CN110117618A - 一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，属于基因标记技术领域，包括，收集1‑细胞期的曼氏无针乌贼受精卵；双酶切插入PGEM‑T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接；将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA；将所得Vasa 3’UTR mRNA注射于受精卵进行标记。本发明标记方法通过注射GFP融合Vasa基因合成的Vasa 3’UTR mRNA到早期受精卵，使GFP在PGCs中特异表达从而使得PGCs得到标记，能够对分离冷冻前的曼氏无针乌贼原始生殖细胞进行活体标记，准确度高，技术简便，周期短用途广。
Description
技术领域
本发明属于基因标记技术领域，具体涉及一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法。
背景技术
头足类属于软体动物，是海洋生态系统中的重要组成部分，同时对海洋生态平衡有着不可或缺的作用。乌贼属于软体动物门(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)，广泛分布在各个海域，在生物系统演化中占有重要的地位。其肉质鲜美可口，具有很好的营养价值，蛋白含量极高。除了可以食用以外，还有很高的药用价值，墨囊可以促进血液凝固并且具有抑菌功能，海螵蛸可以药用，耳石可用来分析物种的年龄和海洋环境的时空变化。另外，乌贼还是海洋生态系统中十分重要的生物因子，在生态系统的食物链中扮演着十分重要的角色，对维持海洋生态系的生态平衡起着非常重要的作用。近年来，乌贼作为重要的经济头足类在海洋生态系统中起着关键的作用。由于过度捕捞与环境变化，其资源量一度遭到极大破坏，其自然资源明显衰退，产量急剧下降，渔汛消失，临近濒危。自上个世纪80年代以来，得益于人工繁育和养成技术的突破，其资源量正处于逐步恢复中。
生殖细胞在胚胎发育早期便与体细胞分离，通过分化成两性配子将遗传信息传递给下一代，使物种代代繁衍、生生不息。原始生殖细胞PGCs是最早出现的生殖细胞，它在胚胎发育的早期形成。在原始性腺分化过程中PGCs分别分化为精原细胞和卵原细胞最终产生精子和卵子。因PGCs具有分化为两性配子的潜能，通过异体移植后能够产生供体的后代，因此，PGCs不仅是研究细胞分化及迁移的理想材料，而且通过对PGCs发生发育的研究，对于生殖发育基础理论、种质资源保存都具有深远的意义，由此PGCs已成为海洋生物繁殖领域生殖细胞操作的研究热点。然而目前海水鱼PGCs在胚胎发育过程中的位置和数量仍不清楚，极大的限制了PGCs冷冻保存技术的发展。胚胎整体原位杂交可以跟踪胚胎发育过程中PGCs的迁移就数量变动，但这一技术主要在淡水鱼中易去卵膜的鱼中应用，传统的胚胎整体原位杂交前取样及保存方式并不适用于海水鱼胚胎样品，同时步骤繁琐。因此，建立曼氏无针乌贼胚胎发育过程中PGCs的定位标记方法，揭示曼氏无针乌贼PGCs起源和迁移模式，为曼氏无针乌贼种质资源的保存、生殖调控机制及人工繁殖育种提供了必要的基础知识。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够对分离冷冻前的曼氏无针乌贼原始生殖细胞进行活体标记，准确度高，技术简便，周期短用途广的曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用Vasa基因为标记基因，包括，
收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵；
双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接；
将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA；
将所得Vasa 3’UTR mRNA注射于受精卵进行标记。
Vasa基因是一种母源效应基因并对生殖细胞的迁移和分化有着重要的作用，能调控蛋白质的翻译，通过mRNA调控其他蛋白质在胞质内定位以及和其他蛋白互作等等，因此Vasa被当做生殖系特异分子标记广泛应用于研究PGCs起源、迁移、分化等；Vasa 3’UTR能够维持嵌合体mRNA在PGCs中的稳定性，而且这个功能在进化中相对保守，本发明标记方法通过注射GFP融合Vasa基因合成的Vasa 3’UTR mRNA到早期受精卵当中，使GFP在胚胎的PGCs中特异表达从而使得PGCs得到标记，能够对分离冷冻前的曼氏无针乌贼原始生殖细胞进行活体标记，准确度高，为PGCs分离冷冻提供了基础，技术简便，周期短用途广。
作为优选，Vasa基因选自斑马鱼Vasa、罗非鱼Vasa、大菱鲆Vasa、鲤鱼Vasa或青鳉Vasa。
作为优选，Vasa 3’UTR片段扩增用引物为：
Vasa-F：5’-GCTGCTGATGTCTAATGCGATT-3’；
Vasa-R：5’-ATCAGCTATTTAATTATCGGAGATC-3’。
作为优选，Vasa 3’UTR片段扩增步骤为：
提取基因组总RNA，反转录合成cDNA，利用Vasa 3’UTR片段扩增用引物进行PCR扩增；其中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃70s，30个循环；最后72℃延伸10min。
更为优选，总RNA提取过程中在组织样品研磨后加入硫酸羟氯喹至1-2μM，然后在频率2-4kHz、强度12-15mW/cm2的超声波下进行超声波循环刺激后再离心。在上述超声波下的刺激下，发生在细胞边缘及周围液体的超声波旋涡能够改变膜通透性，在上述超声波下的刺激下，发生在细胞边缘及周围液体的超声波旋涡能够改变膜通透性，充分释放细胞内RNA；同时由于超声波产生的细胞膜表面电化学紊乱能够吸附硫酸羟氯喹在细胞膜表面，使得硫酸羟氯喹充分发挥抑制溶酶体活性的作用，保证RNA的完整性，提高扩增效果，最终提高标记方法的准确度。
作为优选，EGFP基因扩增用引物为：
EGFP-F：5’-TAGCTGACGTCGCCCCATGGTTAGC-3’；
EGFP-R：5’-TATGTCGCGGTTACTTGCACAGTCGTC-3’。
作为优选，EGFP基因扩增产物中引入Aat II和Sac II酶切位点。
作为优选，3’UTR mRNA注射前用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl。
作为优选，Vasa 3’UTR mRNA的体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在35-40℃、80-130rpm磁力搅拌过程中培养1.5-2.5h后，补加80-100μL 1M的MgCl2和15-22μL 0.3mM的核糖核酸酶Ⅲ，持续反应3.5-4.5h。MgCl2和核糖核酸酶Ⅲ在本发明磁力搅拌条件下能够很好地控制体外合成过程中的转录体系和酶切体系，使得体外转录生成的RNA产物5’端和3’就不会有额外增加的核苷酸，提高RNA的体外转录完成度和目的RNA量，便于分离和纯化，获得转录量高、纯度较高的目的Vasa 3’UTRmRNA，最终提高本发明标记方法的准确度。
作为优选，标记后的受精卵在胚胎培养液中于25-30℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明标记方法通过注射GFP融合Vasa基因合成的Vasa 3’UTR mRNA到早期受精卵当中，使GFP在胚胎的PGCs中特异表达从而使得PGCs得到标记，能够对分离冷冻前的曼氏无针乌贼原始生殖细胞进行活体标记，准确度高，为PGCs分离冷冻提供了基础，技术简便，周期短用途广；本发明方法能够提高RNA的体外转录完成度和目的RNA量，便于分离和纯化，获得转录量高、纯度较高的目的Vasa 3’UTR mRNA，最终提高本发明标记方法的准确度。
本发明采用了上述技术方案提供一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1为实施例4中Vasa 3’UTR mRNA的体外合成所得目的RNA量占转录所得总RNA量的百分比的结果。
具体实施方式
下面，结合具体实施例对本发明一实施方式的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法作进一步说明。
实施例1：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用大菱鲆Vasa基因为标记基因，包括，
1)收集受精卵：
将曼氏无针乌贼在饲养水温为26℃，光照周期为14h(光照)：10h(黑暗)的条件下使用，傍晚时将雌雄曼氏无针乌贼分开，第二天清晨将雄性和雌性按照1:1比例混合，待产卵完毕收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵；
2)提取大菱鲆基因组总RNA，反转录合成cDNA，利用Vasa 3’UTR片段扩增用引物进行PCR扩增；其中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃70s，30个循环；最后72℃延伸10min；
其中，提取大菱鲆基因组总RNA，反转录合成cDNA的步骤为：
A.取无RNA酶的2ml EP管，用的枪头加入500ul Trizol，用酒精泡过的镊子夹取组织样品溶于Trizol液体中，电动匀浆器研磨直到组织完全溶解于液体中，补满Trizol到1mL，加入硫酸羟氯喹至1-2μM，然后在频率2-4kHz、强度12-15mW/cm2的超声波下进行超声波循环刺激，4℃，12000rpm，10min离心；在上述超声波下的刺激下，发生在细胞边缘及周围液体的超声波旋涡能够改变膜通透性，在上述超声波下的刺激下，发生在细胞边缘及周围液体的超声波旋涡能够改变膜通透性，充分释放细胞内RNA；同时由于超声波产生的细胞膜表面电化学紊乱能够吸附硫酸羟氯喹在细胞膜表面，使得硫酸羟氯喹充分发挥抑制溶酶体活性的作用，保证RNA的完整性，提高扩增效果，最终提高标记方法的准确度；
取上清液放进1.5mL EP管中，不能吸到杂质；
加入200ul的氯仿，剧烈震荡，室温静置5分钟，4℃，12000rpm，15min离心；
取三层中的最上层液体到新的1.5mL EP管中，加入500ul异丙醇，室温10min或-20℃过夜；
4℃，12000rpm，10min离心，除去上清液，看到白色片状物即RNA；
加入1mL的75％的乙醇，吹吸混匀，静置5min；
4℃，7500rpm，5min离心，除去上清液，通风橱干燥10min；
加入20ul DEPC水，4℃过夜或-20℃保存；
RNA质量的检验：溶解于DEPC处理水的RNA利用核酸蛋白检测仪测定其在260nm以及280nm处的吸收波长，根据有关资料，260/280值在1.8～2.0之间显示所提取的RNA质量较纯，含有的杂蛋白以及多糖类物质含量较少，低于此范围的RNA不建议使用，高于2.0则说明所提取的RNA有较多降解，不适合下一步扩增基因全长cDNA实验用。测定完成后，取2～3ml上样于1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件设定为135V和150mA，电泳15min，在凝胶成像分析仪中观察RNA电泳条带，提取质量较好的RNA能够观察到明显的28S和18S条带，亮度之比为2:1；
B.cDNA合成：
使用M-MLV反转录试剂盒，具体操作步骤如下：
0.2ml离心管中加入以下反应体系：
总RNA 5.0ul
Oligo DT 1.0ul
混匀后离心，并置于PCR仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min结束。在上述反应体系中继续加入以下试剂：
混匀后离心，于PCR仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出冰浴15min，保存至-20℃备用，长期保存则放置于-80℃冰箱；
3)Vasa 3’UTR mRNA的体外构建：
A.设计引物扩增Vasa 3’UTR片段，插入PGEM-T easy载体，并验证正确插入方向；
B.设计引物扩增EGFP基因，并引入Aat II和Sac II酶切位点，双酶切扩增产物和步骤A得到的产物，连接；
C.用Sal I酶线性化步骤B得到的产物，并体外合成3’UTR mRNA：
体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在40℃、130rpm磁力搅拌过程中培养2.5h后，补加100μL 1M的MgCl2和22μL 0.3mM的核糖核酸酶Ⅲ，持续反应4.5h。MgCl2和核糖核酸酶Ⅲ在该磁力搅拌条件下能够很好地控制体外合成过程中的转录体系和酶切体系，使得体外转录生成的RNA产物5’端和3’就不会有额外增加的核苷酸，提高RNA的体外转录完成度和目的RNA量，便于分离和纯化，获得转录量高、纯度较高的目的Vasa 3’UTR mRNA，最终提高标记方法的准确度。
4)显微注射：
将所得Vasa 3’UTR mRNA用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl，注射于受精卵进行标记，同时标记后的受精卵在胚胎培养液中于27℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
Vasa基因是一种母源效应基因并对生殖细胞的迁移和分化有着重要的作用，能调控蛋白质的翻译，通过mRNA调控其他蛋白质在胞质内定位以及和其他蛋白互作等等，因此Vasa被当做生殖系特异分子标记广泛应用于研究PGCs起源、迁移、分化等；Vasa 3’UTR能够维持嵌合体mRNA在PGCs中的稳定性，而且这个功能在进化中相对保守，该标记方法通过注射GFP融合Vasa基因合成的Vasa 3’UTR mRNA到早期受精卵当中，使GFP在胚胎的PGCs中特异表达从而使得PGCs得到标记，能够对分离冷冻前的曼氏无针乌贼原始生殖细胞进行活体标记，准确度高，为PGCs分离冷冻提供了基础，技术简便，周期短用途广。
上述Vasa 3’UTR片段扩增用引物为：
Vasa-F：5’-GCTGCTGATGTCTAATGCGATT-3’；
Vasa-R：5’-ATCAGCTATTTAATTATCGGAGATC-3’。
上述EGFP基因扩增用引物为：
EGFP-F：5’-TAGCTGACGTCGCCCCATGGTTAGC-3’；
EGFP-R：5’-TATGTCGCGGTTACTTGCACAGTCGTC-3’。
上述EGFP基因扩增产物中引入Aat II和Sac II酶切位点。
上述3’UTR mRNA注射前用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl。
实施例2：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用大菱鲆Vasa基因为标记基因，包括，
1)收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵，具体步骤同实施例1；
2)双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接，具体步骤同实施例1；
3)将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA，其中体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在38℃、100rpm磁力搅拌过程中培养2.0h后，补加90μL 1M的MgCl2和20μL 0.3mM的核糖核酸酶Ⅲ，持续反应4.0h；
4)将所得Vasa 3’UTR mRNA用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl，注射于受精卵进行标记，同时标记后的受精卵在胚胎培养液中于27℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
实施例3：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用大菱鲆Vasa基因为标记基因，包括，
1)收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵，具体步骤同实施例1；
2)双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接，具体步骤同实施例1；
3)将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA，其中体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在35℃、80rpm磁力搅拌过程中培养1.5h后，补加80μL 1M的MgCl2和15μL 0.3mM的核糖核酸酶Ⅲ，持续反应3.5h；
4)将所得Vasa 3’UTR mRNA用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl，注射于受精卵进行标记，同时标记后的受精卵在胚胎培养液中于27℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
对比例1：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用大菱鲆Vasa基因为标记基因，包括，
1)收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵，具体步骤同实施例1；
2)双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接，具体步骤同实施例1；
3)将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA，其中体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在38℃、100rpm磁力搅拌下培养6.0h；
4)将所得Vasa 3’UTR mRNA用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl，注射于受精卵进行标记，同时标记后的受精卵在胚胎培养液中于27℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
对比例2：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用大菱鲆Vasa基因为标记基因，包括，
1)收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵，具体步骤同实施例1；
2)双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接，具体步骤同实施例1；
3)将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA，其中体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在38℃、100rpm磁力搅拌过程中培养2.0h后，补加90μL 1M的MgCl2，持续反应4.0h；
4)将所得Vasa 3’UTR mRNA用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl，注射于受精卵进行标记，同时标记后的受精卵在胚胎培养液中于27℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
对比例3：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用大菱鲆Vasa基因为标记基因，包括，
1)收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵，具体步骤同实施例1；
2)双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接，具体步骤同实施例1；
3)将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA，其中体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在38℃、100rpm磁力搅拌过程中培养2.0h后，补加20μL 0.3mM的核糖核酸酶Ⅲ，持续反应4.0h；
4)将所得Vasa 3’UTR mRNA用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl，注射于受精卵进行标记，同时标记后的受精卵在胚胎培养液中于27℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
实施例4：
测量实施例1、2、3和对比例1、2、3中Vasa 3’UTR mRNA的体外合成所得目的RNA量占转录所得总RNA量的百分比。
制备12％的聚丙烯酰胺凝胶(含7M/L的尿素)，使用Bio-rad小型垂直电泳槽，设置为功率20W，电泳时间15分钟；跑胶结束后转移至培养皿用EB染料染色后，静置15分钟，用Bio-rad仪器观察结果并拍摄照片，在相同背景下对所得条带的浓度预估，然后求得各条带浓度相对百分数，即通过对检测图的光密度分析，得到每个条带的相对数值，然后计算转录所得目的RNA量占转录所得总RNA量的百分比，绘制实施例1、2、3和对比例1、2、3对应目的RNA百分比的变化曲线，如图1所示。图1中1、2、3、4、5、6分别代表实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3，从图中可以看出：实施例1、实施例2和实施例3体外合成Vasa3’UTR mRNA中目的RNA量占转录所得总RNA量的百分比要高于对比例1、对比例2、对比例3，这说明MgCl2和核糖核酸酶Ⅲ需要和磁力搅拌条件相结合，才能获得转录量高、纯度较高的目的Vasa3’UTR mRNA，从而提高本发明标记方法的准确度。
实施例5：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用鲤鱼Vasa基因为标记基因，包括，
1)收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵，具体步骤同实施例1；
2)双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接，具体步骤同实施例1；
3)将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA，其中体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在38℃、100rpm磁力搅拌过程中培养2.0h后，补加90μL 1M的MgCl2和20μL 0.3mM的核糖核酸酶Ⅲ，持续反应4.0h；
4)将所得Vasa 3’UTR mRNA用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl，注射于受精卵进行标记，同时标记后的受精卵在胚胎培养液中于27℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
实施例6：
一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用罗非鱼Vasa基因为标记基因，包括，
1)收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵，具体步骤同实施例1；
2)双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa 3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接，具体步骤同实施例1；
3)将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa 3’UTR mRNA，其中体外合成采用RNA体外合成试剂盒进行；Vasa 3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在38℃、100rpm磁力搅拌过程中培养2.0h后，补加90μL 1M的MgCl2和20μL 0.3mM的核糖核酸酶Ⅲ，持续反应4.0h；
4)将所得Vasa 3’UTR mRNA用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl，注射于受精卵进行标记，同时标记后的受精卵在胚胎培养液中于27℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 沧州硕金生物科技有限公司
<120> 一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgctgatg tctaatgcga tt 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcagctatt taattatcgg agatc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagctgacgt cgccccatgg ttagc 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tatgtcgcgg ttacttgcac agtcgtc 27
Claims (10)
1.一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，采用Vasa基因为标记基因，其特征在于：包括，
收集1-细胞期的曼氏无针乌贼受精卵；
双酶切插入PGEM-T easy载体的扩增Vasa3’UTR片段产物和/或EGFP基因扩增产物，连接；
将连接所得产物用Sal I酶线性化处理，并体外合成Vasa3’UTR mRNA；
将所得Vasa3’UTR mRNA注射于受精卵进行标记。
2.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述Vasa基因选自斑马鱼Vasa基因、罗非鱼Vasa基因、大菱鲆Vasa基因、鲤鱼Vasa基因或青鳉Vasa基因。
3.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述Vasa3’UTR片段扩增用引物为：
Vasa-F：5’-GCTGCTGATGTCTAATGCGATT-3’；
Vasa-R：5’-ATCAGCTATTTAATTATCGGAGATC-3’。
4.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述Vasa3’UTR片段扩增步骤为：
提取基因组总RNA，反转录合成cDNA，进行PCR扩增；
所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃70s，30个循环；最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求4所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述总RNA提取过程中在组织样品研磨后加入硫酸羟氯喹至1-2μM，然后在频率2-4kHz、强度12-15mW/cm2的超声波下进行超声波循环刺激后再离心。
6.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述EGFP基因扩增用引物为：
EGFP-F：5’-TAGCTGACGTCGCCCCATGGTTAGC-3’；
EGFP-R：5’-TATGTCGCGGTTACTTGCACAGTCGTC-3’。
7.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述EGFP基因扩增产物中引入Aat II和Sac II酶切位点。
8.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述3’UTR mRNA注射前用DEPC水、0.02％酚红溶液稀释至100ng/μl。
9.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述Vasa3’UTR mRNA的体外合成的步骤为：在35-40℃、80-130rpm磁力搅拌过程中培养1.5-2.5h后，补加80-100μL1M的MgCl2和15-22μL 0.3mM的核糖核酸酶Ⅲ，持续反应3.5-4.5h。
10.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼原始生殖细胞的标记方法，其特征在于：所述标记后的受精卵在胚胎培养液中于25-30℃培养，在荧光显微镜下观察不同发育时期荧光蛋白表达情况。
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|---|---|---|---|---|
| CN110724744A (zh) * | 2019-09-16 | 2020-01-24 | 浙江海洋大学 | 一种雄性曼氏无针乌贼生殖系体细胞的标记方法 |
| CN120843594A (zh) * | 2025-07-01 | 2025-10-28 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 花鲈vasa 3'UTR在标记硬骨鱼原始生殖细胞中的应用 |
-
2019
- 2019-04-08 CN CN201910275880.6A patent/CN110117618A/zh not_active Withdrawn
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| CN120843594A (zh) * | 2025-07-01 | 2025-10-28 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 花鲈vasa 3'UTR在标记硬骨鱼原始生殖细胞中的应用 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20190813 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |