CN111662995A

CN111662995A - Dna条形码、引物、试剂盒、方法和应用

Info

Publication number: CN111662995A
Application number: CN201910168842.0A
Authority: CN
Inventors: 徐丹洋; 施佳辉; 徐平; 唐蜀昆; 高林瑞; 田飞; 高慧英; 职晓阳; 丁章贵
Original assignee: Yunnan Dayi Microbial Technology Co ltd; Menghai Tea Industry Co ltd
Current assignee: Yunnan Dayi Microbial Technology Co ltd; Menghai Tea Industry Co ltd
Priority date: 2019-03-06
Filing date: 2019-03-06
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2039-03-06
Also published as: CN111662995B

Abstract

本发明提供了DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用。所述DNA条形码来源于黑曲霉TMCC 70012菌株的基因组，并且包含选自如SEQ ID No.4所示的DNA序列中的至少500bp的序列，并且该DNA条形码的长度为500bp‑4000bp。本发明的DNA条形码序列能实现黑曲霉种内菌种的快速鉴别与区分。由此，本发明建立了普洱茶工业发酵生产菌株黑曲霉TMCC 70012的标准基因序列和样品鉴别方法，相比于传统的形态学鉴定方法，显著提高了鉴定效率。

Description

DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用

技术领域

本发明属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及一种用于鉴别普洱茶发酵生产菌株的DNA条形码引物组合物、DNA条形码、试剂盒、方法及应用。具体而言，所述普洱茶发酵生产菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)TMCC 70012。

背景技术

普洱茶是一种具有云南地理标识范围内生产的后发酵茶，其采用大叶种晒青毛茶作为原料，经过一系列工艺制作而成。传统的普洱茶制作过程为：采摘的新鲜茶叶经揉捻、晒青后制成原料晒青毛茶，之后经除杂、潮水、渥堆、晾干、筛分、压制成型、包装出厂。在普洱茶的生产中，渥堆发酵过程是普洱茶品质形成的主要因素，在此过程中，茶叶中诸如茶多酚、咖啡因以及一些多糖物质等内含成分发生了巨大变化，成就了普洱茶的特殊风味、口感、品质以及各种保健功效。

在传统的普洱茶生产中，湿热的环境激活茶叶本身所含的酶，使得茶叶中所含的一部分内含成分转化成微生物能利用的物质；普洱茶发酵过程中微生物也大量生长，产生丰富的胞内酶和胞外酶，催化茶叶中内含成分发生一系列转变，由此形成普洱茶独特的品质。不同的产地，微生物种类及其群落结构的差异，使得普洱茶风味及品质也各具特色。

普洱茶除了其独特的风味和文化外，其诸如减肥、降血糖和血脂、预防和改善心血管疾病、抗衰老、抗癌、消炎、助消化以及养胃等保健功效也备受人们关注，并越来越受消费者欢迎。逐渐增加的市场需求拉动了普洱茶产业的发展，促进了云南地区经济增长。

目前多数生产商的普洱茶生产仍然是半自然人工渥堆的经验式发酵，虽然渥堆过程中以包括黑曲霉(Aspergillus niger)在内的优势共性微生物为主的群落相对稳定，但产品的稳定性还存在较大的提升空间。要进一步获得消费者的青睐和市场的认可、突破外贸壁垒，提升普洱茶企业的市场竞争力，必须实现普洱茶生产的人工可控、清洁化以及高效化，并不断开发新产品、延伸产业链。要做到这些，就必须革新技术，发明一系列安全、清洁、高效、人工可控的自动化普洱茶新工艺，才能确保普洱茶产业的健康发展，给国家和人民带来长远利益。

人工接种和普洱茶的纯种发酵是普洱茶可控发酵的新发展方向。为保护普洱茶发酵工艺和优质微生物种质资源，开发对普洱茶发酵用菌种快速、精准鉴别方法势在必行。

DNA条形码技术可快速、简便地鉴别、区分与其相似菌种，可为普洱茶人工可控纯种发酵工艺开发和资源保护提供理论依据和技术手段，促进普洱茶产业健康发展。

发明内容

为克服形态学在鉴定普洱茶发酵生产菌上存在的缺陷，本发明提供了用于鉴别普洱茶发酵菌种黑曲霉(Aspergillus niger)TMCC 70012的DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用，从而可以准确地将黑曲霉TMCC 70012菌株从易混淆的物种或复合种中鉴别出来，实现进行快速鉴别和区分，可为普洱茶新发酵工艺提供快速鉴别、评估，防止发酵过程中其他杂菌的干扰，以及为普洱茶人工可控发酵工艺及菌种滥用提供举证方法和依据。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)一种用于鉴别黑曲霉菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于黑曲霉TMCC70012菌株的基因组，并且包含选自如SEQ ID No.4所示的DNA序列中的至少500bp的序列，并且该DNA条形码的长度为500bp-4000bp，优选为500bp-900bp。

(2)根据(1)所述的DNA条形码，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.4或SEQID No.7所示。

(3)一种用于扩增(1)或(2)所述的DNA条形码的引物对。

(4)根据(3)所述的引物对，其正向引物的核苷酸序列与黑曲霉TMCC 70012菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC 70012菌株基因组中如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第1位到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第3510位的区域中的序列，并且该正向引物的长度为15-30bp；其反向引物与所述TMCC 70012菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC 70012菌株基因组中如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第471位到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的最后一位的区域中的序列，并且该反向引物的长度为15-30bp。

(5)根据(4)所述的引物对，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

正向引物：5’-ACGCCTCAGTAGAAGATAGT-3’；

反向引物：5’-CTTGCCATGGTGGTGGGATA-3’。

(6)一种用于鉴别黑曲霉菌株的试剂盒，包含根据(3)-(5)中任一项所述的引物对。

(7)一种用于鉴别黑曲霉菌株的方法，包括以下步骤：

a)提供待测菌株的基因组DNA；

b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据(3)-(5)中任一项所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

c)通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测菌株不是黑曲霉TMCC 70012菌株，如果有目标条带，则进行步骤d)；

d)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测序列与(1)或(2)所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性在97％以上，则判定待测菌株是黑曲霉TMCC 70012菌株。

(8)根据(1)或(2)所述的DNA条形码在鉴别黑曲霉菌株中的应用。

(9)根据(3)-(5)中任一项所述的引物对在鉴别黑曲霉菌株中的应用。

(10)根据(6)所述的试剂盒在鉴别黑曲霉菌菌株中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1、本发明采用蛋白质基因组学技术从黑曲霉TMCC 70012菌株的基因组中发现了漏注释的肽段，该肽段坐落于UDP-吡喃半乳糖变位酶GLF A基因编码蛋白GLF A中。本发明进一步通过仔细的研究和比较分析，基于该GLF A基因开发了DNA条形码，该条形码序列能实现黑曲霉种内菌种的快速鉴别与区分。

2、本发明进一步发现，相比于其他基因，GLF A基因的序列(例如SEQ ID No.1)具有通用、易扩增、易比对的特点，其在黑曲霉种内不同菌株之间差异明显。

3、本发明建立了普洱茶工业发酵生产菌株黑曲霉TMCC 70012的标准基因序列和样品鉴别方法，相比于传统的形态学鉴定方法，显著提高了鉴定效率。该方法对于样品的完整程度要求低，鉴别指标能够量化，这对于及时判定普洱茶发酵工艺及其种质资源提供了有效的依据，弥补了该类普洱发酵茶生产菌株基于DNA条形码技术的菌株鉴定的空白。此外，进一步加入了形态学混淆种并运用基于聚类分析的系统发育树法设立鉴定规则进行了鉴定，其鉴定的可靠性和准确性也大大优于常规的分子鉴定方法。

附图说明

图1示出新鉴定肽段VPSFQDILQGR的质谱谱图。

图2示出了合成肽段VPSFQDILQGR质谱图与原鉴定肽段质谱图对比图；所述原鉴定肽段为本发明经过质谱分析并鉴定得到的肽段；图的上方为原鉴定肽段的质谱图，下方为合成肽段的质谱图。

图3示出了SEQ ID NO.1的核苷酸序列，灰色部分为内含子。

图4示出了SEQ ID NO.1及其所编码的蛋白质的氨基酸序列的对应关系，灰色部分为新鉴定的肽段VPSFQDILQGR。

图5A示出TMCC 70012的细胞全蛋白SDS-PAGE分离图谱，加粗显示的条带为GLF A蛋白所在位置；图5B示出GLF A蛋白分子量验证图。图5B中横坐标表示分子量MW的对数，纵坐标表示蛋白质分子量标记的各分子量蛋白在SDS-PAGE电泳分离中的迁移量相对于SDS-PAGE总迁移量的比值。

图6示出条形码序列SEQ ID NO.1通过NCBI-BLASTN得到的与之具有同源性的序列比对图，在图6下方的灰色线段显示出同源性序列。

图7示出了SEQ ID NO.4的核苷酸序列，浅灰色部分为SEQ ID NO.1，深灰色部分为SEQ ID NO.1中的内含子，黑体字为引物序列，下划线部分为用该引物扩增的产物序列，即SEQ ID NO.7。

图8示出条形码序列SEQ ID NO.4通过NCBI-BLASTN得到的与之具有同源性的序列比对图，在图8下方的灰色线段显示出同源性序列。

图9示出利用对本发明的黑曲霉TMCC 70012GLF A基因所设计的引物进行PCR扩增所得产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明利用系统的蛋白质基因组学技术从黑曲霉TMCC 70012菌株中发现了一个难以被传统基因预测软件发现的物种特异基因编码蛋白。由于该基因编码蛋白与UDP-吡喃半乳糖变位酶具有高度同源性，因此将其命名为GLF A。本发明发现编码该蛋白的基因GLFA的开放阅读框(SEQ ID No.1)可以将黑曲霉TMCC 70012菌株从易混淆的物种中鉴别出来，因此可以用于开发鉴别普洱茶工业发酵生产菌株黑曲霉TMCC 70012的DNA条形码。与现有技术相比，本发明通过上述方法获得的DNA条形码的特异性更高。

考虑到DNA条形码应当具有合适的长度和足够的菌株间特异性，本发明进一步通过仔细的研究和比较分析，基于上述特有的DNA序列获得了可准确、有效地鉴别黑曲霉TMCC70012菌株的DNA条形码。

由此，本发明的一个方面提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于黑曲霉TMCC 70012菌株的基因组，并且包含选自如SEQ ID No.4所示的DNA序列中的至少500bp的序列，并且该DNA条形码的长度为500bp-4000bp，优选为500bp-900bp。

本发明通过系统的蛋白质基因组学研究发现了一个难以被传统基因预测软件发现的蛋白编码序列，支持该基因编码序列产物存在的肽段及相关蛋白质组学质谱数据准确可靠；基于该蛋白编码序列在基因组中的位置，确定了编码该蛋白可能的基因序列(SEQ IDNo.1)和蛋白序列(SEQ ID No.3)。SEQ ID No.1的长度为1964bp，根据比对分析，SEQ IDNo.1为黑曲霉TMCC 70012菌株基因组所特有，因此该序列本身即可作为鉴别黑曲霉TMCC70012菌株的DNA条形码。另外，通过理论分析和实验验证，本发明证明包含该序列、长度更长的DNA条码的特异性更加得到保证。当DNA条形码的长度过长时(例如大于4000bp)，对于扩增操作而言较不理想。由此，基于所述基因序列，本发明在黑曲霉TMCC 70012菌株基因组中寻找到了更长、特异性更好的DNA条形码序列。另一方面，通常，DNA条形码的长度不小于500bp时，也能够满足易扩增、易比对的操作要求。因此，本发明通过理论分析和实验验证，证明选自如SEQ ID No.4所示的DNA序列中的至少500bp的序列也能够实现黑曲霉内菌株的快速准确鉴别与区分。

本发明的条形码序列能实现黑曲霉种内菌株的快速准确鉴别与区分。

特别地，本发明发现在黑曲霉TMCC 70012菌株基因组中，SEQ ID No.4中所包含的如SEQ ID No.7所示的DNA序列在不同菌种间以及在黑曲霉种内不同菌株之间具有特别高的特异性。因此，在本发明优选的实施方案中，所述DNA条形码包含选自如SEQ ID No.7所示的DNA序列中的至少500bp的序列。

优选地，所述DNA条形码序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.4或SEQ ID No.7所示。

在本文中，术语“漏注释”是指物种完成基因组测序以后，采用基因预测软件(例如GeneMark、Augustus、Glimmer等)未能将某基因或蛋白预测出来，这些基因或蛋白一般表达量不高、在特定的条件下才表达，所以在研究中难以被发现。

术语“DNA条形码技术(DNA barcoding)”是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，其可以快速、准确的进行物种鉴定。

术语“六框翻译”是蛋白质组学和基因组学中的已知术语，简述其原理为，DNA编码蛋白质时，采用三联体密码子编码蛋白质，给定一条DNA序列，有3种编码可能性，加上其互补链上的3种编码可能，共有6种编码可能性(+1，+2，+3，-3，-2，-1)。

本发明的另一个方面提供了一种用于扩增本发明所述的DNA条形码的引物对。

本领域技术人员可以理解，根据本发明提供的用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码序列，可以容易地设计相应的引物对，从而扩增出所需DNA条形码。

优选地，所述引物对的正向引物的核苷酸序列与黑曲霉TMCC70012菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC 70012菌株基因组中如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第1位到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第3510位的区域中的序列，并且该正向引物的长度一般为15-30bp；其反向引物与所述TMCC 70012菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC 70012菌株基因组中如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第471位到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的最后一位的区域中的序列，并且该反向引物的长度一般也为15-30bp。所述正反引物扩增出的产物即为选自SEQ ID No.4所示的核苷酸序列中的至少500bp的序列。

在优选的实施方案中，所述引物对的正向引物的核苷酸序列与黑曲霉TMCC 70012菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC 70012菌株基因组中如SEQ IDNo.7所示的核苷酸序列的第1位到如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的第369位的区域中的序列，并且该正向引物的长度一般为15-30bp；其反向引物与所述TMCC 70012菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC 70012菌株基因组中如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的第471位到如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列的最后一位的区域中的序列，并且该反向引物的长度一般也为15-30bp。所述正反引物扩增出的产物即为选自SEQ ID No.7所示的核苷酸序列中的至少500bp的序列。

在更优选的实施方案中，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

GLF A-F：5’-ACGCCTCAGTAGAAGATAGT-3’(SEQ ID No.5)；

GLF A-R：5’-GTGGATGGGACGTAAAGCAT-3’(SEQ ID No.6)。

本发明的引物能实现对所述DNA条形码序列的特异性扩增。

本发明还提供了一种用于鉴别黑曲霉菌株的试剂盒，包含根据本发明所述的引物对。

在另一实施方案中，所述试剂盒还包含根据本发明所述的DNA条形码。所述DNA条形码可存在于记录介质上。该记录介质例如为光盘。所述试剂盒还可以包含用于实验操作的任何工具和试剂。

本发明的又一方面提供了一种用于鉴别黑曲霉菌株的方法，包括以下步骤：

a)提供待测菌株的基因组DNA；

b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据本发明所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

c)电泳(例如琼脂糖凝胶电泳)检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测菌株不是黑曲霉菌株TMCC 70012，如果有目标条带，则进行步骤d)；

d)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与本发明所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性在97％以上(优选98％以上，更优选99％以上，更优选100％)，则判定待测菌株是黑曲霉TMCC 70012菌株。

在本文中所使用的术语“同一性”和“同源性”具有相同的含义，可以相互交换使用。

在本发明的具体实施方案中，所述PCR扩增的程序为：1)94℃预变性5分钟；2)94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，其中该程序2)进行30个循环；3)72℃延伸10分钟。

在本发明的又一实施方案中，所述方法还可以包括将测序结果得到的待测核苷酸序列与本发明的DNA条形码进行聚类分析(例如系统发育树)，如果待测序列与DNA条形码聚类在一起，则确定待测菌株为黑曲霉菌株TMCC 70012。

在本发明一个具体的实施方案中，利用本发明的引物对对提取自待鉴别的菌株的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。基于检测是否存在PCR产物来鉴别菌株：如果待鉴定的菌株没有扩增出相应的目标条带，则说明该菌株不是TMCC 70012；如果扩增出相应的目标条带，则证明该菌株可能是TMCC 70012。为了进一步进行鉴别，对PCR产物进行测序，将DNA测序结果与DNA条形码序列进行同源性比对，获得序列间的相似性(即同源性)，如果序列同源性小于97％，则判定待测菌株不是黑曲霉菌株TMCC 70012。如果序列同源性大于或等于97％，则判定待测菌株是黑曲霉菌株TMCC 70012。

如果进行聚类分析，例如系统发育树，则将所述DNA条形码和各待鉴定菌株的DNA测序结果(即待测序列)一起应用MEGA 6或PAUP软件构建NJ系统发育树。如果待鉴定菌株的待测序列与黑曲霉TMCC 70012的DNA条形码聚类在一起，则鉴定为黑曲霉TMCC 70012。

在此所使用的术语“聚类”是指经系统发育树分析后，处于同一个分支，且进化距离相同。

本发明还提供了本发明所述的DNA条形码在鉴别黑曲霉菌株中的应用。

本发明还提供了本发明所述的引物对在鉴别黑曲霉菌株中的应用。

本发明还提供了本发明所述的试剂盒在鉴别黑曲霉菌菌株中的应用。

实施例

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。实施例中所用方法在未具体说明的情况下，均采用常规方法和已知工具。

实施例1：GLF A基因和DNA条形码的获得

1、利用高覆盖蛋白质组技术，采用pFind和pAnno软件对普洱茶工业发酵菌黑曲霉TMCC 70012(Aspergillus niger TMCC 70012)进行了蛋白质组的深度覆盖研究，并对其基因组进行了注释编码基因的验证。为了发现新的蛋白编码区，利用系统蛋白质基因组学中的六框翻译(Six Frame Translation)策略，获得了黑曲霉TMCC 70012基因组数据的六框翻译数据库，穷举了基因组的6种编码可能(+1，+2，+3，-1，-2，-3)，并且将该核酸序列称为“六框翻译核酸序列”，蛋白序列称为“六框翻译蛋白序列”。通常而言，六框翻译核酸序列是从一个终止子到下一个终止子的序列，在本文中，也将其称为“蛋白编码框”。利用这个数据库，采用pFind和pAnno软件对TMCC 70012菌株总细胞蛋白的高覆盖蛋白质组质谱数据进行了新肽段和新蛋白质的鉴定。

经鉴定，发现了一条现有技术中黑曲霉TMCC 70012注释基因中未发现的肽段VPSFQDILQGR，质谱谱图如图1所示。

手工检查质谱谱图结果显示，检测到了肽段VPSFQDILQGR二级质谱谱图(MS2)的几乎所有y离子序列，匹配好，信号强，结果可信。

为进一步确证这个鉴定结果，按照新鉴定肽段VPSFQDILQGR的氨基酸序列化学合成了该肽段，并对合成肽段产生的高能量碰撞MS2进行了核实，一级母离子和二级子离子均符合理论值，表明合成的肽段序列正确，参见图2。

在此基础上，人工检查了根据大规模蛋白质组数据鉴定到的新肽段序列合成肽段的MS₂和大规模鉴定新肽段谱图，两者几乎完全一致，以子离子相似性获得的cosin值高达0.99，由此证明从普洱茶工业发酵菌黑曲霉TMCC 70012鉴定到的新肽段正确无误。

2、根据新肽段所在的位置，以前一个终止密码子和后一个终止密码子包括的区域为界，得到六框翻译核酸序列(蛋白编码框)SEQ ID NO.2。

3、为了进一步确定编码该蛋白的基因的编码起始位点和终止位点，将上述蛋白编码框向上游和下游分别扩展1000bp，采用GeneMark.hmm进行基因预测，参考物种选用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。在该区域预测到了该蛋白编码基因的存在，其读码框与上述蛋白读码框一致，在ORF序列中找到了基因的起始子，但ORF序列的终止子实际位于内含子部分，所以根据基因预测，在后面的序列中找到了真正的终止子，这样根据预测结果，确定了这个基因可能的编码起始和终止位点，其完整的从起始子到终止子的基因序列为SEQ ID NO.1，如图3所示。

SEQ ID NO.1及其所编码的蛋白质的氨基酸序列的对应关系如图4所示。肽段VPSFQDILQGR坐落在该蛋白的N端附近。

该基因(SEQ ID NO.1)的核苷酸序列包括终止子在内共1964bp，除去内含子区域，共编码547个氨基酸，理论分子量为61.0kDa，理论编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4、为了进一步确定所鉴定的序列的正确性，需要确定所鉴定的VPSFQDILQGR的ORF所在区域编码蛋白的分子量，因此测定了其实验分子量(图5)。在YPD培养基中培养TMCC70012菌株并提取其中的总蛋白，进行SDS-PAGE分离，电泳胶经考马斯亮蓝染色，根据蛋白质组样品制备时的分子量特征验证分子量，在SDS-PAGE中，蛋白迁移距离和染料前沿的迁移距离的比值与蛋白分子量对数呈一定关系，见图5。整个泳道按分子量和蛋白质丰度共切成30个胶条(fraction)，并进行胶内消化和质谱分析，其中GLF A蛋白在第13个胶条的质谱数据中被鉴定到了，与预测的分子量大小匹配。理论分子量为61.0kDa，理论分子量与该蛋白所属的胶条所在SDS-PAGE中的位置是一致的。结果显示鉴定到的GLF A的实验分子量大小在59.2-61.8kDa之间，与理论分子量相符，证实了所鉴定的蛋白的正确性。

5、以该基因理论编码产物的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)进行NCBI-BLASTP分析，检索到了序列相似性较高的蛋白。Blastp结果表明我们检测到的TMCC-70012菌株中漏注释GLF A基因产物有结构域HemY超家族，说明该序列构成的蛋白在生物大分子中具有特异结构和独立功能。上述blastp比对结果参见表1。

表1与TMCC 70012 GLF A蛋白序列具有较高同源性的序列

表2与TMCC 70012 GLF A基因序列具有较高同源性的序列

6、将所鉴定的GLF A基因的序列(即SEQ ID NO.1)进行NCBI-BLASTN分析，结果见图6。BLASTN结果总结在表2中。

表2的结果表明GLF A基因的序列(即SEQ ID NO.1)与黑曲霉中的另一菌株有一条同源性较高的序列，但与黑曲霉以外的其他物种之间的差异性较大，可以作为区分TMCC-70012菌株和其他菌种的DNA条形码。另外，如果设定高的同源性比对筛选标准，例如同源性大于等于99％，则该SEQ ID NO.1也可作为区分TMCC-70012菌株和其他黑曲霉菌株的DNA条形码。

7、进一步考虑了GLF A基因序列(即SEQ ID NO.1)前后转录间隔区的序列，得到SEQ ID NO.4，如图7所示。对SEQ ID NO.4进行同源性比较，如图8所示。可从图8得知，SEQID NO.4在NCBI数据库中特异性较高，在SEQ ID NO.4的2250bp之后的片段几乎没有同源性匹配。说明SEQ ID NO.4可有效地区分TMCC-70012和近源菌株，因此可以作为DNA条形码。

实施例2.利用DNA条形码鉴别菌株

依据待测样品的扩增结果和与黑曲霉TMCC 70012菌株GLF A基因序列的扩增结果、序列同源性，来判定待测样品是否为普洱茶工业应用菌株黑曲霉TMCC 70012。

(1)基于SEQ ID NO.4，采用NCBI引物设计工具设计PCR引物，得到正反引物序列分别为：

GLF A-F：5’-ACGCCTCAGTAGAAGATAGT-3’；

GLF A-R：5’-GTGGATGGGACGTAAAGCAT-3’。

引物的位置见图7。所扩增的序列为SEQ ID NO.7(838bp)。

(2)菌株来源

表3选用的相关菌株的信息

(3)分别提取菌株DNA：采用OMEGA E.Z.N.A.^TM的Yeast DNA试剂盒提取基因组DNA，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.5μg/μL。

(4)扩增DNA片段，进行聚合酶链式(PCR)反应，所用引物序列分别为：

GLF A-F：5’-ACGCCTCAGTAGAAGATAGT-3’；

GLF A-R：5’-GTGGATGGGACGTAAAGCAT-3’。

PCR反应体系为50μL，PCR试剂为Thermo Scientific^TM的Taq DNA Polymerase(重组)：ddH₂O 37.7μL、MgCl₂ 5μL，dNTPs 4μL，正向引物1μL，反向引物1μL，Taq DNA聚合酶0.3μL、DNA模板1μL，不含染料。扩增程序为：94℃预变性5分钟；接下来94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，一共进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。

(5)扩增产物检测：用1.0％的琼脂糖凝胶、1×TBE电泳液电泳检测，使用DNA分子量marker判断PCR片段大小。若待测菌株没有预期838bp大小的扩增条带，说明该菌株不是黑曲霉TMCC70012；若出现明显清晰的条带，且无杂带，送生物测序公司进行DNA片段测序。

(6)该引物仅能在黑曲霉TMCC 70012中实现扩增，在同物种的黑曲霉CBS 513.88、CBS 554.65T、CBS 120.49、CBS 101697、CBS 116681、CBS 119557、CBS 117984、CBS 118725中则不能实现扩增，结果如图8所示。该PCR引物的理论扩增序列为838bp，实际扩增结果和预期相符。为了进一步验证扩增的DNA的序列，进行了测序和同源序列比较。该结果证明SEQID NO.7可以非常特异且有效地区分黑曲霉TMCC 70012菌株，从而作为黑曲霉TMCC 70012菌株的DNA条形码。

(7)对于有条带的序列的测序结果，首先用软件Chromas检查测序后得到的序列峰图质量，确定峰图质量达到数据分析的要求之后，用DNASTAR软件包中的SeqMan进行正反向序列的拼接。将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果待测菌株DNA片段与黑曲霉TMCC70012标准DNA条形码的同源性在97％以上，即可判断所述的待测菌株很可能为黑曲霉TMCC70012菌株。

(8)还可以进一步进行聚类分析，例如系统发育树，这可以进一步佐证经上述步骤的判断结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 勐海茶业有限责任公司

<120> DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用

<130> FI-190367-59:52/C

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1964

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 1

atgctcagcc tcgcccgcag gactttgaac cgtgtcccca gctttcaaga tattctacaa 60

ggcaggatga cccaccccga tatgtaagga gacctttccc cctccctcaa acggcaagct 120

tgccttcact acaacaagaa gctcattgga acaattgctg accgttgtct ttgtgcttga 180

attcagctcc gtcgacgttc tcgtcattgg tgccggccct actggtctcg gtgccgcgaa 240

gcgtcttaac cagattgtac gcattgcgcg ccccctatcg tataccttca ctcgaataaa 300

ggctaattgg acaattcgcg ggtgtaggat ggcccttctt ggttgatcgt tgacagcaac 360

gagacccctg gtggtcttgc ttccaccgat gtgacccccg aaggcttcgt atgttgattc 420

ccactttccc ctcaatgggc aggcattgca ctggtcaagc aaacagcgac tgactcgtga 480

caatcacagc tcttcgatgt tggtggtcac gtcatcttct cccactacaa gtacttcgac 540

gactgcatca acgaggctct ccccaaggat gacgactggt acacccacca gcgtatctcc 600

tacgttcgct gccagggcca atgggttccc taccccttcc agaacaacat ctccatgctt 660

cccaagaatg agcaggtccg ctgtatcgat ggcctgatcg acgctgccct tgaggctcgt 720

gtcgccaaca ccaagcccca gaacttcgat gagtggattg ttcgccagat gggtgtcggt 780

atcgccgacc tcttcatgag accctacaac ttcaaggttt gggctgtgcc tacgaccaag 840

gtaagatacg atgtaccaca tggcgagtaa cggcgtgctg attctcatca gatgcaatgt 900

gcctggttgg gtgagcgtgt tgctgcccct aacgtcaagg ccgtgacgac caacgtcatc 960

cttaacaaga ccgctggtaa ctggggtcct aacgctactt tccgtttccc cgcccgtggt 1020

ggtaccggtg gtatctggat cgctgtcgcc gacactatcc ccaaggagaa gactcgcttc 1080

ggtgagaagg gcaaggtcgt caaggtcaat gccaacaaca agaccgtcac cctgggtgat 1140

ggcaccactg tcggctacaa gaagctcgtc tccaccatgg ctgtcgactt cctcgctgag 1200

cagatcggcg accaggagct cgttggcctc accaagcagc tcttctactc ctccactcac 1260

gtcattggtg tcggtatccg tggtacccgc cccgagagaa tcggtgacaa gtgctgggta 1320

agttgacctt ggatggaaac catgaatgac ttcaaaacta acatgctcgt tactagctct 1380

acttccccga ggacaactgc cccttctacc gtgccaccat cttctccaac tactcccccc 1440

acaaccagcc cgagggctcc aagaagcttc ccactctgca gcttgcggat ggctctaagc 1500

cccagagcac tgaggctcag gagggtcctt actggtccat catgttggag gtttccgagt 1560

cttcgatgaa gcctgtcaac cacgagactc tcctggctga ttgcatccag ggtctcgtca 1620

acaccgagat gctgaagccc accgatgaga ttgtctccac ctaccaccgc cgcttcgacc 1680

acggctaccc caccccctcc ctggagcgtg agggtgctct tacccagatc ctgcccagac 1740

tccaggagaa ggacatctgg acccgtggtc gcttcggtag ctggcgctac gaggtcggta 1800

accaggacca ctctttcatg ctcggtgttg aggctgttga caacattgtc aacggcgctg 1860

tcgagctgac ccttaactac cctgacttcg tcaacggtag acagaacacc gagcgtcggc 1920

tggttgacgg cgcccaggtt ttcgccaaga gccaggcgca gtaa 1964

<210> 2

<211> 294

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 2

tgaaaccgat tccaagcgcc ccccaccgct tgcttgtcac gtttcgcttt cccgaccgac 60

cgcaggacgg atacacctat accttcccgc ccatctcccc ttcttgctcc ctccatcacc 120

aacctctctt ctctctctct cttcctcccc tctcatctct ctccttataa ctctgctgtc 180

cctgcagctt cacaaggctc gttttctatg ctcagcctcg cccgcaggac tttgaaccgt 240

gtccccagct ttcaagatat tctacaaggc aggatgaccc accccgatat gtaa 294

<210> 3

<211> 547

<212> PRT

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 3

Met Leu Ser Leu Ala Arg Arg Thr Leu Asn Arg Val Pro Ser Phe Gln

1 5 10 15

Asp Ile Leu Gln Gly Arg Met Thr His Pro Asp Ile Ser Leu Glu Gln

20 25 30

Leu Leu Thr Val Val Phe Val Leu Glu Phe Ser Ser Val Asp Val Leu

35 40 45

Val Ile Gly Ala Gly Pro Thr Gly Leu Gly Ala Ala Lys Arg Leu Asn

50 55 60

Gln Ile Asp Gly Pro Ser Trp Leu Ile Val Asp Ser Asn Glu Thr Pro

65 70 75 80

Gly Gly Leu Ala Ser Thr Asp Val Thr Pro Glu Gly Phe Leu Phe Asp

85 90 95

Val Gly Gly His Val Ile Phe Ser His Tyr Lys Tyr Phe Asp Asp Cys

100 105 110

Ile Asn Glu Ala Leu Pro Lys Asp Asp Asp Trp Tyr Thr His Gln Arg

115 120 125

Ile Ser Tyr Val Arg Cys Gln Gly Gln Trp Val Pro Tyr Pro Phe Gln

130 135 140

Asn Asn Ile Ser Met Leu Pro Lys Asn Glu Gln Val Arg Cys Ile Asp

145 150 155 160

Gly Leu Ile Asp Ala Ala Leu Glu Ala Arg Val Ala Asn Thr Lys Pro

165 170 175

Gln Asn Phe Asp Glu Trp Ile Val Arg Gln Met Gly Val Gly Ile Ala

180 185 190

Asp Leu Phe Met Arg Pro Tyr Asn Phe Lys Val Trp Ala Val Pro Thr

195 200 205

Thr Lys Met Gln Cys Ala Trp Leu Gly Glu Arg Val Ala Ala Pro Asn

210 215 220

Val Lys Ala Val Thr Thr Asn Val Ile Leu Asn Lys Thr Ala Gly Asn

225 230 235 240

Trp Gly Pro Asn Ala Thr Phe Arg Phe Pro Ala Arg Gly Gly Thr Gly

245 250 255

Gly Ile Trp Ile Ala Val Ala Asp Thr Ile Pro Lys Glu Lys Thr Arg

260 265 270

Phe Gly Glu Lys Gly Lys Val Val Lys Val Asn Ala Asn Asn Lys Thr

275 280 285

Val Thr Leu Gly Asp Gly Thr Thr Val Gly Tyr Lys Lys Leu Val Ser

290 295 300

Thr Met Ala Val Asp Phe Leu Ala Glu Gln Ile Gly Asp Gln Glu Leu

305 310 315 320

Val Gly Leu Thr Lys Gln Leu Phe Tyr Ser Ser Thr His Val Ile Gly

325 330 335

Val Gly Ile Arg Gly Thr Arg Pro Glu Arg Ile Gly Asp Lys Cys Trp

340 345 350

Leu Tyr Phe Pro Glu Asp Asn Cys Pro Phe Tyr Arg Ala Thr Ile Phe

355 360 365

Ser Asn Tyr Ser Pro His Asn Gln Pro Glu Gly Ser Lys Lys Leu Pro

370 375 380

Thr Leu Gln Leu Ala Asp Gly Ser Lys Pro Gln Ser Thr Glu Ala Gln

385 390 395 400

Glu Gly Pro Tyr Trp Ser Ile Met Leu Glu Val Ser Glu Ser Ser Met

405 410 415

Lys Pro Val Asn His Glu Thr Leu Leu Ala Asp Cys Ile Gln Gly Leu

420 425 430

Val Asn Thr Glu Met Leu Lys Pro Thr Asp Glu Ile Val Ser Thr Tyr

435 440 445

His Arg Arg Phe Asp His Gly Tyr Pro Thr Pro Ser Leu Glu Arg Glu

450 455 460

Gly Ala Leu Thr Gln Ile Leu Pro Arg Leu Gln Glu Lys Asp Ile Trp

465 470 475 480

Thr Arg Gly Arg Phe Gly Ser Trp Arg Tyr Glu Val Gly Asn Gln Asp

485 490 495

His Ser Phe Met Leu Gly Val Glu Ala Val Asp Asn Ile Val Asn Gly

500 505 510

Ala Val Glu Leu Thr Leu Asn Tyr Pro Asp Phe Val Asn Gly Arg Gln

515 520 525

Asn Thr Glu Arg Arg Leu Val Asp Gly Ala Gln Val Phe Ala Lys Ser

530 535 540

Gln Ala Gln

545

<210> 4

<211> 3979

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 4

atgctcagcc tcgcccgcag gactttgaac cgtgtcccca gctttcaaga tattctacaa 60

ggcaggatga cccaccccga tatgtaagga gacctttccc cctccctcaa acggcaagct 120

tgccttcact acaacaagaa gctcattgga acaattgctg accgttgtct ttgtgcttga 180

attcagctcc gtcgacgttc tcgtcattgg tgccggccct actggtctcg gtgccgcgaa 240

gcgtcttaac cagattgtac gcattgcgcg ccccctatcg tataccttca ctcgaataaa 300

ggctaattgg acaattcgcg ggtgtaggat ggcccttctt ggttgatcgt tgacagcaac 360

gagacccctg gtggtcttgc ttccaccgat gtgacccccg aaggcttcgt atgttgattc 420

ccactttccc ctcaatgggc aggcattgca ctggtcaagc aaacagcgac tgactcgtga 480

caatcacagc tcttcgatgt tggtggtcac gtcatcttct cccactacaa gtacttcgac 540

gactgcatca acgaggctct ccccaaggat gacgactggt acacccacca gcgtatctcc 600

tacgttcgct gccagggcca atgggttccc taccccttcc agaacaacat ctccatgctt 660

cccaagaatg agcaggtccg ctgtatcgat ggcctgatcg acgctgccct tgaggctcgt 720

gtcgccaaca ccaagcccca gaacttcgat gagtggattg ttcgccagat gggtgtcggt 780

atcgccgacc tcttcatgag accctacaac ttcaaggttt gggctgtgcc tacgaccaag 840

gtaagatacg atgtaccaca tggcgagtaa cggcgtgctg attctcatca gatgcaatgt 900

gcctggttgg gtgagcgtgt tgctgcccct aacgtcaagg ccgtgacgac caacgtcatc 960

cttaacaaga ccgctggtaa ctggggtcct aacgctactt tccgtttccc cgcccgtggt 1020

ggtaccggtg gtatctggat cgctgtcgcc gacactatcc ccaaggagaa gactcgcttc 1080

ggtgagaagg gcaaggtcgt caaggtcaat gccaacaaca agaccgtcac cctgggtgat 1140

ggcaccactg tcggctacaa gaagctcgtc tccaccatgg ctgtcgactt cctcgctgag 1200

cagatcggcg accaggagct cgttggcctc accaagcagc tcttctactc ctccactcac 1260

gtcattggtg tcggtatccg tggtacccgc cccgagagaa tcggtgacaa gtgctgggta 1320

agttgacctt ggatggaaac catgaatgac ttcaaaacta acatgctcgt tactagctct 1380

acttccccga ggacaactgc cccttctacc gtgccaccat cttctccaac tactcccccc 1440

acaaccagcc cgagggctcc aagaagcttc ccactctgca gcttgcggat ggctctaagc 1500

cccagagcac tgaggctcag gagggtcctt actggtccat catgttggag gtttccgagt 1560

cttcgatgaa gcctgtcaac cacgagactc tcctggctga ttgcatccag ggtctcgtca 1620

acaccgagat gctgaagccc accgatgaga ttgtctccac ctaccaccgc cgcttcgacc 1680

acggctaccc caccccctcc ctggagcgtg agggtgctct tacccagatc ctgcccagac 1740

tccaggagaa ggacatctgg acccgtggtc gcttcggtag ctggcgctac gaggtcggta 1800

accaggacca ctctttcatg ctcggtgttg aggctgttga caacattgtc aacggcgctg 1860

tcgagctgac ccttaactac cctgacttcg tcaacggtag acagaacacc gagcgtcggc 1920

tggttgacgg cgcccaggtt ttcgccaaga gccaggcgca gtaaagggtt gaaatgttaa 1980

tagaattaca cgggttttaa tttttttctt gaatgattcc ggggggcaaa agatttgttt 2040

agagatctga ttacgatcaa cgggagccat atttcgtcat ttttttactt cttgtcctat 2100

ctatttaact tattttacca attttctttt tgctctttgg ctcattgaaa gcgatgtatg 2160

ggagatgttc ttggcatttt tgtgatgcgt atcatcatcc actttaccag ccgtcttttg 2220

ctccatctac tagacatgaa tagaagttgc ttatcaaacg cgtgtctttc tgttggggac 2280

ttaatttgct gatttacgta tgccggttac atgtctcgcc gcgaccccgt ggagatcgaa 2340

tccagcttca tgacagatga cacatgtatc acccaccgaa gtgaggcagt gtgtgcagca 2400

catcagccca tgcagggcgt ttctaaattc gctcacttct gtcccgatca agtatagcaa 2460

tgtgatatat agcagcatcg caacaactga gtatggagta tggagtatgc agaacggagt 2520

agtatggaat acatcaaacc cacacatatg gagtcatcta ctactacttc gtacttatgt 2580

acaccaatca tctagagaat aaatactact gcagtggtcc aatcggtatt ccgtgtaaga 2640

catactaccg tacgtagtga aacatgggat ctaccgttag ctattaatca atatctgaca 2700

tactatctat ctatcctacc gtgtgataac tccatattct cctcagtact aacccacatc 2760

ccccccatcc acaacccacc cacccgccgt ctcataaggc tgagtgagtg agctcgagct 2820

cgagctcgga gggtatggat gaagaagaga gtgcactgac tatgtcggaa attttcttta 2880

ctcattgttc tactactgta tatctgagta tgctagtaac tactagtagt aatcatgcaa 2940

gtatcccata gttgagcatg tgaattttat atcagtagta gtatcacagc agttactata 3000

tatgatcatg ctgcaggcat acttacatac atatattcac atgtacatac tatggggacc 3060

atcatgtgaa tactacttac atagatacta ctaagtacgt agtacttaac ttagcattcg 3120

cctccaatac tagagaccac cacgcctcag tagaagatag taatttaccg tgataatatt 3180

attaaccacc aaccttacta gtacttactt actatcctcc ccccggaaca tccattaccc 3240

gcaaccaacc atgccaagaa ggggaaccac cccacacacc taaagcggta tagcgcactg 3300

gggcaggacg cgtaagtaga actaaaccca agaaaggaaa aaaaaaaaaa gaatgaaaat 3360

tgggagggag agtcgtgcag aaaaatatgt atccactatt tatccagcat ccacaggcag 3420

aggaaaatta attcccaatg taaaaataga ttttgattat tagtagtagt ctagcccagg 3480

taggacaggt ggtcagaact atcttactct attatttttg cccctcatgg atggccgatg 3540

acgattaaat ggagtgtgat ggcgatgagg gtggtttgtt tcatggatag tagatactct 3600

gtagtactct aggattatgc tagtattgag gtgatactga ggtaataatg gtgatgtcta 3660

atttgttatt tgcagtaatg atagtatctt tcagggaaga gggataccta catacacatg 3720

gttacataac gcaagttggc agctttggat tccatccgct tcagccttat tgtcggtcgg 3780

ttttgctttc ttatttgagc tccccagtct acaccgtcac tcctctacat tacactacac 3840

tacaccatca ttactgaatt ttctgcagct tgcgtgtcga ctgggctcat tgggatggat 3900

gacgaatagc ctcacgagat ctcacccttc attgggtccg gacaccaact ccgcccccca 3960

tgctttacgt cccatccac 3979

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

acgcctcagt agaagatagt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

gtggatggga cgtaaagcat 20

<210> 7

<211> 838

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 7

acgcctcagt agaagatagt aatttaccgt gataatatta ttaaccacca accttactag 60

tacttactta ctatcctccc cccggaacat ccattacccg caaccaacca tgccaagaag 120

gggaaccacc ccacacacct aaagcggtat agcgcactgg ggcaggacgc gtaagtagaa 180

ctaaacccaa gaaaggaaaa aaaaaaaaag aatgaaaatt gggagggaga gtcgtgcaga 240

aaaatatgta tccactattt atccagcatc cacaggcaga ggaaaattaa ttcccaatgt 300

aaaaatagat tttgattatt agtagtagtc tagcccaggt aggacaggtg gtcagaacta 360

tcttactcta ttatttttgc ccctcatgga tggccgatga cgattaaatg gagtgtgatg 420

gcgatgaggg tggtttgttt catggatagt agatactctg tagtactcta ggattatgct 480

agtattgagg tgatactgag gtaataatgg tgatgtctaa tttgttattt gcagtaatga 540

tagtatcttt cagggaagag ggatacctac atacacatgg ttacataacg caagttggca 600

gctttggatt ccatccgctt cagccttatt gtcggtcggt tttgctttct tatttgagct 660

ccccagtcta caccgtcact cctctacatt acactacact acaccatcat tactgaattt 720

tctgcagctt gcgtgtcgac tgggctcatt gggatggatg acgaatagcc tcacgagatc 780

tcacccttca ttgggtccgg acaccaactc cgccccccat gctttacgtc ccatccac 838

Claims

1.一种用于鉴别黑曲霉菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于黑曲霉TMCC 70012菌株的基因组，并且包含选自如SEQ ID No.4所示的DNA序列中的至少500bp的序列，并且该DNA条形码的长度为500bp-4000bp，优选为500bp-900bp。

2.根据权利要求1所述的DNA条形码，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.4或SEQID No.7所示。

3.一种用于扩增权利要求1或2所述的DNA条形码的引物对。

4.根据权利要求3所述的引物对，其正向引物的核苷酸序列与黑曲霉TMCC 70012菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC 70012菌株基因组中如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第1位到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第3510位的区域中的序列，并且该正向引物的长度为15-30bp；其反向引物与所述TMCC 70012菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC 70012菌株基因组中如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的第471位到如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的最后一位的区域中的序列，并且该反向引物的长度为15-30bp。

5.根据权利要求4所述的引物对，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

正向引物：5’-ACGCCTCAGTAGAAGATAGT-3’；

反向引物：5’-CTTGCCATGGTGGTGGGATA-3’。

6.一种用于鉴别黑曲霉菌株的试剂盒，包含根据权利要求3-5中任一项所述的引物对。

7.一种用于鉴别黑曲霉菌株的方法，包括以下步骤：

a)提供待测菌株的基因组DNA；

b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求3-5中任一项所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

d)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测序列与权利要求1或2所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性在97％以上，则判定待测菌株是黑曲霉TMCC 70012菌株。

8.根据权利要求1或2所述的DNA条形码在鉴别黑曲霉菌株中的应用。

9.根据权利要求3-5中任一项所述的引物对在鉴别黑曲霉菌株中的应用。

10.根据权利要求6所述的试剂盒在鉴别黑曲霉菌菌株中的应用。