CN109652425A - 水稻OsHIR3基因的用途以及获得抗病水稻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供水稻OsHIR3基因在制备植物防御病毒或者细菌侵染危害上的用途以及制备方法,其中所述的方法包括：水稻OsHIR3基因构建到植物双元表达载体中，通过电击导入农杆菌菌株；通过水稻成熟胚诱导法获得过表达OsHIR3的转基因水稻。这样的植物具有基础抗病毒或者细菌病害的能力，主要是提高了植物体内SA的水平。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域及植物病害防治领域，尤其涉及植物OsHIR3s基因在植物基础抗性中的应用领域。
背景技术
水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)能够引起水稻条纹叶枯病。灰飞虱(Lapdelphax striatellus,SBPH)是RSV传播的介体，经灰飞虱传播引起的水稻条纹叶枯病，是我国水稻生产中重要的病毒病害，对农业生产安全造成极大威胁。
过敏反应(HR)是植物阻止病原物侵染传播的一种防御机制，其主要特征是侵染周围局部细胞的快速死亡,通过诱导局部的过敏反应即封闭损伤位点以抵御病原菌的进一步侵染。过敏诱导反应基因(HIR)家族被认为是和HR紧密相关的，参与植物对病原物的抗性反应中。目前已鉴定HIR家族的许多成员与普通烟HR诱导蛋白NG1非常相似，NG1作为HR的激活子，能够诱导类HR的坏死斑。大麦快中子突变体植株上HvHIR3上调表达35倍，叶片表现出自发的HR，表明HIR基因能够诱导HR。随后，豆科植物、黄瓜、水稻和小麦中的HIRs被鉴定为与小孢子发育和细菌侵染反应相关。
之前的研究主要集中在HIR1，对其他HIRs研究较少。过表达水稻OsHIR1的转基因拟南芥表现出对丁香假单胞杆菌Pst.DC3000的抗性。目前尚不清楚HIR3s是否与其他HIR家族成员类似，能够诱导HR，参与植物对于病原菌的防御反应中。
寄主植物为适应外界环境刺激，有效减少生物和非生物胁迫对自身的伤害，在长期演化过程中，通过对逆境信号的感知、信号传导和诱发各种防御基因表达，形成了一系列复杂且精细的HR信号传导机制。Ca2+离子、活性氧、多种激素及其他信号分子在HR的信号传导过程中发挥重要功能。水杨酸(Salicylic acid,SA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)、乙烯(Ethylene,ETH)三类激素参与HR信号转导过程，在植物防御反应中的重要作用已获得广泛研究与应用。
就目前来讲，关于HIR的研究主要集中在HIR1上，对HIRs在植物抵御细菌和真菌病原体侵染的作用研究较多。关于其他HIRs的功能研究还不多，也不清楚HIRs是否参与植物抗病毒侵染的过程。这就有必要发现或者筛选一些其它与抗病有关的基因，从而利用这些基因来制造抗病的植物，从而获得抗病的植株，减少化学农药的危害。
发明内容
水稻作为水稻条纹病毒的自然寄主，其OsHIR3与实验寄主本氏烟NbHIR3s序列高度同源(氨基酸同源性达80％)。我们发现RSV侵染诱导了水稻OsHIR3上调表达。我们成功克隆到日本晴水稻(Oryza sativa L.spp.japonica.cv.Nipponbare)的OsHIR3基因，构建瞬时表达载体。经过水稻成熟胚诱导法将上述基因在水稻体内成功超表达，转OsHIR3基因水稻的种子发芽、植株幼苗生长、株高、结实情况与野生型日本晴水稻相比无明显差异。
利用带毒灰飞虱对野生型和转基因水稻植株进行平行饲毒处理，发现转OsHIR3基因水稻植株在RSV侵染后，症状减轻，植株矮化缓解，感病植株仅表现条纹表型，感病植株叶片上RSV RNAs显著减少。由此，我们认为OsHIR3赋予水稻对RSV的耐病性。
此外，转OsHIR3基因水稻植株接种水稻重要的细菌性病原黄单胞水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)，转OsHIR3基因水稻植株叶片全病斑长度明显短于野生型，说明转OsHIR3基因水稻植株增强对Xoo的抗性。综上，OsHIR3赋予水稻对RSV和Xoo的基础抗性。
因而，本发明将水稻OsHIR3植物体内超表达，并通过抗性鉴定获得耐RSV和Xoo的具有基础抗性的转基因水稻，这是首次将HIR3基因作为一种具有基础抗性的基因用于转基因耐病毒水稻创制。
本发明的第一个目的是提供水稻OsHIR3基因。
本发明的第二个目的是提供上述基因的用途。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下技术方案：
日本晴水稻(Oryza sativa L.spp.japonica.cv.Nipponbare)中存在6个HIR家族基因，序列分析表明，除了Os06g0136000属于HIR3家族，基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，其他均属于HIR1家族。上述基因序列是利用引物，以水稻cDNA为模版，通过普通PCR扩增而来。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下技术方案：
将上述OsHIR3构建到植物双元表达载体pCV1300，命名为pCV:OsHIR3，电击导入农杆菌菌株EHA105。通过水稻成熟胚诱导法获得过表达OsHIR3的转基因水稻。
对上述转基因植物进行RSV的接毒鉴定，获得耐受RSV的转基因水稻。
对上述转基因植物进行Xoo的接种鉴定，获得具基础抗性的转基因水稻。
本发明获取的转OsHIR3基因水稻，主要应用于植物RSV和Xoo侵染，减轻病毒及细菌病害的为害。本发明对培育具基础抗性的转基因植物具有重要的理论及实际意义，对植物病害防治其他领域也有指导作用。与通过其他抗病毒策略获得的抗性株系相比，本发明的最主要优势是OsHIR3基因是植物体本身存在的基因，相对于其他病毒来源的抗性基因或片断，具有明显的安全性；转OsHIR3基因水稻对病毒和细菌病害具有基础抗性，抗性更广。
附图说明
图1.1：含有OsHIR3基因的表达载体图谱
图1.2：插入质粒pCV-eGFP-N1载体图谱。
图2：转OsHIR3基因水稻的分子生物学检测
图3：转OsHIR3基因水稻的发育表型
图4：转OsHIR3基因水稻抗RSV分析
图5：转OsHIR3基因水稻抗Xoo分析
图6：OsHIR3介导的基础抗性的调控机理探究。
图7为OsHIR3基因序列图。
具体实施方式
需要说明的是，本实施方式仅仅以举例的方式来说明我们发现的基因的新的功能。通过对模式植物本氏烟上的验证了本发明的有效性，并不认为是对本发明的限制
实施例1：OsHIR3基因的克隆
本发明所转植物为日本晴水稻。
1.重组农杆菌的获得
1)OsHIR3基因的克隆
利用引物OsHIR3-ORF-f和OsHIR3-ORF-r，以日本晴水稻cDNA为模版，通过普通PCR扩增而来。上述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
克隆引物如下：
OsHIR3-ORF-f:5'-ATGGTGAGCGCCTTCTTCCTGCT-3'(SEQ ID NO：2)
OsHIR3-ORF-r:5'-TTACACGTTGCTGCAGGACGCTT-3'(SEQ ID NO：3)
Trizol方法抽提植物总RNA：为避免RNA降解，RNA抽提过程需佩戴口罩和手套。
1.取适量样品于含钢珠的进口2mL Eppendorf(EP)管中，经液氮速冻后迅速于碾磨仪上18rps(Revolutions Per Second，转/秒)震荡30s-1min，充分研磨后加入适量Trizol(1mL/100mg样品，以确保样品充分裂解)，剧烈振荡混匀，冰上放置5min(利于核酸蛋白质复合体的解离)。4℃，13,000rpm离心10min。
2.取上清于新的2mL EP管中，加入1/5体积氯仿，剧烈震荡30s，充分混匀，冰上静置2～3min。4℃，13,000rpm离心30min。
3.EP管最上层是含RNA的无色水相，中层白色层为蛋白相，底层为氯仿相。取上层水相转入新的2mL EP管中(动作尽量轻柔以避免吸取中间蛋白相)，重复步骤2。
4.抽取上层水相于新的1.5mL EP管中，加入等体积(约600μL)已预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，-70℃放置1h。取出置于冰上待其充分解冻后，4℃，13,000rpm离心30min。
5.弃上清，加入1mL已预冷的75％乙醇(RNase-free水配制)，洗涤沉淀(使沉淀充分悬浮起来，以确保洗涤干净彻底)。4℃，13,000rpm离心5min。
6.重复步骤5，彻底洗净残留盐份。
7.弃上清，空管4℃，13,000rpm离心2min，用移液枪小心吸去残留液体，室温晾干，待沉淀块由白色至透明，加适量RNase-free水溶解。
8.RNA浓度可通过紫外分光光度计测定，RNA质量也可以参照RNA的OD260/OD280、OD260/OD230比值。RNA样品置于-80℃备用。
cDNA由通过Trizol方法提取的总RNA反转而来，反转体系和条件如下：
首先在无RNA酶的微量EP管中加入前四种试剂，混匀，70℃变性5min；立即放入冰上，放置2min。再依次加入后面三种试剂，混匀后按以下条件在PCR仪中进行反转。
42℃，2h→72℃，10min
PCR扩增体系如下：
混匀后按以下条件进行PCR循环：
实施例子2：载体构建
利用引物OsHIR3-f和OsHIR3-r，以上述获得的OsHIR3基因全长为模版，与上述同样的条件下扩增获得含有相应酶切位点的OsHIR3序列，通过常规的酶切、连接连入双元表达载体pCV1300的多克隆位点。构建完成的载体图谱如图1.1所示，插入质粒载体如图1.2所示，具体讲，就是在载体GFP(荧光蛋白)的位置被目的基因OsHIR3所替换，最终形成完整的质粒载体。这样的质粒载体是本领域人员容易理解，任何质粒载体都是可以的，也是本领域的常用的手段。
引物如下(下划线TCTAGA和GGATCC分别表示Xba I和Bam HI酶切位点)：
OsHIR3-f:5'-tgcTCTAGAATGGTGAGCGCCTTCTTCCTGCT-3'(SEQ ID NO：4)
OsHIR3-r:5'-cgcGGATCCTTACACGTTGCTGCAGGACGCTT-3(SEQ ID NO：5)'
实施例子3：农杆菌转化、阳性克隆的鉴定与保存
通过电击法将阳性质粒转化农杆菌，具体步骤如下：
①将1μL抽纯质粒DNA(实施例子2获得的)加入到已解冻的农杆菌感受态EHA105(预先取出置于冰上解冻)中，轻轻吹打混匀，加至电击杯中；
②将上述电击杯放入电击槽中(电击仪电压为2.2kV)，按下电击按钮，听到滴声即可；
③抽取菌液至EP管中，加入900μL无抗性LB培养液，220rpm，28℃，振荡培养1h。
④抽取200μL培养好的菌液，均匀涂布在LB平板(含50μg/mL卡那霉素(Kan)和50μg/mL利福平(Rif))，28℃培养2d。
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素(Kan)和50μg/mL利福平(Rif)的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇培过夜，取1μL菌液进行PCR检测。检测引物为特异性引物OsHIR3-detec-f和载体引物NOS-r(引物结合方向的示意图如图2A所示)。取检测结果为阳性的菌液，混合30％甘油，置甘油管中，于-70℃超低温冰箱中保存。
检测引物如下：
OsHIR3-detec-f:5'-AAGGTGATGGGAGATTATGGTTAC-3'(SEQ ID NO：6)
NOS-r：5’-GATAATCATCGCAAGACCGG-3’(SEQ ID NO：7)
PCR检测体系如下：
混匀后按以下条件进行PCR循环：
实施例子4：水稻成熟胚诱导愈伤法获得转基因植株
1)菌液的准备
取-70℃保存的阳性转化菌株(实施例子3)，于含50μg/mL Kan和50μg/mL Rif的LB平板上划线，28℃培养至形成单菌落，挑取单菌落于含50μg/mL Kan、100μg/mL Rif的LB液体培养基中培养，28℃，220rpm振荡培养过夜；将菌液按1:100用新鲜的LB培养基稀释，继续震荡培养至OD600为1.0左右。
2)通过水稻成熟胚诱导愈伤法获得转基因植株，具体步骤如下：
1.消毒：
①取日本晴扬花两周左右(灌浆期)的幼穗，人工或者机械脱粒去壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，用无菌水冲洗种子，除去浮起的瘪粒；
②将种子放入无菌玻璃管中，用无菌水冲洗种子2～3次；
③加入70％酒精消毒1min，倒去酒精，用无菌水冲洗2～3次；
④加入30％次氯酸钠(NaClO，有效氯5.2％，含数滴吐温-20)溶液，静置浸泡30min；倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗2～3次，最后用无菌水浸泡种子，静置30～45min。
2.诱导培养：
将种子平铺于无菌滤纸上，吸干多余水分，按每皿5～10粒种子，置于成熟胚诱导培养基中；用封口膜塑封培养皿，置于28℃光照培养箱中培养约20d。
3.继代培养：
当种子长出淡黄色，致密呈球状的胚性愈伤后，在超净工作台中打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的完整胚性愈伤组织，置于继代培养基中，28℃光照培养箱中，继代培养1周(如不立即使用，可移至暗处，22℃继续培养1周)。
4.共培养：
①挑取农杆菌单克隆摇菌至菌液OD600为1.0左右；收集菌体，用AAM感菌液(含200μM As)重悬菌体，调整菌液浓度OD600约为0.1；
②挑取大小合适的愈伤组织，放入上述制备好的农杆菌悬浮液中，充分浸泡5min；取出愈伤组织于无菌滤纸上干燥0.5～1h；将愈伤组织平铺于共培养基上，25℃暗培养2～2.5d。
5.筛选培养：
①取出愈伤组织，用无菌水清洗，其间不停的振荡；用含500mg/L头孢拉定的无菌水清洗浸泡30min，清洗3次，将愈伤平铺于无菌滤纸上晾干2h；
②将晾干的愈伤转入选择培养基(含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的)上进行第一轮筛选，28℃光照培养箱中培养14d；
③挑取新生出抗性愈伤的初始愈伤置于新的选择培养基(含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的)中进行第二轮选择，28℃光照培养箱中，培养10d左右，直至长出颗粒性的抗性愈伤组织。
6.分化培养：
挑取颜色鲜黄的抗性愈伤组织，移至含有分化培养基的塑料广口瓶中(每瓶放置4-5颗)，置于恒温培养箱中，分化成苗(15～30d)。
7.生根壮苗与移栽：
待愈伤分化出的苗长至2～3cm左右，取出小苗，去除根部愈伤，移至生根培养基中，培养1～2周；向长势良好的苗中加入适量无菌水(当苗长至试管顶部，及时开盖)，炼苗3～7d；洗去根部培养基，将幼苗移栽入土，水面以不淹没小苗为宜，正常温室生长环境培育。
通过水稻成熟胚诱导愈伤法获得转OsHIR3基因水稻14株。
3)转基因植株的分子生物学检测
利用CTAB法提取上述转OsHIR3基因水稻DNA，具体步骤如下：
①取适量植物材料放入2mL EP管中，经液氮快速研磨完全，加入500μL 2×CTAB，剧烈震荡；
②65℃水浴锅反应30min，每10min上下颠倒混匀一次；
③加入500mL氯仿，震荡混匀，室温12,000rpm离心10min，取上清至新的EP管中；
④重复步骤③一次；
⑤加入等体积的异丙醇和1/10体积的NaAc(3M,pH 5.2)，震荡混匀，-20℃放置15min；
⑥室温12,000rpm离心10min；
⑦弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤，室温12,000rpm离心5min；
⑧重复步骤⑦一次；
⑨弃上清，开盖室温放置15min以干燥沉淀，沉淀用40μL ddH2O溶解。
鉴于OsHIR3是水稻内源基因，所以选择特异性引物(OsHIR3-detec-f:5'-AAGGTGATGGGAGATTATGGTTAC-3'(SEQ ID NO：8))和载体引物(NOS-r:5’-GATAATCATCGCAAGACCGG-3’(SEQ ID NO：9))对其进行PCR检测，结果表明，转OsHIR3基因水稻阳性植株12株，阴性植株2株，阳性率为86％(图2B)。
为了检测OsHIR3是否成功整合到基因组且高表达，我们提取了阳性株系T2代植株的叶片总蛋白和总RNA，对其进行Western blot和qRT-PCR检测，结果表明，阳性植株中OsHIR3表达量有所差异，其中转OsHIR3基因水稻株系OE6、OE8、OE12的OsHIR3蛋白水平和OsHIR3mRNA表达量显著高于野生型(图2C和图2D)。表型观察发现，T2代转OsHIR3基因水稻的种子发芽、植株幼苗生长、结实情况与野生型日本晴水稻相比无明显差异(图3)，说明，OsHIR3上调表达对水稻植株的生长发育情况未造成显著影响。
实施例子5：转OsHIR3基因水稻的RSV接种鉴定
本发明选取T2代阳性转OsHIR3基因水稻进行RSV接种鉴定。具体操作内容如下：
1)高带毒率灰飞虱的纯化与鉴定
用感染RSV水稻植株饲养灰飞虱群体5～7天(day,d)，以保证虫体能够充分获毒。然后单独捕捉5龄的雌虫到试管(试管中种植2～3株水稻幼苗供其取食)中进行单虫饲养。单虫饲养2～3周(待第二代幼虫长到2～3龄左右)，每管捕捉3只低龄幼虫进行单虫RT-PCR带毒率检测，然后将阳性虫系分别转移到大烧杯中进行扩大繁殖。对繁殖后代进行抽样检测，待带毒率稳定后将带毒灰飞虱汇总饲养。
2)转OsHIR3基因水稻接种RSV
选择转OsHIR3基因水稻T2代株系作为供试材料，野生型水稻(日本晴)作为对照，同时播种。无菌水处理，37℃恒温培养箱中进行浸种与催芽，每个株系选取20～40粒健康种子。2天左右，种子露白之后进行播种，每个株系分别种植在营养钵(10cm×10cm)中，温室环境中培养。
待水稻生长到3叶期，将其移至接虫笼中，按照每株3～5头的有效接虫量，将上述纯化过的高带毒(RSV)率灰飞虱2～4龄幼虫转入接虫笼，对野生株和转基因植株同时平行进行饲毒2～3d。接虫期间，确保接种的稻苗均匀获毒，每天赶虫两次。饲毒完成后，移除所有灰飞虱，稻苗在温室环境下缓解2～3d后，将植株移栽到大田，进行病害调查与分析。
3)转OsHIR3基因水稻的RSV接种鉴定
接种RSV 4～6d左右，水稻幼苗开始出现卷曲，接毒8～12d左右感病严重的幼苗开始死亡，接毒20d后发病严重的新生叶片出现明显病斑和卷曲，随后，一些发病严重的植株逐渐死亡，具有较强抗性能力的植株叶片出现病斑，有些会随着植株生长而逐渐隐症。
为分析OsHIR3超表达是否赋予水稻植株对RSV抗性，我们选取转OsHIR3基因水稻三个独立株系OE6、OE8、OE12的T2代幼苗进行抗RSV鉴定，每个株系种植30株，以野生型日本晴作为对照，做相同处理。将接毒完成后的水稻植株移栽大田后，继续观察并统计其死亡率。接毒20d后，死亡率统计结果显示，所检三个独立株系OE6、OE8、OE12死亡率均显著低于对照植株(图4A)。接毒30d后，转基因水稻植株生长情况明显好于对照植株。对照植株中，多数感病严重的植株已死亡；而所检三个转基因株系中，感病严重植株仅表现出长势弱小。存活的对照感病植株长势矮小，叶片严重卷曲；而存活的转基因水稻感病株系仅在叶片呈现出条纹表型(图4B)。
通过Northern blot分析了转OsHIR3基因水稻与野生型感病植株中RSV RNAs积累量，结果显示，所检三个转基因独立株系OE6、OE8、OE12感病植株叶片的RSV RNA3积累量均低于对照植株(图4C)。以上结果表明，OsHIR3过表达有效抑制RSV RNAs的积累，转OsHIR3基因水稻植株表现出对RSV耐病性。
实施例6：转OsHIR3基因水稻抗Xoo分析
1)Xoo接种
将白叶枯病菌菌株P10(Xoo)转接于协本哲氏液体培养基中，28℃摇床200r/min培养1d，收集菌体，用ddH2O配制成OD600约0.5。选择转OsHIR3基因水稻T2代株系作为供试材料，野生型水稻(日本晴)作为对照，同时播种，种植于温室。待水稻生长2个月左右(抽穗前)，采用人工剪叶接种法对水稻接种白叶枯病菌菌株P10，接种1～2周后，观察水稻叶片发病情况，测量不同水稻材料发病叶片的病斑长度，统计比较，评价水稻抗性.
2)全病斑长度测定
接种Xoo P10小种两周后，测量感染叶片的全病斑长度。统计结果显示，与野生型相比，转OsHIR3基因水稻三个独立株系OE6、OE8、OE12的病斑长度较短(图5A)。野生型日本晴的病斑长度为(10.5±0.6)cm；而转OsHIR3基因水稻三个独立株系OE6、OE8、OE12的病斑长度分别为(5.2±0.5)cm，(2.1±0.3)cm，(6.1±0.2)cm，统计结果显示，三个独立株系OE6、OE8、OE12与野生型相比两两存在显著差异(图5B)。以上结果表明，转OsHIR3基因水稻植株增强了对Xoo的耐病性。综上，OsHIR3介导的基础抗性不仅针对RSV，也靶向其他病原，如Xoo。
实施例7:NbHIR3s通过正向调控SA途径以获得基础抗性
经上述检测筛选出OsHIR3表达量较高的阳性植株，进行SA含量测定和SA途径关键基因实时荧光定量qRT-PCR分析。参照qRT-PCR说明书，具体操作如下：
将上述试剂依次加至RNase-free EP管中，充分混匀，按10μL/孔点样至384孔定量板中，覆上膜，瞬时离心，置于qRT-PCR仪中进行反应：95℃5min；进行40个循环：95℃20s→58℃20s→72℃20s；72℃10min。
实时荧光定量PCR分析所用特异性定量引物如下所示：
与野生型相比，转OsHIR3基因水稻的三个独立株系OE6、OE8、OE12叶片细胞中，SA含量显著增加(图6A)，SA途径关键基因PBZ1(又名NPR1)，PR1和PR5基因显著上调表达(图6B)。这充分说明，OsHIR3基因通过正向调控SA途径以获得基础抗性。
这是因为植物受病原菌侵染后，系统抗性导致远端未侵染部位产生对病原菌的抗性，这种诱导抗性称之为系统获得性抗性(Systemic Acquired Resistance,SAR)，该现象已在许多植物与病原物互作中得到证实。SAR的典型表现是限制病原菌生长以及抑制其症状发展。植物中，SA在SAR中的作用已有许多报道，主流观点认为，SA是SAR过程中一个重要的信号分子，SA的积累会激发SAR反应。病程相关蛋白(pathogenesis related protein,PR蛋白)的大量表达是SAR反应的重要标志，多种PR蛋白共同协调作用而非某一特定PR蛋白单独作用进而引起SAR反应。经过SA或阿司匹林处理的烟草体内，PR蛋白大量积累，并对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMW)侵染产生抗性；TMV侵染会诱导烟草内源SA含量急剧增加，且抗性品种的SA含量明显高于感病品种；sid1和sid2突变体植株，体内SA无法积累，无法启动SAR，对丁香假单胞菌表现出敏感性，进一步证明SA是SAR过程中关键的信号分子。
调控蛋白NPR1是SA介导的信号转导途径中的一个关键组分，NPR1可以诱导PR-1等抗性基因的表达，从而增强植物抗病性。病原物侵染时，NPR1基因表达受影响的突变体nim1，SA水平正常，但无法诱导SAR，表明NPR1作用于SA下游，是SAR信号转导途径中的一个关键调控因子。Despres等研究发现，NPR1能够与拟南芥富含亮氨酸(bZIP)转录因子的TGA家族成员发生互作，而npr1突变体则丧失了与TGA2的互作，说明NPR1介导的TGA2结合对防御基因的激活非常关键。诱导SAR时，NPR1通过与PR基因启动子区的转录因子的相互作用激活PR-1基因，表明NPR1活性与PR基因表达调控密切相关。研究发现，NPR1的四个点突变体阻断了SA信号，并丧失与TGA2和TGA3的互作，TGA2和TGA3能够结合拟南芥PR-1启动子的SA响应元件，研究通过TGA转录因子将NPR1与SA诱导PR-1基因表达联系起来。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 水稻OsHIR3基因的用途以及获得抗病水稻的方法
<130> 19-100070-00011864
<141> 2019-01-08
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 867
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgagcg ccttcttcct gctgtgcggg tgcgtggacc aggcgagcgt cgcggtggtg 60
gagaagtggg gccgcttcct ccgcctcgcc gagccgggcc tccacttctt caacccgttc 120
gccggcgagt tcgtcgccgg gacgctctcc acccgcgtcc agtcgctcga cgtccgcgtc 180
gagaccaaga ccaaggataa tgtctttgtt cagcttatct gcacaatcca atatcgggtt 240
gttaaggaac atgctgatga tgcattctat gagttgcaga atccccaaca gcaaattcag 300
gcctacgtct ttgatgtggt ccgagctata gttccgagaa tgaatcttga tgatcttttt 360
gagcaaaaga atgatgtggc gaaagctgta cttcaggagc tagaaaaggt gatgggagat 420
tatggttaca gcattgagca cattctcatg gttgacatca tccctgatgc tgctgtacgc 480
agagcaatga atgaaataaa tgcagcacaa aggcttcagc ttgcaagtgt ctacaaagga 540
gaggcggaga agattcttct ggtgaagaaa gcagaagcag aggcagaggc aaaacacctt 600
tccggtgtcg gcattgctag acagcggcag gcgataactg atggcctgag agagaacatc 660
ctgaacttct cgcactcggt ttcaggcacc tcagcaaaag aagtcatgga tctcatcatg 720
gtcacgcagt acttcgacac catcaaagaa cttggggatg gctcgaagaa caccacggtg 780
ttcatacctc atggcccagg ccatgtcagg gatatcagcg agcaaatccg gaatggtatg 840
atggaagcgt cctgcagcaa cgtgtaa 867
<210> 2
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA/RNA
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<212> DNA/RNA
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ggctaggaac gagacgttgg 20
Claims (10)
1.水稻OsHIR3基因在制备植物防御病毒或者细菌侵染危害上的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，所述的OsHIR3基因为SEQ ID NO：1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的用途，所述的病毒为RSV; 细菌为Xoo。
4.根据权利要求1所述的用途，所述的水稻OsHIR3基因来自日本晴水稻。
5.一种获得水稻转基因植物的方法，该方法包括： 水稻OsHIR3基因构建到植物双元表达载体中，通过电击导入农杆菌菌株；通过水稻成熟胚诱导法获得过表达OsHIR3的转基因水稻。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述的OsHIR3基因为SEQ ID NO：1所示的序列。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，双元表达载体包括如下结构：LB-35s PolyA -HPTII-35s启动子-Nos-目的基因-35s启动子-RB。
8.根据权利要求5所述的方法，所述获得的植物具有防御病毒侵染或者细菌的功能。
9.根据权利要求9所述的方法，所述的病毒为RSV; 细菌为Xoo。
10.根据权利要求2所述的用途, 其中，所述的OsHIR3基因通过上调PBZ1（又名NPR1），PR1和PR5而引起SA的上调，从而具有基础抗性的能力。
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