CN109536498B

CN109536498B - 一种pabpc5基因抑制剂及其用途

Info

Publication number: CN109536498B
Application number: CN201811503752.4A
Authority: CN
Inventors: 薛一雪; 刘云会; 刘丽波; 刘啸白; 郑健; 蔡恒; 李振
Original assignee: China Medical University Taiwan
Current assignee: China Medical University Taiwan
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2038-12-10
Also published as: CN109536498A

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种PABPC5基因抑制剂及其在抗胶质瘤中的用途。所述的PABPC5基因靶向抑制剂的基因序列为5’‑GGAACATTCTGTCCTGCAAAG‑3’（SEQ ID No.1），与SEQ ID No.1所示的DNA序列具有90%同源性且具有相同或相近功能的DNA序列。PABPC5基因抑制剂用于制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为脑胶质瘤。通过其在脑胶质瘤中的应用，可以抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭，诱导胶质瘤细胞凋亡，具有针对性的预防和提高胶质瘤治疗效果的优点。

Description

一种PABPC5基因抑制剂及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种PABPC5基因的抑制剂及其在抗胶质瘤中的用途。

背景技术

胶质母细胞瘤是中枢系统最常见也是恶性度最高的恶性肿瘤。目前治疗手段主要以手术为主，放化疗为辅助治疗。但是，由于胶质母细胞瘤具有高侵袭性生长、血管生成旺盛等生物学特征，手术即使达到影像学和显微镜下全切，复发还是在所难免。经综合治疗后其中位生存期仍不超过15个月，5年生存率不超过15%。近年来，随着基因分子水平研究的不断深入，国内外医学界对胶质瘤的发病机制有了新的认识和理解，越来越多的与胶质瘤发生发展密切相关的特定基因被发现，大量临床研究表明，这些特定基因的表达与化疗药物的有效性密切相关。因此，确定胶质瘤的特异性基因，明确其表达状态，并针对该基因研制和开发药物制剂，能够有效的提高胶质瘤的治疗效率，减少药物的毒副作用，具有非常广阔的应用前景。

PABPC5 (Poly(A) binding protein cytoplasmic 5)，是一种可与poly(A)尾结合的RNA结合蛋白。PABPC5位于Xq21.31，含有2个外显子。有研究报道在成年人的大脑中检测到PABPC5的表达，也有研究表明PABPC5与性染色体的形成密切相关。目前尚未发现PABPC5在恶性脑胶质瘤中的表达并参与胶质瘤细胞生物学行为的调控。前期，应用real-time PCR法检测了PABPC5的表达水平。结果显示，在脑胶质细胞中PABPC5的表达水平显著高于正常星型胶质细胞组，这一结果提示PABPC5可能参与对胶质瘤的发生与发展的功能调控。

RNA 干扰技术的原理是利用Dicer酶切割RNA分子，形成RNA沉默复合体，靶向结合目标RNA分子进而降解RNA分子的过程。本发明利用RNA干扰技术研制TSNAX基因的抑制剂，在胶质瘤基因治疗领域发挥作用。

目前，PABPC5在胶质瘤发生发展中的作用以及相关机制还未见报道，关于PABPC5在胶质瘤基因治疗方面的应用目前还是一片空白。因此，研制一种PABPC5相关的药物成为目前亟待解决的问题。本发明的实施能够实现胶质瘤发病机制理论研究向临床应用的转化，解决胶质瘤复发以及治疗抵抗的问题，有效提高胶质瘤的治疗效果。

发明内容

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提供一种在脑胶质瘤中高表达的特异性基因抑制剂，通过其在脑胶质瘤中的应用，可以抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭，诱导胶质瘤细胞凋亡，具有针对性的预防和提高胶质瘤治疗效果的优点。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种PABPC5基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的基因序列为5’-GGAACATTCTGTCCTGCAAAG-3’（SEQ ID No.1），或者与SEQ ID No.1所示的DNA序列具有90%同源性且具有相同或相近功能的DNA序列。

所述的PABPC5基因的靶向抑制剂能够抑制PABPC5基因表达的shRNA序列，shRNA模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为。

正义链。

5’-CACCGGAACATTCTGTCCTGCAAAGTTCAAGAGACTTTGCAGGACAGAATGTTCCTTTTTTG-3’（SEQ ID No.2）。

反义链。

5’-GATCCAAAAAAGGAACATTCTGTCCTGCAAAGTCTCTTGAAGGAACATTCTGTCCTGCAAAG-3’（SEQ ID No.3）。

一种转录上述的shRNA 的转录产物，序列为。

5’-GGAACATTCTGTCCTGCAAAGTTCAAGAGAGGAACATTCTGTCCTGCAAAG-3’（SEQ IDNo.4）。

一种PABPC5基因的抑制剂用于制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤为脑胶质瘤。

所述抗肿瘤药物为含有治疗量的PABPC5基因的抑制剂和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。

所述抗肿瘤药物为药学上可接受的剂型，优选注射剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果。

1）RNA结合蛋白能够维持肿瘤干细胞的干性，通过增强肿瘤相关RNA的稳定性参与肿瘤的发生、发展、转移和血管生成，从而导致化疗药物出现耐药。因此RNA结合蛋白能够通过多种机制发挥癌基因的作用，促进肿瘤发生发展，抑制治疗效果。PABPC5是脑胶质瘤特异性高表达的RNA结合蛋白，能够促进肿瘤的发生发展和诱发耐药。主要针对脑胶质瘤特异性高表达的PABPC5基因，达到靶向治疗，减少副作用。

2）本发明抑制剂的特征为任何药物治疗学上可接受的的剂型，具有极大的临床应用价值。

3）研发针对肿瘤细胞特异性高表达分子的抑制剂，是目前肿瘤治疗药物研发的主要目标，但由于药物研发周期长和治疗效果差等原因，制约了肿瘤靶向药物的发展。RNA 干扰技术具有安全可靠，通过细胞外和细胞内多种途径递送相关肿瘤治疗药物等特点，为肿瘤的治疗提供了相对快速且具有革命性的肿瘤药物研发途径。

4）本发明应用RNA 干扰技术制备RNA结合蛋白PABPC5基因抑制剂，具有靶向治疗、安全有效、生产相对快速和长期有效的特点，填补了抗肿瘤药物研发中的不足。

附图说明

图1是 Real-time PCR方法检测PABPC5在正常脑组织标本和胶质瘤组织标本中的表达情况。与正常脑组织标本相比，PABPC5在胶质瘤组织中表达显著增高，差异有有统计学意义(n=5，^** P<0.01 vs.正常脑组织)；与低级别胶质瘤标本相比，PABPC5在胶质母细胞瘤组织中表达显著增高，差异有有统计学意义。（n=5， ^## P<0.01 vs.低级别胶质瘤）。

图2是Real-time PCR方法检测应用PABPC5基因抑制剂后，PABPC5在人脑胶质瘤U87和U251细胞中的表达情况。与空白对照组相比，U87和U251细胞中，PABPC5在抑制剂组中表达显著下调，差异有统计学意义。（n=3，^** P<0.01 vs.空白对照组）。

图3是Transwell检测应用PABPC5基因抑制剂后，人脑胶质瘤U87、U251细胞迁移能力的变化。（n=3，^** P<0.01 vs.空白对照组）。

图4是 Transwell检测应用PABPC5基因抑制剂后，人脑胶质瘤U87、U251细胞侵袭能力的变化。（n=3，^** P<0.01 vs.空白对照组）。

图5是流式细胞仪检测应用PABPC5基因抑制剂后，人脑胶质瘤U87细胞凋亡能力的变化。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明抗肿瘤物质的制备方法。

1.实时定量PCR检测PABPC5的表达。

1.1 Trizol法提取组织和细胞中的总RNA。

1.1.1 用冷PBS洗涤收集的细胞（液氮冻存组织应用组织匀浆机以5000rpm在0℃粉碎30秒），加入1 ml Trizol试剂吹打数次，镜下观察细胞成油滴状（充分裂解），后移入1.5 ml EP管中，静置5 分钟，使其充分裂解。

1.1.2向样品中加入0.2 ml氯仿，手动剧烈震荡室温下静置3分钟。

1.1.3于4℃ 12000g离心15分钟，取上层水相到新的EP管中，再加入0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10分钟。

1.1.4 4℃ 12000g离心15分钟后弃上清，加入1 ml 75%乙醇。

1.1.5 4℃ 7500g离心5分钟，室温干燥15分钟后加入40 μl DEPC水，样品可冻存于-80℃冰箱。

1.2 一步染料法qRT-PCR检测PABPC5的表达。

应用Trizol提取总RNA：将 Trizol 直接加在细胞上吹打。室温放置5分钟后，向管中加入 0.2 ml 氯仿，剧烈震荡15秒，室温下放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟，取上层水相至另一新管中。加入0.5 ml异丙醇震荡，室温条件下放置5分钟。4℃，12000g离心10分钟，弃上清，管底白色沉淀以1 ml 75%乙醇洗涤，漩涡器振荡。4℃，7500g离心5分钟，弃上清液，倒置 EP 管于干净滤纸上，至可见乙醇完全挥发。加入适量 DEPC 水，稍加吹打至 RNA完全溶解。总RNA用Nanodrop分光光度计测定RNA浓度，以及OD260/OD280比值，验证纯度（RNA纯度验证标准：当OD260/OD280在1.7-2.0，说明RNA纯度很高，当OD260/OD280＜1.7时，表明有蛋白质或酚污染；当OD260/OD280＞2.0时，表明可能有异硫氰酸残存）。

应用One Step SYBR^® PrimeScript^® PLUS RT-PCR Kit(TaKaRa, 中国)，根据说明书的操作进行扩增。主要步骤包括，将所合成的目的基因和 GAPDH 上下游引物用 0.1%DEPC 水溶解后，配置RT-PCR 反应体系 (20μl)：One Step SYBR® buffer，10μl；TaKaRaEx Taq HS Mis，1.2μl ；PrimeScript PLUS TRase Mix， 0.4μl ；PCR上游引物，0.8μl ；PCR下游引物，0.8μl ；ROX Refference Dye，0.4μl ；总RNA，2μl ；RNase Free dH₂O，4.4μl 。将上述各成分混匀标注号码后放入基因扩增仪内。扩增的条件与参数为：42℃，5 min，95℃，10s； 95℃ 5s，60℃ 34s 共 40 个循环。测定CT值，以GAPDH为内参照，以2-^△△Ct表示PABPC5的相对表达量。

检测PABPC5基因在正常星形胶质细胞和胶质瘤细胞中的表达水平，如图1所示，与正常脑组织标本相比，PABPC5在胶质母细胞瘤组织中表达显著增高，而且表达水平随肿瘤级别的升高而升高。

2. PABPC5基因抑制剂的制备和应用。

设计PABPC5基因的干扰序列，选定靶向人PABPC5基因并特异性抑制PABPC5 基因表达的靶基因序列如下。

5’-GGAACATTCTGTCCTGCAAAG-3’（SEQ ID No.1）。

在NCBI 的同原序列比对分析nucleotide blast 中输入GGAACATTCTGTCCTGCAAAG序列进行比对分析，结果表明该序列和人的其它mRNA 基因没有高度同源性，可作特异性干扰PABPC5基因的特异性序列。

针对以上靶序列设计靶向人PABPC5基因而抑制PABPC5基因表达的shRNA序列如下，包括正义链和反义链，此shRNA 序列为。

正义链。

反义链。

转录上述的shRNA 的转录产物，序列为。

5’-GGAACATTCTGTCCTGCAAAGTTCAAGAGAGGAACATTCTGTCCTGCAAAG-3’ （SEQ IDNo.4）。

将以上序列信息设计并合成相应质粒，作为PABPC5基因抑制剂。PABPC5基因抑制剂转染：sh-NC、sh-PABPC5的质粒U6/GFP/Neo，使PABPC5表达沉默，不含有PABPC5序列或shRNA的空质粒为实验阴性对照；应用24孔培养板培养胶质瘤细胞，当细胞生长达到80%左右时进行转染；配置转染需要的质粒、Opti-MEM^®Ⅰ和LTX and Plus reagent (LifeTechnologies)转染试剂。A管：一个孔按照1μg质粒DNA溶解于50 μl Opti-MEM®Ⅰ+1μlp3000，放置5 min，B管：孔按照1μl LTX and Plus溶解于50 μl Opti-MEM^®Ⅰ中；将A、B两管混匀后静置5 min；吸出培养液，每孔加入转染混合液100 µL，再加入EBM-2培养液400 µL；48 h后用含有浓度为0.4 mg/mL抗生素G418的培养基进行筛选，不断增加G418的浓度，大约4周后得到能够稳定沉默PABPC5的细胞系。在后续实验中分为3组，分别是：正常组，转染PABPC5沉默空质粒的空白对照组，转染PABPC5沉默质粒的抑制剂组。

检测应用PABPC5基因抑制剂后，U87和U251胶质瘤细胞中PABPC5的表达情况。结果如图2所示，与空白对照组相比，PABPC5在抑制剂组中表达显著下调。

3. 细胞Transwell迁移和侵袭实验。

1) 在24孔细胞培养板内每孔加入500µl含有10%血清的DMEM高糖培养液，孔内放置孔径为8µm的transwell小室。

2) 细胞计数后，将不同组细胞用不含有血清的DMEM高糖培养液将其吹成细胞悬液，分别均匀地铺在上室里面，每孔小室里加入100µl细胞悬液大约含10000个细胞。放入37℃恒温培养箱中培养24小时。

3) 24 小时后取出小室，用棉棒将上室内面没有迁移过去的细胞擦净，按照甲醇∶冰乙酸 = 3∶1的比例配置固定液。

4) 将小室放入固定液中，使小室底面的细胞固定30分钟。

5) 用PBS清洗小室后晾干。配制吉姆萨染液，染液：工作液1:9。将吉姆萨染液滴与小室底面，染色1小时。

6) 用PBS清洗两次，在倒置400×显微镜下观察细胞的迁移情况，随机取每组细胞的5个视野进行细胞个数的统计，以此代表细胞的迁移能力。

4. 细胞Transwell侵袭实验。

1) 在小室内面均匀铺上50µl浓度为500ng/µl的基质胶Matrigel，放入37℃恒温箱中4小时使其凝固。

2) 然后再铺上细胞悬液，方法同迁移实验。

实验结果如图3和图4所示，应用PABPC5基因抑制剂后，与空白对照组相比，抑制剂组的胶质瘤U87、U251细胞迁移和侵袭能力均显著降低。

5. 细胞凋亡实验。

1) 用预冷的PBS清洗细胞两次。用不含EDTA的胰酶消化，将细胞轻轻吹打成细胞悬液后转移至1.5ml离心管中，1000rpm离心3分钟收集细胞。

2) 用PBS继续清洗，1000rpm离心3分钟，离心后倒掉上清，重复两次。

3) 将工作液10×binding buffer稀释十倍。每管加入100µl Binding Buffer，悬浮细胞。

4) 每管相继加入5µl Annexin V-PI和5µl FITC混匀，室温避光15分钟。

5) 上机前向每管加入400µl1×binding buffer，吹打均匀后，上流式细胞仪(FACScan, BD公司，美国)检测细胞凋亡的变化。

实验结果如图5所示，与空白对照组相比，PABPC5基因抑制剂能够显著诱导胶质瘤U87细胞的凋亡。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医科大学

<120> 一种PABPC5基因抑制剂及其用途

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaacattct gtcctgcaaa g 21

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caccggaaca ttctgtcctg caaagttcaa gagactttgc aggacagaat gttccttttt 60

tg 62

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatccaaaaa aggaacattc tgtcctgcaa agtctcttga aggaacattc tgtcctgcaa 60

ag 62

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaacattct gtcctgcaaa gttcaagaga ggaacattct gtcctgcaaa g 51

Claims

1.一种 PABPC5基因的靶向抑制剂在制备抗脑胶质瘤药物中的用途，其特征在于，所述PABPC5基因的靶向抑制剂为能够抑制PABPC5基因表达的shRNA序列，所述shRNA序列针对的靶序列为5’-GGAACATTCTGTCCTGCAAAG-3’(SEQ ID No.1)。