CN110951663A - 表达pd-1抗体的重组细菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达PD‑1抗体的重组细菌及其构建方法和应用。该表达PD‑1抗体的重组细菌由表达PD‑1抗体的重组表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌Nissle 1917中得到。上述表达PD‑1抗体的重组细菌抗肿瘤效果好。

Description

表达PD-1抗体的重组细菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种表达PD-1抗体的重组细菌及其构建方法和应用。

背景技术

程序性死亡受体1(PD-1)是一种由288个氨基酸组成的免疫抑制分子，是胞内区、胞外区及疏水性跨膜区构成的I型跨膜糖蛋白。PD-1的胞内区由尾部的两个独立的免疫受体酪氨酸转换基序和抑制基序构成，胞外区由位于顶端的信号序列和免疫球蛋白可变区构成。

PD-1经诱导可表达于多种细胞，如活化得T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞以及树突状细胞等。研究表明，肿瘤细胞表达的PD-L1与T细胞表达的PD-1特异性结合后会抑制T细胞的增殖分化能力、降低多种免疫因子的表达以及促进活化的效应细胞T细胞凋亡，从而介导肿瘤细胞的免疫逃逸。在这种情况下，如果能给予PD-1抗体药物，特异性结合PD-1，以阻断肿瘤细胞中PD-L1与T细胞的PD-1结合，则可实现对肿瘤的治疗作用。

尽管上述治疗通路已被证明确切有效，但目前以PD-1抗体为主要活性成份的抗肿瘤药物对肿瘤的治疗效果并不理想。

发明内容

基于此，有必要提供一种抗肿瘤效果好的表达PD-1抗体的重组细菌。

一种表达PD-1抗体的重组细菌，由表达PD-1抗体的重组表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌Nissle 1917中得到。

上述表达PD-1抗体的重组细菌利用减毒鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌Nissle 1917的肿瘤靶向性及肿瘤抑制作用，实现了表达PD-1抗体的重组细菌在肿瘤处直接表达PD-1抗体，使得PD-1抗体具有靶向性，避免了PD-1抗体无法在肿瘤细胞特异性聚集，提高PD-1抗体的有效利用率，从而提高PD-1抗体的抗肿瘤效果。

在其中一个实施例中，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

在其中一个实施例中，所述表达PD-1抗体的重组表达载体包括目的表达片段，所述目的表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或所述目的表达片段含有如SEQID No.2所示的核苷酸序列，或所述目的表达片段含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

一种表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，包括以下步骤：

将含有编码PD-1抗体的核苷酸序列的目的表达片段导入表达空载体，得到重组表达载体；及

将所述重组表达载体转化到宿主中，得到表达PD-1抗体的重组细菌，所述宿主为减毒鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌Nissle 1917。

在其中一个实施例中，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

在其中一个实施例中，所述目的表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或所述目的表达片段含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，或所述目的表达片段含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

在其中一个实施例中，还包括所述目的表达片段的制备步骤，所述目的表达片段的制备步骤包括：

以pUC57-hPD-1为模板，通过PCR扩增，获得含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的目的表达片段；或

以pUC57-mPD-1为模板，通过PCR扩增，获得含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的目的表达片段或含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的目的表达片段。

在其中一个实施例中，获得含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的目的表达片段的步骤中，PCR的引物如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；获得含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的目的表达片段的步骤中，PCR的引物如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；获得含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的目的表达片段的步骤中，PCR的引物如SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11所示。

在其中一个实施例中，所述表达空载体为Abvec-Igk质粒或pET-28c质粒。

在其中一个实施例中，所述目的表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者所述目的表达片段含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述表达空载体为Abvec-Igk质粒，所述宿主为减毒鼠伤寒沙门氏菌。

上述表达PD-1抗体的重组细菌或上述表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法制得的表达PD-1抗体的重组细菌在制备抗肿瘤药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述肿瘤为黑色素瘤、宫颈癌。

一种抗肿瘤药物，包括上述表达PD-1抗体的重组细菌或上述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法制得的表达PD-1抗体的重组细菌。

附图说明

图1为实施例1的重组质粒Abvec-Igk-hPD-1、重组质粒Abvec-Igk-mPD-1、重组质粒pET-28c-mPD-1的结构示意图；

图2为实施例1中注射Abvec-Igk-hPD-1-VNP20009后宫颈癌模型小鼠的肿瘤体积变化图；

图3是实施例1中注射Abvec-Igk-mPD-1-VNP20009、pET-28c-mPD-1-VNP20009、pET-28c-mPD-1-Nissle 1917后黑色素瘤模型小鼠的肿瘤体积变化图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一实施方式的表达PD-1抗体的重组细菌，由表达PD-1抗体的重组表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌Nissle 1917中而得到。

虽然PD-1抗体能够作为抗肿瘤药物的有效成分，但常规给药方式下，PD-1抗体无法在肿瘤内特异性聚集，使其靶向性差。而上述表达PD-1抗体的重组细菌利用减毒鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌Nissle 1917的肿瘤靶向性及肿瘤抑制作用，实现了表达PD-1抗体的重组细菌在肿瘤处直接表达PD-1抗体，能够使得PD-1抗体具有靶向性，避免了PD-1抗体无法对肿瘤细胞特异性聚集，提高PD-1抗体的有效利用率，从而提高PD-1抗体的抗肿瘤效果。

具体地，表达PD-1抗体的重组表达载体包括目的表达片段。目的表达片段包括表达PD-1抗体的核苷酸片段。进一步地，目的表达片段包括表达PD-1单克隆抗体的核苷酸片段。在本实施方式中，目的表达片段还包括与表达空载体对应的用于制备重组表达载体的酶切位点。

在其中一个实施例中，目的表达片段含有编码表达人源PD-1单克隆抗体的核苷酸片段。进一步地，目的表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列包括Age I和Hind III的酶切位点和编码人源PD-1单克隆抗体的核苷酸序列。具体地，如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列为：5’-ACCGGTCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTGAGAACCTGTACTTCCAAGGTGCTAGCGAACTGGTGGTAACTCAAGAACCGTCTCTGACCGTGTCTCCAGGTGGCACCGTCACTCTGACCTGTGGTTCTAGCACTGGTGCAGTCACCAGCGGTAACTATCCGAGCTGGCCGCAACAGAAACCAGCACAGGCTCCGCGTCCACTGATCTACACTACCACTAACAAACACTCTTGGACCCCAGCTCAGTTCTCTGGCTCTCTGCTCGGTGGCAAAGCTGTACTGACTCTGTCTGGTGTTCAGCCAGAAGACGAAGCTGACTATTACTGCCGTCTGTTCTATGGTGGTCCGTGGGTCTTTGGTGGCGGTACTCAGCTGACCGACCTGGGTGGTGGCTCTTCTCGTAGCTCCGAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGTCGTGGCCTGGTACAGCCAGGTGGCTCTCTGCGTCTGTCTTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCTTCAGCAGCTATGCTACCAACTGGGTACGTCAGGCTCCAGGTAAAGGTCTGGAGTGGGTCTCTCTGATCTCTGGTAGCGGTGGTTCTACCTTCTACGCAGACTCTGTGAAAGACCGTTACACCATCTCTCGTGACAACTCCAAGAACACGGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGATGAAGACACTGCAGTCTATTACTGTGCACGTGTGTCTCCGTTCGACTACGGTGCTGATTATTGGGGTCAAGGTACTCTGGTCACCGTCAGCTCTGCATCTACTCAGTCTCCATCTGTCACTAGCTGAAAGCTT-3’。

在其中一个实施例中，目的表达片段含有编码表达鼠源PD-1单克隆抗体的核苷酸片段。进一步地，目的表达片段含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列包括Age I和Hind III的酶切位点和编码鼠源PD-1单克隆抗体的核苷酸序列。具体地，如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为：

5’-ACCGGTTATGAGCTGACTCAGCCACCTTCAGCATCAGTCAATGTAGGAGAGACTGTCAAAATCACCTGCTCTGGGGACCAATTGCCGAAATATTTTGCAGATTGGTTTCATCAAAGGTCAGACCAGACCATTTTGCAAGTGATATATGATGATAATAAGCGCCCCTCGGGGATCCCTGAAAGAATCTCTGGGTCCAGCTCAGGGACAACAGCCACCTTGACCATCAGAGATGTCCGGGCTGAGGATGAAGGTGACTATTACTGTATCTCAGGATATGTTGATAGTGATAGCAAATTGTATGTTTTTGGCAGCGGAACCCAGCTCACCGTCCTAGGTTGTGGCTGCGGCGGAGGCGGAAGCGGAGGCGGATGTGGCTGCTCATCCGTCACTGTCCAAACCGGGCAAGGTTGGTTCGATCTGTCTCCCTATGGAAGCGGAGATAGATCATGTTACTATACTGCCACGGACGAGACTAGACTGAACAACATGCAACTGTACGTTATGAGCCGATCCGATGATAGATCCATCACCTTCAGAGGCAAAGTGTCGGGTTCGTACTATACTGCATATAATTATAGTAAAACGTACATACACGCTGTTTGGGAGCTGGGGAAGGGGCCAGCTCAGCGCGTCTGGAGCATGTTCTATGACAGTTTCACCTTCGGATCTGCCGTGTGTTCCCTCAAACTGTCAGGGCAGCCTAAGGTGTTAGGAGGAGGTTCTGAGCTGCTTCGGGTGGAGCATCATCACCATCACCATTAAATGCTT-3’。

在另一个实施例中，目的表达片段含有编码表达鼠源PD-1单克隆抗体的核苷酸片段，目的表达片段含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列包括Nco I和Xho I的酶切位点和编码鼠源PD-1单克隆抗体的核苷酸序列。具体地，如SEQID No.3所示的核苷酸序列为：

5’-ATGGAGTATGAGCTGACTCAGCCACCTTCAGCATCAGTCAATGTAGGAGAGACTGTCAAAATCACCTGCTCTGGGGACCAATTGCCGAAATATTTTGCAGATTGGTTTCATCAAAGGTCAGACCAGACCATTTTGCAAGTGATATATGATGATAATAAGCGCCCCTCGGGGATCCCTGAAAGAATCTCTGGGTCCAGCTCAGGGACAACAGCCACCTTGACCATCAGAGATGTCCGGGCTGAGGATGAAGGTGACTATTACTGTTTCTCAGGATATGTTGATAGTGATAGCAAATTGTATGTTTTTGGCAGCGGAACCCAGCTCACCGTCCTAGGTTGTGGCTGCGGCGGAGGCGGAAGCGGAGGCGGATGTGGCTGCTCATCCGTCACTGTCCAAACCGGGCAAGGTTGGTTCGATCTGTCTCCCTATGGAAGCGGAGATAGAACATGTTACTATACTGCCACGGACGAGACTAGACTGAACAACATGCAACTGTACGTCATGAGCCGATCCGATGATAGATCCATCACCTTCAGAGGCAAAGTGTCGGGTTCGTACTATACTGCATATAATTATAGTAAAACGTACATACACGCTGTTTGGGAGCTGGGGAAGGGGCCAGCTCAGCGCGTCTGGAGCATGTTCTATGACAGTTTCACCTTCGGATCTGCCGTGTGTTCCCTCAAACTGTCAGGGGAGCCTAAGGTGTTAGGAGGAGGTTCTGAGCTGCTTCGGGTGGAGCTCGAG-3’。

优选地，减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009是一种具有肿瘤靶向性及肿瘤抑制作用的鼠伤寒沙门氏菌；并且减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009具有的遗传毒性减弱(puri基因缺失)、败血症性休克电位的降低(msbb基因缺失)和抗生素敏感性，具有极好的安全性。

在其中一个实施例中，表达PD-1抗体的重组细菌由表达PD-1抗体的重组表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中而得到，其中，表达PD-1抗体的重组表达载体包括含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的目的表达片段。

在其中一个实施例中，表达PD-1抗体的重组细菌由表达PD-1抗体的重组表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中而得到，其中，表达PD-1抗体的重组表达载体包括含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的目的表达片段。

在其中一个实施例中，表达PD-1抗体的重组细菌由表达PD-1抗体的重组表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中而得到，其中，表达PD-1抗体的重组表达载体包括含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的目的表达片段。

在其中一个实施例中，表达PD-1抗体的重组细菌由表达PD-1抗体的重组表达载体转化到大肠杆菌Nissle 1917中而得到，其中，表达PD-1抗体的重组表达载体包括含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的目的表达片段。

在其中一个实施例中，重组表达载体的空载体为Abvec-Igk质粒或pET-28c质粒。Abvec-Igk质粒是核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；pET-28c质粒是核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子。具体地，如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为：

5’-TTCGAGCTCGCCCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAGAATAACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCACCTCGGTTCTATCGATTGAATTCCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACACTCGAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGAAGCTTGGCCGCCATGGCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGATCGGGAATTAATTCGGCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGGAACTTGGTTAGGTACCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTGTTAACAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCCTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGTAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGTATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGATGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCAGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCA-3’。具体地，如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列为：

5’-ATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCGAATTCGGATCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGAGATCCCGGACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCGGGATCTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCTAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGAATTAATTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCA-3’。

一实施方式的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，包括步骤S110～步骤S120。具体地：

步骤S110：将含有编码PD-1抗体的核苷酸序列的目的表达片段导入表达空载体，得到重组表达载体。

具体地，将含有编码PD-1抗体的核苷酸序列的目的表达片段通过酶切酶连的方式导入表达空载体。目的表达片段包括与表达空载体上的酶切位点对应的酶切位点。目的表达片段上的酶切位点用于目的表达片段与表达空载体经相同的限制性内切酶酶切后可以在连接酶的作用下连接，以制备重组表达载体。进一步地，连接酶为T4连接酶。

在其中一个实施例中，目的表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或者，目的表达片段含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或者，目的表达片段含有如SEQID No.3所示的核苷酸序列。

在其中一个实施例中，还包括目的表达片段的制备步骤。具体地，目的表达片段的制备步骤包括：以pUC57-hPD-1为模板，通过PCR扩增，获得含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的目的表达片段。进一步地，PCR的引物如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。如SEQID No.6所示的引物的核苷酸序列为：5’-CTTCACCGGTCACCATCATCATCATCAT-3’；如SEQ IDNo.7所示的引物的核苷酸序列为：5’-TGCGAAGCTTTCAGCTAGTGACAGATGG-3’。

在另一个实施例中，目的表达片段的制备步骤包括：以pUC57-mPD-1为模板，通过PCR扩增，获得含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的目的表达片段或含有如SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列的目的表达片段。

进一步地，获得含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的目的表达片段的步骤中，PCR的引物如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；具体地，如SEQ ID No.8所示的引物的核苷酸序列为：5’-CTTCACCGGTTATGAGCTGACTCAG-3’。具体地，如SEQ ID No.9所示的引物的核苷酸序列为：5’-TATTAAGCTTTTAATGGTGATGGTGATGATGCTCCACCCGAAGCAG-3’。

进一步地，获得含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的目的表达片段的步骤中，PCR的引物如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。具体地，如SEQ ID No.10所示的引物的核苷酸序列为：5’-CTTCCCATGGAGTATGAGCTGACTCAG-3’。如SEQ ID No.11所示的引物的核苷酸序列为：5’-TATTCTCGAGCTCCACCCGAAGCAG-3’。

表达空载体可以为本领域常用的用于表达的空载体。本实施方式中，表达空载体为Abvec-Igk质粒或pET-28c质粒。Abvec-Igk质粒是核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子；pET-28c质粒是核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子。

进一步地，将含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的目的表达片段导入Abvec-Igk质粒，得到Abvec-Igk-hPD-1重组质粒。将含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的目的表达片段导入Abvec-Igk质粒，得到Abvec-Igk-mPD-1重组质粒。将含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的目的表达片段导入pET-28c质粒，得到pET-28c-mPD-1重组质粒。

当然，在将目的表达片段导入表达空载体后，还包括验证目的表达片段是否正确导入表达空载体及将已经正确插入目的表达片段的重组表达载体进行扩大培养的步骤。具体地，验证目的表达片段是否正确导入表达空载体的方式包括菌落抗性筛选或测序。

步骤S120：将重组表达载体转化到宿主中，得到表达PD-1抗体的重组细菌，宿主为减毒鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌Nissle 1917。

优选地，减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

在其中一个实施例中，重组表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌的方式为电转化。具体地，采用0.1cm电转杯，以1.8kV，200Ω，25μF，电转4.7ms的条件，将重组表达载体电转至感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中；然后通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，得到表达PD-1抗体的重组细菌。

进一步地，将Abvec-Igk-hPD-1重组质粒、Abvec-Igk-mPD-1重组质粒、pET-28c-mPD-1重组质粒分别电转至感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中；然后通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，得到三种表达PD-1抗体的重组细菌。

在其中一个实施例中，感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的制备步骤包括：将减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100的比例接种于100mL LB培养基中，振荡培养至细菌OD值为0.4；冰浴20min，而后以4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃、3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，得到感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

在其中一个实施例中，重组表达载体转化到大肠杆菌Nissle 1917的方式为热激转化。具体地，将重组表达载体与感受态的大肠杆菌Nissle 1917混合冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min；然后通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆，得到表达PD-1抗体的重组细菌。进一步地，将pET-28c-mPD-1重组质粒与感受态的大肠杆菌Nissle 1917混合冰浴30min，42℃热激60s，冰浴2min；然后通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆，得到表达PD-1抗体的重组细菌。

进一步地，感受态的大肠杆菌Nissle 1917是通过以下方法制备的：将大肠杆菌Nissle 1917划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落接种于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100比例接种于100mL LB培养基中振荡培养至细菌OD值为0.4；冰浴30min，然后以4℃、5000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的0.1M CaCl₂重悬，冰浴20min后洗涤1次，以4℃、5000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的含0.1M CaCl₂的10％甘油中，得到感受态的大肠杆菌Nissle 1917。

当然，在其他实施方式中，可以使用本领域常用的其他转化方式将重组表达载体转化到感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌中。

上述表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法简捷易操作，适合工业化生产。并且上述表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009介导真核和原核质粒转染细胞，实现真核和原核表达，以及采用大肠杆菌Nissle 1917介导原核质粒转染细胞，实现原核表达。

上述表达PD-1抗体的重组细菌或上述表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法制得的表达PD-1抗体的重组细菌在制备抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤药物，包括上述表达PD-1抗体的重组细菌或上述表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法制得的表达PD-1抗体的重组细菌。

上述抗肿瘤药物包括上述表达PD-1抗体的重组细菌，通过表达PD-1抗体的重组细菌在实体瘤处表达hPD-1抗体或mPD-1抗体，使之与T细胞的PD-1结合，从而阻断肿瘤细胞中PD-L1与T细胞的PD-1的结合，进而实现在肿瘤处聚集而杀伤肿瘤细胞的作用。上述抗肿瘤药物能够特异性地、靶向性地杀伤肿瘤细胞的同时降低其对机体正常细胞的损伤，抗肿瘤效果好。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实验中所采用的原始质粒pet28c、E.coli DH5α、大肠杆菌Nissle 1917、限制性内切酶、T4DNA连接酶、LB固体培养基及液体培养基，均为常规生化实验材料，均自市面购得；Abvec-Igk质粒可以根据现有技术制备获得。

实施例1

(1)获得目的表达片段：

以包含有人源hPD-1序列的pUC57-hPD-1质粒为模板，如SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7所示的核苷酸序列为引物，通过PCR扩增，获得如SEQ ID No.1所示的目的表达片段：Age-I-hPD-1-Hind III片段。

以包含鼠源mPD-1的pUC57-mPD-1质粒为模板，如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的核苷酸序列为引物，通过PCR扩增，获得如SEQ ID No.2所示的目的表达片段；Age-I-mPD-1-Hind III片段。

以包含鼠源mPD-1的pUC57-mPD-1质粒为模板，如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的核苷酸序列为引物，通过PCR扩增，获得如SEQ ID No.3所示的目的表达片段：Nco I-mPD-1-Xho I片段。

(2)重组表达载体的构建：

将步骤(1)获得的Age-I-hPD-1-Hind III片段和Abvec-Igk质粒(SEQ ID No.4)分别经Age I和Hind III双酶切，并将双酶切产物纯化后采用T4连接酶连接，得到重组表达载体Abvec-Igk-hPD-1，或称重组质粒Abvec-Igk-hPD-1。重组质粒Abvec-Igk-hPD-1的结构示意图如图1所示。

将步骤(1)获得的Age-I-mPD-1-Hind III片段和Abvec-Igk质粒分别经Age I和Hind III双酶切，并将双酶切产物纯化后采用T4连接酶连接，得到重组表达载体Abvec-Igk-mPD-1，或称重组质粒Abvec-Igk-mPD-1。重组质粒Abvec-Igk-mPD-1的结构示意图如图1所示。

将步骤(1)获得的Nco I-mPD-1-Xho I片段和pET-28c(SEQ ID No.5)分别经Nco I和Xho I双酶切，并将双酶切产物纯化后采用T4连接酶连接，得到重组表达载体pET-28c-mPD-1，或称重组质粒pET-28c-mPD-1。重组质粒pET-28c-mPD-1的结构示意图如图1所示。

(3)感受态制备：

将-80℃保存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mL LB中，37℃振荡培养12h；按1：100比例接种于100mL LB中振荡培养至细菌OD＝0.4左右；冰浴20min后，4℃，5000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃，5000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃，5000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，得到感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，分装后-80℃留存备用。

将-80℃保存的大肠杆菌Nissle 1917划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mL LB中，37℃振荡培养12h；按1：100比例接种于100mL LB中振荡培养至细菌OD＝0.4左右；冰浴30min后，4℃，5000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的0.1M CaCl₂重悬，冰浴20min后洗涤1次，4℃，5000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的含0.1M CaCl₂的10％甘油中，制成感受态的大肠杆菌Nissle 1917，分装后-80℃留存备用。

(4)转化及筛选：

采用0.1cm电转杯将步骤(2)获得的重组质粒Abvec-Igk-hPD-1、重组质粒Abvec-Igk-mPD-1和重组质粒pET-28c-mPD-1分别电转进入感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，电转条件为：1.8kv 200Ω25μF，电转4.7ms；然后通过氨苄青霉素和卡纳霉素抗性筛选出阳性克隆，获得三种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。三种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009对应命名为Abvec-Igk-hPD-1-VNP20009、Abvec-Igk-mPD-1-VNP20009和pET-28c-mP D-1-VNP20009。

将步骤(2)获得的重组质粒pET-28c-mPD-1转化至感受态的大肠杆菌Nissle 1917中，条件：冰浴30min后，42℃60s，冰浴2min；通过卡纳霉素抗性筛选出阳性克隆，获得重组大肠杆菌Nissle 1917，命名为pET-28c-mPD-1-Nissle 1917。

(5)效果测试：

人宫颈癌HeLa细胞(2×10⁷/mL)溶解于PBS溶液，注射于babl-c裸鼠靠近宫颈部位的阴道黏膜下层，每只25μL，持续注射7天，得到小鼠宫颈癌模型。小鼠黑色素瘤B16F10细胞接种于C57BL/6小鼠皮下，得到黑色素瘤模型小鼠。

将宫颈癌模型小鼠随机均等分为3组，每组10只，并命名为Model组、VNP20009组和Abvec-Igk-hPD-1-VNP20009组。然后将减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009、步骤(4)获得的Abvec-Igk-hPD-1-VNP20009分别通过尾静脉以1×10⁵CFU的注射量注射至对应组别的宫颈癌模型小鼠中，其中Model组为以生理盐水为注射物的空白对照。对各组宫颈癌模型小鼠的治疗每三天进行一次，每3天对宫颈癌模型小鼠的肿瘤体积进行一次测量，实验结束(或小鼠死亡)后从宫颈癌模型小鼠体内取出肿瘤并测量直径和称重，结果如图2所示。图2中，横坐标为时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm³)。

将黑色素瘤模型小鼠随机均等分为5组，每组10只，并命名为Model组、VNP20009组、Abvec-Igk-mPD-1-VNP20009组、pET-28c-mPD-1-VNP20009组和pET-28c-mPD-1-Nissle1917组。将减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009、步骤(4)获得的Abvec-Igk-mPD-1-VNP20009、pET-28c-mPD-1-VNP20009和pET-28c-mPD-1-Nissle 1917分别通过尾静脉以1×10⁵CFU的注射量注射至对应组别的黑色素瘤模型小鼠中，其中Model组为以生理盐水为注射物的空白对照。对各组黑色素瘤模型小鼠的治疗每三天进行一次，每3天对黑色素瘤模型小鼠的肿瘤体积进行一次测量，实验结束(或小鼠死亡)后从小鼠体内取出肿瘤并测量直径和称重，结果如图3所示。图3中，横坐标为时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm³)

由图2可知，Abvec-Igk-hPD-1-VNP20009对宫颈癌细胞的生长有明显抑制。

由图3可知，Abvec-Igk-mPD-1-VNP20009、pET-28c-mPD-1-VNP20009和pET-28c-mPD-1-Nissle 1917对黑色素瘤细胞的生长有明显的抑制。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市前海金卓生物技术有限公司

<120> 表达PD-1抗体的重组细菌及其构建方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accggtcacc atcatcatca tcattcttct ggtgagaacc tgtacttcca aggtgctagc 60

gaactggtgg taactcaaga accgtctctg accgtgtctc caggtggcac cgtcactctg 120

acctgtggtt ctagcactgg tgcagtcacc agcggtaact atccgagctg gccgcaacag 180

aaaccagcac aggctccgcg tccactgatc tacactacca ctaacaaaca ctcttggacc 240

ccagctcagt tctctggctc tctgctcggt ggcaaagctg tactgactct gtctggtgtt 300

cagccagaag acgaagctga ctattactgc cgtctgttct atggtggtcc gtgggtcttt 360

ggtggcggta ctcagctgac cgacctgggt ggtggctctt ctcgtagctc cgaagttcag 420

ctgctggaat ctggtcgtgg cctggtacag ccaggtggct ctctgcgtct gtcttgtgca 480

gcttctggct tcaccttcag cagctatgct accaactggg tacgtcaggc tccaggtaaa 540

ggtctggagt gggtctctct gatctctggt agcggtggtt ctaccttcta cgcagactct 600

gtgaaagacc gttacaccat ctctcgtgac aactccaaga acacggtgta tctgcagatg 660

aacagcctgc gtgatgaaga cactgcagtc tattactgtg cacgtgtgtc tccgttcgac 720

tacggtgctg attattgggg tcaaggtact ctggtcaccg tcagctctgc atctactcag 780

tctccatctg tcactagctg aaagctt 807

<210> 2

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accggttatg agctgactca gccaccttca gcatcagtca atgtaggaga gactgtcaaa 60

atcacctgct ctggggacca attgccgaaa tattttgcag attggtttca tcaaaggtca 120

gaccagacca ttttgcaagt gatatatgat gataataagc gcccctcggg gatccctgaa 180

agaatctctg ggtccagctc agggacaaca gccaccttga ccatcagaga tgtccgggct 240

gaggatgaag gtgactatta ctgtatctca ggatatgttg atagtgatag caaattgtat 300

gtttttggca gcggaaccca gctcaccgtc ctaggttgtg gctgcggcgg aggcggaagc 360

ggaggcggat gtggctgctc atccgtcact gtccaaaccg ggcaaggttg gttcgatctg 420

tctccctatg gaagcggaga tagatcatgt tactatactg ccacggacga gactagactg 480

aacaacatgc aactgtacgt tatgagccga tccgatgata gatccatcac cttcagaggc 540

aaagtgtcgg gttcgtacta tactgcatat aattatagta aaacgtacat acacgctgtt 600

tgggagctgg ggaaggggcc agctcagcgc gtctggagca tgttctatga cagtttcacc 660

ttcggatctg ccgtgtgttc cctcaaactg tcagggcagc ctaaggtgtt aggaggaggt 720

tctgagctgc ttcgggtgga gcatcatcac catcaccatt aaatgctt 768

<210> 3

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagtatg agctgactca gccaccttca gcatcagtca atgtaggaga gactgtcaaa 60

atcacctgct ctggggacca attgccgaaa tattttgcag attggtttca tcaaaggtca 120

gaccagacca ttttgcaagt gatatatgat gataataagc gcccctcggg gatccctgaa 180

agaatctctg ggtccagctc agggacaaca gccaccttga ccatcagaga tgtccgggct 240

gaggatgaag gtgactatta ctgtttctca ggatatgttg atagtgatag caaattgtat 300

gtttttggca gcggaaccca gctcaccgtc ctaggttgtg gctgcggcgg aggcggaagc 360

ggaggcggat gtggctgctc atccgtcact gtccaaaccg ggcaaggttg gttcgatctg 420

tctccctatg gaagcggaga tagaacatgt tactatactg ccacggacga gactagactg 480

aacaacatgc aactgtacgt catgagccga tccgatgata gatccatcac cttcagaggc 540

aaagtgtcgg gttcgtacta tactgcatat aattatagta aaacgtacat acacgctgtt 600

tgggagctgg ggaaggggcc agctcagcgc gtctggagca tgttctatga cagtttcacc 660

ttcggatctg ccgtgtgttc cctcaaactg tcaggggagc ctaaggtgtt aggaggaggt 720

tctgagctgc ttcgggtgga gctcgag 747

<210> 4

<211> 4119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcgagctcg cccgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 60

ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 120

ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 180

acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 240

ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 300

aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 360

tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 420

gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 480

gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 540

ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 600

ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 660

caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt 720

gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc ccaccccctt ggcttcgtta 780

gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac acatacgatt taggtgacac 840

tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc 900

acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt 960

agcaactgca accggtgtac actcgagcgt acggtggctg caccatctgt cttcatcttc 1020

ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 1080

ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 1140

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 1200

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 1260

cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gaagcttggc 1320

cgccatggcc caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 1380

caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca 1440

tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcgatc gggaattaat tcggcgcagc accatggcct 1500

gaaataacct ctgaaagagg aacttggtta ggtaccttct gaggcggaaa gaaccagctg 1560

tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg 1620

caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca 1680

ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact 1740

ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 1800

atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag 1860

tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc tgttaacagc ttggcactgg 1920

ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 1980

cagcacatcc ccccttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 2040

cccaacagtt gcgtagcctg aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 2100

atctgtgcgg tatttcacac cgcatacgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg 2160

cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc 2220

cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc 2280

ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct 2340

cgaccccaaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac 2400

ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac 2460

tggaacaaca ctcaacccta tctcgggcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat 2520

ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa 2580

aatattaacg tttacaattt tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 2640

gttaagccaa ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg ctgcgccccg acacccgcca 2700

acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct 2760

gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg 2820

aggcagtatt cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc 2880

atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc 2940

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 3000

tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc 3060

gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg 3120

gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat 3180

ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc 3240

acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg atgacgccgg gcaagagcaa 3300

ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa 3360

aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt 3420

gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct 3480

tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat 3540

gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgccag cagcaatggc aacaacgttg 3600

cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg 3660

atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt 3720

attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg 3780

ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg 3840

gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg 3900

tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa 3960

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 4020

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 4080

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaacca 4119

<210> 5

<211> 5367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgacccat ttgctgtcca ccagtcatgc tagccatatg 240

gctgccgcgc ggcaccaggc cgctgctgtg atgatgatga tgatggctgc tgcccatggt 300

atatctcctt cttaaagtta aacaaaatta tttctagagg ggaattgtta tccgctcaca 360

attcccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atctcgatcc tctacgccgg 420

acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga 480

catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt 540

gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc 600

attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca 660

ggagtcgcat aagggagagc gtcgagatcc cggacaccat cgaatggcgc aaaacctttc 720

gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag 780

taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg 840

tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg 900

agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga 960

ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta 1020

aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg 1080

tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca 1140

ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc 1200

cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg 1260

aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc 1320

tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat 1380

atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt 1440

ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg 1500

ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg 1560

ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca tgttatatcc 1620

cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct 1680

tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg 1740

tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 1800

attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 1860

gcaattaatg taagttagct cactcattag gcaccgggat ctcgaccgat gcccttgaga 1920

gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt cgccgcactt 1980

atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct ctgggtcatt 2040

ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct tgcggtattc 2100

ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa acgtttcggc 2160

gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg 2220

tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg 2280

atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca 2340

tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc 2400

accattatgt tccggatctg catcgcagga tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca 2460

tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc 2520

cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta 2580

acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc atcggtatca ttacccccat gaacagaaat 2640

cccccttaca cggaggcatc agtgaccaaa caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc 2700

tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa 2760

caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc 2820

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 2880

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 2940

ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 3000

ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat 3060

accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac 3120

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 3180

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 3240

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 3300

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 3360

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 3420

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 3480

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 3540

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 3600

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 3660

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 3720

aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 3780

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 3840

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 3900

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgaaca ataaaactgt 3960

ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt 4020

gctctaggcc gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc 4080

gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc 4140

cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg 4200

tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta 4260

ctcctgatga tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat 4320

tagaagaata tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc 4380

ggttgcattc gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg 4440

ctcaggcgca atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc 4500

gtaatggctg gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac 4560

cggattcagt cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga 4620

aattaatagg ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg 4680

ccatcctatg gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa 4740

aatatggtat tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt 4800

ttttctaaga attaattcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 4860

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg aaattgtaaa cgttaatatt 4920

ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 4980

atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 5040

gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 5100

gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 5160

aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 5220

ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 5280

gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 5340

ccgctacagg gcgcgtccca ttcgcca 5367

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttcaccggt caccatcatc atcatcat 28

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcgaagctt tcagctagtg acagatgg 28

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttcaccggt tatgagctga ctcag 25

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tattaagctt ttaatggtga tggtgatgat gctccacccg aagcag 46

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttcccatgg agtatgagct gactcag 27

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tattctcgag ctccacccga agcag 25

Claims (13)

1.一种表达PD-1抗体的重组细菌，其特征在于，由表达PD-1抗体的重组表达载体转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌Nissle 1917中得到。

2.根据权利要求1所述的表达PD-1抗体的重组细菌，其特征在于，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

3.根据权利要求1或2所述的表达PD-1抗体的重组细菌，其特征在于，所述表达PD-1抗体的重组表达载体包括目的表达片段，所述目的表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或所述目的表达片段含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，或所述目的表达片段含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

4.一种表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

将含有编码PD-1抗体的核苷酸序列的目的表达片段导入表达空载体，得到重组表达载体；及

将所述重组表达载体转化到宿主中，得到表达PD-1抗体的重组细菌，所述宿主为减毒鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌Nissle 1917。

5.根据权利要求4所述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，其特征在于，所述减毒鼠伤寒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。

6.根据权利要求4所述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，其特征在于，所述目的表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或所述目的表达片段含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，或所述目的表达片段含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，其特征在于，还包括所述目的表达片段的制备步骤，所述目的表达片段的制备步骤包括：

以pUC57-hPD-1为模板，通过PCR扩增，获得含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的目的表达片段；或

以pUC57-mPD-1为模板，通过PCR扩增，获得含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的目的表达片段或含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的目的表达片段。

8.根据权利要求7所述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，其特征在于，获得含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的目的表达片段的步骤中，PCR的引物如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；获得含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的目的表达片段的步骤中，PCR的引物如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示；获得含有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的目的表达片段的步骤中，PCR的引物如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示。

9.根据权利要求4～6任一项所述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，其特征在于，所述表达空载体为Abvec-Igk质粒或pET-28c质粒。

10.根据权利要求4所述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法，其特征在于，所述目的表达片段含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或者所述目的表达片段含有如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列，所述表达空载体为Abvec-Igk质粒，所述宿主为减毒鼠伤寒沙门氏菌。

11.权利要求1～3任一项所述的表达PD-1抗体的重组细菌或权利要求4～10任一项所述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法制得的表达PD-1抗体的重组细菌在制备抗肿瘤药物中的应用。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤、宫颈癌。

13.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的表达PD-1抗体的重组细菌或权利要求4～10任一项所述的表达PD-1抗体的重组细菌的构建方法制得的表达PD-1抗体的重组细菌。

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