CN111982992B - 葡萄糖宽范围高精度自动检测方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葡萄糖宽范围高精度自动检测方法。在自制的普鲁士蓝生物酶电极对于葡萄糖浓度检测具有宽范围线性化特性的基础上，提出的根据自主识别检测区域自动调节进样量，实现葡萄糖浓度范围未知下的宽范围高精度检测。本发明采用普鲁士蓝生物酶电极在专用检测池中与微生物发酵液反应产生微安级电流，通过设计微安电流检测电路和滤波处理，建立响应信号与葡萄糖浓度响应方程，计算葡萄糖浓度的测量值，根据测量值系统自主识别检测浓度区间，根据偏差调节进样量设定值V，通过高精密智能进样装置自动进样V，使得检测池中的待测物浓度处于传感电极的最佳响应范围，实现葡萄糖宽范围、高精度自动检测。

Description

葡萄糖宽范围高精度自动检测方法和系统
技术领域
本发明涉及微生物发酵行业领域，针对发酵过程底物、中间代谢物、产物等关键组分浓度的在线检测问题，提供了一种葡萄糖宽范围高精度自动检测方法，实现葡萄糖在未知浓度下的宽范围、精准检测，属于生物制药、通信及软件交叉学科技术领域。
背景技术
微生物发酵行业领域普遍采用批式发酵为主的“粗放式”生产模式，在生产过程中不能及时跟踪底物或产物的浓度变化，对发酵过程的认识往往处于“黑箱”状态，生产操作完全依赖于操作经验，导致生产效率低下且环境污染严重，因此我国亟需研制发酵底物和产物浓度的在线分析仪器。
发酵过程中各组分浓度检测至关重要，它能够帮助人们实时了解发酵的进程，知道相关微生物的生理状况，通过检测得到的信息越多，对发酵过程的了解就越透彻，从而更好的进行发酵调控。
目前应用于发酵过程中的各组分浓度检测的方法主要包括：滴定显色法、高效液相色谱法、生物传感器法等，已经受到广泛采用。生物传感器可将反应组分浓度的量转换为可识别的物理信号如光学信号、电化学信号等，对产生的物理信号进行处理放大后，通过研究信号的变化，可以得出发酵组分浓度的变化量。该方法对待测物具有良好的选择性，且其灵敏度高、成本低、易微型化，所以更加受到发酵过程的青睐。
通过在线分析关键组分的浓度如发酵底物、中间代谢物和产物等可以实时反应细胞生理状态，根据细胞的生理状态可以揭示细胞生长代谢规律及阶段特性，从而指导微生物发酵过程的实时调控，使发酵中底物得到充分利用，同时提高产物的合成效率。
发明内容
本发明针对背景技术中存在的问题，提出了一种葡萄糖宽范围高精度自动检测方法和系统。
技术方案：
本发明首先公开了一种葡萄糖宽范围高精度自动检测方法，它包括以下步骤：
S1、酶电极与底物发生化学反应产生微安级的电流信号；
S2、电流信号转换成标准电压信号；
S3、数字滤波系统对信号进行滤波获得有效的AD值，有效消除检测中的多种信号干扰；
S4、建立浓度响应方程；
S5、基于电压的数字信号精确测量待测物的葡萄糖浓度；
S6、判断是否处于最佳浓度范围，是则进行S7；否则调节进样量，并返回步骤S5；
S7、获得待测物的葡萄糖最终浓度。
优选的，S2的具体步骤为：
S2-1、电流信号通过I/V转换电路转换为电压信号；
S2-2、电压信号通过两级程控放大转换为标准电压信号。
优选的，S3的具体步骤为：
S3-1、标准电压信号通过16位的A/D转化电路转化为数字信号；
S3-2、数字信号经数字滤波Y(n)＝αX(n)+(1-α)Y(n-1)处理后得到有效的AD值；α为小于1大于0的数，X(n)为本次实际采集到的AD值，Y(n-1)为上次最后得出的AD值，Y(n)为本次所得AD值。加入数字滤波可以滤除随机信号的干扰，数字滤波采用本次采样AD值与上次采样AD值进行加权，得到有效AD值，使得上一次的输出信号对下一次的信号有反馈作用。
优选的，S4中浓度响应方程的建立步骤为：
S4-1、检测池仅有缓冲液时，进行S1-S3采集到的AD值记为ADV0；
S4-2、注入体积V0浓度C0的标准液，进行S1-S3采集到的AD值记为ADV1；
S4-3、建立浓度响应方程：
Figure BDA0002615473540000021
式中，y为采集到的AD值，x为待测物浓度c。
更优的，S4还包括浓度响应方程的检验步骤：
S4-4、再次注入体积V0的标准液，进行S1-S3采集到的AD值记为ADV2；
S4-5、根据S4-3已建立的浓度响应方程计算此时待测物浓度c，若c∈[C0-2％，C0+2％]，则认为浓度响应方程可靠；否则认为浓度响应方程失败，并重复S4-1-S4-5建立浓度响应方程。
优选的，S5中待测物的葡萄糖浓度的测量步骤为：
S5-1、清洗移液针，在检测池中注入一定体积V1的待测液，采集此时的AD值记为ADV3；
S5-2、将ADV3作为y代入S4-3建立的浓度相应方程，获得待测液的理论浓度C1＝x；
S5-3、待测液实际浓度C：
Figure BDA0002615473540000031
式中，V0为标准液的体积。
优选的，普鲁士蓝生物电极检测芯片因为其生物特性会在合适的浓度范围内与反应电流有良好的线性关系，S6中判断是否处于最佳浓度范围的步骤是：
S6-1、建立酶电极微弱电流与待测物不同浓度的线性关系；
S6-2、根据线性关系将待测物浓度与进样量划分不同区间：V1，V2，V3为进样量体积，V1>V2>V3，X0，X1，X2，X3为检测芯片对应进样量的最佳检测浓度节点，X0<X1<X2<X3；
当进样量为V1时，芯片的最佳检测范围在X0～X1之间，当进样量为V2时，芯片的最佳检测范围在X1～X2之间，当进样量为V3时，芯片的最佳检测范围在X2～X3之间；
S6-3、判断步骤S5获得浓度C与X1的大小：
(1)若C＜X1，则认为处于最佳浓度范围并结束；
(2)若C≥X1，则调整进样量为V2，重复S5获得浓度C′；
判断获得浓度C′与X2的大小：
(3)若C′＜X2，则认为处于最佳浓度范围并结束；
(4)若C′≥X2，则调整进样量为V3，重复S5获得浓度C″。
优选的，连续测量3次取平均值获得待测物的葡萄糖最终浓度。
本发明还公开了一种葡萄糖宽范围高精度自动检测系统，包括酶电极传感系统、微安电流检测电路、数据滤波采集系统、主机，高精密注射自动控制系统：
酶电极设置在检测池中，与底物发生化学反应产生微安级的电流信号；
微安电流检测电路检测微安级的电流信号，并转换成标准电压信号；
数据滤波采集系统将标准电压信号进行滤波，有效消除检测中的多种信号干扰，实现高精度检测；
主机基于建立的浓度响应方程，根据浓度测量值与响应电流线性关系获取待测物浓度数据；
高精密注射自动控制系统，控制系统自主识别不同浓度区间，根据浓度区间自动调节进样量，保证检测池中的待测物浓度处于传感电极的最佳响应范围内。
优选的，它还包括自主定标系统，用于在检测时自动判断酶活性是否降低，并以此来确定是否重新建立相应的浓度响应方程，从而提高检测的精度。
本发明的有益效果
一种葡萄糖宽范围高精度自动检测方法采用了普鲁士蓝制备的电化学酶生物传感器，酶生物传感器与不同浓度的待测组分反应产生微安级电化学信号，微安电流检测电路把微安级电流信号通过I/V和二级程控放大电路转换为标准电压信号，然后通过16位的A/D转化电路转化为数字信号，并经过数字滤波处理得到有效的AD值，根据浓度与AD值线性关系建立方程，计算得到组分浓度的测量值，控制系统自主识别不同浓度区间，判断测量值是否处于最佳浓度范围内，根据偏差自动调节进样量设定值V，保证检测池中的待测物浓度分布在检测芯片的最合适范围内，并通过高精密进样装置将待测液注入检测池中进行检测，采用多次检测求平均值，从而实现宽范围高精度检测。
普鲁士蓝生物酶电极因其检测特性会对检测葡萄糖有一定的浓度范围，本发明给出的自动检测方法可以扩大葡萄糖浓度的检测范围并提高检测精度。通过自制的普鲁士蓝生物酶电极设计电极传感系统、高精度低成本检测电路、数据滤波采集系统、自主定标系统、浓度响应方程、高精密注射自动装置，实现葡萄糖的宽范围高精度检测。
生物发酵过程的研究是一个浩大的工程，对发酵过程进行实时监控，将为生物发酵的研究提供数据支持，可以使研究更加深入和透明化，为先进的发酵过程控制提供依据，方便对发酵过程进行反馈控制，为生物发酵中的生化反应创造更好的反应环境。
附图说明
图1为本发明的检测方法的功能模块设计图。
图2为本发明的自制备传感芯片
图3为本发明的微安电流检测电路总体结构框图
图4为本发明自动调整进样量逻辑图。
图中标记为：1-绝缘层、2-工作层、3-导电层、4-参比层、5-聚对苯二甲酸已二醇脂(PET)基板、6-集成传感芯片、7-参比电压电路、8-I2C电路、9-I/V转换电路、10-信号放大器、11-噪声抑制电路、12-数字I/O口、13-存储电路、14-主芯片、15-时钟、16-16位ADC、17-电源、18-485电路、19-主机
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此：
本发明公开了一种葡萄糖宽范围高精度自动检测方法，结合图1，它包括以下步骤：
S1、酶电极与底物发生化学反应产生微安级的电流信号；
S2、电流信号转换成标准电压信号；
S3、数字滤波系统对信号进行滤波获得有效的AD值，有效消除检测中的多种信号干扰；
S4、建立浓度响应方程；
S5、基于电压的数字信号精确测量待测物的葡萄糖浓度；
S6、判断是否处于最佳浓度范围，是则进行S7；否则调节进样量，并返回步骤S5；
S7、获得待测物的葡萄糖最终浓度。
优选的实施例中，S1中酶电极采用普鲁士蓝生物酶电极，根据普鲁士蓝材料规整纳米晶结构对葡萄糖浓度宽线性范围的精确识别特性，利用丝网印刷技术将传感系统中的三电极集成为微型传感芯片；S2中采用微安电流检测电路，采集酶电极产生的微安级的电流信号，经过设计I/V转化电路和放大电路转换成标准电压信号，通过16位高精度A/D转化电路实现微安级电流精确信号检测与转换；S3中设计数据滤波采集系统，对于检测电路采集信号进行滤波，有效消除检测中的多种信号干扰，实现高精度检测；S4中，主机建立浓度响应方程：根据浓度测量值与响应电流线性关系，根据自主标定建立浓度响应方程，并对方程进行校验，确保方程的可靠性；S6中，高精密注射自动控制系统自主识别不同的浓度区间，根据浓度区间自动调节进样量，保证检测池中的待测物浓度处于传感电极的最佳响应范围内，实现葡萄糖的宽范围高精度的检测。
结合图2，集成传感芯片6作为普鲁士蓝生物酶电极，采用自制的普鲁士蓝生物电极检测芯片，包括绝缘层1、工作层2、导电层3、参比层4、基板5，导电层3设计为三电极印刷芯片的构型，采用丝网印刷技术将普鲁士蓝(工作电极-工作层2)、碳浆料(对电极)及AgCl(参比电极-参比层4)微型化集成至同一有机支撑体-基板5上，优选的实施例中，基板5为聚对苯二甲酸已二醇脂(PET)基板；采用酶附着于工作电极上，与底物产生化学反应产生微安级的电流，当不同浓度的底物与普鲁士蓝生物电极检测芯片反应时会产生不同大小微安级电流，普鲁士蓝生物电极检测芯片因为其生物特性会在合适的浓度范围内与反应电流有良好的线性关系，根据其检测特性可以将待测组分浓度划分为不同区间。
结合图3，葡萄糖宽范围高精度自动检测系统包括参比电压电路7、I2C电路8、I/V转换电路9、信号放大器10、噪声抑制电路11、数字I/O口12、存储电路13、主芯片14、时钟15、16位ADC16、电源17、485电路18、主机19。其中：数字I/O口12、存储电路13、主芯片14、时钟15、16位ADC16组成MCU；I/V转换电路9、信号放大器10、噪声抑制电路11用于将集成传感芯片6反应产生的微安级电流信号经过I/V转换电路和信号放大器，噪声抑制，然后由16位ADC16采集到此时的数字信号，并通过485电路18传送给主机19，在主机19中进行待测物的葡萄糖浓度检测。
如图4所示为自动调整进样量逻辑图。移液针抽取V1体积的待测液进行检测，计算出浓度为C1，根据V0、V1和C1的关系得出待测液的实际浓度为：
Figure BDA0002615473540000061
判断C′1与X1的大小关系：若C′1小于X1，则重复上述两次清洗取样，计算出浓度分别为C″1、C″′1，计算待测液的浓度C＝(C′1+C″1+C″′1)/3，再清洗结束；若C′1大于X1，调整进样量为V2，清洗，移液针抽取V2体积的未知浓度的待测液进行检测，计算出浓度为C2，根据V0、V2和C2的关系得出待测液的实际浓度为：
Figure BDA0002615473540000062
判断C′2与X2的大小关系，若C′2小于X2，重复上述两次清洗取样，计算出浓度分别为C″2、C″′2，计算待测液的浓度C＝(C′2+C″2+C2″′)/3，再清洗结束；若C2大于X2，调整进样量为V3，清洗，移液针抽取V3体积的未知浓度的待测液进行检测，计算出浓度为C3，根据V0、V2和C3的关系得出待测液的实际浓度为：
Figure BDA0002615473540000063
重复上述两次清洗取样，计算出浓度分别为C″3、C″′3，计算待测液的浓度C＝(C′3+C″3+C3″′)/3，再清洗结束。
下面结合具体实操对本发明作进一步说明。
根据实验得出普鲁士蓝生物电极检测芯片检测葡萄糖时的进样量与浓度的分段关系为：在进样量为50μl时，芯片的最佳检测范围为0.2～5g/L之间，当进样量为25μl时，芯片的最佳检测范围在5～20g/L之间，当进样量为5μl时，芯片的最佳检测范围在20～100g/L之间。
葡萄糖溶液在检测池中与酶电极反应产生微弱的微安级电流，通过检测电路的I/V转换电路转换为电压信号，电压信号通过两级程控放大转换为标准电压信号，通过16位的A/D转化电路转化为数字信号，数字信号经数字滤波Y(n)＝αX(n)+(1-α)Y(n-1)处理后得到有效的AD值。
控制系统根据采集到AD值，检测池中只有缓冲液时为2583，50uL体积的已知浓度6g/L的葡萄糖标准液时为2144.6，建立浓度响应方程
Figure BDA0002615473540000064
再次注入相同体积的葡萄糖标准液采集到的2141.5值代入已经建立的浓度响应方程计算出浓度6.04g/L，6.04g/L在标准液浓度6g/L的±2％误差以内，认为浓度响应方程可靠。
浓度响应方程建立成功后，清洗，移液针抽取50uL体积的未知浓度的葡萄糖待测液进行检测，计算出浓度为10.23g/L，根据V0、V1和C1的关系得出待测液的实际浓度为：10.23g/L；
10.23大于5，调整进样量为25uL，清洗，移液针抽取25uL体积的未知浓度的待测液进行检测，计算出浓度为22.50g/L，根据V0、V2和C2的关系得出待测液的实际浓度为：45.00g/L；
45.00大于20，调整进样量为5uL，清洗，移液针抽取5uL体积的未知浓度的待测液进行检测，计算出浓度为6.01g/L，根据V0、V2和C3的关系得出待测液的实际浓度为：60.1g/L，重复上述两次清洗取样，计算出浓度分别为60.5g/L、59.8g/L，计算待测液的浓度C＝(60.1+60.5+59.8′)/3，再清洗结束。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神做举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (9)

1.一种葡萄糖宽范围高精度自动检测方法，其特征在于它包括以下步骤：
S1、酶电极与底物发生化学反应产生微安级的电流信号；
S2、电流信号转换成标准电压信号；
S3、数字滤波系统对信号进行滤波获得有效的AD值，有效消除检测中的多种信号干扰；
S4、建立浓度响应方程；
S5、基于电压的数字信号精确测量待测物的葡萄糖浓度；
S6、判断是否处于最佳浓度范围，是则进行S7；否则调节进样量，并返回步骤S5；S6中判断是否处于最佳浓度范围的步骤是：
S6-1、建立酶电极微弱电流与待测物不同浓度的线性关系；
S6-2、根据线性关系将待测物浓度与进样量划分不同区间：V1，V2，V3为进样量体积，V1>V2>V3，X0，X1，X2，X3为检测芯片对应进样量的最佳检测浓度节点，X0<X1<X2<X3；
当进样量为V1时，芯片检测的最佳浓度范围在X0～X1之间，当进样量为V2时，芯片检测的最佳浓度范围在X1～X2之间，当进样量为V3时，芯片检测的最佳浓度范围在X2～X3之间；
S6-3、判断步骤S5获得浓度C与X1的大小：
(1)若C＜X1，则认为处于最佳浓度范围并结束；
(2)若C≥X1，则调整进样量为V2，重复S5获得浓度C′；
判断获得浓度C′与X2的大小：
(3)若C′＜X2，则认为处于最佳浓度范围并结束；
(4)若C′≥X2，则调整进样量为V3，重复S5获得浓度C″；
S7、获得待测物的葡萄糖最终浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于S2的具体步骤为：
S2-1、电流信号通过I/V转换电路转换为电压信号；
S2-2、电压信号通过两级程控放大转换为标准电压信号。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于S3的具体步骤为：
S3-1、标准电压信号通过16位的A/D转化电路转化为数字信号；
S3-2、数字信号经数字滤波Y(n)＝αX(n)+(1-α)Y(n-1)处理后得到有效的AD值，其中：α为小于1大于0的数，X(n)为本次实际采集到的AD值，Y(n-1)为上次最后得出的AD值，Y(n)为本次所得AD值。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于S4中浓度响应方程的建立步骤为：
S4-1、检测池仅有缓冲液时，进行S1-S3采集到的AD值记为ADV0；
S4-2、注入体积V0浓度C0的标准液，进行S1-S3采集到的AD值记为ADV1；
S4-3、建立浓度响应方程：
Figure FDA0003546123870000021
式中，y为采集到的AD值，x为待测物浓度c。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于S4还包括浓度响应方程的检验步骤：
S4-4、再次注入体积V0的标准液，进行S1-S3采集到的AD值记为ADV2；
S4-5、根据S4-3已建立的浓度响应方程计算此时待测物浓度c，若c∈[C0-2％，C0+2％]，则认为浓度响应方程可靠；否则认为浓度响应方程失败，并重复S4-1-S4-5建立浓度响应方程。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于S5中待测物的葡萄糖浓度的测量步骤为：
S5-1、清洗移液针，在检测池中注入一定体积V1的待测液，采集此时的AD值记为ADV3；
S5-2、将ADV3作为y代入S4-3建立的浓度相应方程，获得待测液的理论浓度C1＝x；
S5-3、待测液实际浓度C：
Figure FDA0003546123870000022
式中，V0为标准液的体积。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于连续测量3次取平均值获得待测物的葡萄糖最终浓度。
8.一种葡萄糖宽范围高精度自动检测系统，其特征在于包括酶电极传感系统、微安电流检测电路、数据滤波采集系统、主机，高精密注射自动控制系统：
酶电极设置在检测池中，与底物发生化学反应产生微安级的电流信号；
微安电流检测电路检测微安级的电流信号，并转换成标准电压信号；
数据滤波采集系统将标准电压信号进行滤波，有效消除检测中的多种信号干扰，实现高精度检测；
主机基于建立的浓度响应方程，根据浓度测量值与响应电流线性关系获取待测物浓度数据；
高精密注射自动控制系统，控制系统自主识别待测物浓度所处的浓度区间，根据所述浓度区间自动调节进样量，保证检测池中的待测物浓度处于传感电极的最佳响应范围内。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于它还包括自主定标系统，用于在检测时自动判断酶活性是否降低，并以此来确定是否重新建立相应的浓度响应方程，从而提高检测的精度。
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