CN110760446A - 一种卵囊藻培养工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种卵囊藻培养工艺，诱变产生具备耐高浓度醋酸钠特性的卵囊藻藻株，并针对性改进培养工艺，采用发酵罐培养工艺，改变培养基组分，最后进行光适应性培养，大幅缩短卵囊藻种液的培养周期，适用于扩种，且培养的藻株藻相稳定，不易老化及倒藻，并且卵藻种液适于长时间存储及运输。

Description

一种卵囊藻培养工艺

技术领域

本发明涉及水产养殖水质调控和水体环境治理技术领域，具体涉及一种卵囊藻培养工艺。

背景技术

卵囊藻主要分布于河口和水产养殖池塘等富含有机物的水体中，具有持续时间长和种群稳定等特点，能降低水体中的氨氮、亚硝酸盐等有害因子的浓度，提高水中的溶氧，从而使水环境处于良性的平衡状态，抑制弧菌的生长。因其特性，卵囊藻广泛存在于南方对虾养殖池，可调控和改善养殖环境并防止对虾疾病。

但传统的卵囊藻培养方式是采用开放水泥池培养，其培养规模大，但缺点是：(1)易污染，占地面积大，受天气影响大，不易掌控，而且藻细胞生长缓慢、倍增时间长、一次性投资大而产量低，不适用于扩种阶段；(2)传统方式所培育的卵囊藻藻相不够稳定，易老化和倒藻，其用于对虾等养殖池塘特别是养殖中后期时易发生倒藻现象，死亡的藻类会产生大量藻毒素，会出现池塘水质不稳定的现象，进而导致对虾等海产品的死亡；(3)传统方式所培育的卵囊藻难以在常温下进行长时间的存储和运输，给使用造成不便，这些导致卵囊藻难以在实际生产中得到大规模的应用，需改进。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种卵囊藻培养工艺，以至少解决上述一项问题。

技术方案是：

一种卵囊藻培养工艺，包括如下步骤：

a、诱变筛选出在至少10g/L NaAc浓度下培养基中生长的卵囊藻藻株；

b、接种至发酵罐中异养培养，培养基包括如下浓度成分：1.5-3g/L碳源、0.03-0.08g/L磷源、0.2-0.5g/L氮源、0.03-0.08g/L铁盐以及微量水溶型维生素，其中碳源为NaAc，罐中pH：7-8，发酵期间添加营养盐；

C、将发酵完成的藻进行通气光照培养。

在本公司大量的试验过程中发现诱变产生的耐高浓度醋酸钠的卵囊藻，适应性强，藻株藻相稳定，不易老化及倒藻，对此针对性改进培养工艺，采用发酵罐培养工艺，改变培养基组分，最后进行光适应性培养，大幅缩短卵囊藻种液的培养周期，适用于扩种，并且卵藻种液适于长时间存储及运输。

在进一步的优化方案中，a步骤中：通过紫外辐射诱变纯化的卵囊藻藻株，从而筛选出在10g/L NaAc浓度下培养基中生产的卵囊藻藻株。

更佳地，在10-12g/L NaAc浓度下培养基中接种卵囊藻，通过波长275～320nm的紫外线辐射诱变，时长25min-35min，优选30min。

优选采用UVB于15-20cm的高度辐射诱变，在本公司大量的试验中，通过上述方法能稳定诱变得到耐高浓度醋酸钠的卵囊藻藻株。

在进一步的优化方案中，b步骤中接种至发酵罐中的卵囊藻种子液浓度≥300*10⁴/mL，初始接种量5％-10％，有利于发酵培养。

如将上述所得藻株活化后接种入灭菌反应器中通气光照培养，光照强度500-1000Lx，通气量为0.2vvm,培养时间4d，使卵囊藻种液达到所需浓度，当然也可采用异养培养的方法，此外通气量可适应性调整。

在进一步的优化方案中，b步骤中：培养基组分中：碳源-NaAc、氮源-硝酸钾、磷源-磷酸二氢钾、铁盐-三氯化铁，维生素包括VB1：0.001-0.003g/L，VB12：0.0001-0.0002g/L，为缩短耐高浓度醋酸钠的卵囊藻藻株的培养周期，本培养基筛选优化组分，添加本培养基后，藻细胞生长快、倍增时间短。

在进一步的优化方案中，b步骤为流加发酵，流加营养盐的量为发酵藻液的25％-35％，更佳地，营养盐在卵藻接种后第二天添加。

在进一步的优化方案中，营养盐组分：醋酸钠150-300g/L、硝酸钾20-50g/L、磷酸二氢钾2-8g/L、三氯化铁3-8g/L、VB10.1-0.3/L、VB120.01-0.02/L。

当然氮源也可选用其他组分如铵态氮(硝酸铵)、硝酸钠等，磷源包括磷酸钙等，铁盐包括硫酸亚铁、EDTA铁盐等，维生素包括叶酸、维生素等。

在进一步的优化方案中，b步骤中：温度：25-28℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，缩短培养周期。

在进一步的优化方案中，c步骤中在光反应器中，通气量为0.2vvm。

更佳地，c步骤中光照强度1-3d，光照强度500-1000Lx。

在发酵罐中进行异养培养后，如直接投放在有氧环境中，卵囊藻易批量死亡，对此需进行适应性培养，如控制通气量使卵囊藻逐步适应有氧环境，，以及进一步控制光照强度进行光适应培养，最后完成卵囊藻种液的培养。

本发明的有益效果：1、按照本方法培养出的卵囊藻藻株藻相稳定，不易老化及倒藻；

2、本方法培养出的藻适应性强；

3、本方法培养出的种液适于长时间存储及运输；

4、本方法大幅缩短卵囊藻培养扩种时间。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详述，以使本发明技术方案更易于理解和掌握。

一、培养

实施例1

本实施例中，卵囊藻采用紫外辐射诱变方法，具体而言：

a、在湛水107-13培养基中添加醋酸钠直至浓度达10g/L，接种卵囊藻，稀释到10³-10⁴个细胞/mL，在超净台中，将藻液放置在20cm直径的大培养皿中，藻液厚度不超过0.5cm，用8W的UVB于15-20cm的高度，处理30min。

将处理后的藻液接种到含10g/LNaAc的固体湛水107-13平板中，筛选出正常生长的卵囊藻藻株。

然后将上述卵囊藻藻株活化，将上述所得藻株接种入灭菌反应器中通气光照培养，光照强度500-700Lx，通气量为0.2vvm，培养时间4d，至卵囊藻种子液浓度为300*10⁴/mL。

b、将上述培养的卵囊藻种液接种至100L发酵罐中异养培养，初始接种种子量5％，占培养基质量比，发酵罐中培养基包括如下浓度成分：1.5g/L醋酸钠、0.2g/L硝酸钾、0.03g/L磷酸二氢钾、0.03g/L三氯化铁、VB1：0.001g/L，VB12：0.0001g/L，流加发酵，接种后第二天流加营养盐，包括如下浓度成分：醋酸钠150g/L、硝酸钾20g/L、磷酸二氢钾2g/L、三氯化铁3g/L、VB1 0.1g/L、VB12 0.01g/L，整个流加营养盐的量约为发酵藻液的25％，发酵工艺参数：罐中pH：7-8，温度：25-26℃，罐压：0.03-0.04MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，培养时长100h，培养结束后藻细胞浓度为950*10⁴/mL。

C、将发酵完成的藻液加入光反应器中进行通气光照培养，通气量为0.2vvm，培养时长为1d，光照强度500-700Lx，培养结束后检测藻细胞浓度为980*10⁴/mL。

实施例2

本实施例中，卵囊藻采用实施例1所述的紫外辐射诱变方法，然后将310*10⁴/mL浓度的卵囊藻种子液接种至100L发酵罐中异养培养，初始接种种子量10％，占培养基质量比。

发酵罐中培养基包括如下浓度成分：3g/L醋酸钠、0.5g/L硝酸钾、0.08g/L磷酸二氢钾、0.08g/L三氯化铁、VB1：0.003g/L，VB12：0.0002g/L。

流加发酵，接种后第二天流加营养盐，包括如下浓度成分：醋酸钠300g/L、硝酸钾50g/L、磷酸二氢钾8g/L、三氯化铁8g/L、VB1 0.3g/L、VB12 0.02g/L，整个流加营养盐的量约为发酵藻液的30％。

发酵工艺参数：罐中pH：7-8，温度：25-28℃，罐压：0.06-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，培养时长100h后，藻细胞浓度为1300*10⁴/mL。

根据藻液的pH反馈控制流加培养基的用量，整个流加培养基的量约为发酵藻液的25％，培养结束时藻细胞浓度为1300*10⁴/mL。

C、将发酵完成的藻液加入干净的光反应器中进行通气光照培养，通气量为0.2vvm，光照强度3d，光照强度700-1000Lx，培养结束后检测藻细胞浓度为1300*10⁴/mL。

实施例3

本实施例中，卵囊藻采用实施例1所述的紫外辐射诱变方法，然后将350*10⁴/mL浓度的卵囊藻种子液接种至100L发酵罐中异养培养，初始接种种子量8％，占培养基质量比。

发酵罐中培养基包括如下浓度成分：2.2g/L醋酸钠、0.4g/L硝酸钾、0.05g/L磷酸二氢钾、0.06g/L三氯化铁、VB1：0.002g/L，VB12：0.00015g/L。

流加发酵，接种后第二天流加营养盐，包括如下浓度成分：醋酸钠220g/L、硝酸钾40g/L、磷酸二氢钾5g/L、三氯化铁6g/L、VB1-0.15g/L、VB12-0.015g/L，整个流加营养盐的量约为发酵藻液的35％。

发酵工艺参数：罐中pH：7-8，温度：25-28℃，罐压：0.06-0.07MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％，培养时长约100h后，藻细胞浓度为1250*10⁴/mL。

C、将发酵完成的藻液加入光反应器中进行通气光照培养，通气量为0.2vvm，光照强度2d，光照强度900-1000Lx，培养结束后检测藻细胞浓度为1250*10⁴/mL。

二、检测

将上述实施例制备的卵囊藻种液移至对虾养殖基地培养试验，试验方法如下：

试验1

为了充分展示该工艺生产的藻的优势，我们分别用开放式培养池进行了该卵囊藻的自养通气培养，培养基为湛水107-13，接种之前，培养池和培养用水都经过彻底消毒并中和。培养的接种量为养殖水体的5％。

在培养中，我们用显微镜和计数板对藻细胞的浓度进行测定，结果发现，在培养到15d时，藻细胞的浓度达到最高，为85*10⁴/mL。

我们将该自养的卵囊藻与上述实施例中发酵产生的卵囊藻在常温下的存放时间进行了对比，为了实验的对比性，我们将藻细胞浓度都调整到约1000*10⁴/mL，密封于1L的培养瓶，放置于弱光(小于300lx)、室温(20-25℃)环境中静置。分别于不同的存放时间时取样，测细胞浓度与活性，结果如下：

表1.不同来源的卵囊藻细胞储存中细胞浓度与活性变化

从培养时间和培养后藻细胞的浓度以及藻在储存中的活性变化可以看出，本发明发酵工艺生产的藻相对于目前已有的自养、开放池培养的藻具有明显的优势，适于长时间存储及运输。

试验2

分别用开放式培养池进行了该卵囊藻的自养通气培养，培养基为湛水107-13，接种之前，培养池和培养用水都经过彻底消毒并中和。培养的接种量为养殖水体的10％。

在培养中，我们用显微镜和计数板对藻细胞的浓度进行测定，结果发现，在培养到12d时，藻细胞的浓度达到最高，为105*10⁴/mL。

我们分别使用该发酵工艺生长的卵囊藻和开放池自养培养产生的卵囊藻用来调水。我们将藻细胞浓度都调整为1000*10⁴/mL。

我们选用了4个大小约为1亩的水泥池，其中两个经过消毒并中和，另外2个不经过消毒，其中有虾苗，将上述两种方式生产的卵囊藻10L分别接种于上述池子中，并在各池子中加入2公斤的尿素，0.5公斤的磷酸二氢钾，结果如下。

表2.不同来源的藻接入不同水体中出现黄绿水色的时间

虾池中出现黄绿水色代表虾池中含有多量绿色藻，因此从表2中可以看出：本发明发酵生产的藻与开放池生长的藻接种于消毒池和虾池中水色变化时间来看，该发酵工艺生产的卵囊藻相对于自养的藻具有较大的优势，存活性及适应性更强，并且在后续的观察中发现本发明发酵工艺生产的藻，藻相稳定，不易老化及倒藻。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，包括如下步骤：

a、诱变筛选出在至少10g/L NaAc浓度下培养基中生长的卵囊藻藻株；

b、接种至发酵罐中异养培养，培养基组分包括1.5-3g/L碳源、0.03-0.08g/L磷源、0.2-0.5g/L氮源、0.03-0.08g/L铁盐以及微量水溶型维生素，其中碳源为NaAc，罐中pH：7-8，发酵期间添加营养盐；

C、将发酵完成的藻进行通气光照培养。

2.根据权利要求1所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，a步骤中：通过紫外辐射诱变纯化的卵囊藻藻株，从而筛选出在至少10g/L NaAc浓度下培养基中生产的卵囊藻藻株。

3.根据权利要求2所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，在10-12g/L NaAc浓度下培养基中接种卵囊藻，通过波长275～320nm的紫外线辐射诱变，时长25min-35min。

4.根据权利要求1所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，b步骤中接种至发酵罐中的卵囊藻种子液浓度≥300*10⁴/mL，初始接种量5％-10％。

5.根据权利要求1所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，b步骤中：培养基组分中：碳源-NaAc、氮源-硝酸钾、磷源-磷酸二氢钾、铁盐-三氯化铁，维生素包括VB1：0.001-0.003g/L，VB12：0.0001-0.0002g/L。

6.根据权利要求1所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，b步骤为流加发酵，流加营养盐的量为发酵藻液的25％-35％。

7.根据权利要求6所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，营养盐组分：醋酸钠150-300g/L、硝酸钾20-50g/L、磷酸二氢钾2-8g/L、三氯化铁3-8g/L、VB1 0.1-0.3/L、VB120.01-0.02/L。

8.根据权利要求1所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，b步骤中：温度：25-28℃，罐压：0.03-0.08MPa，风量：1.0-2.0vvm，DO≥20％。

9.根据权利要求1所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，c步骤中在光反应器中，通气量为0.2vvm。

10.根据权利要求9所述的一种卵囊藻培养工艺，其特征在于，c步骤中光照强度1-3d，光照强度500-1000Lx。