CN110012897A - 干细胞制剂及其在制备治疗骨关节炎的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及干细胞制剂及其在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。本发明提供的组合物，能够显著的提高脐带间充质干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细胞制剂，具有良好的修复骨关节炎导致的软骨损伤的作用，从而起到治疗骨关节炎的效果。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及干细胞制剂及其在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)一种严重影响软骨及周围组织的退行性关节疾病，随着人口老龄化的发展和普遍肥胖，近年来OA的发病情况持续加剧。目前，OA治疗方法包括药物干预和手术治疗，药物干预以对乙酰氨基酚、NSAIDs类药物、润滑剂及类固醇激素关节腔注射、软骨保护剂为主，手术治疗包括人工关节置换术及微骨折手术等，这些治疗方法的疗效有限，且不能阻止疾病的进展。因此，软骨损伤修复一直是临床研究中的棘手问题。
近年来，随着干细胞研究的深入以及生物工程技术的普遍应用，(干)细胞疗法为OA患者带来的希望，使用的细胞类型包括自体软骨细胞、自体骨髓间充质干细胞、自体/异体脂肪间充质干细胞以及脐带血间充质干细胞等。自体软骨细胞的增殖能力有限，并且取材受到OA患者严重程度的限制，受益患者有限。而通过自体骨髓/脂肪获得并扩增到足够数量的间充质干细胞，还存在对患者造成一定伤害、较长的等待时间、细胞产品难以标准化等问题。自体/异体骨髓及脂肪来源间充质干细胞的扩增能力优于自体软骨细胞，但与脐血/脐带来源的间充质干细胞相比，扩增能力仍然较弱。但目前用于治疗关节损伤的脐血来源的间充质干细胞药物已有报道，但是疗效较为有限，并且制剂的稳定性较差。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供干细胞制剂及其在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，该药物对骨关节炎导致的软骨损伤存在良好的修复效果，且稳定性良好。
本发明提供了一种组合物，其由10mg/mL～150mg/mL白蛋白、100nmol/L～10μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、10μg/mL～100μg/mL维生素C和1mg/mL～10mg/mL维生素E和溶媒组成；
所述溶媒由DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液组成。
本发明中，所述溶媒中DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为(5～10)：(35～50)：(35～50)。
一些实施例中，所述组合物由100mg/mL白蛋白、1μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、50μg/mL维生素C和5mg/mL维生素E和溶媒组成；
所述溶媒中DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为5：45：50。
一些实施例中，所述组合物由150mg/mL白蛋白、100mmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、100μg/mL维生素C和1mg/mL维生素E和溶媒组成；
所述溶媒中DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为10：35：50。
一些实施例中，所述组合物由10mg/mL白蛋白、10μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、10μg/mL维生素C和10mg/mL维生素E和溶媒组成；
所述溶媒中DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为5：50：35。
本发明所述的组合物作为细胞冻存液的应用。
本发明提供的组合物用于细胞冻存液，能够显著性的提高细胞的存活率。6个月内细胞存活率仍可达95.72％。
本发明还提供了一种细胞冻存的方法，其以勃脉力A重悬细胞后，细胞悬液与等体积的本发明所述组合物混合，而后于液氮中保存。
所述冻存的细胞冻存液中，包括：5mg/mL～75mg/mL白蛋白、50nmol/L～5μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、5μg/mL～50μg/mL维生素C和0.5mg/mL～5mg/mL维生素E和溶媒组成；冻存液的溶媒由DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液组成，其中DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为(5～10)：(130～145)：(35～50)。
冻存效果最佳的实施例中，所述冻存液由50mg/mL白蛋白、0.5μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、25μg/mL维生素C和2.5mg/mL维生素E和溶媒组成；冻存液的溶媒由DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为5：145：50组成。
本发明所述冻存适宜的细胞为脐带间充质干细胞。
本发明所述的组合物在制备干细胞制剂中的应用。
本发明所述的组合物用以制备干细胞制剂能够用于治疗骨关节炎。所述干细胞制剂可以为新鲜制备也可冻存后使用。研究表明，本发明提供的干细胞制剂冻存6个月后，仍有95.72％的细胞存活，用于具有良好的软骨修复能力。
本发明还提供了一种干细胞制剂，其包括：间充质干细胞和本发明所述的组合物。
本发明中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
本发明中，所述间充质干细胞的密度为2.5×106cells/mL～25×106cells/mL。所述干细胞制剂中还包括勃脉力A，其中勃脉力A与所述组合物的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述干细胞制剂由2.5×106cells/mL～25×106cells/mL间充质干细胞，5mg/mL～75mg/mL白蛋白、50nmol/L～5μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、5μg/mL～50μg/mL维生素C和0.5mg/mL～5mg/mL维生素E和溶媒组成；其溶媒由DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液组成，其中DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为(5～10)：(130～145)：(35～50)。
进行功效验证的实施例中，所述干细胞制剂由2.5×106cells/mL或25×106cells/mL间充质干细胞、50mg/mL白蛋白、0.5μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、25μg/mL维生素C和2.5mg/mL维生素E和溶媒组成；其溶媒由DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为5：145：50组成。
本发明所述的干细胞制剂在制备修复软骨损伤的药物中的应用。
本发明所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
本发明还提供了修复软骨损伤的方法，其为给予本发明所述的干细胞制剂。
本发明还提供了治疗骨关节炎的方法，其为给予本发明所述的干细胞制剂。
本发明提供的组合物，能够显著性的提高脐带间充质干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细胞制剂，能够具有良好的修复软骨损伤的作用，从而起到治疗骨关节炎的效果。
附图说明
图1示倒置显微镜观察的脐带间充质干细胞形态，其中：A为40倍镜下观察，B为100倍镜下观察；
图2示脐带间充质干细胞流式鉴定；
图3示脐带间充质干细胞诱导分化潜能检测；
图4示干细胞制剂对兔软骨损伤模型的修复效果；其中，A示左侧膝关节为模型对照组，右侧膝关节为假手术组；B示左侧膝关节为干细胞低剂量治疗组1；右侧膝关节为溶媒对照组；C示左侧膝关节为干细胞高剂量治疗组；右侧膝关节为溶媒对照组。
具体实施方式
本发明提供了干细胞制剂及其在制备治疗骨关节炎的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
脐带：是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其内含2条脐动脉、1条脐静脉。脐带间充质干细胞：在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织-华通氏胶,从华通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)。
其中，脐带间充质干细胞原代分离及培养包括：
1)在无菌环境下，用生理盐水清洗脐带组织去除多余血液，用镊子去除脐带组织的外膜及动静脉，得到的华通氏胶组织并剪碎至1mm3大小；
2)将剪碎后的组织块平铺至15cm培养皿中，待组织块固定于培养皿上后，加入20～30ml无血清培养基，并置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养；
3)每周换液2次，观察组织块周围细胞生长的情况，待待细胞汇合度长至80％～90％后进行消化处理传代培养。
脐带间充质干细胞的传代培养包括：
1)在无菌环境下，弃去培养皿中培养基，用生理盐水清洗2-3次；
2)加入3-5ml 0.05％胰蛋白酶消化1-2min，显微镜下观察消化情况，并用含血清的细胞培养基终止消化，收集细胞悬液至离心管中；
3)室温条件下，500g离心5min，离心后弃上清，加入3～5ml无血清培养基吹打混合均匀，取样计数；
4)根据计数结果，按照1×104/cm2～5×104/cm2细胞密度接种至新的培养皿中并加入无血清培养基，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养。
对上述获得的脐带间充质干细胞鉴定：
1)细胞形态鉴定
取培养的脐带间充质干细胞，倒置显微镜下观察结果如图1。如图1所示细胞形态、大小均一，折光性强，呈长梭形漩涡状排列，符合间充质干细胞特性。
2)细胞表面标志物检测
取培养的脐带间充质干细胞，采用流式细胞术检测MSCs的阳性marker(CD73、CD105、CD90)和阴性marker(CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR)的表达率，按照国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的阳性marker表达率≥95％，阴性marker≤2％的标准。对检测结果进行鉴定，CD73表达量为100.0％，CD90表达量为100.0％，CD105表达量为99.96％，CD11b表达量为0.06％，CD19表达量为0.46％，CD34表达量为0.06％，CD45表达量为0.6％，HLA-DR表达量为0.50％，符合间充质干细胞的鉴定要求(图2)。
3)细胞诱导分化潜能检测
取对数生长期的脐带间充质干细胞，分别采用成脂、成骨和成软骨诱导分化培养基诱导培养3-4周后进行分化潜能检测。用油红O对细胞进行成脂染色鉴定，和对照组相比，诱导的脐带间充质干细胞经染色后出现大小不一的小脂滴，说明脐带间充质干细胞具有成脂分化潜能；用茜素红染色液对细胞进行成骨染色鉴定，和对照组相比，诱导组细胞形成钙结节，被茜素红染成深红色，说明脐带间充质干细胞具有成骨分化潜能；用苏木精-伊红染色法对细胞进行成软骨染色鉴定，和对照组相比，诱导组的细胞外基质染色较深，说明脐带间充质干细胞具有成软骨分化潜能(3)。
脐带间充质干细胞培养至P3-P7代时，可用于本申请所述干细胞制剂的制备。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
按照表1配制组合物：
表1组合物配方
配制方法为：将人血白蛋白、勃脉力A注射液、临床级DMSO、葡萄糖注射液、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)、维生素C、维生素E混合制成组合物。
实施例2
分别取实施例1中各组的组合物，以及P5脐带间充质干细胞，配制干细胞制剂：
1)待脐带间充质干细胞汇合度长至80％-90％左右，弃去培养皿中培养基，用生理盐水清洗2-3次；
2)加入3-5ml 0.05％胰蛋白酶消化1-2min，显微镜下观察消化情况，并用含血清的细胞培养基终止消化，收集细胞悬液至离心管中；
3)室温条件下，500g离心5min，弃离心后上清，加入勃脉力A注射液吹打混合均匀，取样计数；
4)根据计数结果，采用勃脉力A注射液调整细胞密度为5×106cells/mL～50×106cells/mL；
5)分别向细胞悬液中缓慢加入等体积的各组组合物，混匀后分装至冻存管中，每管0.5-2ml，在冻存管上贴上标签并进行程序降温后，转移至液氮中储存。其中加入实验组1组合物的细胞悬液中，细胞的终密度为2.5×106cells/mL，加入实验组2组合物的细胞悬液中，细胞的终密度为15×106cells/mL，加入实验组3组合物的细胞悬液中，细胞的终密度为25×106cells/mL；加入对照组1组合物的细胞悬液中，细胞的终密度为15×106cells/mL，加入对照组2组合物的细胞悬液中，细胞的终密度为15×106cells/mL，加入对照组3组合物的细胞悬液中，细胞的终密度为15×106cells/mL。
实施例3
将实验组与对照组组合物制得的脐带间充质干细胞制剂分别在液氮下保存1个月、3个月、6个月后，采用37℃水浴锅复苏后用台盼蓝染色检测细胞活率。结果如表2：
表2细胞活率
| 实验组1 | 实验组2 | 实验组3 | 对照组1 | 对照组2 | 对照组3 | |
| 0个月 | 97.72±0.34 | 98.23±0.21 | 98.45±0.34 | 98.12±0.36 | 98.05±0.23 | 98.56±0.64 |
| 1个月 | 95.43±0.42 | 97.49±0.19 | 96.32±0.64 | 93.26±0.46 | 94.84±0.35 | 92.27±0.31 |
| 3个月 | 94.35±0.78 | 96.08±0.45 | 94.28±0.38 | 89.27±0.17 | 90.44±0.42 | 88.45±0.44 |
| 6个月 | 92.17±0.64 | 95.72±0.28 | 91.93±0.72 | 85.73±0.28 | 86.91±0.11 | 85.11±0.61 |
结果表明，实施例的细胞制剂在6个月内仍可以很好的保持细胞活率，而对比例中的细胞制剂在3个月后细胞活率已降至90％以下，说明本专利的制剂配方可以稳定的保持脐带间充质干细胞活率，各实施例的效果显著性优于各对比例(p<0.05)。其中，实验组2的细胞活率最高，与其他各组存在显著性差异(p<0.05)。
实施例4
利用骨关节炎动物疾病模型开展脐带间充质干细胞制剂疗效评估
1)新西兰兔软骨损伤(Cartilage injury,CI)模型制作
将兔子的后腿脱毛并用75％酒精消毒，从侧部环髌骨切入，将髌骨移到旁侧，然后将膝关节弯曲90°暴露内侧股骨髁的非负重区域。然后用尖头锥在远端股骨中央间节凹槽的前上端4mm处的位置标记，然后用钻头以次标，记为中心制作一个直径3mm深度1mm的软骨缺损。之后将髌骨复位。在清洗伤口后，用2-0vicryl可吸收缝合线修复关节腔，并用3-0丝光缝合线缝合皮肤，最后皮肤进行清洁并修整。
术后给予庆大霉素(2mg/kg)和头孢曲松(50mg/kg)混合剂，相隔24小时给药一次，持续五天。
手术后1周，对模型动物造模关节进行评估，选择造模关节无肿胀、无明显炎症反应并且基本生命体征正常的动物模型进行后续干细胞制剂疗效评估实验。
2)干细胞制剂对骨关节炎的疗效评估
利用实施例2所述组合物配制的干细胞制剂进行骨关节炎导致的兔软骨损伤模型的软骨修复实验，实验分为干细胞制剂低剂量组、干细胞制剂高剂量组和溶媒对照组和模型对照组。
结果显示(图4)：
干细胞制剂低剂量(2×106cells)组(n＝8)动物软骨修复率为62.5％(5/8)，
干细胞制剂高剂量(6×106cells)组(n＝8)动物软骨修复率为75％(6/8)，
溶媒对照组(n＝8)动物软骨修复率为12.5％(1/8)，
模型对照组(n＝8)软骨修复率为12.5％(1/8)。
各组软骨修复面积如表3：
表3软骨损伤面积(mm2)
其中，**示与治疗前相比存在显著性差异，p<0.01。
结果表明，本发明提供的脐带间充质干细胞制剂对软骨损伤具有良好的修复作用，其修复面积明显高于模型组及溶媒对照组(p<0.01)，且效果成剂量依赖关系。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种组合物，其由10mg/mL～150mg/mL白蛋白、100nmol/L～10μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、10μg/mL～100μg/mL维生素C和1mg/mL～10mg/mL维生素E和溶媒组成；
所述溶媒由DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述溶媒中DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为(5～10)：(35～50)：(35～50)。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，
其由100mg/mL白蛋白、1μmol/L垂体腺苷酸环化酶激活多肽、50μg/mL维生素C和5mg/mL维生素E和溶媒组成；
所述溶媒中DMSO、勃脉力A和5wt％的葡萄糖注射液的体积比为5：45：50。
4.权利要求1～3任一项所述的组合物作为细胞冻存液的应用。
5.权利要求1～3任一项所述的组合物在制备干细胞制剂中的应用。
6.一种干细胞制剂，其包括：间充质干细胞和权利要求1～3任一项所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；所述间充质干细胞的密度为2.5×106cells/mL～25×106cells/mL。
8.根据权利要求6～7任一项所述的干细胞制剂，其特征在于，还包括勃脉力A，其中勃脉力A与所述组合物的体积比为1：1。
9.权利要求6～8任一项所述的干细胞制剂在制备修复软骨损伤的药物中的应用。
10.权利要求6～8任一项所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
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