CN112062811B - 一种维拉卡肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种维拉卡肽的制备方法，其包括以下步骤：1)以固相合成的方法制备全保护的维拉卡肽主链‑固相合成树脂；2)裂解脱除Cys的侧链保护基P；3)固相电化学法氧化，通过二硫键偶联半胱氨酸；4)裂解所有保护基以及固相合成树脂，得到维拉卡肽粗肽；任选地，5)色谱纯化，得到维拉卡肽精肽；其中，固相电化学氧化方法为，将步骤2)所得脱除Cys的侧链保护基的多肽‑固相合成树脂在电解质和溶液中电解至二硫键反应完全；P为Cys的侧链保护基。此方法能够提高片段肽树脂的利用率，提高主链片段利用率和原子利用率，从而降低生产成本，避免了原研专利中2,2‑二硫二吡啶化合物的使用，更加环保，倡导了绿色化学的理念。

Description

一种维拉卡肽的合成方法
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种维拉卡肽的合成方法。
背景技术
维拉卡肽(Etelcalcetide)是由AMGEN INC开发的一种拟钙剂，主要用于慢性肾病成人患者做血液透析治疗的继发性甲状旁腺功能亢进的多肽药物。2017年2月07日在美国上市，商品名为Parsabiv。其用于继发性甲状旁腺机能亢进时在降低甲状旁腺素水平方面与西那卡塞一样好，并且因其可在血液透析后静脉给药，优于现有的标准拟钙剂治疗药西那卡塞。
维拉卡肽的主链有七个D-型氨基酸组成，侧链通过一个二硫键与L-半胱氨酸相连。其肽序如下：
Figure BDA0002088727820000011
维拉卡肽肽序
常规方法偶联合成维拉卡肽的关键在于二硫键的构建，常规的肽合成中使用的构建二硫键的方法包括空气氧化法，碘/醋酸体系氧化法，双氧水氧化法，这类方法无法保证反应的专一选择性，无可避免的会产生错配杂质，产品纯度较低，增加了纯化的难度。专利CN105504012介绍了一种假稀释反应避免液相反应中存在的多肽链间二硫键错配问题，但固相成二硫键反应为非均相反应，反应转化率较低，导致产品维拉卡肽收率低于30％。专利CN106928320和专利CN201580029560.2报道了2,2-二硫二吡啶活化法合成维拉卡肽的方法，但产生等当量的巯基吡啶化合物，不但增加纯化难度，而且给环境造成污染，不利于环保。专利CN106928321介绍了一种全液相合成维拉卡肽的方法，但反应后处理操作繁杂，总收率较低。
开发原子经济性反应和环保已成为绿色化学研究的核心内容，从原子经济性的角度来讲，常规的依序偶联方法由于无法避免这种线性肽的二硫键的构建的专一选择性问题，导致最后一个L-型半胱氨酸二硫键的构建时，七个D-氨基酸主链片段有效利用率较低，即原子利用率较低。在一般的固相合成操作过程中，氨基酸用量一般为3～5eqv，当主链片段有效利用率较低时将造成相应氨基酸的大量浪费，而且D-氨基酸价格较昂贵，更有必要提高原子利用率，从而降低生产成本，减少能源浪费。而采用2,2-二硫二吡啶活化法合成维拉卡肽又会导致大量的巯基吡啶副产物生成，造成环境污染，不利于环保。
发明内容
鉴于上述情况，亟需一种环保高效的维拉卡肽制备方法，本发明通过Fmoc/tBu策略固相连接主链氨基酸残基，然后通过电化学方法固相偶联侧链半胱氨酸，最后裂解沉淀得到维拉卡肽。如此，可以避免反应的专一选择性问题，提高主链片段利用率，提高原子利用率，从而降低生产成本，避免了2,2-二硫二吡啶化合物的使用，更加环保，符合绿色化学的理念。反应流程如下：
Figure BDA0002088727820000021
本发明一个方面提供了一种维拉卡肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)以固相合成的方法制备全保护的维拉卡肽主链-固相合成树脂，即Ac-D-Cys(P)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-固相合成树脂；
2)裂解脱除Cys的侧链保护基P；
3)固相电化学法氧化，通过二硫键偶联半胱氨酸；
4)裂解所有保护基以及固相合成树脂，得到维拉卡肽粗肽；
任选地，5)色谱纯化，得到维拉卡肽精肽；
其中，固相电化学氧化方法为，将步骤2)所得脱除Cys的侧链保护基的多肽-固相合成树脂在电解质和溶液中电解至二硫键反应完全；
P为Cys的侧链保护基。
在本发明的技术方案中，步骤3)中的电化学反应温度为25℃-65℃，优选40-60℃。
在本发明的技术方案中，步骤3)中的电解质选自四丁基高氯酸铵、四丁基四氟硼化铵、四丁基六氟膦化铵，优选四丁基四氟硼化铵。
在本发明的技术方案中，步骤3)中的采用铂电极通电氧化，电流强度为5-20mA；优选10-15mA。
在本发明的技术方案中，步骤3)的反应时间为2-100小时。
在本发明的技术方案中，步骤1)中固相合成树脂为Rink Amide AM Resin、RinkAmide MBHA Resin或Rink Amide Resin等树脂，树脂替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.3-0.5mmol/g。
在本发明的技术方案中，步骤1)中固相合成的方法制备指按照C端到N端的顺序偶联Fmoc-AA-OH，Fmoc-AA-OH的偶联顺序为依次偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Cys(P)-OH，然后偶联乙酸。
在本发明的技术方案中，Fmoc-Cys(P)-OH中P为Trt、Mmt或Dpm。
在本发明的技术方案中，所述固相合成的方法包括：a)脱除Fmoc，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；b)将待偶联氨基酸(或乙酸)和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；c)重复a)和b)。
在本发明的技术方案中，脱除Fmoc的试剂为20％的哌啶/DMF溶液(DBLK)，即哌啶：DMF(体积比)为1:4的混合溶液。
在本发明的技术方案中，所述步骤a)中的偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物，其中化合物A为HOBt或HOAt，化合物B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。
在本发明的技术方案中，步骤1)的反应在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力下进行；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
步骤1)的反应优选将固相合成树脂在偶联之前进行溶胀，所述洗涤和溶胀的步骤本领域可采用实现该目的的任何试剂进行，包括DMF、NMP、二氯甲烷等，优选DMF。所述反应中应用的检测方法是本领域已知的可实现此目的的任意方法，例如色谱法或化学标定法，优选使用可判定反应终点的试剂，优选茚三酮，当使用茚三酮时，若树脂显色则说明多肽中有游离的胺，即胺上无保护基。选用的偶联剂为DIPCDI+A或者DIPEA+A+B，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU其中之一。
步骤2)所用到的脱除剂为TFA/DCM的混合液，溶液体积比为1％-10％，优选1％-5％，反应终点为溶液由红色变为无色。
步骤4)中裂解液为TFA，TIS和H2O的混合物；优选为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5。
步骤5)所述纯化步骤采用反相高压液相色谱法。进一步地，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
Ac-D-Cys(Mmt)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-固相合成树脂中，D代表D构型氨基酸，Mmt、Pbf为侧链保护基，主链通过氨基酸的α氨基和羧基偶联。
缩写及英文含义
Figure BDA0002088727820000041
Figure BDA0002088727820000051
有益效果
本发明通过Fmoc/tBu策略固相连接主链氨基酸残基，然后通过电化学方法固相氧化偶联侧链的半胱氨酸，然后经裂解、沉淀、纯化后得到维拉卡肽。此种方法能够提高片段肽树脂的利用率，提高主链片段利用率，提高原子利用率，从而降低生产成本，避免了原研专利中2,2-二硫二吡啶化合物的使用，更加环保，倡导了绿色化学的理念。
具体实施方式
实施例1：主链肽树脂合成
称取Rink Amide树脂(52g，替代度为0.48mmol/g)加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，再用DMF溶胀树脂30分钟，加入DBLK脱保护(5min+7min)，树脂用DMF洗涤6次。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Ala-OH(23.372g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。Fmoc-D-Ala-OH(23.372g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。Fmoc-D-Cys(Mmt)-OH(46.180g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。加入70mL醋酸酐和60mL吡啶室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂6次。偶联结束后用甲醇收缩，真空抽干得到肽树脂80.0g，树脂增重率80.5％。
实施例2：固相脱除半胱氨酸保护基
在实施例1中得到的肽树脂中加入2％TFA/CH2Cl2溶液250mL脱除Mmt保护基。反应出现红色，反应2分钟，然后抽掉溶液，重复10次，直至溶液红色消失，用CH2Cl2洗涤3次后再用DMF洗涤3次。
实施例3：固相氧化偶联半胱氨酸
将实施例2中得到的肽树脂加入到1000ml三口瓶中，依次加入DMF500ml、四丁基四氟硼化铵8.2g(25mmol)、半胱氨酸盐酸盐一水合物11.7g(75mmol)，然后插入铂电极(阳极：15mm×15mm×0.3mm，阴极：15mm×15mm×0.3mm))，控制电流12mA，40℃搅拌反应48小时。反应结束后，停止通电，过滤，DMF洗涤6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，真空干燥得肽树脂94.0g，树脂增重率为79.5％。
实施例4：裂解肽树脂
将实施例3得到的肽树脂94.0g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)，940ml)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入9.4L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，氮气吹干得到粗肽26.20克，粗肽纯度89.7％，收率99.92％。
实施例5：反相色谱制备精肽
将实施例4得到的粗肽用高效液相纯化，以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。得精肽16.8g，纯度99.98％，收率64.5％。
实施例6：原研方法对比实施例主链肽树脂合成
称取Rink Amide树脂(52g，替代度为0.48mmol/g)加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，再用DMF溶胀树脂30分钟，加入DBLK脱保护(5min+7min)，树脂用DMF洗涤6次。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Ala-OH(23.372g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。Fmoc-D-Ala-OH(23.372g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。Fmoc-D-Cys(Mmt)-OH(46.180g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。加入70mL醋酸酐和60mL吡啶室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂6次。偶联结束后用甲醇收缩，真空抽干得到肽树脂80.0g，树脂增重率80.5％。
实施例7：原研方法对比实施例，裂解及2,2-二硫二吡啶活化
将实施例6得到的肽树脂51.3g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)，900ml)和2,2-二硫二吡啶(35.2g，6.4eqv)室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入9L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，氮气吹干得到活化中间体粗肽10.7克，粗肽纯度84.3％，收率91.06％。
实施例8：原研方法对比实施例，氧化得到粗肽
将实施7中的活化粗肽(10.7g)加入至1.5％TFA水溶液(3.5L)中，加入L-Cys-OH(1.55g,1.1eqv)搅拌2小时。经HPLC检测，粗肽纯度40.31％。
实施例9：原研方法对比实施例，反相色谱制备精肽
将实施例7得到的粗肽用高效液相纯化，得精肽4.3g，纯度98.7％，收率32.4％。
实施例10固相氧化偶联半胱氨酸(条件筛选-温度)
将实施例2中得到的肽树脂加入到1000ml三口瓶中，依次加入DMF500ml、四丁基四氟硼化铵8.2g(25mmol)、半胱氨酸盐酸盐一水合物11.7g(75mmol)，然后插入铂电极(阳极：15mm×15mm×0.3mm，阴极：15mm×15mm×0.3mm))，控制电流12mA，60℃搅拌反应48小时。反应结束后，停止通电，过滤，DMF洗涤6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，真空干燥得肽树脂93.0g，树脂增重率为78.6％。
实施例11：裂解肽树脂(条件筛选-温度)
将实施例10得到的肽树脂93.0g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)，940ml)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入9.3L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，氮气吹干得到粗肽25.20克，粗肽纯度90.1％，收率96.18％。
实施例12固相氧化偶联半胱氨酸(条件筛选-电解质)
将实施例2中得到的肽树脂加入到1000ml三口瓶中，依次加入DMF500ml、四丁基六氟膦化铵9.3g(25mmol)、半胱氨酸盐酸盐一水合物11.7g(75mmol)，然后插入铂电极(阳极：15mm×15mm×0.3mm，阴极：15mm×15mm×0.3mm))，控制电流12mA，40℃搅拌反应48小时。反应结束后，停止通电，过滤，DMF洗涤6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，真空干燥得肽树脂94.1g，树脂增重率为79.5％。
实施例13：裂解肽树脂(条件筛选-电解质)
将实施例12得到的肽树脂94.1g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)，940ml)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入9.4L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，氮气吹干得到粗肽25.50克，粗肽纯度89.80％，收率97.30％。
实施例14固相氧化偶联半胱氨酸(条件筛选-电流)
将实施例2中得到的肽树脂加入到1000ml三口瓶中，依次加入DMF500ml、四丁基四氟硼化铵8.2g(25mmol)、半胱氨酸盐酸盐一水合物11.7g(75mmol)，然后插入铂电极(阳极：15mm×15mm×0.3mm，阴极：15mm×15mm×0.3mm))，控制电流15mA，40℃搅拌反应48小时。反应结束后，停止通电，过滤，DMF洗涤6次，DCM洗涤3次，甲醇收缩，真空干燥得肽树脂93.9g，树脂增重率为79.5％。
实施例15：裂解肽树脂(条件筛选-电流)
将实施例14得到的肽树脂93.9g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)，940ml)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入9.4L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，氮气吹干得到粗肽25.70克，粗肽纯度89.7％，收率98.12％。

Claims (16)

1.一种维拉卡肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)以固相合成的方法制备全保护的维拉卡肽主链-固相合成树脂，即Ac-D-Cys(P)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-固相合成树脂；
2)裂解脱除Cys的侧链保护基P；
3)固相电化学法氧化，通过二硫键偶联半胱氨酸；
4)裂解所有保护基以及固相合成树脂，得到维拉卡肽粗肽；
任选地，5)色谱纯化，得到维拉卡肽精肽；
其中，固相电化学氧化方法为，将步骤2)所得脱除Cys的侧链保护基的多肽-固相合成树脂在电解质和溶液中电解至二硫键反应完全；
P为Cys的侧链保护基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，Cys的侧链保护基选自Trt、Mmt和Dpm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，步骤3)中的电化学反应温度为25℃-65℃。
4.根据权利要求3所述的制备方法，步骤3)中的电化学反应温度为40-60℃。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤3)中的电解质选自四丁基高氯酸铵、四丁基四氟硼化铵、四丁基六氟膦化铵。
6.根据权利要求5所述的制备方法，步骤3)中的电解质选自四丁基四氟硼化铵。
7.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤3)中的采用铂电极通电氧化，电流强度为5-20mA。
8.根据权利要求7所述的制备方法，步骤3)中电流强度为10-15mA。
9.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤1)中固相合成的方法制备指按照C端到N端的顺序偶联Fmoc-AA-OH，Fmoc-AA-OH的偶联顺序为依次偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Cys(P)-OH，然后偶联乙酸。
10.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，所述固相合成的方法包括：a)脱除Fmoc，接着用溶剂洗涤树脂，直至用检测方法检测到完全脱除Fmoc为止；b)将待偶联氨基酸或乙酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用检测方法检测到反应终止为止；c)重复a)和b)。
11.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤2)所用到的脱除剂为TFA/DCM的混合液，溶液体积比为1％-10％，反应终点为溶液由红色变为无色。
12.根据权利要求11所述的制备方法，步骤2)所用到的脱除剂TFA和DCM溶液体积比为1％-5％。
13.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤4)中裂解液为TFA，TIS和H2O的混合物。
14.根据权利要求13所述的制备方法，步骤4)中裂解液为TFA，TIS和H2O的混合物，其比例为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5。
15.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，步骤5)所述纯化步骤采用反相高压液相色谱法。
16.根据权利要求15所述的制备方法，所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
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