CN110856446A

CN110856446A - 抗pd-l1抗体及其用途

Info

Publication number: CN110856446A
Application number: CN201880025898.4A
Authority: CN
Inventors: Y·拉夫罗夫斯基; 许婷; S·巴巴索夫; A·雷皮克; M·萨姆索诺夫; V·伊格纳提夫; S·阿库阿泽
Original assignee: Afam Overseas Co Ltd
Current assignee: Afam Overseas Co Ltd
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2020-02-28
Also published as: AU2018256392A1; KR102323960B1; AU2018256392B2; CL2019002953A1; PH12019502302A1; EP3612565A4; BR112019021828A2; MA50038A; MX2019012461A; EP3612565A1; BR112019021828B1; SG11201909041SA; WO2018195226A1; CO2019012118A2; JP2020517239A; EA201900443A1; MY199319A; KR20190141169A; JP2023025003A; US20210115143A1

Abstract

公开了完全人抗PD‑L1抗体及其相应的应用。完全人抗体能够与人PD‑L1特异性结合。通过采用基于酵母展示文库的筛选技术以及通过亲和力成熟以进一步提高其对PD‑L1的亲和力来获得抗体。公开的完全人抗PD‑L1抗体显示出良好的特异性、亲和力和稳定性。它们能够通过与活化的T细胞结合而增强T细胞活性，同时显著抑制肿瘤生长。公开的完全人抗PD‑L1抗体可用于诊断和治疗PD‑L1相关癌症和其他相关疾病。

Description

抗PD-L1抗体及其用途

领域

本公开涉及生物医学领域，并且涉及完全人抗PD-L1抗体及其药物用途。

背景

当T细胞对外源抗原作出反应时，它们需要抗原呈递细胞(APC)来向静息T淋巴细胞提供两个信号：第一个信号在T细胞借助TCR识别与MHC分子结合的抗原肽时产生，之后抗原识别信号通过TCR/CD3复合物传递；第二信号由一系列共刺激分子提供；这样，就可以正常激活T细胞，进而产生正常的免疫反应。根据第二信号产生的作用，这些共刺激分子可被分类为正共刺激分子或负共刺激分子，正负共刺激信号的调节以及所述信号之间的相对平衡在身体的整个免疫反应过程中起着重要的调节作用。

PD-1是CD28受体家族的成员，该家族还包括CTLA4、CD28、ICOS和BTLA。当添加单克隆抗体并观察到其增加T细胞增殖时，发现了该家族的最初成员CD28和ICOS(Hutloff等(1999)Nature 397:263-266；Hansen等(1980)Immunogenics 10:247-260)。PD-1的配体包括PD-L1和PD-L2，研究结果已表明，该受体与配体的结合下调T细胞活化和相关细胞因子的分泌(Freeman等(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等(2001)Nat Immunol 2:261-8；Carter等(2002)Eur J Immunol 32:634-43；Ohigashi等(2005)Clin Cancer Res 11:2947-53))。

PD-L1(B7-H1)是一种细胞表面糖蛋白，其属于B7家族，包括IgV样和IgC样区域、跨膜区域和细胞质尾部区域。相应的基因最早于1999年发现并被克隆(Dong H等(1999)NatMed 5:1365-1369)，该糖蛋白本身被确定为与T细胞受体PD-1相互作用并在免疫反应的负面调节中起重要作用。除了作用于T细胞上表达的PD-1外，PD-L1当在T细胞上表达时，还可与APC上的CD80相互作用以传递负信号，从而起着T细胞抑制剂的作用。除了在巨噬细胞谱系细胞上表达以外，PD-L1在正常人组织中也以低水平表达，但该糖蛋白在某些肿瘤细胞系(包括例如肺癌、卵巢癌、结肠癌和黑色素瘤)中表现出相对高的表达(Iwai等(2002)PNAS99:12293-7；Ohigashi等(2005)Clin Cancer Res 11:2947-53)。研究结果表明，PD-L1在肿瘤细胞中的表达增加会增加T细胞凋亡，从而在使肿瘤细胞逃避免疫反应中起重要作用。研究人员已发现，PD-L1基因转染的P815肿瘤细胞系可显示出对特定CTL裂解的体外抗性，并且当接种到小鼠体内时，所述细胞具有更高的致瘤性和侵袭性。这些生物特性可以通过阻断PD-L1来逆转。在PD-1敲除小鼠中，PD-L1/PD-1途径被阻断，并且接种的肿瘤细胞不能形成肿瘤(Dong H等(2002)Nat Med 8:793-800)。

仍然需要能够以高亲和力结合PD-L1并因此阻断PD-1与PD-L1结合的抗PD-L1抗体。

概述

在本发明的某些方面，结合筛选和亲和力成熟的酵母展示系统被用于获得显示出良好的特异性和相对高的亲和力和稳定性的完全人抗PD-L1抗体，从而完成本发明。

本发明的第一方面涉及抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其包括选自以下之一的一组CDR区：

(1)分别对应于SEQ ID NO:1-3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别对应于SEQID NO:4-6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列或者分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％或95％的同一性的序列；

(2)分别对应于SEQ ID NO:7-9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别对应于SEQID NO:10-12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列或者分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％或95％的同一性的序列；

(3)分别对应于SEQ ID NO:13-15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别对应于SEQ ID NO:16-18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列或者分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％或95％的同一性的序列；

(4)分别对应于SEQ ID NO:1、2和19的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别对应于SEQ ID NO:4-6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列或者分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％或95％的同一性的序列；

(5)分别对应于SEQ ID NO:7、20和9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别对应于SEQ ID NO:10-12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列或者分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％或95％的同一性的序列；

(6)分别对应于SEQ ID NO:13-15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及分别对应于SEQ ID NO:21、17和18的轻链CDR1，CDR2和CDR3序列的序列或者分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％或95％的同一性的序列。

由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分中的任一种也包括选自以下之一的一组重链可变区框架区：

1)分别对应于SEQ ID NO:22-25的FR1、FR2、FR3和FR4序列，或分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列；

2)分别对应于SEQ ID NO:30-33的FR1、FR2、FR3和FR4序列，或分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列；

3)分别对应于SEQ ID NO:38-41的FR1、FR2、FR3和FR4序列，或分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列；

4)分别对应于SEQ ID NO:30-33的FR1、FR2、FR3和FR4序列，或分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列。

由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体的任一种或相应的抗原结合部分也包括选自以下之一的一组轻链可变区框架区：

1)分别对应于SEQ ID NO:26-29的FR1、FR2、FR3和FR4序列，或分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列；

由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分中的任一种包括选自以下之一的一组重链可变区：

1)分别对应于SEQ ID NO:47、49、51、53或54的序列，或分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列。

由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分中的任一种包括选自以下的一组轻链可变区：

1)分别对应于SEQ ID NO:48、50、52、55或56的序列，或分别与前述序列之一具有大于70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列。

由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分中的任一种对应于完整抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。

在本发明的任何实例中，当本发明由scFv构成时，在上述抗PD-L1抗体或其抗原结合部分的重链与轻链可变区之间也包括连接肽。

在本发明的一些具体实例中，上述连接肽的序列是如SEQ ID NO:67所示。

由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分的任一实例对应于完整抗体。

由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分的任一实例，其中重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。

在本发明的某些实例中，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

在本发明的具体实例中，重链恒定区对应于IgG1。

在本发明的某些特定实例中，IgG1氨基酸序列是如SEQ ID NO:68所示的。

由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分中的任一种，其中所述轻链恒定区是κ区或λ区。

在本发明的某些具体实例中，κ轻链恒定区的氨基酸序列是如SEQ ID NO:70所示的。

在本发明的某些具体实例中，λ轻链恒定区的氨基酸序列是如SEQ ID NO:72所示的。

本发明的第二方面涉及包含编码抗体重链可变区的核酸序列的核酸分子，其中上述抗体重链可变区包括选自以下的一组氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO:1-3；

(ii)SEQ ID NO:7-9；

(iii)SEQ ID NO:13-15；

(iv)SEQ ID NO:1、2和19；

(iv)SEQ ID NO:7、20和9；

在由本发明第二方面构成的核酸分子的任一种中，其中上述抗体重链可变区包括选自以下的一组核酸序列：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54或通过对上述序列之一的框架区中包含的一个或几个氨基酸进行替换而产生的序列。

在本发明的一些实例中，前述核酸包含选自SEQ ID NO:57-61所示的那些序列。

在本发明的一些实例中，上述核酸还包含编码抗体重链恒定区的核酸序列，其中所述重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。

在本发明的一些实例中，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

在本发明的一个具体实例中，重链恒定区对应于IgG1。

在本发明的一个具体实例中，IgG1核酸序列是如SEQ ID NO:69所示的。

本发明的第三方面涉及含有能够编码抗体轻链可变区的核酸序列的核酸分子，其中上述抗体轻链可变区包括选自以下的一组氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO:4-6；

(ii)SEQ ID NO:10-12；

(iii)SEQ ID NO:16-18；

(iv)SEQ ID NO:21、17和18。

由本发明的第三方面构成的核酸分子的任一种，其中上述抗体轻链可变区包括选自以下的一组核酸序列：SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQID NO:56或通过对上述序列之一的框架区中包含的一个或几个氨基酸进行替换而产生的序列。

在本发明的一些方面，上述核酸包括选自SEQ ID NO:62-66所示的那些序列。

在本发明的一些方面，上述核酸还包含能够编码抗体轻链恒定区的核酸序列，其中所述轻链恒定区是κ区或λ区。

在本发明的一个具体方面，κ轻链恒定区的核酸序列是如SEQ ID NO:70所示的。

在本发明的一个具体方面，λ轻链恒定区的氨基酸序列是如SEQ ID NO:72所示的。

本发明的第四方面涉及包含由本发明的第二或第三方面构成的核酸的任一种的载体。

由本发明的第四方面构成的载体的任一种包含由本发明的第二方面构成的核酸的任一种和由本发明的第三方面构成的核酸的任一种。

本发明的第五方面涉及宿主细胞，其包含由本发明的第二或第三方面构成的核酸的任一种或由本发明的第四方面构成的载体的任一种。

本发明的第六方面涉及缀合物，其包含由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种以及其他生物活性物质，其中上述抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分直接地或通过连接片段与另一种生物活性物质缀合。

在本发明的一些方面，上述另外的生物活性物质选自能够直接或间接抑制细胞生长或杀伤细胞或以其它方式通过激活免疫反应而抑制或杀伤细胞的化学物质、毒素、多肽、酶、同位素、细胞因子或其他单独的生物活性物质或其混合物，诸如奥里斯他汀MMAE(Auristatin MMAE)、奥里斯他汀MMAF(Auristatin MMAF)、美登素DM1(Maytansine DM1)、美登素DM4(Maytansine DM4)、加利车霉素、倍癌霉素(duocarmycin)MGBA、多柔比星、蓖麻毒素、白喉毒素和其它相关毒素、I131、白细胞介素、肿瘤坏死因子、趋化因子、纳米颗粒等。

本发明的第七方面涉及组合物(诸如药物组合物)，其包含由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种、由本发明的第二或第三方面构成的核酸的任一种、由本发明的第四方面构成的载体的任一种、由本发明的第五方面构成的宿主细胞的任一种或由本发明的第六方面构成的缀合物的任一种以及任何药学上可接受的载体或赋形剂和任何一种或多种其他生物活性物质。

由本发明的第七方面构成的组合物的任一种(诸如药物组合物)，其中上述其他生物活性物质包括但不限于其他抗体、融合蛋白或药物(例如，抗癌药物，诸如化学疗法和放疗药物)。

本发明还涉及试剂或试剂盒，其包含由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种，其中上述检测试剂或试剂盒用于检测是否存在PD-L1蛋白或其衍生物。

本发明还涉及诊断试剂或试剂盒，其包含由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种，其中上述诊断试剂或试剂盒用于PD-L1相关疾病(例如，肿瘤或病毒感染，诸如显示高PD-L1表达的病毒感染或显示高PD-L1表达的肿瘤的情况)的体外(例如，细胞或组织)或体内(例如，人或模型动物)诊断。

在本发明的一些方面，上述抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分还与荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标记物等偶联，其可用于检测或可用单独的试剂检测。

在本发明的一些方面，上述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、神经胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫癌、骨肉瘤、甲状腺癌和前列腺癌。

在本发明的一些方面，上述病毒感染包括但不限于急性、亚急性或慢性HBV、HCV或HIV感染。

本发明还涉及这样的应用，其中由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种、由本发明的第二方面或第三方面构成的核酸的任一种、由本发明的第四方面构成的载体的任一种、由本发明的第五方面构成的宿主细胞的任一种、由本发明的第六方面构成的缀合物的任一种或由本发明的第七方面构成的组合物的任一种用于制备用于预防或治疗PD-L1相关疾病(例如，肿瘤或病毒感染，诸如显示高PD-L1表达的病毒感染或显示高PD-L1表达的肿瘤的情况)的药物。

在本发明的某些方面，上述肿瘤是指PD-L1相关肿瘤，诸如显示高水平PD-L1表达的肿瘤。

在本发明的特定方面，上述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、神经胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫癌、骨肉瘤、甲状腺癌和前列腺癌。

本发明还涉及其中由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种用于制备用于诊断PD-L1相关疾病(例如，肿瘤或病毒感染，诸如显示高PD-L1表达的病毒感染或显示高PD-L1表达的肿瘤的情况)的试剂或试剂盒的应用。

在本发明的一些方面，上述肿瘤是指PD-L1相关肿瘤，诸如显示高水平PD-L1表达的肿瘤。

本发明还涉及其中由本发明第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种用于制备用于预防或治疗CD80相关疾病的药物的应用。

在本发明的说明书中，如上提及的CD80相关疾病包括与高CD80表达相关的疾病。

本发明还涉及用于预防或治疗PD-L1相关疾病(例如，肿瘤或病毒感染，诸如显示高PD-L1表达的病毒感染或显示高PD-L1表达的肿瘤的情况)的方法，其中前述方法包括给予受试者有效预防或治疗剂量的由本发明第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种、由本发明的第二或第三方面构成的核酸的任一种、由本发明的第四方面构成的载体的任一种、由本发明的第五方面构成的宿主细胞的任一种、由本发明的第六方面构成的缀合物的任一种或由本发明的第七方面构成的组合物的任一种，与任选的放射治疗(例如X射线照射)的给予一起)。

在本发明的一些方面，上述肿瘤是指PD-L1相关肿瘤，例如显示高水平PD-L1表达的肿瘤。

本发明还涉及用于预防或治疗CD80相关疾病的方法，其中上述方法包括给予受试者有效的预防或治疗剂量的由本发明的第一方面构成的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分的任一种。

在本发明的上下文中，如上提及的CD80相关疾病包括与高CD80表达相关的疾病。

在下文中进一步描述本发明：

在本发明的上下文中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术术语应对应于本领域技术人员所理解的它们各自的通常含义。此外，本文中使用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学和免疫学相关术语以及实验室规程均对应于在其各自领域中广泛采用的术语和标准规程。然而，下面提供相关术语的定义和解释，以进一步阐明本发明。

在本发明的上下文中，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链组成(其中每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分为κ或λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且各自相应的抗体同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。对于轻链和重链，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，而重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链均由重链可变区(VH)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由三个结构域(C_H1、C_H2和C_H3)组成。每条轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。轻链恒定区由一个结构结构域(C_L)组成。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(C1q)。V_H和V_L区可以进一步细分为具有高可变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个V_H和V_L由3个CDR和4个FR组成，它们从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗体结合部位中的每一个结合部位。针对每个区域或结构结构域的氨基酸分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md(1987和1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917和Chothia等(1989)Nature 342:878-883给出的定义。就用于产生抗体的方法而言，术语“抗体”不受任何特定限制。例如，其特别地包括重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，包括例如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。

在本发明的上下文中，抗体的“抗原结合部分”是指沿抗体全长的一个或多个部分，其中所述部分保持与所述抗体所结合的相同抗原(例如，PD-L1)结合的能力，并与完整抗体竞争对给定抗原的特异性结合。通常参见Fundamental Immunology，第7章(Paul,W.，编辑，第2版，Raven Press,NY(1989)，出于所有目的其通过全文引用并入本文。抗原结合部分可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整抗体产生。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和类似多肽，其包括能够赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

在本发明的上下文中，术语“Fd片段”是指由V_H和C_H1结构结构域组成的抗体片段；术语“Fv片段”是指由抗体单臂的V_L和V_H结构结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”是指由V_H结构结构域组成的抗体片段(Ward等，Nature 341:544-546(1989))；术语“Fab片段”是指由V_L、V_H、C_L和C_H1结构结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')₂片段”是指包括两个Fab片段的抗体片段，所述两个Fab片段通过铰链区中的二硫键连接。

在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如，scFv)，其中通过使其产生为单条多肽链接头，V_L和V_H结构结构域通过配对形成单价分子(参见例如，Bird等，Science242:423-426(1988)和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。这样的scFv分子可具有以下一般结构：NH₂-V_L-连接体-V_H-COOH或NH₂-V_H-连接体-VL-COOH。合适的常规连接体(连接肽)由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的连接体，但也可使用变体(Holliger等(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他连接体描述于Alfthan等(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等(2001),Eur.J.Immunol.31:94-106,Hu等(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等(1999),J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等(2001),Cancer Immunol中。在本发明的一个方面，上述连接肽的序列是(GGGGS)₃。

在一些情况下，抗体由双特异性抗体构成，所述双特异性抗体能够分别结合两种不同类型的抗原或抗原表位，并且包括与第一抗原特异性结合的抗体的轻链和重链或其抗原结合部分，以及与第二抗原特异性结合的抗体的轻链和重链或其抗原结合部分。在本发明的一些方面，包括在上述双特异性抗体中的与第一抗原特异性结合的抗体的轻链和重链或其抗原结合部分可对应于由本发明构成的抗体或相应的抗原结合部分的任一种，并且包括在上述双特异性抗体中的与第二抗原特异性结合的抗体的轻链和重链或其抗原结合部分可对应于不同的抗PD-L1抗体或相应的抗原结合部分，或靶向不同的抗原的抗体或相应的抗原结合部分。

在一些情况下，抗体对应于双抗体，即二价抗体，其中V_H和V_L结构域在一条多肽链上表达，但使用的连接子太短，不允许同一条链上的两个结构结构域之间配对，从而迫使结构结构域与另一条链的互补结构结构域配对，从而产生两个抗原结合部位(参见，例如，Holliger P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)以及Poljak R.J.等，Structure 2:1121-1123(1994))。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学裂解)来从给定抗体(诸如单克隆抗体2E12)获得抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并使用与用于完整抗体的那些方法相同的方法选择性地筛选抗体的抗原结合部分。

在本发明的上下文中，上面提及的抗原结合部分包括单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、scFv-Fc二价分子、dAb和互补决定区(CDR)片段、Fab片段、Fd片段、Fab'片段以及Fv和F(ab')₂片段。

在本发明的上下文中，如上提及的IgG1重链恒定区包括同种异型，诸如G1m(f)、G1m(z)、G1m(z,a)和G1m(z,a,x)。在本发明的一些方面，上述IgG1重链恒定区对应于G1m(f)。

在本发明的上下文中，上述κ轻链恒定区包括各种同种异型，诸如Km1、Km1、2和Km3。在本发明的一些方面，上述κ轻链恒定区对应于Km3型区。

在本发明的上下文中，前述λ轻链恒定区包括各种同种异型，诸如λI、λII、λIII和λVI。在本发明的一些方面，上述λ轻链恒定区对应于λII型区。

还可通过常规的基因工程重组技术或化学合成方法获得本发明涉及的抗体核酸。一方面，本发明所涉及的抗体核酸的序列包括抗PD-L1抗体重链可变区或属于抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明所涉及的抗体核酸的序列还包括抗PD-L1抗体轻链可变区或属于抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明所涉及的抗体核酸的序列还包括属于重链和轻链可变区的CDR序列。互补决定区(CDR)是与抗原表位结合的部位，并且在本发明的上下文中，CDR序列通过IMGT/V-QUEST来验证(http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)。然而，通过不同的解析方法获得的CDR序列略有不同。

本发明的一个方面涉及编码抗体B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50重链和轻链可变区序列的核酸分子。编码抗体B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50重链可变区序列的核酸分子分别对应于SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:59。编码抗体B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50轻链可变区序列的核酸分子分别对应于SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66。本发明还涉及编码抗体B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50重链和轻链可变区序列的核酸分子的变体或类似物。

另一方面，本发明还涉及各种分离的核酸分子变体；具体而言，所述核酸变体的序列应显示与以下核酸序列有至少70％的相似性：SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66，其中相似性达到至少75％是优选的，相似性达到至少80％是更优选的，相似性达到至少85％是尤其更优选的，相似性至少达到90％是甚至尤其更优选的，相似性达到至少95％是最优选的。

本发明还涉及编码以氨基酸序列SEQ ID NO:47、49、51、53、54和51的形式存在的抗体B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50重链可变区序列的相应的分离的核酸分子。本发明还涉及编码以氨基酸序列SEQ ID NO:48、50、52、48、55和56的形式存在的抗体B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50轻链可变区序列的相应核酸分子。

本发明涉及含有上述核酸分子的重组表达载体，并且还涉及已用所述分子转化的宿主细胞。此外，本发明涉及用于在特定条件下培养包含上述核酸分子的宿主细胞，然后分离以获得本发明所述的抗体的方法。

抗体氨基酸序列

单克隆抗体mAb B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50重链和轻链可变区的氨基酸序列可源自相应的核酸序列。抗体mAb B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50重链可变区的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:47、49、51、53、54和51。抗体mAb B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50轻链可变区的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:48、50、52、48、55和56。

另一方面，本发明提供的抗体的重链可变区的氨基酸序列应显示与SEQ ID NO:47、49、51、53、54和51中给出的序列有至少70％相似性，其中相似性达到至少80％是优选的，相似性达到至少85％是更优选的，相似性达到至少90％是甚至更优选的，相似性达到至少95％是最优选的。

另一方面，本发明提供的抗体的轻链可变区的氨基酸序列应显示与SEQ ID NO:48、50、52、48、55和56中给出的序列有至少70％相似性，其中相似性达到至少80％是优选的，相似性达到至少85％是更优选的，相似性达到至少90％是甚至更优选的，相似性达到至少95％是最优选的。

抗体B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50的重链和轻链可变区的CDR氨基酸序列确定为如下：

抗体B60-55的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:1-3。抗体B60-55的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:4-6。

抗体BII61-62的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:7-9。抗体BII61-62的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:10-12。

抗体B50-6的重链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:13-15。抗体B50-6的轻链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:16-18。

另一方面，抗PD-L1抗体或其片段的重链的CDR中包含的氨基酸序列可以通过SEQID NO:1-3、7-9、13-15、19和20的一个或多个氨基酸突变、添加或缺失来获得。优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过三个。更优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过两个。最优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过一个。

另一方面，抗PD-L1抗体或其片段的轻链的CDR中包含的氨基酸序列可通过SEQ IDNO:4-6、10-12、16-18和21的一个或多个氨基酸突变、添加或缺失来获得。优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过三个。更优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过两个。最优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过一个。

抗体B60-55、BII61-62、B50-6、B60、BII61和B50的重链和轻链可变区的FR氨基酸序列确定为如下：

抗体B60-55和B60的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别对应于SEQ ID NO:22-25。轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别对应于SEQ ID NO:26-29。

抗体BII61-62的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别对应于SEQ ID NO:30-33。轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别对应于SEQ ID NO:34-37。

抗体B50-6和B50的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别对应于SEQ ID NO:38-41。轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别对应于SEQ ID NO:42-45。

抗体BII61的重链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别对应于SEQ ID NO:30-33。轻链可变区的FR1、FR2、FR3和FR4序列分别对应于SEQ ID NO:34、46、36、37。

另一方面，抗PD-L1抗体的重链可变区的FR中包含的氨基酸序列可通过SEQ IDNO:22-46的一个或多个氨基酸突变、添加或缺失来获得。优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过三个。更优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过两个。最优选地，经历突变、添加或缺失的氨基酸的数量不应超过一个。

在前述抗体、CDR或框架区中包含的氨基酸发生突变、添加或缺失后获得的变体仍应保持与人PD-L1特异性结合的能力。本发明还包括抗原结合部分的此类变体。

上述抗体的变体是抗体B60-55-1，其具有SEQ ID NO:85的完整重链和SEQ ID NO:87的完整轻链，重链C末端处的末端赖氨酸残基可失去。B60-55-1的重链可通过利用SEQ IDNO:86的核酸序列来表达。可将该核酸序列掺入表达载体中以进一步掺入表达细胞系中。B60-55-1的轻链可通过利用SEQ ID NO:88的核酸序列来表达。可将该核酸序列掺入表达载体中以进一步掺入表达细胞系中。

可通过添加药学上可接受的赋形剂或佐剂将B60-55-1抗体配制为药物组合物。该组合物可包含约275mM的丝氨酸，约10mM的组氨酸，并且具有约5.9的pH值。该组合物可包含约0.05％的聚山梨酸酯80，约1％的D-甘露糖醇，约120mM的L-脯氨酸，约100mM的L-丝氨酸，约10mM的L-组氨酸-HCl，并且具有约5.8的pH。

由本发明构成的单克隆抗体变体可通过常规基因工程方法获得。本领域技术人员完全知道采用核酸突变来修饰DNA分子的方法。另外，还可通过化学合成获得编码重链和轻链变体的核酸分子。

在本发明的上下文中，用于测定序列同一性和序列相似性百分数的算法的实例包括BLAST和BLAST 2.0，其分别描述于Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403410中。使用例如文献中给出的参数或默认参数，BLAST和BLAST 2.0可用于测定由本发明构成的氨基酸序列的百分比相似性。任何公众可通过国家生物技术信息中心获得能够执行BLAST分析的软件。

在本发明的上下文中，与如上所述的给定氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列包括与所述氨基酸序列基本相同的多肽序列，诸如当使用本文中概述的方法(例如，采用标准参数的BLAST分析)时被确定为与由本发明构成的多肽序列具有至少70％同一性的序列，其中显示出至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的序列是优选的。

在本发明的上下文中，术语“载体”是指一种类型的核酸递送媒介物，其包括编码某种蛋白质的多核苷酸并允许所述蛋白质被表达。在转化、转导或转染宿主细胞后，载体允许其所携带的一种或多种遗传物质组分在所述宿主细胞内表达。例如，载体包括：质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体(诸如X噬菌体或M13噬菌体)和动物病毒。用作载体的动物病毒的实例包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(诸如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可包含几种表达控制元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报道基因。此外，载体可包含复制起点。载体还可包括有助于进入细胞的组分，诸如病毒颗粒、脂质体或蛋白质外壳，但是所述组分不限于上述物质。

在本发明的上下文中，术语“宿主细胞”是指导入了载体的细胞，其包含许多不同的细胞类型，包括原核细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、真菌细胞诸如酵母细胞或曲霉菌属(Aspergillus)细胞、昆虫细胞(诸如果蝇S2细胞或Sf9)或动物细胞(诸如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NS0细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或其他人细胞)。

可通过完整抗体分子的水解(参见Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)和Brennan等，Science 229:81(1985))获得本发明构成的抗体片段。另外，这些抗体片段也可由重组宿主细胞直接产生(综述于Hudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little等，Immunol.Today,21:364-370(2000))。例如，Fab'片段可直接从大肠杆菌细胞获得或化学偶联以形成F(ab')₂片段(Carter等，Bio/Technology,10:163-167(1992))。作为另一个实例，可通过使用GCN4亮氨酸拉链连接获得F(ab')₂片段。另外，还可直接从重组宿主细胞培养基中分离Fv、Fab或F(ab')₂片段。本领域普通技术人员将完全了解用于产生抗体片段的其他技术。

在本发明的上下文中，术语“特异性结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，诸如抗体与相应抗原之间发生的反应。此处，与主要抗原结合的抗体对次要抗原的结合亲和力非常弱或无法检测。在某些方面，特异于给定抗原的抗体以小于<10^-5M(例如，10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M)的亲和力(KD)结合所述抗原，其中KD是指解离速率与结合速率的比率(koff/kon)，该量可通过本领域技术人员熟悉的方法测量。

在本发明的一些方面，由本发明构成的抗PD-L1抗体能够与人PD-L1特异性结合，同时也与鼠PD-L1结合，但不与PD-L2或B7H3结合。

在本发明的一些方面，由本发明构成的抗PD-L1抗体能够相对于hPD-1竞争性地结合hPD-L1。

在本发明的上下文中，PD-L1相关疾病包括例如与PD-L1相关的肿瘤和病毒感染，特别是与高水平PD-L1表达相关的肿瘤和病毒感染。

在本发明的上下文中，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub and D.R.Gren，编辑，Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其通过引用并入本文。

本发明的益处

本发明采用酵母展示技术结合筛选和亲和力成熟来获得显示出良好特异性和相对高的亲和力和稳定性的完全人抗PD-L1抗体，其中所述抗体能够与人PD-L1特异性结合或还同时与鼠PD-L1结合，但不与B7H3或PD-L2结合；并且所述抗体与活化的T细胞结合，以进一步增强T细胞的活化，并显著抑制肿瘤的生长。

附图简述

图1：纯化的抗hPD-L1 scFv对hPD-L1/hPD-1配体-受体结合的抑制。

X轴代表EGFP荧光强度，而Y轴代表SA-PE荧光强度。A-对应于空白对照，B-对应于阴性对照，C-对应于B50 scFv，D-对应于B60 scFv，以及E对应于BII61 scFv。

图2：显示亲和力成熟筛选后对hPD-L1酵母的亲和力增加的酵母

此处，X轴代表myc的荧光强度(myc阳性对应于表达完整抗体片段的酵母)，Y轴代表SA-APC的荧光强度，其表示抗原结合能力。

图3：亲和力成熟后获得的抗体与hPD-1竞争结合hPD-L1的能力比较

此处，横轴对应于抗体浓度(单位：ng/ml)，纵轴对应于OD值。

A)显示BII61-62与BII61的比较，B)显示B50与B50-6的比较，C)显示B60与B60-55的比较。

图4：抗hPD-L1抗体和hPD-L1结合能力的ELISA测量

此处，横轴对应于抗体浓度(单位：ng/ml)，纵轴对应于OD值。

图5：抗hPD-L1和hPD-1竞争性结合hPD-L1的竞争性ELISA测量

此处，横轴对应于抗体浓度(单位：ng/ml)，纵轴对应于OD值。

图#5对应于BII61-62 mAb，图#2对应于B50-6 mAb，并且图#3对应于B60-55 mAb。

图6：抗hPD-L1和CD80竞争性结合hPD-L1的竞争性ELISA测量

图7：抗hPD-L1抗体特异性的检测

此处，X轴代表EGFP荧光强度，Y轴代表相应抗体结合的荧光强度，A-对应于空白对照，B–对应于阴性对照，C–对应于BII61-62mAb，D-对应于B60-55 mAb，E-对应于B50-6 mAb；

(1)对应于hPD-L1-EGFP蛋白，(2)对应于hB7H3-EGFP，(3)对应于hPD-L2-EGFP蛋白；

图8：抗hPD-L1抗体和mPD-L1的结合能力。此处，X轴代表EGFP荧光强度，Y轴表示相应抗体结合的荧光强度，A-对应于空白对照，B-对应于阴性对照，C-对应于B60-55 mAb，D-对应于BII61-62mAb，E对应于B50-6 mAb；

(1)对应于hPD-L1-EGFP蛋白，(2)对应于mPD-L1-EGFP蛋白。

图9：抗hPD-L1抗体和食蟹猴PD-L1的结合能力

图10：抗hPD-L1抗体对CD4⁺T细胞的活化

图11：抗hPD-L1抗体B50-6对肿瘤生长的抑制活性

图12：抗hPD-L1抗体B60-55和BII61-62对肿瘤生长的抑制活性

此处，A-对应于当使用3mg/kg的剂量时，BII61-62 mAb和B60-55对肿瘤生长的抑制；B-对应于当使用不同剂量时，BII61-62mAb对肿瘤生长的抑制作用。

图13：B60-55和抗体2.41H90P的稳定性比较

此处，A-对应于B60-55和抗体2.41H90P随时间的IC50值；B-对应于抗体二聚体随时间的比例；C-对应于在B60-55加速稳定性测试中获得的竞争性ELISA结果。

图14：CaPure-HA上B60-55-1的色谱图；B60-55-1的保留时间约为45分钟。

图15：在TSKgel G3000SWXL(Tosoh)柱上对纯化的B60-55-1进行尺寸排阻色谱分析。

图16：纯化的B50-55-1的考马斯染色的SDS-PAGE分析：泳道1-在还原条件下，泳道2-在非还原条件下，泳道3-分子量标记。

图17：用于SPR测量的替代捕获方法：

图A-将抗人IgG作为捕获抗体固定在芯片上；通过固定的抗体捕获B60-55-1或阿妥珠单抗，并应用各种浓度的PD-L1-His配体。

图B–将PD-L1-Fc融合蛋白直接固定在传感器芯片上，并且应用了不同浓度的B60-55-1或阿妥珠单抗。

图C–为了研究与PD-L1-Fc融合蛋白和PD-L1-His两者的相互作用，将B60-55-1或阿妥珠单抗直接固定在芯片上；施加了一系列浓度的PD-L1-带His标签或PD-L1-Fc。

图18：PD-L1-带His标签配体与固定的比较物阿妥珠单抗或B60-55-1结合的传感图；该方法示意性地显示在左侧图中，动力学参数概括于表中。将抗人捕获抗体固定在传感器芯片上，并捕获阿妥珠单抗或B60-55-1，然后捕获各种浓度的PD-L1-His配体：

图A-阿妥珠单抗的结果；

图B-B60-55-1的结果。

图19：阿妥珠单抗或B60-55-1与固定的PD-L1-Fc融合蛋白结合的传感图；该方法示意性地显示在左侧图上，动力学参数概括于表中；将各种浓度的B60-55-1或阿妥珠单抗应用于芯片：

图A-阿妥珠单抗的结果；

图B-B60-55-1的结果。

图20：PD-L1-His或PD-L1-Fc与固定的B60-55-1结合的传感图；该方法示意性显示在左图中，并且动力学参数概括于表中。

图21：PD-L1-His或PD-L1-Fc与固定的阿妥珠单抗结合的传感图；该方法示意性地显示于左图中，动力学参数概括于表中。

图22：与来自Promega ADCC Reporter Bioassay试剂盒的对照抗体相比，B60-55-1和阿妥珠单抗没有ADCC活性。

图23：B60-55-1和阿妥珠单抗与C1q结合的评估。

图24：在MLR测定中，B60-55-1和比较物抗体对T细胞活化的浓度依赖性效力。

图25：药物治疗后的体重变化；箭头指示给药时间。

图26：药物治疗后的肿瘤体积抑制；箭头指示给药时间。

图27：在分组(n＝8)后29天的观察期间，三组中的个体肿瘤生长。

图28：给药后第29天的肿瘤重量抑制。

图29：来自下表7所示的实验设计的三个测试组中的平均肿瘤体积。

图30：来自第21和41天的下表7所示的实验设计的三个测试组中的平均肿瘤体积；每天的3个体积对应于组1(左)、组2(中心)和组3(右)。

发明详述

在以下部分中，通过以下实施例进一步说明本发明的方面。然而，如本领域的任何技术人员应该理解的，以下实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。以下实施例中未指定的任何条件都应设置为常规使用的条件或制造商推荐的条件。对于使用的其未指定制造商的任何试剂或仪器均对应于可商购的标准产品。

实施例1：重组人PD-L1和PD-1的表达以及相关EGFP细胞的制备。

基于蛋白质数据库Uniprot中包含的PD-L1的氨基酸序列(Q9NZQ7)(即，Q9NZQ7中包含的从残基1至残基238的序列)获得人PD-L1的细胞胞外结构域的氨基酸序列；基于蛋白质数据库Uniprot中包含的人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区的氨基酸序列(P01857)获得IgG1-Fc的结构结构域的氨基酸序列(即，P01857中包含的从残基104至残基330的序列)；以及基于蛋白质数据库Uniprot中包含的人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区的氨基酸序列(P01868)获得IgG1-Fc的结构结构域的氨基酸序列(即，P01868中包含的从残基98至残基324的序列)。使用在线工具DNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计相应的编码DNA序列以获得hPD-L1-Fc和hPD-L1-muFc融合蛋白基因，并且使用相同的方法获得hPD-1-Fc基因。基于蛋白质数据库Uniprot中包含的信息获得增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的氨基酸序列(C5MKY7)以及人PD-L1的氨基酸序列(Q9NZQ7)、鼠PD-L1的氨基酸序列(Q9EP73)和人PD-1的氨基酸序列(Q15116)。使用在线工具DNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计相应的编码DNA序列以获得PD-L1-EGFP融合蛋白基因，并使用相同的方法获得hPD-1-EGFP和mPD-L1-EGFP基因。通过人工合成获得了相应的DNA片段。合成的基因序列用Fermentas制造的HindIII和EcoRI双重消化，并克隆到商业载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen，V863-20)中，然后进行测序以验证质粒已被正确构建，获得重组质粒DNA；即：pcDNA4-hPD-L1-Fc、pcDNA4-hPD-L1-muFc、pcDNA4-hPD1-Fc、pcDNA4-hPD-L1-EGFP、pcDNA4-hPD1-EGFP和pcDNA4-mPD-L1-EGFP。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)用于从实验室培养的树突状细胞(DC细胞)(其中通过从PBMC分离的单个核细胞的TNF-α成熟获得所述DC细胞)中扩增人PD-L2和B7H3基因，并且所使用的基因扩增引物如下：

PDL2-F HindIII：GCGCAAGCTTGCCACCATGATCTTCCTCCTGCTAATG(SEQ ID NO:74)，

PDL2-R EcoI：

GCCGAATTCGATAGCACTGTTCACTTCCCTC(SEQ ID NO:75)；

hB7H3-F HindIII：GCGCAAGCTTGCCACCATGCTGCGTCGGCGGGGCAGC(SEQ ID NO:76)；

hB7H3-R BamHI：GCGCGAATTCGGCTATTTCTTGTCCATCATCTTC(SEQ ID NO:77)。

然后将获得的PCR产物用Fermentas HindIII和EcoRI双重消化，并克隆到预先构建的pcDNA4-hPD-L1-EGFP中，然后进行测序以验证质粒已被正确构建，获得重组质粒DNA；即：pcDNA4-hPD-L2-EGFP和pcDNA4-hB7H3-EGFP。

将相应的EGFP重组质粒转染至HEK293(ATCC,CRL-1573^TM)细胞中，并在转染后48小时进行荧光激活细胞分选(FACS)，以验证hPD-L1、mPD-L1、hPD-L2和hB7H3的表达。

将pcDNA4-hPD-L1-Fc、pcDNA4-hPD-L1-muFc和pcDNA4-hPD1-Fc瞬时转染至HEK293细胞中以产生蛋白质。将所述重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释，并添加到转化所需的PEI(聚乙烯亚胺)溶液中，然后将每种质粒/PEI混合物分别添加到细胞悬液中，并在37℃10％CO₂和90rpm下培养；同时，补充添加50μg/L胰岛素样生长因子(IGF-1)。此后四个小时，进行EX293培养基、2mM谷氨酰胺和50μg/L IGF-1的补充添加，并且以135rpm继续培养。再过24小时后，加入3.8mM丙戊酸钠(VPA)。培养5-6天后，收集瞬时表达培养物的上清液，并使用蛋白A亲和色谱法初步纯化并获得hPD-L1-Fc、hPD-L1-muFc和hPD-1-Fc蛋白样品用于下面的实施例。将如此获得的蛋白质样品进行使用SDS-PAGE的初步测试，目标条带清晰可见。

实施例2：在酵母展示文库中筛选抗hPD-L1抗体，克隆表达并鉴定。

将酵母展示技术用于筛选PD-L1的完全人抗体。克隆了从21名健康人受试者获得的脾脏和淋巴结的IgM和IgG cDNA中包含的VH和VL基因，以构建scFV酵母展示文库(VH与VL之间的连接序列是连接肽

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:67)

和连接肽)。该文库的存储容量为5x 10⁸。复苏10x容量的酵母文库，并诱导酵母在其表面表达抗体；使用100nM生物素化的hPD-L1抗原磁珠进行两轮富集，然后使用抗myc抗体和生物素化的hPD-L1流式分选进行另外两轮富集。将如此获得的酵母铺平板并挑选单个克隆。将使用抗myc抗体以及生物素化的hPD-L1或对照抗原hPD-1对经历扩增和表达诱导的单克隆酵母进一步进行染色分析，并将抗原阳性或对照阴性的酵母评估为阳性酵母。

使用以下PCR引物对FACS确认的酵母克隆进行酵母菌落PCR和测序：

pNL6-F：

GTACGAGCTAAAAGTACAGTG(SEQ ID NO:78)；

pNL6-R：

TAGATACCCATACGACGTTC(SEQ ID NO:79)；

其中使用的测序引物是pNL6-R。使用BioEdit软件包对测序后获得的序列结果进行比对分析。

使用Fermentas HindIII和EcoRI酶的双重消化，将如上所述获得的单链抗体scFv基因和先前获得的IgG1-Fc基因融合并克隆至商业载体pEE6.4(Lonza)中，然后按照标准分子克隆程序进行克隆和质粒微量制备。提取的质粒在HEK293细胞中瞬时表达，并使用蛋白A柱纯化。

将hPD-L1-EGFP细胞重悬于0.5％PBS-BSA缓冲液中，然后加入上述纯化的抗hPD-L1 scFv抗体，同时，以2μg hIgGI蛋白用作阴性对照以及将hPD-1-Fc加入阳性对照来建立相应的对照。使用的二抗是来自eBioscience的抗hIg-PE。染色完成后，通过流式细胞仪进行检测。将以上方法用于鉴定能够结合细胞表面PD-L1抗原的抗体。

将hPD-L1-EGFP细胞重悬于0.5％PBS-BSA缓冲液中，然后加入上述纯化的抗hPD-L1 scFv抗体，同时，以2μg hIgG1蛋白用作阴性对照，建立阴性对照；将0.3μg hPD-1-Fc-生物素添加到所有样品中，并将eBioscience的SA-PE用作二抗；染色完成后，通过流式细胞仪进行检测，结果示于图1中。将以上方法用于鉴定能够阻断细胞表面PD-L1抗原和PD-1结合的抗体。

在筛选和鉴定后，获得了三个显示出良好特征的抗体株：B50、B60和BII61。如从结果中可以看出的，所有三个抗hPD-L1抗体株均能够阻断与hPD-1受体的结合。

连接肽序列

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:67)

包含在上述抗体的重链可变区与轻链可变区之间。

B50重链可变区的氨基酸序列为：

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:51)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:13-15；未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:38-41；

相应的DNA序列为：

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA(SEQ ID NO:59)；

轻链可变区的氨基酸序列为：

QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL(SEQ ID NO:56)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:21、17和18，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:42-45；

相应的DNA序列为：

CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTGATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCAC CCAGCTGACCGTCCTC(SEQ ID NO:66)。

B60重链可变区的氨基酸序列为：

QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFSYGWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:53)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:1、2和19，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:22-25；

相应的DNA序列为：

CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAGCTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:60)；

轻链可变区的氨基酸序列为：

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:48)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:4-6，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:26-29；

并且相应的DNA序列为：

GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAA(SEQ ID NO:62).

BII61重链可变区的氨基酸序列为：

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVK SRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:54)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:7、2和9，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:30-33；

并且相应的DNA序列为：

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:61)；

轻链可变区的氨基酸序列为：

DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK(SEQ ID NO:55)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:10-12，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:34、46、36和37；

并且相应的DNA序列为：

GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATA TCAAA(SEQ ID NO:65)。

实施例3：抗hPD-L1 scFv改进的亲和力酵母文库的构建。

以pEE6.4-B50-Fc、pEE6.4-B60-Fc和pEE6.4-BII61-Fc质粒为模板并以以下序列为引物分别进行标准PCR反应：

pEE6.4-F：

TCTGGTGGTGGTGTGGTTCTGCTAGC(SEQ ID NO:80)和

cMyc-BBXhoI：GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG(SEQ ID NO:81)

纯化PCR产物并使用Fermentas NheI和BglII将其克隆至商业pCT302载体(addgene:#41845)中，获得重组质粒pCT302-B50、pCT302-B60和pCT302-BII61。接下来，基于Ginger等(2006)Nat Protoc 1(2):755-68中详述的方法，使用易错PCR，获得scFv随机突变的PCR产物。使用的引物是

T7 proshort：

TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO:82)和

Splice 4/L：

GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT(SEQ ID NO:83)。

使用Fermentas GeneJET DNA纯化试剂盒纯化如此获得的PCR产物，然后通过乙醇沉淀浓缩至大于1μg/μl的浓度。使用Fermentas NheI和BamHI对商业载体pCT302进行双重消化，同时，使用Fermentas FastAP脱磷酸酶对载体进行脱磷酸，然后再次使用FermentasGeneJET DNA纯化试剂盒进行纯化，并进行乙醇沉淀，以将产物浓缩至大于1μg/μl的浓度。根据Ginger等(2006)Nat.Protoc.1(2)：755-68中所述的方法进行酵母的电转化和体内重组，以获得亲和力成熟的酵母文库。

实施例4：筛选表达具有提高的亲和力的抗hPD-L1 scFv的酵母。

使用10nM和1nM的hPD-L1-Fc蛋白对如上所述获得的亲和力成熟的酵母文库进行两轮流式分选(flow sorting)，并将如此获得的酵母产物铺板并挑选单克隆进行鉴定。通过使用先前获得的野生型酵母作为对照，使用低浓度抗原染色进行流式染色以鉴定显示出增加的亲和力的酵母单克隆。

使用上述方法将已通过FACS验证的酵母克隆进行酵母菌落PCR和测序。将亲和力成熟后获得的scFv基因与先前获得的IgG1-Fc基因融合在一起，并使用Fermentas HindIII和EcoRI酶的双重消化物将其克隆至商业载体pEE6.4中，然后按照标准分子克隆程序进行克隆和质粒微量制备。提取的质粒在HEK293细胞中瞬时表达，并使用蛋白A柱纯化。

使用实施例2中描述的方法测量抗体结合能力和阻断能力。

关于结合力测试结果参见图2；结果表明，亲和力成熟后获得的三种抗体株具有显著增加的亲和力。

关于阻断能力测试的结果参见图3。结果表明，对于亲和力成熟后获得的三种抗体株，与PD-1竞争竞争性结合PD-L1的IC50值对于BII61-62为0.837μg/ml(对于BII61为0.884μg/ml)，对于B50-6为4.56μg/ml(对于B50为5.63μg/ml)以及对于B60-55为1.14μg/ml(对于B60为16.8μg/ml)。

亲和力成熟后，获得三个显示出增加的亲和力的抗hPD-L1 scFv抗体序列，即B50-6、B60-55和BII61-62。与B50相比，B50-6显示其VL CDR1中有从D至N的氨基酸突变；与B60相比，B60-55显示其VH CDR3中有从S至N的氨基酸突变；与BII61相比，BII61-62显示其VHCDR2中有从S至G的氨基酸突变，以及其VL FR2中有从I至V的氨基酸突变。连接肽序列

GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:67)

包含在上述抗体的重链可变区与轻链可变区之间。

B50-6重链可变区的氨基酸序列为：

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:13-15，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:38-41；

并且相应的DNA序列为：

轻链可变区的氨基酸序列为：

QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL(SEQ ID NO:52)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:16-18，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:42-45；

并且相应的DNA序列为：

CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTAATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAG CTGACCGTCCTC(SEQ ID NO:64)；

B60-55重链可变区的氨基酸序列为：

QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:47)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:1-3，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:22-25；

并且相应的DNA序列为：

CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:57)；

轻链可变区的氨基酸序列为：

并且相应的DNA序列为：

GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CAAA(SEQ ID NO:62)；

BII61-62重链可变区的氨基酸序列为：

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVK GRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTV SS(SEQ ID NO:49)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:7-9，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:30-33；

并且相应的DNA序列为：

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAGGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQID NO:58)；

轻链可变区的氨基酸序列为：

DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLVYGASSLQ SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK(SEQ ID NO:50)；

其中带下划线的部分构成CDR1、2和3，分别对应于SEQ ID NO:10-12，未带下划线的部分构成FR1、2、3和4，分别对应于SEQ ID NO:34-37；

并且相应的DNA序列为：

GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGGTCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGT GGATATCAAA(SEQ ID NO:63)。

实施例5：将scFv抗体转化为IgG抗体。

基于Uniprot蛋白数据库中包含的人免疫球蛋白γ1(IgG1)的恒定区的氨基酸序列(P01857)，获得人IgG1恒定区氨基酸序列。使用在线工具DNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计相应的编码DNA序列，以获得人IgG1恒定区基因，并将通过筛选获得的B50-6、B60-55和BII61-61的重链可变区的VH序列与人IgG1恒定区基因剪接在一起，同时，将以下信号肽序列添加到VH的5'端：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(SEQ IDNO:84)；

合成剪接的基因，并用Fermentas HindIII和EcoRI酶进行双重消化，将该基因克隆至载体pEE6.4中，得到pEE6.4-B50-6HC、pEE6.4-B60-55HC和pEE6.4-BII61-62HC。基于Uniprot蛋白数据库中包含的人免疫球蛋白κ恒定区的氨基酸序列(P01834)，获得人κ轻链恒定区氨基酸序列。使用在线工具DNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计相应的编码DNA序列，以获得人κ轻链恒定区基因，并将通过筛选获得的B60-55和BII61-61的重链可变区的VL序列与人κ轻链恒定区基因剪接在一起，同时将以下信号肽序列添到VL的5'末端：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(SEQ IDNO:84)；

使用在线工具DNAworks(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计相应的编码DNA序列以获得人兰姆达(λ)轻链恒定区基因，并将通过筛选获得的B50-6的轻链可变区的VL序列与人λ轻链恒定区基因剪接在一起，同时将以下信号肽序列添加至VL的5'末端：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT(SEQ IDNO:84)；

以及合成剪接的基因，并用Fermentas HindIII和EcoRI酶进行双重消化，将该基因克隆至载体pEE12.4(Lonza)中，以获得pEE12.4-B50-6LC、pEE12.4-B60-55LC和pEE12.4-BII61-62LC。

使用AidLab Maxiprep试剂盒(PL14)制备如上所述获得的重链和轻链质粒。将重组构建的轻链和重链质粒共转染至HEK293细胞中以表达抗体。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释，并添加到转化所需的PEI(聚乙烯亚胺)溶液中，然后将每种质粒/PEI混合物各自分别添加到细胞悬液中，并在37℃，10％CO₂和90rpm下培养；同时，补充添加50μg/IGF-1。此后四个小时，补充添加EX293培养基、2mM谷氨酰胺和50μg/L IGF-1，并以135rpm继续培养。再过24小时后，加入3.8mM VPA。培养5-6天后，收集瞬时表达培养物的上清液，并使用蛋白A亲和色谱法纯化并获得抗hPD-L1 B50-6、B60-55和BII61-62 mAb抗体。

IgG1链恒定区氨基酸序列为：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:68)；

IgG1链恒定区核酸序列为：

GCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATAACTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGACGAACTGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA(SEQ ID NO:69)；

κ链恒定区氨基酸序列为：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:70)；

κ链恒定区核酸序列为：

CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGA ATGC(SEQ ID NO:71)；

B50-6轻链(λ)恒定区氨基酸序列为：

GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS(SEQ ID NO:72)；

以及B50-6轻链(λ)恒定区核酸序列为：

GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACGCTGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT(SEQ ID NO:73).

实施例6：抗hPD-L1 mAb特性的验证。

纯化的抗hPD-L1抗体和hPD-L1结合能力的测定(ELISA方法)：

使用包被缓冲液(50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)将hPD-LI-muFc稀释至2μg/ml，然后将溶液以100μL/孔等分，并在4℃下放置过夜。然后甩掉板上的液体，并使用PBST(pH 7.4，0.05％Tween-20，V/V)进行洗涤，并将样品密封在3％BSA-PBS中1小时。从2,000ng/ml开始对抗体B50-6mAb、B60-55mAb和BII61-62mAb各自进行两倍连续稀释，共11种不同浓度，以稀释剂(1％BSA-PBS)用作对照，并在37℃下孵育2小时。然后加入山羊抗人IgG-HRP(缀合有HRP的山羊抗人IgG)，并孵育1小时。然后加入可溶的单组分TMB生色底物溶液，并将每个样品在室温下于黑暗环境中显色5-10分钟。以50μL/孔加入2N H₂SO₄以终止显色反应。然后将每个样品放在MD SpectraMax Plus384微量板读数器上，读取OD450nm-650nm值，然后使用SoftMax Pro v5.4软件包进行数据处理和作图分析。结果示于图4中。

使用上述方法，这三种抗体株的抗原结合EC50值经测定为40μg/ml(B60-55 mAb)、18.3μg/ml(BII61-62 mAb)和28.1μg/ml(B50-6mAb)。

纯化的抗hPD-L 1抗体和hPD-L1结合动力学(SPR)的测量：

使用利用Biacore X100进行的表面等离子体共振(SRP)测量了抗PD-L1抗体B50-6mAb、BII61-62 mAb和B60-55 mAb相对于重组人PD-L1的结合动力学。将重组hPD-L1-Fc直接包被在CM5生物传感器芯片上，以获得约1000个反应单位(RU)。为了进行动力学测量，将抗体在HBS-EP+1x缓冲液(GE，目录号：BR-1006-69)中通过三倍系列稀释(从1.37nm至1000nm)进行稀释，在25℃下进行采样120秒，其中解离时间为30分钟，并用10mM甘氨酸-HCl(pH2.0)进行再生120秒。使用简单的一对一Languir结合模型(Biacore评估软件3.2版)来计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(kD)计算为koff/kon的比率。

关于测量的抗PD-L1结合亲和力值，参见表1。

表1.抗hPD-L1抗体和hPD-L1结合动力学的测量

命名	Kon(1/Ms)	Koff(1/s)	KD(M)
				B50-6mAb	1.672E+5	1.370E-2	8.193E-8
B60-55mAb	1.295E+6	2.222E-4	1.716E-10
				BII 61-62mAb	9.795E+4	4.264E-4	4.353E-9

纯化的抗hPD-LI抗体与hPD-1竞争对hPD-L1的结合能力的测量：

使用包被缓冲液(50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)将hPD-L1-hIgG稀释至5μg/ml，然后将溶液在4℃放置过夜。使用PBST(pH7.4，0.05％Tween-20,V/V)进行洗涤，并将样品密封在3％BSA-PBS中1小时。将待测抗hPD-L1 mAb的浓度稀释至100μg/ml，然后使用1％BSA-PBST-0.05％Tween-20(含10μg/ml的hPD-1-hIgG-生物素)进行1:6系列稀释，共9种不同的稀释度，并将稀释液在37℃下放置2小时。洗涤板后，加入缀合有辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白(SA-HRP)，并将样品在室温下孵育1.5小时。然后加入可溶性单组分TMB生色底物溶液，并将每个样品在室温下于黑暗环境中显色5-10分钟，然后加入2N H₂SO₄终止显色反应。然后将每个样品放在MD SpectraMax Plus384微量板读数器上，读取OD450nm-650nm值，然后使用SoftMax Pro v5.4软件包进行数据处理和作图分析；基于测得的数据和IC50值分析抗体的竞争力，结果示于图5中。

使用上述方法，三种抗体株相对于PD-L1而言对PD-1的竞争性抗原结合IC50值经测定为0.255μg/ml 1.7nM(B60-55)、0.24μg/ml 1.6nM(BII61-62)和1.76μg/ml 11.7nM(B50-6)。

纯化的抗hPD-LI抗体与CD80竞争对hPD-L1的结合能力的测量：

对通过筛选获得的三种抗体株B60-55，BII61-62和B50-6进行了评估，以通过竞争性ELISA方法确定它们是否能够阻断PD-L1和CD80的结合。使用的具体方法如下：使用包被缓冲液(50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)将hPD-L1-hFc稀释至5μg/ml，然后将溶液在4℃下放置过夜。使用PBST(pH 7.4，0.05％Tween-20,V/V)进行洗涤，并将样品密封在3％BSA-PBS中1小时。将待测抗hPD-L1 mAb的浓度稀释至100μg/ml，然后使用1％BSA-PBST-0.05％Tween-20(含100μg/ml的hCD80-hFc-生物素，R&D：140-B1-100)进行1:6系列稀释，总共9种不同的稀释度，并将稀释液在37℃下放置2小时。洗涤板后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白-生物素(SA-缀合有HRP)，并将样品在室温下孵育1.5小时。然后加入可溶性单组分TMB生色底物溶液，并将每个样品在室温下于黑暗环境中显色5-10分钟，然后加入2N H₂SO₄终止显色反应。然后将每个样品放在MD SpectraMax Plus384微量板读数器上，读取OD450nm-650nm值，然后使用SoftMax Pro v5.4软件包进行数据处理和作图分析；以及基于测得的数据和IC50值分析抗体的竞争力，结果示于图6中。

使用上述方法，三种抗体株相对于CD80而言对PD-L1的竞争性抗原结合IC50值经测定为0.543μg/ml(B60-55)、0.709μg/ml(BII61-62)和0.553μg/ml 11.7nM(B50-6)。

确定PD-L1是否被特异性识别的验证：纯化的抗hPD-L1与hPD-L1、hPD-L2和hB7H3 的结合

将实施例1中构建的包含hPD-L1-EGFP、hB7H3-EGFP和hPD-L2-EGFP的HEK293细胞悬浮在0.5％PBS-BSA缓冲液中，然后添加抗hPD-L1 mAb蛋白(hIgG Fc用作阴性对照)，并在冰上孵育20分钟。洗涤后，加入eBioscience二抗抗hIg-PE，并将样品在冰上放置20分钟。洗涤后，将细胞重悬于500μl的0.5％PBS-BSA缓冲液中，并在流式细胞仪中进行测量。

结果示于图6中。如结果所示，所述三种抗体株均能够与hPD-L1-EGFP细胞结合，但不能与hB7H3-EGFP和hPD-L2-EGFP细胞结合，表现出良好的特异性。

纯化的抗hPD-L1与鼠PD-L1(mPD-L1)的结合：

将实施例1中构建的含有hPD-L1-EGFP和mPD-L1-EGFP的HEK293细胞悬浮在0.5％PBS-BSA缓冲液中，然后加入目标抗hPD-L1 mAb(hIgG Fc与用作阴性对照)并在冰上孵育20分钟；然后进行洗涤，加入eBioscience二抗抗hIg-PE，并将样品在冰上静置20分钟。洗涤后，将细胞重悬于0.5％PBS-BSA缓冲液中，并在流式细胞仪中进行测量。结果示于图7中。如结果所示，B50-6 mAb能够与鼠PD-L1(mPD-L1)结合，而B60-55和BII61-62不能与mPD-L1结合。

纯化的抗hPD-L1与食蟹猴PD-L1的结合：

用人淋巴细胞分离培养基(Tianjin Hao Yang)分离食蟹猴PBMC，将细胞重悬于RPMI完全培养基中，然后将细胞密度调节至100万个细胞/ml，之后将200万个食蟹猴PBMC添加至24孔板，与此同时，添加植物凝集素(PHA)至终浓度为2μg/ml；将细胞刺激48小时，然后收集它们，在FACS缓冲液中洗涤并进行抗体染色。同型对照(抗KLH)用作阴性对照，商业PE标记的抗人PD-L1抗体(Biolegend：329705)用作阳性对照。使用我们的内部抗体作为一抗，在洗涤后使用抗hIg-PE作为二抗进行抗体染色。每个染色步骤后，在4℃下孵育30分钟，进行染色后，使用FACS缓冲液通过离心将细胞洗涤两次，然后添加二抗或将细胞直接固定在2％低聚甲醛中，然后使用Guava进行分析。结果示于图8中。结果表明，食蟹猴T细胞在用PHA刺激后表达PD-L1，并且产生的三种抗体株能够与活化的食蟹猴T细胞结合。

实施例7：在树突状细胞-T细胞混合淋巴细胞反应中测量CD4⁺T细胞的PD-L1抗体活化。

使用人淋巴细胞分离培养基(Tianjin Hao Yang)通过密度梯度离心从健康供体获得的富集的外周血白细胞中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。接着，将所述细胞重悬于无血清的RPMI1640中，并在10cm培养皿中培养1-2小时，然后除去非贴壁细胞，并将细胞在含有10％FBS的RPMI中培养。以250ng/ml(对于GM-CSF(Shanghai Primegene:102-03))和100ng/ml(对于IL-4(Shanghai Primegene:101-04))的终浓度加入细胞因子，然后每2-3天加入新鲜的含细胞因子的培养基。在培养的第6天，使用50ng/ml TNF-α(ShanghaiPrimegene：103-01)诱导细胞成熟，并将细胞再孵育24小时。收获成熟的树突状细胞，并用HLA-DR抗体进行染色以验证成熟度。然后将细胞以200,000个细胞/ml的浓度重悬于RPMI完全培养基中。将50μl的所得悬浮液添加至96孔U型板(Costar：3799)的每个孔中，并将细胞置于培养箱中培养。

按照提供的说明，使用磁珠分离试剂盒(Miltenyi Biotec：130-096533)从获自另一个供体的PBMC中分离CD4⁺T细胞。对细胞计数并以200万个细胞/ml的浓度重悬于RPMI完全培养基中，然后将它们添加到含有树突状细胞的96孔U形底平板中，其中向每个孔中添加50μl。将100μl已经在RPMI完全培养基中连续稀释的PD-L1抗体添加到每个孔中，以获得100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml和0μg/ml的最终抗体浓度。然后将细胞培养五天，取上清液，并使用IFN-γELISA检测试剂盒(eBioscience)检测上清液中的IFN-γ水平。结果示于图9。结果显示，PD-L1抗体可增强混合淋巴细胞反应中γ-IFN的CD4⁺T细胞分泌。也就是说，PD-L1抗体增强了T细胞活化。对于BII61-62获得的EC50值为0.078μg/ml(相当于0.5nM)，对于B60-55获得的EC50值为0.189μg/ml(相当于1.2nM)。

实施例8：抗hPD-L1抗体对肿瘤生长的抑制活性。

已经很清楚，许多肿瘤表达PD-1配体作为削弱机体抗肿瘤T细胞反应的一种方式。在许多不同的受试者的肿瘤和肿瘤浸润性白细胞中发现了PD-L1表达水平的特征性升高，并且所述增加的PD-L1表达通常与不良预后相关。鼠肿瘤模型已经显示出肿瘤中PD-L1表达的相似增加，并且还证明了PD-1/PD-L1途径在抑制肿瘤免疫中的作用。

此处，我们提供了实验结果，表明阻断PD-L1影响在同基因C57B6小鼠中发现的MC38细胞(鼠结直肠癌细胞)的肿瘤生长。

在第0天，在C57B6小鼠中皮下接种了100万个MC38细胞(由the University ofChicago的Yangxin Fu教授提供)；然后在第0、3、7和10天对小鼠进行10mg/kg抗PD-L1(B50-6)或PBS腹膜内注射。在第3天测量肿瘤尺寸，并计算肿瘤体积以画出一条肿瘤生长曲线(见图10)；结果表明抗PD-L1(B50-6)能够显著抑制肿瘤生长。

使用免疫缺陷型NOD/SCID(非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷症)小鼠研究PD-L1抗体B60-55和BII61-62的体内活性，所述抗体无法识别鼠PD-L1。将使用当皮下移植到NOD/SCID小鼠中时表达人PD-L1的黑色素瘤细胞系A375(ATCC,CRL-1619^TM)和人外周血单个核细胞(PBMC)进行的实验用于实现上述目的。注射前将A375细胞和PBMC以5:1的比例混合，进行皮下注射，总体积为100μl(包含500万个A375细胞和100万个PBMC)；在肿瘤接种后第0、7、14、21和28天腹膜内施用抗体(对于图11-A，抗体剂量为3mg/kg，对于图11-B，抗体剂量直接显示在图11中)，PBS用作阴性对照。每个实验组由4-6只小鼠组成。每周观察肿瘤形成两次，使用游标卡尺测量尺寸，并计算肿瘤体积以绘制肿瘤生长曲线(见图11)；结果表明，抗体B60-55和BII-61-62能够显著抑制肿瘤生长。

实施例9：B60-55和抗体2.41H90P(Medimmune)的稳定性比较。

在45℃下进行抗PD-L1抗体B60-55和MedImmune LLC的抗体2.41H90P的加速稳定性测试，使用的具体测试程序如下：将抗PD-L1抗体B60-55和MedImmune LLC的抗PD-L1抗体2.41H90P(根据美国专利第20130034559号中给出的制备2.14H9的方法制备的，然后将抗体重命名为2.41H90P)富集至10mg/ml的浓度，之后将100μg抗体添加到200μg PCR试管中，并置于45℃的批次中；在第0、10、20和30天采集样品，之后进行竞争性ELISA和SE-HPLC分析测试，其中使用的竞争性ELISA方法与实施例6中所述的相同，以获得IC50值。SE-HPLC使用Shimadzu LC LC20AT HPLC色谱仪进行；将样品浓缩至1mg/ml，并以0.5ml/min的流速上样，总样品体积为50μg；样品上样后进行30分钟的等度洗脱，结果示于图12中。

在图12中，A显示B60-55和抗体2.41H90P随时间变化的IC50值的图形比较，数据表明在不同时间点样品竞争性没有明显变化；B显示抗体二聚体随时间的比例，数据表明对于B60-55和2.41H90P，二聚体比率随时间降低；然而，2.41H90P的下降速度比B60-55快，表明B60-55更稳定；C显示对于B60-55加速稳定性测试获得的竞争性ELISA曲线，数据表明B60-55能够保持相对良好的活性和稳定性。

实施例10：抗体变体B60-55-1的按比例放大的制备和制剂稳定性。

为了评估抗体按比例放大制备的潜力，基本上如前述公开中所述克隆示例性抗体变体B50-55-1。B60-55-1完整重链的氨基酸序列为：

QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:85)；

相应的DNA序列为：

CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCAACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATGCCTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGAGGAAATGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA(SEQID NO:86)；

完全轻链的氨基酸序列为：

EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:87)；

相应的DNA序列为：

GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACGCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGAAT GC(SEQ ID NO:88)；

在使用ActiCHO(GE)或Dynamis(Thermo Fisher Scientific)培养基的生物反应器中生长的CHO细胞中产生B60-55-1。最初，使用蛋白A亲和色谱树脂MabSelect Sure LX,GE从澄清的细胞培养液中纯化B60-55-1，然后进行两个其他色谱步骤-在Q-吸附剂(GE)膜上以流通模式进行阴离子交换色谱以及作为最后的抛光步骤在羟基磷灰石树脂(CaPure-HA,Tosoh)上进行柱色谱。

在蛋白A树脂上观察到的B60-55-1纯化步骤收率约为95-98％。Q-吸附剂色谱的观察到的步骤收率约为93％-95％。可去除B60-55-1的二聚体、寡聚体和聚集体、痕量残留DNA以及从蛋白A柱漏出的蛋白A的B60-55-1的最终纯化步骤是在CaPure-HA上进行的抛光色谱，其也用作良好的病毒清除步骤。最终的羟基磷灰石步骤收率约为77％-85％。在CaPure-HA上进行的B60-55-1纯化的色谱图示于图14中。

如通过尺寸排阻HPLC评估的，在CaPure-HA上层析后，B60-55-1的同质性不低于99％。分析尺寸排阻色谱图示于图15中。

在还原和非还原条件下，在SDS存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)也证明了B60-55-1制剂的高纯度。考马斯染色的凝胶的图像示于图16中。

纯化的B50-55-1的LC-MS胰蛋白酶肽作图分析表明，纯化的抗体的重链缺少C端赖氨酸残基，这不影响纯化的抗体的抗原结合特性(参见实施例11)。

在压力稳定性研究中测试了为B60-55-1开发的几种液体制剂。在这些研究中，将具有浓度约为50mg/mL的B60-55-1的不同B60-55-1制剂的无菌样品在40℃下孵育6周。将样品合并，并在孵育期间的七个时间点(0、1周、2周、3周、4周、5周和6周)合并样品并进行分析。随后对合并的样品进行了测试，测量蛋白浓度(B60-55-1的浓度)、纯度、完整性、浊度和重量克分子渗透压浓度。通过在280nm处的吸光度测量蛋白质浓度，通过SDS-PAGE评估蛋白质一致性和完整性，通过A600测量浊度，通过校准渗透压计测量重量克分子渗透压浓度。基于应力稳定性实验的结果，将以下制剂用于后续研究：275mM丝氨酸、10mM组氨酸，pH 5.9。在该制剂中，在40℃下孵育5周后，B60-55-1的纯度超过95％。另外，以下制剂产生基本相似的蛋白质稳定性：0.05％的聚山梨酸酯80、1％的D-甘露醇、120mM L-脯氨酸、100mM L-丝氨酸、10mM L-组氨酸-HCl，pH 5.8。

实施例11：通过SPR进行的纯化B60-55-1和hPD-L1结合动力学研究。

本研究的目的是使用SPR方法进行B60-55-1对比阿妥珠单抗与人PD-L1的相互作用的结合参数的比较评估。使用几种方法进行测定，并使用两种形式的人PD-L1：PD-L1-带His标签和PD-L1-Fc融合蛋白。使用一系列不同浓度的PD-L1配体来计算解离常数(Kd)。使用了以下设备：R75000DC，等离子体共振光谱仪，Reichert Technologies，具有SPRAutolink Control和TraceDrawer评估软件包的仪器#00478-1115。传感器芯片SR7000Gold Sensor Slide、500kDa羧甲基葡聚糖，Reichert,Inc,Prt号：13206066。

以下是使用的试剂：在1％D-甘露糖醇、10mM乙酸钠，pH 5.4中的B60-55-1原液32mg/ml；在20mM组氨酸、14mM乙酸、0.04％聚山梨酯20、4％蔗糖中的阿妥珠单抗(Tecentriq)，60mg/ml，批次3109904，Genentech Inc.；PD-L1-加His标签人重组体，HEK293衍生的Phe19-Thr239，登录号Q9NZQ7，R&D systems，目录号9049-B7-100，批号DDIW0116081；PD-L1-Fc，人IgG Fc融合蛋白，人重组体，HEK293衍生的Phe19-Thr239，登录号Q9NZQ7，R&D systems，目录号156-B7-100，批号DKL2116031；Human Antibody Capture试剂盒，GE Healthcare，目录号BR-1008-39，批号10247121；运行缓冲液：补充有0.005％Tween-20的1x PBS、脱气并通过0.2u过滤器过滤。

测量结合参数的标准方法之一是将捕获抗体固定在芯片上，随后加载测试抗体，然后进行配体施加。然而，由于PD-L1-Fc融合蛋白中人IgG Fc片段的存在，由抗人抗体介导的捕获不能用于该配体。因此，对于PD-L1-Fc，采用了图17所示的替代方法。对于配体的PD-L1-带His标签形式，使用了图17中图A所示的抗体捕获方法。为了测试PD-L1-Fc融合蛋白的结合，使用了两种替代方法：(1)图17中图B所示的PD-L1-Fc本身的直接固定，以及(2)图17中图C所示的测试抗体B60-55-1和比较物阿妥珠单抗的固定。

使用相同的化学方法和方案将所有蛋白质共价连接至芯片。缀合于芯片的蛋白质包括单克隆抗人IgG抗体、PD-L1-Fc配体、B60-55-1和阿妥珠单抗。将抗人IgG和PD-L1-Fc用于与缀合程序相容的缓冲液中，而将B60-55-1和阿妥珠单抗制剂在偶联前针对0.1x PBS充分透析。将SR7000 Gold Sensor Slide放入仪器中，并以250μl/min用运行缓冲液，补充有0.005％Tween 20的1x PBS进行引发(prime)，持续5分钟，然后使其稳定在25μl/min。所有步骤均在25℃下进行。使用固定缓冲液(10mM乙酸钠pH 5.0)将蛋白制剂稀释至25μg/ml的终浓度。如下制备用于固定方法的试剂：由水中40mg/ml的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)和10mg/ml的水中的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)组成的EDC/NHS活化剂、水中1M的乙醇胺-HCl，pH 8.5。激活：将EDC/NHS激活剂以10μl/min注入芯片中，持续8分钟，然后用运行缓冲液洗涤5分钟。固定：将终浓度为25μg/ml的抗人IgG以10μl/min注入芯片中，持续8分钟。去活化：通过以10μl/min注入1M乙醇胺-HCl封闭芯片表面上未反应的活性基团，持续7分钟。抗体缀合后，将芯片用运行缓冲液以25μl/min洗涤15分钟。

为了研究PD-L1-带His标签的配体与B60-55-1和阿妥珠单抗的相互作用，使用了抗体捕获方法。将抗人IgG共价连接到芯片上，并用于如图17中图A所示的捕获测试抗体。将具有固定的抗人IgG的芯片与运行缓冲液以25μl/min的流速平衡10-15分钟。以25μl/min加载测试抗体B60-55-1或阿妥珠单抗2分钟，然后将芯片洗涤3分钟以去除未结合的抗体。从100nM浓度开始，使用运行缓冲液制备PD-L1-His配体的2倍稀释液。使用七个浓度：100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3,125nM和1.56nM。以25μl/min加载配体3分钟。配体加载后，使用运行缓冲液以25μl/min的流速进行实验的解离阶段，持续5分钟。通过将3M MgCl₂以25μl/min运行通过芯片30秒钟来进行固定的抗人IgG结合的蛋白复合物的解离。如图18所示产生捕获的B60-55-1或阿妥珠单抗在不同的PD-L1-His配体浓度下的一系列传感图，并将其用于分析。使用1:1结合模型的动力学评估来分析PD-L1-His与测试抗体的相互作用。获得以下Kd值：B60-55-1Kd＝40.2nM；阿妥珠单抗Kd＝0.67nM。

研究结果表明，单体PD-L1对比较物阿妥珠单抗的结合亲和力比对B60-55-1的结合亲和力高约2-log，分别为0.67nM和40.2nM。B60-55-1-PD-L1-His相互作用的较低亲和力归因于较高的解离速率，而根据图18中的表格，B60-55-1和阿妥珠单抗的缔合阶段基本相同。

为了研究PD-L1-Fc配体与B60-55-1及其比较物阿妥珠单抗的结合特性，如图17中图B所示，将PD-L1-Fc融合蛋白直接固定在芯片上。为了确定用于芯片有效再生的条件，进行探查实验。发现3M MgCl₂不会从固定的PD-L1-Fc解离结合的抗体(B60-55-1和阿妥珠单抗均未解离)。测试了几个再生条件，包括具有pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0的10mM甘氨酸-HCl缓冲液和10mM NaOH。已确定pH 3.0和pH 2.5缓冲液不会有效去除结合的抗体，而NaOH处理会使配体失活，从而导致结合丧失。随后得出结论，pH 2.0的甘氨酸-HCl适用于这些系列实验。

如本实施例中先前所述，将PD-L1-Fc配体固定在芯片上，并施加一系列浓度的B60-55-1或阿妥珠单抗。从100nM浓度开始，使用运行缓冲液制备B60-55-1或阿妥珠单抗的两倍稀释液。使用七个浓度：100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM和1.56nM。将配体以25μl/min加载3分钟。配体加载后，使用运行缓冲液以25μl/min的流速进行实验的解离阶段，持续5分钟。生成了不同浓度的B60-55-1或阿妥珠单抗下固定的PD-L1-Fc的一系列传感图(如图19所示)，并将其用于分析。将1:1结合模型的动力学评估用于分析固定的PD-L1-Fc与测试抗体的相互作用。获得以下Kd值：B60-55-1Kd＝0.66nM；阿妥珠单抗Kd＝0.26nM。

研究结果表明，固定的二聚体PD-L1-Fc对B60-55-1与对比较物阿妥珠单抗的结合亲和力相似，分别为0.6nM对比0.26nM，如图19中的表格所示。两种抗体的观察到的亲和力相似性反映了与二聚体配体的相互作用，这显然不同于与配体的加His标签的单体形式的相互作用。

为了进一步评估测试抗体的结合特性，如图17中图C所示，将B60-55-1或阿妥珠单共价交联在芯片上。这种方法使得能够直接比较PD-L1配体的两种形式，即带His-标签的蛋白和Fc融合蛋白。重新评估了该结合系统的再生条件，发现10mM甘氨酸-HCl，pH 2.0提供了足够的回收率。如本实施例中先前所述，将B60-55-1和阿妥珠单抗固定在单独的传感器芯片上，然后将各种浓度的PD-L1-His或PD-L1-Fc融合蛋白依次施加于固定的抗体。从100nM浓度开始，使用运行缓冲液制备PD-L1-His或PD-L1-Fc的两倍稀释液。使用七个浓度：100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3,125nM和1.56nM。将配体以25μl/min加载3分钟。配体加载后，使用运行缓冲液以25μl/min的流速进行实验的解离阶段，持续5分钟。生成不同浓度的PD-L1-His或PD-L1-Fc融合蛋白下固定的B60-55-1或阿妥珠单抗的一系列传感图(如图20和图21所示)，并将其用于分析。将1:1结合模型的动力学评估用于分析固定的B60-55-1与两种形式的配体即PD-L1-His和PD-L1-Fc的相互作用。对于B60-55-1获得以下Kd值：对于单体PD-L1-His配体，Kd＝14.3nM；对于二聚PD-L1-Fc配体，Kd＝0.45nM；对于阿妥珠单抗：对于单体PD-L1-His配体，Kd＝0.62nM，而对于二聚PD-L1-Fc配体，Kd＝0.19nM。

因此，比较单体PD-L1-His和二聚PD-L1-Fc与B60-55-1及其比较物阿妥珠单抗的结合亲和力，表明了B60-55-1表现出对PD-L1-Fc的亲和力比对PD-L1-His的亲和力高约2-log，而阿妥珠单抗对PD-L1-His和PD-L1-Fc具有相似的亲和力。后者表明阿妥珠单抗无法区分该配体的单体形式与二聚体形式。

对B60-55-1和阿妥珠单抗的结合特性的评估出乎意料地表明B60-55-1可以实质上区分其同源靶标PD-L1的二聚体形式与单体形式，这与目前临床上使用的比较抗体相反。

实施例12：B60-55-1抗体和阿妥珠单抗的效应子功能的可比性。

本实施例公开了B60-55-1抗体与比较物阿妥珠单抗的效应子功能的进一步分析和比较。本公开包括对与Fcγ受体：CD16a、CD32a和CD64的结合的评估；使用PD-L1阳性细胞对抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的评估；补体诱导的细胞毒性(CDC)活性、C1q结合和FcRn结合评估。

除了其在结合抗原方面的作用外，抗体还可通过与Fcγ受体相互作用(通过与抗体的Fc区的相互作用)来调节免疫反应。这些与存在于天然杀伤(NK)和其他髓样细胞上的受体的相互作用诱导这些细胞释放细胞因子，诸如IFNγ和含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，其在ADCC中达到顶点。

进行的研究表明，B60-55-1抗体未表现出可检测的与CD16a受体的结合，而阿妥珠单抗对于CD16a的Kd为1.6E-5M；B60-55-1未显示出可检测的与CD32a受体的结合，而阿妥珠单抗对于CD32a的Kd为4.1E-5M；与其他IgG1抗体相比，B60-55-1与CD64受体的结合低至1/10，但与阿妥珠单抗相比，其与CD64的结合相似。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)是抗体的作用机制，通过该机制，感染病毒的或其他患病的细胞被细胞介导的免疫系统的组分(诸如天然杀伤细胞)靶向破坏。Promega的ADDC reporter Bioassay Core试剂盒(目录号G7014)是用于定量ADCC的生物发光报告基因测定。该测定法结合了在细胞表面上表达FcγRIIIa受体的效应细胞，所述FcγRIIIa受体与结合至表达靶受体的细胞表面的测试抗体的Fc片段结合。通过生物学将靶细胞与效应细胞桥接导致在效应细胞中通过NFAT途径激活基因转录，从而驱动萤火虫萤光素酶的表达，这可通过发光进行定量。由于B60-55-1未显示与CD16a和CD32a的任何结合，因此预期该分子不会表现出任何ADCC活性。使用PD-L1阳性细胞系A2058进行测定。将B60-55-1和阿妥珠单抗的ADCC活性与利妥昔单抗(一种已知具有强大ADCC活性的抗体)的ADCC进行了比较。

如对该工程化IgG1抗体所预期的，与利妥昔单抗(图22中的对照)相比，B60-55-1并未表现出实质性的ADCC活性，但其表现出与阿妥珠单抗相当的ADCC活性。

B60-55-1和阿妥珠单抗是靶向PD-L1的抗体，比较了这两种抗体与C1q的结合。使用抗原结合两位点ELISA检测两种抗PD-L1抗体与C1q相互作用的亲和力。在该测定中，在4℃下将两种抗体均以25μg/mL、20μg/mL、15μg/mL、10μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL和0μg/mL的浓度包被在板上过夜。然后洗涤该板并用SuperBlock溶液封闭，随后添加2μg/mL的结合缓冲液中的C1q(Sigma，目录号C1740)并在室温下孵育1小时。然后洗涤板，并在室温下将抗C1q-HRP缀合物(Thermo，目录号PA1-84324)在结合缓冲液(100μL/孔)中以1:250的稀释度加入板中，进行1小时。通过用洗涤缓冲液洗涤除去未结合的HRP缀合的抗体。通过使用生色底物TMB检测HRP活性。通过添加硫酸来终止显色反应，并在450nm下读取板。在三参数曲线拟合后，计算出样品和参考标准品的EC50。报告值是参考标准EC50相对于样品EC50的EC50％，因此，较高的百分数表示样品的效力较高。这些实验的目的是使用ELISA形式测定阿妥珠单抗和B60-55-1与C1q的结合。

ELISA测定结果示于图23中。经确定阿妥珠单抗与C1q结合的EC-50为14.9μg/mL，而B60-55-1与C1q结合的EC-50为6.9μg/mL。因此，这些结合特性是可比的。

另外，比较了B60-55-1与阿妥珠单抗之间在PD-L1阳性细胞(A2058细胞)上诱导CDC的能力。在该测定中，细胞裂解，可在显微镜下观察到“细胞血影”(裂解的细胞)，并通过向细胞加入发光CytoTox-Glo试剂1小时进行定量。

两种产品均表现出非常低的CDC活性。对于阿妥珠单抗，EC50为0.09μg/ml，而B60-55-1的EC50为0.05μg/ml。

IgG的半衰期取决于新生Fc受体(FcRn)，除其他功能外，其还可保护IgG免于分解代谢。FcRn在酸性pH下结合IgG的Fc结构域，确保内吞的IgG在溶酶体区室中不被降解，然后释放到血流中。比较了B60-55-1与阿妥珠单抗与由CHO细胞稳定表达的FcRn受体的结合。

研究表明，B60-55-1以4.7e-7M的Kd(该Kd对于抗体来说是典型的)与FcRn结合，而阿妥珠单抗显示略高的对FcRn的亲和力，其中Kd为1E-7M。

实施例13：通过混合淋巴细胞反应比较性评估B60-55-1抗体、阿妥珠单抗和派立珠单抗的效力。

进行混合淋巴细胞反应(MLR)测定以评估B60-55-1和阿妥珠单抗对T细胞活化的效力。通过T细胞分泌的白细胞介素2(IL-2)的浓度来测量T细胞的活化。从人外周血单个核细胞(PBMC)中分离出树突状细胞(DC)和CD4+T细胞。派立珠单抗在MLR中对T细胞活化的效力用作内部对照，以监测测定性能。通过GraphPad Prism使用S形剂量响应非线性回归拟合分析半最大有效浓度(EC50)。

试剂和材料

RPMI 1640：Gibco,Invitrogen(目录号22400)；FBS,Gibco,(目录号10099)；青霉素-链霉素(P/S):Gibco,Invitrogen(目录号10378)；磷酸盐缓冲盐水(PBS):Gibco,Invitrogen(目录号10010-023)；用于树突状细胞的QC抗体:抗CD1a[HI149](FITC),Abcam(ab18231)、抗CD86[HB15e](FITC),Abcam(ab134491)、抗CD86[BU63](FITC),Abcam(ab77276)、抗HLA DR[GRB1](FITC),Abcam(ab91335)；CD4+T Cell Isolation试剂盒:Miltenyi Biotec,(目录号130-096-533)；Pan Monocyte Isolation试剂盒:MiltenyiBiotec,(目录号130-096-537)。

细胞系

树突状细胞，由新鲜分离的人血(超过20名健康供体)制备的；CD4+T细胞，由新鲜分离的人血(超过20位健康供体)制备的。

测定试剂盒

Human IL2 HTRF试剂盒(Cisbio，目录号64IL2PEB)。

检测装置

PHERAstarPlus，BMG Labtech。

细胞制备

通过CD4+T Cell Isolation试剂盒纯化CD4+T细胞。使用Lymphoprep通过密度梯度离心法制备PBMC，按照GenScript的方案，将细胞维持在37℃/5％CO₂的完全培养基中。

通过Pan Monocyte Isolation试剂盒纯化树突状细胞。使用Lymphoprep通过密度梯度离心法制备PBMC，按照GenScript的方案，将细胞维持在37℃/5％CO₂的完全培养基中。通过FACS，利用其表面标志物(CD1a、CD83、CD86和HLA-DR)验证树突状细胞的纯度。

抗体制备

在测试之前，将样品于绝热包装(Dry shipper)中运送并于4℃储存。将样品用RPMI 1640稀释并用于测试。

用于抗体测试的混合淋巴细胞反应

-通过以1000rpm离心3分钟收获效应细胞(CD4+T细胞)；

-用测定缓冲液连续稀释测试样品；

-将效应细胞原种接种到96孔测定板上，并添加测试样品；

-通过以1000rpm离心3分钟收获靶细胞(树突状细胞)；

-加入靶细胞以引发反应并轻轻混合；

-将板在37℃/5％CO₂培养箱中孵育3天；

-进行人IL-2测试并读取板；

-B60-55-1和阿妥珠单抗的测试浓度范围：从300nM开始，3倍稀释，一式三份10个点；

-派立珠单抗的测试浓度范围：从10μg/ml开始，5倍稀释，一式三份6个点。

混合淋巴细胞反应(MLR)测定

MLR测定的结果示于图24中，B60-55-1和阿妥珠单抗能够在MLR中激活T细胞,具有不同IL-2分泌。用作对照的派立珠单抗的T细胞活化数据与历史数据一致。MLR数据的分析示于表2中。MLR测定中B60-55-1和阿妥珠单抗的EC50值分别为0.4665nM和21.53nM。因此，B60-55-1在MLR测定中以显著更高的效力激活T细胞。

表2.MLR的最佳拟合值概括

	派立珠单抗	B60-55-1	派立珠单抗	阿妥珠单抗
					底部	60.62	49.49	68.18	55.2
顶部	164.2	94.34	161.3	86.13
					LogEC50	-0.8871	-0.3311	-0.7364	1.333
HillSlope	0.7036	1.097	0.9005	1.356
					EC50	0.1297pg/ml	0.4665nM	0.1835pg/ml	21.53nM
EC50(nM)	0.8705	0.4665	1.2315	21.53

实施例14：在人源化PD-L1小鼠的皮下MC38-hPD-L1小鼠结肠癌模型的治疗中评价B60-55-1的功效

这项研究的目的是测试B60-55-1及其比较物阿妥珠单抗的体内功效，在治疗植入人源化PD-L1小鼠的皮下MC38-hPD-L1鼠结肠癌中二者均以10mg/kg给药。

试剂和设备

Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)：Cellgro，目录号10-013-CVR，于4℃储存。胎牛血清(FBS)：Excell，目录号FSP500，于-20℃下储存。磷酸盐缓冲盐水(PBS)：Gibco，目录号20012027，于4℃下存储。天平：Shanghai Shun Yu Heng Ping Science and EquipmentCo.Ltd，目录号MP5002。卡尺：Hexagon Metrolog，目录号00534220。

测试与对照品

将抗体B50-55-1以50mg/ml的浓度储存在PBS中；阴性对照IVIG：Guang DongShuang Lin BIOPharmacy Co.Ltd，批号20160407，以50mg/ml储存在PBS中；阳性对照抗体阿妥珠单抗(atezolizumab)：Genentech/Roche，批号3109904，以60mg/ml的浓度储存在含有冰醋酸(16.5mg)、L-组氨酸(62mg)、聚山梨酸酯20(8mg)和蔗糖(821.6mg)的缓冲液中。

给药溶液制备

给药前用PBS稀释测试品和对照品，暂时于2至8℃下储存，在室温下4小时内使用。将剩余的未稀释的测试品和对照品于2至8℃下储存。

动物

由Beijing Biocytogen Co.Ltd.提供40只雄性B-hPD-L1人源化小鼠品系C57BL/6(质量证书编号：201716816)

畜舍管理

将动物圈养在Beijing Biocytogen Co.,Ltd.的动物中心的无特定病原体的隔离室中，每只通风笼(IVC)中5只动物。到达后使动物适应三天至一周。

温度保持在20-26℃，湿度保持在40-70％。笼由聚碳酸酯制成，其尺寸为300mm*180mm*150mm。筑窝用品是压力灭菌的软木，每周更换一次。每个笼子的识别标签均包含以下信息：动物数量、性别、品系、接收日期、处理、组号和处理开始日期。在整个研究期间，动物可以自由接触高压灭菌的干颗粒食物和水。食品为SPF级，购自Beijing Keao XieliFeed Co.,Ltd.。水经超滤纯化。通过耳朵编码标记动物。

实验方法与程序

亲本MC38鼠结肠癌细胞系购自Shunran Shanghai Biological TechnologyCo.Ltd.。通过由Biocytogen Co,Ltd.用人PD-L1替代小鼠PD-L1来构建MC38-hPD-L1细胞系。将细胞在补充有10％热灭活的FBS的DMEM中维持单层培养，每周传代两次。收获在指数生长期生长的细胞并计数以用于肿瘤接种。

每只小鼠在右前侧腹皮下注射0.1mL PBS中的MC38-hPD-L1肿瘤细胞(5x 10⁵)，以进行肿瘤发展。当平均肿瘤尺寸达到约100mm³时，将荷瘤动物随机分入三个研究组。每组由8只小鼠组成。按照如下所示的预定方案向荷瘤小鼠施用测试品和对照品。

给药方案

注释：(1)基于体重施用给药体积(10μL/g)。

(2)i.p.是指腹膜内。

(3)BIW x 8是指每周两次的给药频率并且8份剂量

如果小鼠的体重减轻超过10％，则调整治疗方案并相应减少给药体积，或者将动物从研究中暂停。

在完成给药后，每周两次连续监测肿瘤体积和体重长达2周。

用CO₂对动物实施安乐死，然后进行骨髓破碎以确认安乐死。

肿瘤测量指标

使用卡尺每周两次在二个维度上测量肿瘤尺寸，并使用以下公式以mm³表示体积：V＝0.5a x b²，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。

在肿瘤接种和动物分组之前、然后在实验期间每周进行两次、最后在实验结束对动物实施安乐死之前对动物称重。当意外死亡或动物濒临死亡时对动物称重。

在整个实验期间中，每天两次(早晨和下午)检查动物的行为和状态，包括但不限于肿瘤溃疡的外观、动物的精神状态、食物和水的消耗量的肉眼估计等。

在研究终止时收集肿瘤并称重。为安乐死的动物和收集的肿瘤拍照，并在以后的报告中附上。

药物评价指标

相对肿瘤生长抑制(TGI％)：TGI％＝(1-T/C)x 100％。T和C分别指在给定的一天中治疗组和媒介物组的平均相对肿瘤体积(RTV)。T/C％代表相对肿瘤增殖率^[1]，公式为：T/C％＝T_RTV/C_RTV x 100％(T_RTV：治疗组的平均RTV；C_RTV：媒介物组的平均RTV；RTV＝V_t/V₀，V₀是指分组时的肿瘤体积，V_t是指在治疗后的每个指定时间点测量的肿瘤体积。

肿瘤重量的抑制率(IR_TW％)：在终点，对动物的肿瘤称重，确定每组的平均肿瘤重量，并通过下式计算IR_TW％：

IR_TW％＝(W_对照组-W_治疗组)/W_对照组×100

W是指平均肿瘤重量。

使用学生t检验/双因素ANOVA分析数据，P<0.05被认为具有统计学意义。统计分析和生物学观察都被考虑在内。

结果

在整个实验中没有观察到明显的临床体征。在研究过程中，大多数动物的体重逐渐增加。平均体重和随时间的平均百分比体重变化示于图25和表3中。B60-55-1组中的动物与对照组相比，体重无统计学差异(P>0.05)。

表3.具有鼠结肠癌MC38-hPD-L1肿瘤移植物的人源化B-hPD-L1小鼠的体重变化。

注释：

a：平均值±SEM。

b：通过独立样本T检验对分组后23天的处理组对比媒介物组的平均体重进行的统计分析

在整个实验期间，密切监测所有小鼠的肿瘤生长，其中每周两次测量肿瘤尺寸并且记录。在最佳治疗点(分组后23天)计算并分析肿瘤生长抑制(TGI％)。统计分析结果示于表4和表5中。图26和图27中绘制了三个组中的单个小鼠肿瘤生长。在施用阿妥珠单抗和B60-55-1后，均观察到肿瘤生长速率减小。

在2/8和1/8小鼠中分别观察到阿妥珠单抗组和B60-55-1组中有明显的肿瘤消退。

表4.分组后第23天B60-55-1的肿瘤生长抑制

注释：

a：平均值±SEM。

b：通过混合标准差t检验对分组后23天的处理组对比媒介物组的平均体重进行的统计分析。

表5.不同B60-55-1组的肿瘤体积的统计分析

注释：通过混合标准差t检验对分组后23天的相对肿瘤体积进行的统计分析。

在分组后第29天，从处死的小鼠中切出所有肿瘤，照相并称重。肿瘤重量的统计分析结果示于表6和图28中。由于在给药完成后肿瘤仍在生长，所以与第23天的肿瘤生长抑制率相比，肿瘤生长抑制率(TGI_TV％)受损。因此，研究终点(第23天)时处理组中的肿瘤重量与媒介物组没有明显差异(P>0.05)。

表6.开始给药后第29天对B60-55-1的肿瘤重量抑制

注释：

a：平均值±SEM。

b：通过独立样品T检验对分组后第29天的平均肿瘤重量进行的统计分析。

在这项研究中，大多数动物的体重逐渐增加。与对照组中的动物相比，B60-55-1组中的动物在体重方面未显示统计学差异(P>0.05)，表明B60-55-1在目前的剂量上是安全的。在阿妥珠单抗和B60-55-1施用后均观察到减小的肿瘤生长速率。在最佳肿瘤生长抑制点(分组后第23天)，媒介物对照组的平均肿瘤体积为2078±459mm³，而在阳性对照处理组中，平均肿瘤体积为1046±336mm³，在B60-55-1处理组中，平均肿瘤体积为1022±552mm³。肿瘤生长抑制TGI_TV％分别为52.7％和53.9％。在该研究的终点(分组后第29天)，在2/8和1/8小鼠中观察到阿妥珠单抗和B60-55-1组中明显的肿瘤消退，肿瘤重量抑制IR_TW％分别为44.2％和31.8％。与对照组相比，B60-55-1组中的动物肿瘤体积，所述化合物具有抗肿瘤活性但无显著差异。

因此，在这项研究中，B60-55-1在10mg/kg的剂量水平上显示与阿妥珠单抗相当的抗肿瘤功效而不会负面影响动物体重或诱导任何异常临床观察。

实施例15：使用人源化NSG^TM小鼠在乳腺癌异种移植模型中评估B60-55-1。

不包括皮肤癌，乳腺癌是女性中最普遍的癌症形式，在她们到70岁(CDC)时，会影响约7％的女性。根据美国癌症协会的估计，2017年美国将有252,710例新诊断的病例和40,610例死亡。在所有阶段的总和中，2006-2012年的5年相对生存率约为90％。三阴性乳腺癌是一种独特的侵袭性乳腺癌亚型，其在临床上对于雌激素和孕激素受体和HER2蛋白的表达呈阴性。当前，没有靶向疗法可用来解决这种形式的乳腺癌。开发原发性人癌症的小鼠模型与人疾病相关，因为其代表了概括人疾病的小鼠临床相关癌症模型。Jackson实验室已在高度免疫缺陷的NSG^TM小鼠品系以及NSG^TM衍生品系(诸如NSG^TM-SGM3)中建立了患者来源的异种移植物(PDX)乳腺癌模型以及细胞系异种移植物模型。因其高效植入人细胞和组织的能力，开发了NSG^TM(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠。由于免疫系统的先天缺陷，移植效率比其他小鼠品系显著提高。人源化NSG^TM(hu-CD34 NSG^TM)小鼠是注射了人CD34+造血干细胞的NSG^TM小鼠，并且已变成体内研究人免疫功能的重要工具。这些小鼠为新型免疫疗法，特别是具有人特异性并且不与小鼠很好地交叉反应的免疫疗法的应用提供了强大的临床前平台。另外，这些模型还用于疾病的基因组学分析和/或临床前药物开发。在这项研究中，在人源化NSG^TM小鼠中建立的MDA-MB-231细胞系乳腺癌异种移植模型用于评估新型抗体。

小鼠和居所

将移植物植入后16周在外周血中具有>25％的人CD45+细胞的植入了人CD34+细胞的雌性hu-CD34 NSG^TM小鼠用于这项研究。使用植入了来自两个供体的CD34+细胞的hu-CD34NSG^TM小鼠群。将小鼠以每笼最多5只小鼠的密度饲养在单独通风的聚砜笼中，并用HEPA过滤空气。用受控的12小时光照/黑暗周期(上午6点至下午6点光照)的人造荧光灯完全照亮动物室。动物房的正常温度和相对湿度范围分别为22-26℃和30-70％。动物房被设置为每小时最多进行15次空气交换。随意提供酸化至pH值为2.5至3.0的过滤后的自来水和标准啮齿动物食物。

方法和记录

将MDA-MB-231细胞在1:1与基质胶(Matrigel)的混合物中以5X 10⁶植入来自两个个体供体的三十八(38)只hu-CD34 NSG^TM小鼠的乳房脂肪垫中。植入后每周记录体重和临床观察1次至2次，并且一旦肿瘤变得可触摸，便将数字卡尺测量用于测定肿瘤体积，每周2次。当肿瘤达到约62-98mm³时基于肿瘤体积将小鼠随机化，并从第0天开始按照表7给药。在给药开始后每周2次记录体重、临床观察和数字卡尺测量。在研究结束之前，对达到身体状况评分≤2、体重减轻≥20％或肿瘤体积>2000mm³的动物实施安乐死。在研究结束之前，对具有溃疡性肿瘤的动物实施安乐死。在研究第41天，通过CO₂窒息对所有剩余动物实施安乐死。

表7.实验设计

*将相同的媒介物用于配制B60-55-1。

**当由于肿胀而不可能通过尾静脉进行静脉注射时，将给药途径切换为IP。在第35天给组3的一只动物进行IP给药，在第38天给组1的一只动物和组3的两只动物进行IP给药。

***在第0、3、7、10、14、17、21、24、28、31、35和38天给动物给药。

结果

研究结果概括在图29和图30中。结果表明，在研究中使用的乳腺癌异种移植模型中，抗体B60-55-1表现出可与派立珠单抗相当的功效。

Tecentriq是Genentech USA,Inc.的注册商标。

尽管已在此处详细地描述了本发明的特定实施方案，本领域技术人员将意识到，可以基于已经公开的指南和教导对更详细的方面进行各种修改和替换；并且所述变化全都落在本发明的范围内。本发明的全部范围由所附权利要求书和任何等效记录给出。

Claims

1.一种抗PD-L1抗体或其抗原结合部分，其包含选自以下的多肽组：

(1)包含分别对应于SEQ ID NO:1、2和3的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链，以及包含分别对应于SEQ ID NO:4、5和6的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链；

(2)包含分别对应于SEQ ID NO:7、8和9的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链，以及包含分别对应于SEQ ID NO:10、11和12的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链；

(3)包含分别对应于SEQ ID NO:13、14和15的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链，以及包含分别对应于SEQ ID NO:16、17和18的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链；

(4)包含分别对应于SEQ ID NO:1、2和19的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链，以及包含分别对应于SEQ ID NO:4、5和6的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链；

(5)包含分别对应于SEQ ID NO:7、20和9的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链，以及包含分别对应于SEQ ID NO:10、11和12的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链；以及

(6)包含分别对应于SEQ ID NO:13、14和15的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链，以及包含分别对应于SEQ ID NO:21、17和18的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链。

2.如权利要求1中所述的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区具有选自以下的序列：

SEQ ID NO:47、49、51、53或54，或分别与所述序列之一具有70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列。

3.如权利要求1中所述的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分，其包含轻链可变区，所述轻链可变区具有选自以下序列的序列：

SEQ ID NO:48、50、52、55或56，或分别与所述序列之一具有70％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性的序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分，其对应于完整抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。

5.如权利要求4中所述的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分，其为还包含在重链可变区与轻链可变区之间的连接肽的scFv。

6.如权利要求5中所述的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分，其中所述连接肽包含SEQ ID NO:67的序列。

7.如权利要求1-4中任一项所述的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分，其中所述重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。

8.如权利要求7中所述的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分，其中所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

9.如权利要求6-8中任一项所述的抗PD-L1抗体或其相应的抗原结合部分，其中所述轻链恒定区是κ区或λ区。

10.一种核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，所述抗体重链可变区包含选自以下的一组氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO:1-3；

(ii)SEQ ID NO:7-9；

(iii)SEQ ID NO:13-15；

(iv)SEQ ID NO:1、2和19；和

(v)SEQ ID NO:7、20和9。

11.如权利要求10所述的核酸分子，其中所述抗体重链可变区包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54。

12.一种核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，所述抗体轻链可变区包含选自以下的一组氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO:4-6；

(ii)SEQ ID NO:10-12；

(iii)SEQ ID NO:16-18；和

(iv)SEQ ID NO:21、17和18。

13.如权利要求12所述的核酸分子，其中所述抗体重链可变区包含选自以下的氨基酸序列：

SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56。

14.一种载体，其包含含有能够编码抗体重链可变区的核酸序列的核酸分子，所述抗体重链可变区包含选自以下的一组氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO:1-3；

(ii)SEQ ID NO:7-9；

(iii)SEQ ID NO:13-15；

(iv)SEQ ID NO:1、2和19；和

(v)SEQ ID NO:7、20和9。

15.如权利要求14所述的载体，其还包含含有能够编码抗体轻链可变区的核酸序列的核酸分子，所述抗体轻链可变区包含选自以下的一组氨基酸序列：

(i)SEQ ID NO:4-6；

(ii)SEQ ID NO:10-12；

(iii)SEQ ID NO:16-18；和

(iv)SEQ ID NO:21、17和18。

16.一种抗PD-L1抗体或所述抗体的抗原结合部分，所述抗体包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的轻链。

17.一种核酸分子，其包含能够编码具有选自以下的序列的多肽的核酸序列：

SEQ ID NO:85；和SEQ ID NO:87。

18.如权利要求17所述的核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:88的序列。

19.一种宿主细胞，其包含能够编码具有选自以下的序列的多肽的核酸：

SEQ ID NO:85；和SEQ ID NO:87。

20.一种组合物，其包含：

具有SEQ ID NO:85的重链和SEQ ID NO:87的轻链的抗体，或所述抗体的抗原结合部分；和

药学上可接受的赋形剂或佐剂。

21.如权利要求21所述的组合物，其包含约275mM的丝氨酸、约10mM的组氨酸，具有约5.9的pH。

22.如权利要求21所述的组合物，其包含约0.05％聚山梨酸酯80、约1％D-甘露醇、约120mM L-脯氨酸、约100mM L-丝氨酸，约10mM L-组氨酸-HCl，具有约5.8的pH。

23.一种治疗或预防与人PD-L1的活性的调节相关的疾病或状况的方法，所述方法包括向需要治疗或预防与人PD-L1的活性的调节相关的疾病的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO.85的重链和SEQ ID NO.87的轻链的抗体或者所述抗体的抗原结合部分。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述疾病是肺癌、卵巢癌、结肠癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、神经胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫癌或骨肉瘤。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述疾病是HBV、HCV或HIV感染。