菌上去除未与细菌相结合的标记试剂，其中所述待测定的细菌被收集在所述膜上，
(c)测定与所收集的细菌相结合的标记试剂，优选地通过发光测量、荧光测量和/或拉曼测量，和
(d)定量地评价来自步骤(c)的测量信号。
根据本发明的方法允许快速地且定量地测定样品中的细菌。所述方法可以在取样后直接进行，而无需事先培养待测定的细菌。对于标记试剂与细菌结合来说所需的温育时间优选地在一秒钟至最大五分钟，特别优选地直至最大2.5分钟的范围内。这导致，可达到少于十分钟，优选地少于五分钟的总测量时间。
优选地，所述方法用于定量地测定军团菌。然而，也可以测定其他细菌，特别是人致病细菌，例如沙门氏菌，利斯特氏菌，大肠病菌例如大肠杆菌(E.coli)，例如EHEC，或医院病菌例如MRSA。其中对细菌进行测定的样品可以是拭子样品或水样品，但是也可以是生物学样品，例如来自肉类产品、乳产品或蛋类产品的食物样品，或体液例如血液、血浆、血清、尿等。
通过根据本发明的方法的细菌测定通过使用能与待测定的细菌相结合的标记试剂并且测量来自与细菌相结合的标记试剂的信号来进行。所述测定可以例如通过发光测量、荧光测量和/或测量拉曼辐射(例如借助于表面增强拉曼光谱学(SERS))来进行。在此情况下，使用能与待测定的细菌相结合的标记试剂，优选地荧光的、发光的或具有拉曼活性的标记试剂，其对于待测定的细菌来说是选择性的，即识别在样品的其他组成部分中不存在的、在待测定的细菌上或内的结构。例如，所述标记试剂可以选自经标记的核酸探针、抗体、噬菌体及其组合。优选地，所述标记试剂为经标记的噬菌体。
在一个实施方案中，可以使用荧光或发光的标记试剂，其发射例如在200nm至10μm，特别地200nm至2μm的范围内的荧光辐射或发光辐射。特别优选的发射波长在1300-1500nm的范围内。
用于与互补的细菌核酸序列进行杂交的经荧光或发光标记的核酸探针原则上是已知的，并且例如用于FISH-技术。所述核酸探针通常是基于脱氧核糖核苷酸类似物和/或核酸类似物例如LNA-构件的探针。它们可以例如针对对于待检测的细菌来说特异的核糖体RNA序列和/或DNA序列。
还已知针对对于待检测的细菌来说特异的抗原(例如存在于细菌表面上的抗原)的经标记的抗体，例如经荧光或发光标记的抗体，即多克隆或单克隆抗体以及抗体片段或抗体衍生物。
在另一个特别优选的实施方案中，所述标记试剂可以为噬菌体，其携带标记，例如荧光标记或发光标记，并且特异性地识别在待测定的细菌上的表面结构。用于军团菌的噬菌体例如在Lammetyn(Microb.Ecol.56(2000),191-197)中作了描述。用于沙门氏菌的噬菌体例如在Atterbury等人(Appl.Environ.Microbiol.73(2007),4543-4549)、Wichard等人(J.Food Prot 2(2003),178-340)或deLappe等人(J.Med.Microbiol.58(2009))中作了描述。利斯特氏菌的噬菌体例如在Klumpp&Loessner(www.Ncbi.Nlm.nih.gov>PMC3827098)中作了描述。用于MRSA的噬菌体例如在Sahin等人(Mikrobiol.Bul.47(2013),27-34)中作了描述。用于大肠杆菌的噬菌体，例如T-噬菌体、λ-噬菌体等在Sambrook等人(MolecularCloning,A Laboratory Manual)中作了描述。
对于根据本发明的方法，使用经标记的噬菌体，例如经荧光或发光标记的噬菌体，优选地以相对于待检测的细菌而言过量。可以以大约107-109个噬菌体/批料来使用它们。通常发现，在这些条件下，每个细菌细胞配备有大约50-400个噬菌体，特别地大约50-250或50-150个噬菌体。例如，一个大肠杆菌细菌细胞可以配备有大约70个噬菌体。
在另一个优选的实施方案中，可以使用通过拉曼光谱学可检测的标记试剂，例如包含表面增强的具有拉曼光谱学活性的颗粒的标记试剂。这些标记试剂优选地包含金属颗粒，例如金或银颗粒和/或拉曼报道分子，其结合至能与待检测的细菌相结合的探针。所述拉曼报道分子可以例如选自异硫氰酸酯染料或多硫荧光染料。如上面所描述的，所述探针可以选自选择性地与待测定的细菌相结合的核酸、抗体和噬菌体。
标记试剂的荧光或发光基团可以选自任何已知的有机或无机的荧光染料或发光染料，其优选地共价结合至标记试剂。合适的荧光基团为荧光染料，例如荧光素、罗丹明、噁嗪或藻红蛋白，荧光蛋白例如GFP或其变体，以及荧光量子点。用于表面增强拉曼光谱学(SERS)的合适的检测基团为包含一个或多个异硫氰酸酯基团和/或硫原子的物质。
待检测的细菌与标记试剂的温育在反应室中进行。为此，将待检验的样品引入到反应室中。可以在引入到第一室中之前或之后，使标记试剂与样品相接触。优选地，所述第一室包含具有预先确定的量的标记试剂的储库，所述标记试剂在那里可以以液体的或干燥的形式存在。优选地，所述标记试剂以干燥的且在与样品液体相接触后可重构的形式存在。所述第一室(其中进行待测定的细菌与标记试剂的温育)在至少一侧处用膜进行约束。备选地，可以将掺有标记试剂的样品从温育室导入到用膜进行约束的另一个室中。该膜对于待测定的细菌来说是不可渗透的，但对于标记试剂，即对于未与细菌相结合的标记试剂，来说是可渗透的。该膜具有例如大约0.5-3μm，例如1-2μm的孔径。合适的膜(例如，由合成材料例如尼龙制成的膜)是已知的。
在一个优选的实施方案中，在根据本发明的测定方法中使用测量池，其包括至少两个室和一个被布置在所述室之间的膜，所述膜对于待测定的细菌来说是不可渗透的而对于未与待测定的细菌相结合的标记试剂来说是可渗透的。例如，所述测量池可以包括用于温育的第一室和用于接纳分开的样品组成部分和多余的标记的第二室，它们如上面所描述的那样经过膜相连接。
在温育结束后，通过所述膜来去除未与细菌相结合的标记试剂，并且收集在膜上的待测定的细菌。该步骤可以通过对膜施加低压来进行，从而处于与膜相接触的样品液体和未结合的标记试剂穿过膜，并且在膜上的细菌得以收集。备选地，样品液体和未结合的标记试剂的去除还可以通过离心来进行。优选地，将与细菌分开的样品液体和未结合的标记试剂导入到位于膜后面的第二室中。
在温育之前或/和期间，可以进行标记试剂与待检验的样品的均匀混合。为此可以设计安排振荡部件，其任选地集成在测量装置中。在温育后，可以洗涤经标记的细菌，任选地一次或多次。
对被设计安排用于温育的第一室进行如此配置，从而它可以接纳其中存在对于定量测定来说足够的量的细菌的样品体积。通常，设计安排用于在0.5ml或更大，例如1-100ml，优选地5-50ml的范围内的样品体积的反应室。特别优选的是在大约10ml的范围内的体积。
根据本发明的方法基于通过测量对于标记基团来说特征性的辐射(例如荧光辐射、发光辐射和/或拉曼辐射)来测定与所收集的细菌相结合的标记试剂。为此，在所收集的细菌上照射来自光源的激发光，并且测量由存在于细菌上的标记试剂所发射的荧光辐射、发光辐射和/或拉曼辐射。在一个优选的实施方案中，通过在去除样品液体和多余的标记试剂以及任选地一个或多个洗涤步骤后直接在膜上检验所收集的细菌来进行所述测量。
作为光源，优选地使用激光器，例如量子级联激光器。该激光器与合适的光学系统相连接，以便使得能够照射所收集的细菌，优选地平面照射所收集的细菌，优选地平面照射在膜上所收集的细菌。激光系统向反应室中的耦联可以通过在光学上透明的纤维(例如玻璃纤维)来进行。
为了检测荧光或发光，作为激光器，可以使用在UV范围内(例如具有350-420nm的入射波长)的多模或单模激光二极管。优选的是365nm和405nm的入射波长，其可以通过使用商购可得的标准激光二极管来获得。为了检测拉曼辐射，也可以使用具有在UV、VIS或近IR范围内的合适的入射波长的激光器。
与细菌相结合的标记试剂的测定可以通过荧光光谱学，优选地通过荧光相关光谱学，和/或通过拉曼光谱学来进行。在此情况下，借助于合适的共聚焦光学系统来将来自于光源的激发光聚焦在样品中，以产生激发体积，其中存在待测定的细菌。
用光检测器测量由与细菌相结合的标记试剂所发射的辐射，例如荧光辐射、发光辐射和/或拉曼辐射。所述光检测器可以为例如雪崩光电二极管或EMCCD照相机。优选地，作为光检测器，使用光谱仪，其使得能够在至少50nm，至少100nm和直至200或250nm的范围内在光谱上分辨所发射出的光。优选地，使用具有处于200和2000nm之间的测量范围的光检测器，例如光谱仪。所述光谱仪的光学分辨率为0.35-1nm，优选地大约0.6-0.9nm。
在一个实施方案中，通过表面增强拉曼光谱学(SERS)来测定经标记的细菌。该方法基于通过单色激光来激发拉曼报道分子，其中发射出特异性的拉曼光谱。通过拉曼报道分子与其所与之结合的金属纳米颗粒的相互作用来增强信号。优选的金属纳米颗粒由贵金属例如银或金组成，并且可以具有不同的结构和大小(Wang等人,Chem.Rev.2013,113,1391-1428；EP 2 134 642 B1)。
定量地评价在光检测器中所获得的测量信号。作为结果，获得存在于待检验的样品中的细菌数目，其与所测量的荧光辐射、发光辐射和/或拉曼辐射相关。所测量的细菌数目相应于一定的菌落形成单位(CFU)值/样品体积。
可以将基于测量信号而测定的细菌数目按照界限值归入一个或多个类别。这些界限值与对于各个方法来说特异的荧光强度相关。在检测军团菌的情况下，可以例如设定第一个界限值，其相应于100CFU/100ml这样的数目。如果所测定的细菌的数目超过该值，那么必须采取措施以对抗在相应的水系统中的军团菌。作为另一个界限值，可以设定10,000CFU/100ml这样的数目。如果所测定的细菌的数目超过该值，那么必须采取紧急措施，其伴有相应的水系统的立即关闭。
为了支持定量评价，可以进行校准，例如通过使用至少一个可以经由参考激光器来产生的参考信号。备选地，还可以通过使用内标物来进行校准，所述内标物例如为荧光的、发光的或具有拉曼活性的颗粒，其携带与光学可检测的标记试剂不同的荧光、发光或拉曼标记。
本发明的另一个目标是用于定量地测定细菌的测量池，其包括：
(i)第一室，其任选地包含具有用于待测定的细菌的标记试剂(例如噬菌体)的储库，其中所述标记试剂优选地选自荧光标记试剂、发光标记试剂和拉曼标记试剂，
(ii)第二室，和
(iii)膜，其被布置在所述第一室和所述第二室之间，其中所述膜对于待测定的细菌来说是不可渗透的而对于未与待测定的细菌相结合的标记试剂来说是可渗透的。
本发明的另外一个目标是用于定量地测定细菌的装置，其包括：
(i)上面所说明的测量池，
(ii)用于将多余的标记试剂从所述第一室中撤出并进入所述第二室中的工具，
(iii)用于激发经标记的、在膜上所收集的细菌的辐射，例如荧光辐射、发光辐射和/或拉曼辐射的工具，和
(iv)用于定量地评价来自于所收集的细菌的测量信号的工具。
根据本发明的测量池和装置可以在用于定量地测定细菌的方法中，特别是在上面所描述的根据本发明的方法中使用。特别优选的是用于定量地测定水样品中的军团菌的用途。
此外，将通过下面的附图来阐明本发明：
图1显示了测量池，其被制成测量小杯的形式。所述测量池包括用于接纳例如10ml的样品体积的反应室或第一室(10)。在第一室(10)中，设计安排了具有预先确定的量的标记试剂的标记物储库(12)，优选地以干燥的形式。第一室(10)在一侧处包含用于接纳样品的开口(14)。此外，第一室(10)经由膜(16)与第二室(18)相连接。如此地来形成膜(16)，从而它对于存在于第一室(10)中的细菌来说是不可渗透的，但对于未与细菌相结合的标记试剂来说是可渗透的。
为了进行测量，在与标记试剂进行温育后，将存在于第一室(10)中的液体导入到第二室(18)中。使具有与之相结合的标记试剂的存在于样品中的细菌沉积在膜(16)上。未结合的标记试剂可以穿透过膜(16)，并且与液体一起到达第二室(18)中。在膜(16)上所沉积的细菌的测量可以在原位进行，而无需进一步的措施。
图2显示了在对于待测定的细菌(例如大肠杆菌或军团菌)来说阳性的样品上进行的光谱测量的结果。测量信号的记录通过其测量范围优选地在350和550nm之间的光谱仪来进行。所述光谱仪的光学分辨率优选地为0.4-0.1nm。来自于待测定的细菌的荧光信号在510至520nm(ROI)的范围内。通过参考激光器来确保光谱的振幅具有正确的参考值。所述评价包括设定两个关于细菌计数的界限值，其分别为100CFU/100ml何10,000CFU/100ml。在该图中，测量信号的强度超过了10,000CFU的界限值。因此，所测定的样品被极其严重地污染了。
图3显示了测定具有大肠杆菌细菌的样品的结果。作为标记试剂，使用与无机染料K2WO4:Eu(颗粒大小5-15nm)相偶联的大肠杆菌噬菌体。
在与标记试剂一起在反应室中进行温育后，使样品中所包含的细菌沉积在膜上并在那里进行测定。为此，用激光器(405nm/25mW)均匀地对所述膜进行辐照，并且定量地测定在610-615nm的波长下所产生的发射辐射。通过经由使用具有已知的大肠杆菌细菌数目(例如在10-109个细胞的范围内)的标准样品来进行的事先校准，以经修正的脉冲所测量的信号与样品中的菌落形成单位(CFU)的数目的定量转换是可能的。
此外，在光谱中看到在702nm处的Ca-参考激光器的峰，其用相应于10,000CFU这一界限值的10％的强度进行了照射。
在590和600nm之间的范围内，还可看到在染料中所包含的钨标记物的信号，其不是用于定量地测定细菌的。
在图3中所显示的样品的测定产生了相应于9,030CFU的细菌数目的信号。通过借助于FACS的核查，可以验证该细菌数目。

Claims (17)

1.用于定量地测定样品中的细菌的方法，其包括下列步骤：
(a)将待检验的样品与能与待测定的细菌相结合的标记试剂一起进行温育，所述标记试剂优选地选自荧光标记试剂、发光标记试剂和拉曼标记试剂，
(b)通过对于所述待测定的细菌来说不可渗透而对于所述标记试剂来说可渗透的膜，从细菌上去除未与细菌相结合的标记试剂，其中所述待测定的细菌被收集在所述膜上，
(c)测定与所收集的细菌相结合的标记试剂，优选地通过荧光测量、发光测量和/或拉曼测量，和
(d)定量地评价来自步骤(c)的测量信号。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述细菌选自军团菌，沙门氏菌，利斯特氏菌，大肠病菌例如大肠杆菌(E.coli)，医院病菌例如MRSA。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述标记试剂选自经标记的核酸探针、抗体、噬菌体及其组合。
4.根据权利要求1至3之一的方法，其特征在于，作为标记试剂，使用经标记的噬菌体，优选地经荧光、发光或拉曼标记的噬菌体。
5.根据权利要求1至4之一的方法，其特征在于，使用测量池用于进行测量，所述测量池包括：
(i)第一室，其任选地包含关于所述标记试剂的储库，
(ii)第二室，和
(iii)膜，其被布置在所述第一室和所述第二室之间，其中所述膜对于待测定的细菌来说是不可渗透的而对于未与待测定的细菌相结合的标记试剂来说是可渗透的，并且
其中在温育步骤结束后，从所述第一室中去除未与待测定的细菌相结合的标记试剂，并引导其通过所述膜而进入到所述第二室中。
6.根据权利要求1至5之一的方法，其特征在于，使用具有大约0.5-3μm的孔径的膜。
7.根据权利要求1至6之一的方法，其特征在于，在根据步骤(a)的温育之前和/或期间，进行所述标记试剂与所述待检验的样品的混合。
8.根据权利要求1至7之一的方法，其特征在于，使用具有共聚焦光学系统的激光器作为光源用于根据步骤(c)的光学测定。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，将所述激光器在集成装置中与光谱仪一起作为检测单元进行使用。
10.根据权利要求1至9之一的方法，其特征在于，根据步骤(d)的定量评价包括按照预先确定的界限值将所测定的细菌数目归入一个或多个类别。
11.根据权利要求1至10之一的方法，其特征在于，使用至少一种参考信号，特别是由激光器所产生的参考信号，用于根据步骤(d)的定量评价。
12.用于定量地测定细菌的测量池，其包括：
(i)第一室，其任选地包含关于标记试剂的储库，其中所述标记试剂优选地选自荧光标记试剂、发光标记试剂和拉曼标记试剂，
(ii)第二室，和
(iii)膜，其被布置在所述第一室和所述第二室之间，其中所述膜对于待测定的细菌来说是不可渗透的而对于未与待测定的细菌相结合的标记试剂来说是可渗透的。
13.根据权利要求12的测量池，其特征在于，所述第一室的容积为2-20ml。
14.根据权利要求12或13的测量池，其特征在于，所述标记试剂为经标记的噬菌体。
15.用于定量地测定细菌的装置，其包括：
(i)根据权利要求12至14之一的测量池，
(ii)用于将多余的标记试剂从所述第一室中撤出并进入所述第二室中的工具，
(iii)用于激发经标记的、在膜上所收集的细菌的辐射，优选地荧光辐射、发光辐射和/或拉曼辐射的工具，和
(iv)用于定量地评价来自于所收集的细菌的测量信号的工具。
16.根据权利要求12至14之一的测量池或者根据权利要求15的装置在用于定量地测定细菌的方法中，特别是在根据权利要求1至11之一的方法中的用途。
17.根据权利要求16的用途，所述用途为用于定量地测定水样品中的军团菌。
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