CN110384657A - 靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用 - Google Patents

靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110384657A
CN110384657A CN201910636099.7A CN201910636099A CN110384657A CN 110384657 A CN110384657 A CN 110384657A CN 201910636099 A CN201910636099 A CN 201910636099A CN 110384657 A CN110384657 A CN 110384657A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
targeting
microvesicle
microbubbles
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910636099.7A
Other languages
English (en)
Inventor
赵云
刘朝奇
姜矜君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Three Gorges University CTGU
Original Assignee
China Three Gorges University CTGU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Three Gorges University CTGU filed Critical China Three Gorges University CTGU
Priority to CN201910636099.7A priority Critical patent/CN110384657A/zh
Publication of CN110384657A publication Critical patent/CN110384657A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种超声联合靶向PD‑L1载miR‑34a微泡的制备方法，具体是将生物素化脂质微泡与链酶亲和素孵育，加入生物素化的PD‑L1抗体，经孵育后离心得到靶向PD‑L1微泡。将所得的靶向PD‑L1微泡和miR‑34a质粒室温下孵育，再用PBS冲洗，离心，除去未结合在微泡表面的miR‑34a质粒，得到靶向PD‑L1载miR‑34a微泡。本发明将靶向PD‑L1载miR‑34a微泡应用于制备抑制宫颈癌移植瘤的药物上，结果表明靶向PD‑L1载miR‑34a微泡具体更高的抑瘤效果，靶向PD‑L1载miR‑34a微泡的体积抑制率和体重抑制率分别为54.32%和60.14%。

Description

靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的 药物上的应用
技术领域
本发明涉及一种脂质微泡，具体为靶向PD-L1载miR-34a微泡，并将其应用于制备治疗宫颈癌。
背景技术
宫颈癌是全世界女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌高居妇科恶性肿瘤第二位，发病率高且逐渐趋于年轻化，严重危害女性健康。宫颈癌主要是由于人乳头瘤病毒(HPV) 感染造成，目前认为高危型HPV持续感染、机体的免疫功能下降及宫颈癌局部微环境之间的相互作用，促进宫颈癌的发生发展。当前治疗方法包括手术切除、放疗、化疗。手术是治疗宫颈癌的主要方法之一，虽然手术能暂时切除病灶，但肿瘤细胞具有很强的侵袭性和转移性，病灶并不能完全切除。辅助化疗在临床上被广泛用于术前和术后治疗，能够有效地降低肿瘤分期、减少宫旁浸润，为手术提供了良好的条件，但化疗的靶向性差，易产生耐药，全身毒副作用明显。宫颈癌是放射敏感性肿瘤，放疗对于中晚期患者和复发患者的效果是得到肯定的，但其严重的并发症给治疗带来极大的困难。因此探索宫颈癌的发病机制，寻找宫颈癌治疗的新靶点，对宫颈癌的早期诊断、治疗及预后评估具有重要的临床意义。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种靶向PD-L1载miR-34a微泡，并将其应用于制备抑制宫颈癌移植瘤的药物。进一步优选方案中，应用于制备抑制U14宫颈癌细胞的药物。
所述的靶向PD-L1载miR-34a微泡是通过薄膜水化法及机械震荡法制备的生物素化脂质微泡，具体步骤包括如下：
(1)二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺 (PEI-600)混于玻璃试管中，60℃水浴锅预热后，涡旋状态下充入氮气使混合液成膜于试管壁；
所述的二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比75-90:3-6:3-6:2-6。优选方案中，所述的二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000- 生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比85:5:5:5。
二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺均为美国Avanti公司购买.
(2)将步骤(1)中成膜后的玻璃管抽真空(抽真空3h以上，使液体充分挥发)后，加入Tris 缓冲液，水浴超声(使玻璃管壁上的薄膜充分溶解于Tris缓冲液中，液体澄清后停止水浴超声) 后置于西林瓶中密封，冲入C3F8气体，冷藏保存；
(3)将步骤(2)中冷藏后的西林瓶经振荡后得到白色乳状液体(一般震荡25-30s)；将该白色乳状液体移经离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)后弃去下层液体即为生物素化脂质微泡(下层液体为游离的脂质和杂质)；
(4)向步骤(3)中生物素化脂质微泡滴加链酶亲和素(美国Avanti公司购买)，在2-4℃、避光下恒温振荡孵育，得到微泡混悬液；
(5)将步骤(4)中的微泡混悬液离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)后，弃去下清液 (以除去游离的链酶亲和素)后，采用PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清(优选方案为重复PBS 缓冲液漂洗、离心、弃下清的步骤3次)，得到微泡；
(6)将生物素化的PD-L1抗体(美国eBioscience公司购买)加入步骤(5)的微泡中，在2-4℃、避光的恒温振荡孵育过夜后离心(在1000rpm的离心速度下离心3min)，弃下清液(以除去游离的生物素化PD-L1抗体)，加入PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清(优选方案为重复PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清的步骤3次)，即可得到靶向PD-L1微泡。
(7)将所得的靶向PD-L1微泡和miR-34a质粒室温下孵育，再用PBS冲洗，离心(在1000rpm 的离心速度下离心3min)，除去未结合在微泡表面的miR-34a质粒，得到靶向PD-L1载miR-34a 脂质微泡，即为靶向PD-L1载miR-34a微泡。
所得靶向微泡通过血球计数板计数，粒度仪测量粒径，显微镜下观察微泡形态；通过激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。
所述的链酶亲和素的加入量相对于生物素化脂质微泡的加入量过量；生物素化的PD-L1抗体的加入量相对于微泡的加入量过量；miR-34a质粒的加入量相对于靶向PD-L1微泡的加入量过量。
本发明将所制备得到的靶向PD-L1载miR-34a微泡在制备抑制宫颈癌移植瘤的药物上的应用。
所述的靶向PD-L1载miR-34a微泡在制备抑制U14宫颈癌细胞的药物上的应用。
所述的靶向PD-L1载miR-34a微泡的浓度为1×107-1.5×109个/ml。
将所得靶向PD-L1载miR-34a微泡与PD-L1高表达的Hela宫颈癌细胞共同孵育，经PBS反复洗涤后，光学显微镜下观察靶向PD-L1微泡在细胞水平上的靶向聚集性。将制备的靶向微泡和空微泡(未载入PD-L1抗体和miR-34a)尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，通过超声诊断仪观察微泡在小鼠移植瘤内的超声成像效果。
实施本申请的技术方案所采用的小鼠和细胞系的情况如下：
SPF级BALB/c小鼠，雌性，18g左右，由三峡大学动物实验中心提供，饲养于三峡大学动物实验中心无特定病原体屏障环境中，严格SPF级实验动物操作规程。U14宫颈癌细胞瘤株，由三峡大学肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室提供。
小鼠宫颈癌移植瘤的建立及分组处理
从荷U14宫颈癌细胞的小鼠腹腔内抽取腹水，调整细胞浓度约2×107/ml于小鼠右前腋皮下接种0.2ml，一周后形成约0.5cm皮下肿瘤结节。将成功建立的小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤模型，随机分为5组，每组10只：对照组、空微泡组、靶向微泡组。根据分组给予不同种类微泡制剂的注射，每两天经尾静脉注射(0.2ml/只)及超声辐照瘤体一次，辐照条件：频率1MHZ，功率 1W/cm2，占空比50％，辐照时间90s/只，其中对照组给予相同剂量的生理盐水处理，并于治疗前测量瘤体长径(a)短径(b)，按公式V＝1/2ab2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。治疗5次后处死部分小鼠，剥离瘤体，计算肿瘤体积及质量抑瘤率。剩余小鼠继续治疗，隔天每组取一只小鼠处死，取脾脏，分离脾细胞。
乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞免疫杀伤活性
本发明的试验数据采用SPSS18.0软件进行统计学分析，结果用(x±s)表示，P<0.05为差别具有统计学意义。
附图说明
图1为靶向PD-L1载miR-34a微泡光学显微镜图片。
图2为琼脂糖凝胶电泳图反映微泡载DNA的数量。
图3为靶向PD-L1载miR-34a微泡粒径图。
图4靶向PD-L1微泡激光共聚焦图像，其中A为PE标记(链霉亲和素)发射的红色荧光图像， B为FITC标记(抗鼠IgG)的图像，反映微泡上有PD-L1抗体，C为A和B图叠加。
图5细胞免疫荧光检测到高表达PD-L1的宫颈癌细胞，其中，A为PD-L1阳性；B为DAPI染色； C为A和B的叠加图。
图6为靶向PD-L1载miR-34a微泡与空微泡对宫颈癌细胞的寻靶作用，A为靶向PD-L1载miR-34a 微泡，B为空微泡。
图7为不同组处理对肿瘤生长的抑制作用。
图8为不同组处理诱导肿瘤细胞凋亡，其中，A.Control组；B.MB+US组；C.PD-L1+US组； D.miR-34a+US组；E.PD-L1+miR-34a+US组。
具体实施方式
实施例1
靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备及其特征
1)将二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素(DSPE-PEG2000-Biotin)、硬脂酸—聚乙酰亚胺(PEI-600)按摩尔比85:5:5:5混于玻璃试管中，轻轻摇晃，充分混匀，60℃水浴锅预热后，将玻璃试管放在涡旋振荡器上，用N2吹玻璃试管中的液体，边吹边涡旋，在玻璃管壁底部形成一层均质的薄膜。
2)将成膜后的玻璃管连接真空抽气机，抽真空3h，使液体充分挥发。
3)取出玻璃试管后，向其中加入5ml Tris缓冲液，放入超声清洗机中水浴5min，使玻璃管壁上的薄膜充分溶解于Tris缓冲液中，液体澄清后停止水浴超声。使用移液枪将其分装到5个西林瓶中并加盖密封。
4)分别向每个西林瓶中冲入C3F8气体，放入4℃冰箱保存。
5)将西林瓶固定在高速振荡仪上，调节振荡时间为30s，振荡后液体呈白色乳状液体；将液体移至离心管中，使用台式低速离心机1000rpm离心3min，离心后弃去下层液体即为普通生物素化脂质微泡，下层液体为游离的脂质和杂质。
6)取生物素化脂质微泡1ml于试管中，向其中缓慢滴加过量的PE标记链酶亲和素，在4℃、避光的恒温振荡器里孵育30min。
7)使用台式低速离心机将上述微泡混悬液以1000rpm离心3min，弃下清液以除去游离的链酶亲和素；加入PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清，如此重复3次。
8)将生物素化的PD-L1抗体加入上述微泡中，在4℃、避光的恒温振荡器里孵育过夜；使用台式低速离心机将孵育后的微泡混悬液以1000rpm离心3min，弃下清液以除去游离的生物素化PD-L1抗体；加入PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清，如此重复3次，制备出靶向PD-L1微泡。
9)将所得的靶向PD-L1微泡和miR-34a质粒室温下孵育，再用PBS冲洗，离心(在1000rpm 的离心速度下离心3min)，除去未结合在微泡表面的miR-34a质粒，得到靶向靶向PD-L1载 miR-34a脂质微泡，即为靶向PD-L1载miR-34a微泡。
靶向PD-L1联合miR-34a微泡的形态特征
本发明通过薄膜水化法和生物素-亲和素法制备出靶向PD-L1微泡，再通过静电吸附法制备出靶向PD-L1载miR-34a微泡，肉眼观察微泡呈白色乳状液体，在光学显微镜下观察(图1)微泡呈圆形，性状规则、粒径分布较均一，无凝聚成团的现象，分散性较好，符合实验要求。
靶向PD-L1载miR-34a微泡的一般性状
琼脂糖凝胶电泳结果显示，1μg质粒大约结合25μl微泡(图2)。使用血球计数板测得微泡浓度约为4.6x107个/ml；马尔文粒径仪测得微泡的平均粒径约为938.9±80nm(图3)。
激光共聚焦显微镜下观察靶向PD-L1微泡
在激光共聚焦显微镜观察下靶向微泡表面抗体的连接情况，在激光共聚焦显微镜下的同一视野，不同通道观察微泡表面的荧光染色情况，结果显示，PE标记的链酶亲和素与生物素化微泡结合后，可见到微泡周围发红色荧光，FITC标记的山羊抗小鼠荧光二抗与PD-L1抗体后在可见下微泡周围发绿色荧光，二者Merge后红色荧光与绿色荧光完全重合发黄色荧光，表明通过生物素-亲和素的方法成功的制备出靶向PD-L1载miR-34a微泡；而非靶向微泡组的荧光无特异性，非靶向微泡制备的原材料中不含有生物素，无法与链酶亲和素连接，因此制备的微泡不具有靶向性，在激光共聚焦显微镜下观察微泡周无特异性的激发荧光(图4)。
将所得的靶向PD-L1微泡和sPD1质粒(pcDNA3.1(-)-sPD1)室温下孵育，再用PBS冲洗，离心 (在1000rpm的离心速度下离心3min)，除去未结合在微泡表面的sPD1质粒，得到靶向PD-L1 载sPD1脂质微泡，即为靶向PD-L1载sPD1微泡。
检测宫颈癌细胞表面PD-L1的表达情况
通过细胞免疫荧光实验检测宫颈癌细胞表面是否表达PD-L1，如图5所示，红色荧光为PE 标记的PD-L1抗体，蓝色荧光为DAPI染细胞核，结果显示宫颈癌细胞周围发红色荧光，表明宫颈癌细胞表面高表达PD-L1。
靶向PD-L1微泡与宫颈癌细胞的结合情况
在光学显微镜下观察靶向微泡和非靶向微泡对宫颈癌细胞的粘附效果，结果显示(图6)大量靶向PD-L1微泡呈环形围绕在宫颈癌细胞周围，而非靶向微泡在宫颈癌细胞周围没有粘附，证实靶向微泡具有良好的靶向性和寻靶能力。
细胞基因转染实验
实施例2
靶向PD-L1载miR-34a微泡作为制备抑制宫颈癌的药物上的应用
不同治疗组对小鼠皮下移植瘤抑制作用的比较
U14细胞皮下接种于雌性Babl/c小鼠直至成瘤，小鼠生命体征良好，毛发顺滑，饮食活动正常，生命体征基本稳定。小鼠接种肿瘤细胞一周后在皮下均可触及小结节，质地较硬，表明动物模型建模成功。将建模成功的小鼠随机分组，每组6只。对照组和空微泡(MB)+超声辐射(US) 组小鼠，活动度较好，其余三个治疗组[靶向PD-L1、载sPD1基因、靶向PD-L1载sPD1微泡+ 超声辐射(US)]在每次治疗后，活动度稍减低。在治疗过程中，可见对照组和MB+US组小鼠肿瘤体积明显增大，前肢活动度稍减低，个别小鼠出现跛行，精神状况尚可，其余三组特别是 PD-L1+miR-34a+US组肿瘤增大不明显，体型相对消瘦。
治疗期间，小鼠体重逐渐增加，对照组和MB+US组小鼠肿瘤体积明显增大，治疗结束后剥离肿瘤组织后计算抑瘤率。结果显示，PD-L1+US、miR-34a+US、PD-L1+miR-34a+US三组的体积抑瘤率分别为35.38％、40.50％、54.32％，质量抑瘤率分别35.80％、42.43％、60.14％，与对照组相比较，三组治疗组均能抑制肿瘤体积(P<0.05)和质量(P<0.05)的增加，均对肿瘤细胞具有抑制作用，差异具有统计学意义；其中PD-L1+miR-34a+US组的抑制作用更为明显(P<0.01)，差异具有显著统计学意义；MB+US组与对照组相比较，体积抑瘤率和质量抑瘤率无明显差异。 PD-L1+miR-34a+US组与其他各组相比较，体积抑瘤率(P<0.05)和质量抑瘤率(P<0.05)增加，差异具有统计学意义。各组肿瘤组织的体积抑瘤率和质量抑瘤率见表1和图7(注：对照组和MB+US组肿瘤组织体积增长迅速，呈指数增长，与对照组比较，其余三治疗组体积增长较慢 (P<0.05)，以PD-L1+miR-34a+US组更为显著(P<0.01)。)
表1各组肿瘤体积抑瘤率和质量抑瘤率的比较
(注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与其它各组比较#P<0.05)
TUNEL染色
TUNEL染色检测各组凋亡细胞的表达(图8)，与对照组相比，PD-L1+US组和miR-34a+US 组中，凋亡细胞数目表达增多(P<0.05)，差异有统计学意义，以PD-L1+miR-34a+US组凋亡细胞数目增多的更为明显(P<0.01)，差异有显著统计学意义。表明PD-L1抗体和miR-34a均对肿瘤细胞具有一定的抑制作用，而PD-L1联合miR-34a能够协同促进肿瘤细胞发生凋亡。

Claims (7)

1.靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺混于玻璃试管中，50-60℃水浴锅预热后，涡旋状态下充入氮气使混合液成膜于试管壁；
（2）将步骤（1）中成膜后的玻璃管抽真空后，加入Tris缓冲液，水浴超声后置于西林瓶中密封，冲入C3F8气体，冷藏保存；
（3）将步骤（2）中冷藏后的西林瓶经振荡后得到白色乳状液体；将该白色乳状液体移经离心后弃去下层液体即为生物素化脂质微泡；
（4）向步骤（3）中生物素化脂质微泡中滴加链酶亲和素，在2-4 °C、避光下恒温振荡孵育，得到微泡混悬液；
（5）将步骤（4）中的微泡混悬液离心后，弃去下清液后，采用PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清，得到微泡；
（6）将生物素化的PD-L1抗体加入步骤（5）的微泡中，在2-4 °C、避光的恒温振荡孵育过夜后离心，弃下清液，加入PBS缓冲液漂洗、离心、弃下清，即可得到靶向PD-L1微泡；
（7）将步骤（6）所得的靶向PD-L1微泡和miR-34a质粒室温下孵育，再用 PBS冲洗，离心，除去未结合在微泡表面的miR-34a质粒，得到靶向PD-L1载miR-34a微泡。
2.根据权利要求1所述的靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法，其特征在于，二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比75-90:3-6:3-6:2-6。
3.根据权利要求2所述的靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法，其特征在于，二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素、硬脂酸—聚乙酰亚胺摩尔比85:5:5:5。
4.根据权利要求1所述的靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法，其特征在于，链酶亲和素的加入量相对于生物素化脂质微泡的加入量过量；生物素化的PD-L1抗体的加入量相对于微泡的加入量过量，miR-34a质粒的加入量相对于靶向PD-L1微泡的加入量过量。
5.根据权利要求1-4任一项所制备得到的靶向PD-L1载miR-34a微泡在制备抑制宫颈癌的药物上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的靶向PD-L1载miR-34a微泡在制备抑制U14宫颈癌细胞的药物上的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的靶向PD-L1载miR-34a微泡的浓度为1×107-1.5×109个/ml。
CN201910636099.7A 2019-07-15 2019-07-15 靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用 Pending CN110384657A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910636099.7A CN110384657A (zh) 2019-07-15 2019-07-15 靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910636099.7A CN110384657A (zh) 2019-07-15 2019-07-15 靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110384657A true CN110384657A (zh) 2019-10-29

Family

ID=68286504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910636099.7A Pending CN110384657A (zh) 2019-07-15 2019-07-15 靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110384657A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4008358A4 (en) * 2019-09-02 2022-09-07 IMGT Co, Ltd. IMMUNE MICROBLADDER COMPLEX AND ITS USE

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1753912A (zh) * 2002-12-23 2006-03-29 惠氏公司 抗pd－1抗体及其用途
JP2018059865A (ja) * 2016-10-07 2018-04-12 株式会社特殊免疫研究所 微小胞マーカーによる抗ｃｄ２０抗体医薬品に対する薬物感受性の予測方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1753912A (zh) * 2002-12-23 2006-03-29 惠氏公司 抗pd－1抗体及其用途
JP2018059865A (ja) * 2016-10-07 2018-04-12 株式会社特殊免疫研究所 微小胞マーカーによる抗ｃｄ２０抗体医薬品に対する薬物感受性の予測方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU-E QIN: "Ultrasound-Mediated Co-Delivery of miR-34a and sPD-1 Complexed with Microbubbles for Synergistic Cancer Therapy", 《CANCER MANAGEMENT AND RESEARCH》 *
佚名: "《https://www.sohu.com/a/245830939_177233》", 8 August 2018 *
吴猛: "PD-L1 抗体纳米颗粒的制备及其肺癌靶向治疗作用", 《鲁东大学学报(自然科学版)》 *
秦琪: "PD-1/PD-L1信号通路及相关抗体在宫颈癌免疫治疗中的应用", 《生命的化学》 *
郑荣琴: "《超声造影新技术临床应用》", 30 June 2007, 广东科技出版社 *
马瑶: "超声介导载miR-34a脂质微泡对宫颈癌抑制作用的体内实验研究", 《实用医学杂志》 *
马瑶: "靶向PD-L1微泡对宫颈癌移植瘤抑制作用及靶向显影的实验研究", 《中国超声医学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4008358A4 (en) * 2019-09-02 2022-09-07 IMGT Co, Ltd. IMMUNE MICROBLADDER COMPLEX AND ITS USE

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jia et al. Highly penetrative liposome nanomedicine generated by a biomimetic strategy for enhanced cancer chemotherapy
JP2019507761A (ja) 併用療法によって固形腫瘍又はリンパ系腫瘍を処置する方法
US12551438B2 (en) Nanobowl-supported drug-loaded liposome, preparation method therefor and application thereof
US8168603B2 (en) G-quartet oligonucleotides that target hypoxia-inducible factor 1-α (HIF1α)
CN112641943A (zh) 一种载抗肿瘤药物的超声给药微泡复合物及其制备方法与应用
Wang et al. Precise Targeting Therapy of Orthotopic Gastric Carcinoma by siRNA and Chemotherapeutic Drug Codelivered in pH‐Sensitive Nano Platform
TW202023577A (zh) 奈米粒子及其製備方法與用途
Wu et al. Ultrasound-mediated mesoporous silica nanoparticles loaded with PDLIM5 siRNA inhibit gefitinib resistance in NSCLC cells by attenuating EMT
Ma et al. Ultrasound targeting of microbubble-bound anti PD-L1 mAb to enhance anti-tumor effect of cisplatin in cervical cancer xenografts treatment
Yuan et al. Thermal/ultrasound-triggered release of liposomes loaded with Ganoderma applanatum polysaccharide from microbubbles for enhanced tumour ablation
Zeng et al. Normalizing tumor blood vessels to improve chemotherapy and inhibit breast cancer metastasis by multifunctional nanoparticles
CN110384657A (zh) 靶向PD-L1载miR-34a微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用
Wang et al. TMTP1-modified polymeric micelles for the inhibition of ovarian cancer metastasis and recurrence through enhanced photothermal-immunotherapy
CN113456614A (zh) 一种基于plga的粒径可变型抗肿瘤仿生纳米制剂及其制备方法和应用
CN110339371B (zh) 靶向CD133载sPD1微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用
CN115920070B (zh) 多重细胞膜介导的仿生纳米/基因递送平台及其制备方法和靶向结肠癌的制药应用
CN109700799A (zh) 牛樟芝素及其微纳米颗粒在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用
CN116570562A (zh) 一种仿生脂质体杂合囊泡及其制备方法与应用
CN110585127A (zh) 靶向pd-l1微泡的制备方法及在制备抑制宫颈癌的药物上的应用
WO2022242762A1 (zh) 一种特定药脂比的药物组合物在抗肿瘤中的应用
CN110974844B (zh) 一种负载no的靶向微泡及其制备方法和应用
CN115317606B (zh) 一种增加实体瘤穿透性并具磁热敏感化免疫治疗功效的磁性纳米液滴及其制备方法和应用
CN109620976B (zh) 一种相变型纳米粒及其制备方法和应用
CN115990136B (zh) 一种抗肿瘤组合物、纳米制剂、制备方法和用途
CN106924748A (zh) 高穿透性肿瘤靶向脂质插件的构建及其促进细胞及细胞膜制剂向肿瘤聚集的作用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191029