CN112461802A - 一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，具体包括以下内容：在冰上解冻冠状病毒活性蛋白酶样品；使用裂解缓冲液配制冠状病毒活性蛋白酶样品液和FRET肽溶液；在黑色的半区96孔板中，添加冠状病毒活性蛋白酶样品液和FRET肽溶液；在摇床上混合1分钟，用微孔板密封膜封住实验孔，并在37℃下进行孵育；待孔板的温度降至环境温度，移除孔板的密封膜；在荧光仪上读取激发波长/发射波长＝340/495nm时的荧光强度值；用Edans/Dabcyl标准曲线，确定生成的Edans标记肽片段的浓度，并使用公式计算酶比活性。本发明所提供的同一实验方案可用于检测两种病毒蛋白酶的活性。
Description
技术领域
本发明涉及酶活性检测技术领域，具体为一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法。
背景技术
新冠病毒产生两种剪切病毒多聚蛋白的蛋白酶，类木瓜蛋白酶(PLpro)，以及类胰凝乳蛋白酶(3CLpro)。这两种蛋白酶活性的测量目前缺乏一份通用的定量检测方案，虽然已有报道其各自单独的测活法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法或高压液相色谱法。但这些方法都是基于对裂解后的肽片段进行分离，因而是相当繁琐且非定量的，只适合终点分析，若应用于化合物库高通量筛选并不实际。
近些年来，文献中也有描述使用荧光探针进行蛋白酶活性的测定。荧光基团，如共价连接在底物多肽末端的7-氨基-4-氨甲酰甲基香豆素(ACC)，可用作蛋白水解的报道基团。然而，蛋白酶对这些底物的识别可能会受到影响，因为在本来需要裂解的位点处，只有一侧含有天然底物的同源序列，另一侧被荧光基团所取代。例如，3CLpro有一个Leu-Gln↓Ser-Ala-Gly识别序列，这里箭头标记了剪切位点。虽然N端Leu-Gln序列对结合特异性起关键作用，但C端Ser-Ala-Gly序列可能对结合亲和力和切割效率起重要作用。因此，在裂解位点的序列结构受到破坏的底物可能无法像包含完整识别序列的底物那样被有效的切割。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，以解决上述背景技术中的存在的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，具体包括以下内容：
(1)在冰上解冻冠状病毒活性蛋白酶样品；
(2)使用裂解缓冲液配制2倍终浓度的冠状病毒活性蛋白酶样品液和2倍终浓度的FRET肽溶液；
(3)在黑色的半区96孔板中，添加25μl 2倍终浓度的冠状病毒活性蛋白酶样品液和25μl 2倍终浓度的FRET肽溶液，达到50μl的反应体积；
(4)在摇床上混合1分钟，用微孔板密封膜封住实验孔，并在37℃下进行孵育；
(5)待孔板的温度降至环境温度，移除孔板的密封膜；
(6)在荧光仪上读取激发波长/发射波长＝340/495nm时的荧光强度值；
(7)用Edans/Dabcyl标准曲线，确定生成的Edans标记肽片段的浓度，并使用公式计算酶比活性。
优选的，所述冠状病毒活性蛋白酶样品包括类木瓜蛋白酶样品和类胰凝乳蛋白酶样品。
优选的，所述裂解缓冲液包括类木瓜蛋白酶缓解液和类胰凝乳蛋白酶缓解液，所述类木瓜蛋白酶缓解液为：20mM Tris-HCl、pH 7.3，100mM NaCl和1mM EDTA的混合液，且在使用前加1mM新配DTT；所述类胰凝乳蛋白酶缓解液为：50mM HEPES、pH 7.5溶液，且在使用前加1mM新配DTT。
优选的，所述内容(7)中的酶比活性的计算公式为：酶比活力(SA)(pmol/min/mg)＝(Edans(μM)*反应体积(μl))/(反应时间(min)*酶量(mg))。
优选的，所述内容(4)中的孵化时间为60-90min。
与已公开技术相比，本发明存在以下优点：完全定量；更低的检出限促成更广的酶活力分析窗口；更少的工作量和更短的实验周期；可兼容高通量筛选的应用；利用天然底物序列可以提高酶反应效率；同一实验方案可用于检测两种病毒蛋白酶的活性。
附图说明
图1为本发明所生成的类胰凝乳蛋白酶滴定曲线；
图2为本发明所生成的类木瓜蛋白酶滴定曲线；
图3为本发明中的Edans/Dabcyl标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，具体包括以下内容：
(1)在冰上解冻类木瓜蛋白酶样品；
(2)使用20mM Tris-HCl、pH 7.3，100mM NaCl和1mM EDTA的混合液，再加入1mM新配DTT作为溶液，用以配制2倍终浓度的类木瓜蛋白酶样品样品液和2倍终浓度的FRET肽溶液；
(3)在黑色的半区96孔板中，添加25μl 2倍终浓度的类木瓜蛋白酶样品液和25μl2倍终浓度的FRET肽溶液，达到50μl的反应体积；
(4)在摇床上混合1分钟，用微孔板密封膜封住实验孔，并在37℃下进行孵育60-90min；
(5)待孔板的温度降至环境温度，移除孔板的密封膜；
(6)在荧光仪上读取激发波长/发射波长＝340/495nm时的荧光强度值；
(7)用Edans/Dabcyl标准曲线如图3所示，确定生成的Edans标记肽片段的浓度，并使用公式计算酶比活性，所述酶比活性的计算公式为：酶比活力(SA)(pmol/min/mg)＝(Edans(μM)*反应体积(μl))/(反应时间(min)*酶量(mg))，生成的类木瓜蛋白酶滴定曲线如图2所示。
实施例2
一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，具体包括以下内容：
(1)在冰上解冻类胰凝乳蛋白酶样品；
(2)使用50mM HEPES、pH 7.5溶液和1mM新配DTT作为溶液配制2倍终浓度的类胰凝乳蛋白酶样品液和2倍终浓度的FRET肽溶液；
(3)在黑色的半区96孔板中，添加25μl 2倍终浓度的类胰凝乳蛋白酶样品液和25μl 2倍终浓度的FRET肽溶液，达到50μl的反应体积；
(4)在摇床上混合1分钟，用微孔板密封膜封住实验孔，并在37℃下进行孵育60-90min；
(5)待孔板的温度降至环境温度，移除孔板的密封膜；
(6)在荧光仪上读取激发波长/发射波长＝340/495nm时的荧光强度值；
(7)用Edans/Dabcyl标准曲线如图3所示，确定生成的Edans标记肽片段的浓度，并使用公式计算酶比活性，所述酶比活性的计算公式为：酶比活力(SA)(pmol/min/mg)＝(Edans(μM)*反应体积(μl))/(反应时间(min)*酶量(mg))，生成的生成的类胰凝乳蛋白酶滴定曲线如图1所示。
本发明的工作原理为：类木瓜蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶这两种冠状病毒蛋白酶的酶活性可通过基于荧光共振能量转移(FRET)的检测方法得到检测，在完整的FRET肽中，Edans的荧光因为接近Dabcyl猝灭剂而被猝灭；当底物被裂解成两个单独的片段时，荧光得到恢复，并可以在激发波长/发射波长＝340nm/495nm时监测。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，其特征在于：具体包括以下内容，
(1)在冰上解冻冠状病毒活性蛋白酶样品；
(2)使用裂解缓冲液配制2倍终浓度的冠状病毒活性蛋白酶样品液和2倍终浓度的FRET肽溶液；
(3)在黑色的半区96孔板中，添加25μl 2倍终浓度的冠状病毒活性蛋白酶样品液和25μl 2倍终浓度的FRET肽溶液，达到50μl的反应体积；
(4)在摇床上混合1分钟，用微孔板密封膜封住实验孔，并在37℃下进行孵育；
(5)待孔板的温度降至环境温度，移除孔板的密封膜；
(6)在荧光仪上读取激发波长/发射波长＝340/495nm时的荧光强度值；
(7)用Edans/Dabcyl标准曲线，确定生成的Edans标记肽片段的浓度，并使用公式计算酶比活性。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，其特征在于：所述冠状病毒活性蛋白酶样品包括类木瓜蛋白酶样品和类胰凝乳蛋白酶样品。
3.根据权利要求2所述的一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，其特征在于：所述裂解缓冲液包括类木瓜蛋白酶缓解液和类胰凝乳蛋白酶缓解液，所述类木瓜蛋白酶缓解液为：20mM Tris-HCl、pH 7.3，100mM NaCl和1mM EDTA的混合液，且在使用前加1mM新配DTT；所述类胰凝乳蛋白酶缓解液为：50mM HEPES、pH 7.5溶液，且在使用前加1mM新配DTT。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，其特征在于：所述内容(7)中的酶比活性的计算公式为：酶比活力(SA)(pmol/min/mg)＝(Edans(μM)*反应体积(μl))/(反应时间(min)*酶量(mg))。
5.根据权利要求1所述的一种基于荧光共振能量转移的冠状病毒蛋白酶测活法，其特征在于：所述内容(4)中的孵化时间为60-90min。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210309 |
|
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