CN112961202A - 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法 - Google Patents
一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物合成技术领域，公开了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，包括如下步骤：S1.提取纯化GM1：将动物脑组织提取制得纯化后的GM1；S2.GM1的水解：将步骤S1制得的纯化后的GM1经SCDase催化的水解反应，使纯化后的GM1鞘氨醇部分中的多羟基脂肪胺的脂肪酸模块水解去除，而后经纯化制得纯化后的Lyso‑GM1；S3.特定脂肪酸模块的GM1的合成：将步骤S2制得的纯化后的Lyso‑GM1和特定脂肪酸在SCDase催化条件下反应，合成后经纯化制得特定脂肪酸模块的GM1。本发明能够高效制备千克级规模的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)，并对其进行再次分离纯化。
Description
技术领域
本发明属药物合成技术领域，具体涉及一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法。
背景技术
近年来对包括单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)在内的神经节苷脂(GLS)的应用研究受到广泛重视。大量研究发现，神经节苷脂对早老年性痴呆、帕金森综合症、脑及脊髓神经意外损伤、癫痫、脑瘫、缺血缺氧性脑病等有良好的治疗作用，可有效促进受损伤神经的功能恢复。而神经节苷脂(GLS)在神经系统中含量最高，各种GLS中，GM1和GT1b对神经突起生长的促进较大，因而目前单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)具有较广泛的药用前景。
我国自上世纪90年代从意大利引进单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)注射液至今，已经完全实现了单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)类药物的国产化。而作为核心的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的提取直接决定了药品的产量和质量。对于单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)而言，提取原料宜首选各种哺乳动物脑组织，如猪脑、羊脑、牛脑、水牛脑等。而猪脑组织中，GM1、GM3、GD1a和GD1b的含量百分比接近牛脑，而与人脑有较大的差别，主要表现是GM1和GD1b的含量明显高于人脑，所以目前对于单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1的提取，主要以猪脑为原料。
近年来，随着单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)广泛应用于临床治疗，其不良反应(ADR)也屡有发生。比如2016年由开封市食品药品检验所发表的“单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液致不良反应56例文献分析”，再比如2018年由福建中医药大学附属人民医院发表的“单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液的不良反应分析”等文章，均对单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的不良反应进行了统计分析。目前的研究表明，单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)应用于临床存在一定的药品安全风险，而导致上述药品安全风险的原因除了药品杂质因素外，还有众多未可知的因素。
现有制备单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)一般是采用猪脑为原料，采用层析的方式提取神经节苷脂物质，而后再通过纯化最终制得单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)纯品。如公开号为CN103087120B，发明名称为“单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法及其应用”的中国专利，再比如公开号为CN101177439A，发明名称为“千克级规模高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备”的中国专利，均是采用上述方式。从现有专利文献和相关已公开文献的检索结果看，单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的制备，纯度已经较高，相关杂质的含量已经可以控制在目前我国要求的药品杂质质量控制限度以内。因而，获知单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)药品安全风险的原因，并克服药品安全风险问题，是目前单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)临床应用急需解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，能够高效制备千克级规模的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)，并对其进行再次分离纯化，得到鞘氨醇部分链长为16或者18个碳原子GM1，以发挥各化合物最大的药物功能，并有效降低不良反应发生率。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：本发明保护一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，采用如下纯化合成路线：
首先，从动物脑组织提取纯化得到GM1；
然后，
最后，
进一步，上述单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，包括如下步骤：
S1.提取纯化GM1：将动物脑组织经丙酮处理、总脂抽提和神经节苷脂的Folch分配后制得GM1粗品，而后经过柱层析纯化制得纯化后的GM1；
S2.纯化后的GM1的水解：将步骤S1制得的纯化后的GM1经SCDase催化的水解反应，使纯化后的GM1鞘氨醇部分中的多羟基脂肪胺的脂肪酸模块水解去除，而后经纯化制得纯化后的Lyso-GM1；Lyso-GM1需通过C18或阴离子树脂纯化，与水解下来的脂肪酸链分开，再合成我们需要的脂肪酸链；
S3.纯碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的GM1的合成：将步骤S2制得的纯化后的Lyso-GM1和碳18或碳20或碳n脂肪酸在SCDase催化条件下反应，合成碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的GM1，而后经纯化制得碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的纯化后的GM1。
优选的，所述步骤S1包括以下步骤：
1)丙酮处理：将动物脑组织冷冻后去除脑膜和血管，加丙酮后打碎搅拌，而后抽滤、干燥，得到丙酮不溶物干粉；
2)总脂抽提：以氯仿-甲醇-水的混合溶液为抽提液，将步骤1)得到的丙酮不溶物干粉加入到抽提液中搅拌均匀，对丙酮不溶物干粉进行抽提，抽提后离心除去不溶物，收集上清液；
3)Folch分配：将步骤2)得到的上清液加蒸馏水充分混合，而后静置分层，取上层，而后向剩余下层溶液中添加蒸馏水充分混合后静置分层，取上层并多次重复后合并首次和之后的上层溶液，对合并的上层溶液减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，得GM1水溶液，而后脱盐浓缩，得到GM1粗提物；
4)柱层析纯化：将步骤3)得到的GM1粗提物先进行弱阴离子交换层析，而后进行凝胶排阻层析，最后冻干得纯化后的GM1。
更优选的，所述步骤2)中，抽提液中氯仿、甲醇和水的体积比为5：5：1；以10L抽提液添加1kg丙酮不溶物干粉的比例添加。
更优选的，所述步骤2)中，搅拌操作需要在4℃环境中持续搅拌过夜。
更优选的，所述步骤3)中，首次添加蒸馏水需要添加上清液体积15％的蒸馏水；之后添加蒸馏水需要添加下层溶液体积10％的蒸馏水；重复2～4次。
更优选的，所述步骤3)中，所述脱盐操作使用Sephadex-G25进行。
优选的，所述步骤S2中，反应体系中需要包括表面活性剂和金属离子；所述表面活性剂优选采用Triton X-100、TDC、sodium cholate或Tween 80中的一种，所述金属离子优选采用Ca2+、Mn2+、Co2+或Mg2+中的一种。
更优选的，所述表面活性剂采用Triton X-100、sodium cholate或Tween 80时，质量体积浓度控制在0.07％；所述金属离子采用Mn2+、Co2+或Mg2+时，浓度控制在100mM。
优选的，所述步骤S2中，所述水解反应的反应体系pH值控制在5.8，反应体系中需要包括表面活性剂TDC、金属离子Ca2+和SCDase，所述TDC质量体积浓度控制在0.07～0.7％，Ca2+的浓度控制在2.5～100mM，SCDase浓度控制在每mol底物4000U以上。
更优选的，所述步骤S2中，所述水解反应的反应体系中，采用35mM的乙酸钠缓冲液，pH值5.8。
更优选的，所述TDC质量体积浓度控制在0.4％，Ca2+的浓度控制在100mM，SCDase浓度控制在每mol的底物酶量5000U左右。
优选的，所述步骤S2中，所述纯化采用先离心去沉淀，而后取上清液用Sep-Pak tC18固相萃取柱纯化。
更优选的，所述固相萃取柱纯化的具体步骤为：先用100％甲醇洗，而后用超纯水和水洗，上样后用65％的甲醇洗脱出TDC，最后用85％甲醇洗脱Lyso-GM1，洗脱得到的Lyso-GM1经蒸发去甲醇后冻干，最终制得纯化后的Lyso-GM1。
优选的，所述步骤S3中，所述合成反应的反应体系pH值控制在7.5，反应体系中需要包括DME和SCDase，所述DME质量百分比浓度控制在10％；所述Lyso-GM1和脂肪酸的添加量控制在Lyso-GM1浓度0.75～10mM、脂肪酸质量百分比1～10mg/mL。SCDase的浓度控制在150～200U。
更为优选的，所述Lyso-GM1浓度1～10mM。
更优选的，所述步骤S3中，所述合成反应的反应体系还包括50mM的Tris-HCl。
优选的，所述步骤S3中，所述纯化采用先纳滤法除盐，然后用Sep-Pak tC 18固相萃取柱纯化。
更优选的，所述步骤S3中，所述固相萃取柱纯化的具体步骤为：先用纳滤法除盐，然后将除盐后的反应混合液流过一个500mg的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；再将流穿液流过一个5g的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；用水洗50mL，再用50％的甲醇洗50mL，然后用100％的甲醇洗下带有特定脂肪酸模块的GM1；最后蒸发浓缩并冻干，制得带有特定脂肪酸模块的纯化后的GM1。
本发明的有益效果是：首先，本发明首次提出了现有纯化后的GM1可以进一步纯化获得固定碳链长度脂肪酸模块的GM1产品，能够有效解决目前生产的GM1本身为混合物的问题；其次，本专利目的是通过应用生物酶法将GM1进一步纯化为16或者18个碳原子或者其它碳链长度的GM1，以发挥其各自化合物最大的药物功能，并能尽可能减少其他杂质带来的副作用；最后，本发明采用丙酮法提取、柱层析纯化和酶水解法进一步纯化的工艺方法，产品总收率较高，纯度也极高，成本相对较为低廉，工艺过程简单，可以适用于千克级的GM1产品的生产。
附图说明
图1是本发明实施例2制备出的碳22脂肪酸模块的GM1的色谱图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
名词解释：
GM1：单唾液酸四己糖神经节苷脂
SCDase：鞘脂N去酰基化酶
Lyso-GM1：酶-单唾液酸神经节苷酯
Folch分配：二氯甲烷/甲醇液液相分离提取脂质
Sephadex-G25：葡聚糖凝胶
TDC：牛磺脱氧胆酸钠
DME：乙二醇二甲醚
本发明的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，采用如下纯化合成路线：
首先，从动物脑组织提取纯化得到GM1；
然后，
最后，
本发明的单唾液酸四己糖神经节苷脂的纯化方法，具体包括如下步骤：
S1.提取纯化GM1：将动物脑组织经丙酮处理、总脂抽提和神经节苷脂的Folch分配后制得GM1粗品，而后经过柱层析纯化制得纯化后的GM1；
S2.纯化后的GM1的水解：将步骤S1制得的纯化后的GM1经SCDase催化的水解反应，使纯化后的GM1鞘氨醇部分中的多羟基脂肪胺的脂肪酸模块水解去除，而后经纯化制得纯化后的Lyso-GM1；
S3.纯碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的GM1的合成：将步骤S2制得的纯化后的Lyso-GM1和碳18或碳20或碳n脂肪酸在SCDase催化条件下反应，合成碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的GM1，而后经纯化制得碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的纯化后的GM1。
在一些优选实施方式中，所述步骤S1具体包括如下操作：
1)丙酮处理：将动物脑组织冷冻后去除脑膜和血管，加丙酮后打碎搅拌，而后抽滤、干燥，得到丙酮不溶物干粉；
2)总脂抽提：以氯仿-甲醇-水的混合溶液为抽提液，将步骤1)得到的丙酮不溶物干粉加入到抽提液中搅拌均匀，对丙酮不溶物干粉进行抽提，抽提后离心除去不溶物，收集上清液；
3)Folch分配：将步骤2)得到的上清液加蒸馏水充分混合，而后静置分层，取上层，而后向剩余下层溶液中添加蒸馏水充分混合后静置分层，取上层并多次重复后合并首次和之后的上层溶液，对合并的上层溶液减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，得GM1水溶液，而后脱盐浓缩，得到GM1粗提物；
4)柱层析纯化：将步骤3)得到的GM1粗提物先进行弱阴离子交换层析，而后进行凝胶排阻层析，最后冻干得纯化后的GM1。
发明人通过对GM1的不良反应相关文献和临床表现研究后发现，现有的GM1在临床使用时，即使纯度控制较佳，仍然存在不良反应。通过对医学文献的研究，发明人认为导致不良反应的重要因素是由于现有的GM1本身是混合物，包含了鞘氨醇部分链长为16和18个碳原子两种GM1，而不同碳链长度的GM1的功效和毒性显然并不相同，因而发明人认为需要将现有GM1进行进一步纯化，将16和18个碳原子两种GM1分离，这样能够对GM1的药用功效和不良反应的进一步研究提供基础。发明人通过研究发现碳18或碳20的GM1疗效最佳，且副作用相对最低，因而考虑将现有16和18个碳原子两种GM1进行再处理，制备碳18或碳20的GM1。
本发明主要利用SCDase水解反应的可逆性来实现GM1鞘氨醇部分中的多羟基脂肪胺的脂肪酸模块的去除和新脂肪酸模块的合成。采用上述反应模式能够实现GM1鞘氨醇部分中的多羟基脂肪胺的脂肪酸模块碳链长度的自由控制，可以依据需要对脂肪酸模块进行控制获得不良反应率更低、药效更佳的GM1产品。而且这种合成方法制备的GM1产品杂质含量极低，不会有副产物产生，纯度极高，经过优化后，收率也能控制在较高水平。
本发明的步骤S1中提取纯化GM1的过程是针对现有技术进行过优化的提取工艺。不但产量较高，而且杂质含量能够控制在极低水平，纯化过程简单易操作，可以便捷地生产千克级的GM1。Folch分配和柱层析纯化是工艺的核心，采用Folch分配能够有效将抽提液中的GM1提取分离出来，收率较高，而且Folch分配能够有效去除杂质；而柱层析纯化采用弱阴离子交换层析后进行凝胶排阻层析，能够更进一步去除杂质和溶剂，同时有效控制纯化过程中GM1的损失。本发明的提取工艺是通过上述两个步骤有机协同，从而实现收率和纯度均较佳的技术效果。
而本发明的后续进一步提纯过程依赖SCDase水解反应，有效的杂质控制也能保证反应过程中SCDase的活性较佳，反应体系的干扰较低，最终的收率和纯度能够较佳。
在一些优选实施方式中，所述步骤2)中，抽提液中氯仿、甲醇和水的体积比为5：5：1；以10L抽提液添加1kg丙酮不溶物干粉的比例添加。
在一些优选实施方式中，所述步骤2)中，搅拌操作需要在4℃环境中持续搅拌过夜。
上述参数是总脂抽提的最佳参数。能够确保投料损耗最低，收率最高，同时杂质量最低。氯仿、甲醇和水的比例是抽提液的最佳比例，能够获得最佳的抽提效果。
在一些优选实施方式中，所述步骤3)中，首次添加蒸馏水需要添加上清液体积15％的蒸馏水；之后添加蒸馏水需要添加下层溶液体积10％的蒸馏水；重复2～4次。
在一些优选实施方式中，所述步骤3)中，所述脱盐操作使用Sephadex-G25进行。
上述Folch分配方案的选择是基于粗品收率和成本的综合考虑后的结果。发明人通过实验研究发现，采用上述的操作步骤(加水量)，能够获得较佳的分层效果，分离出的上层中GM1的含量较高。通过持续分离实验，而后进行实验结果的分析，发明人发现采用上述的操作步骤时，重复进行4次后可以将98％的GM1分离出来。而后续重复需要不断进行静置分层，耗时较长，不利于成本控制。
本发明的另一个核心部分是进一步纯化GM1的工艺参数选择。
在一些优选实施方式中，所述步骤S2中，反应体系中需要包括表面活性剂和金属离子；所述表面活性剂优选采用Triton X-100、TDC、sodium cholate或Tween 80中的一种，所述金属离子优选采用Ca2+、Mn2+、Co2+或Mg2+中的一种。
优选的，所述表面活性剂采用Triton X-100、sodium cholate或Tween 80时，质量体积浓度控制在0.07％；所述金属离子采用Mn2+、Co2+或Mg2+时，浓度控制在100mM。
在一些更优选实施方式中，所述步骤S2中，所述水解反应的反应体系pH值控制在5.8，反应体系中需要包括表面活性剂TDC、金属离子Ca2+和SCDase，所述TDC质量体积浓度控制在0.07～0.7％，Ca2+的浓度控制在2.5～100mM，SCDase浓度控制在74mU以上。
优选的，所述步骤S2中，所述水解反应的反应体系中，采用35mM的乙酸钠缓冲液，pH值5.8。
优选的，所述TDC质量体积浓度控制在0.4％，Ca2+的浓度控制在100mM，SCDase浓度控制在3.9U。
目前对于GM1的水解而言，采用SCDase水解的水解率一般在65％左右，水解率很低，对于工业化生产而言收率较低。发明人通过研究发现，在表面活性剂条件下，在酸性反应体系中，水解率会提高。发明人进一步研究发现在反应体系中引入金属离子后，水解率会进一步提高，发明人推测，金属离子的引入能够提高水解率，是由于金属离子的引入能够抑制SCDase的合成活性，这样能够控制反应向水解方向进行，有效抑制水解产物重新生成GM1。上述条件综合优化后，水解率能提升至90％以上。
在实验研究过程中，发明人发现采用TDC和Ca2+的反应体系水解率最高，能够达到97％以上。通过实验过程的观察，发明人发现反应过程中会产生沉淀。发明人推测，由于SCDase水解的反应是可逆的，因而在反应过程中一部分GM1水解，而水解后的反应物也会重新合成GM1，而当反应进行至平衡状态时，两个反应速率处于平衡状态，因而水解率会达到最大值。据此，发明人合理推测TDC和Ca2+存在某种协同的效果导致水解率急剧上升，其次Ca2+可以和水解生成的脂肪酸形成沉淀从而进一步导致水解率提升。
在一些更优选实施方式中，所述步骤S2中，所述纯化采用先离心去沉淀，而后取上清液用Sep-Pak tC 18固相萃取柱纯化。
优选的，所述固相萃取柱纯化的具体步骤为：先用100％甲醇洗，而后用超纯水和水洗，上样后用65％的甲醇洗脱出TDC，最后用85％甲醇洗脱Lyso-GM1，洗脱得到的Lyso-GM1经蒸发去甲醇后冻干，最终制得纯化后的Lyso-GM1。
上述纯化过程易操作，成本较低。而且主要采用甲醇，易去除，不易残留杂质，能够有效控制纯度。发明人发现采用65％的甲醇能够洗脱TDC，而不会洗脱Lyso-GM1和GM1，而采用85％甲醇能够洗脱Lyso-GM1而不会洗脱GM1。因而确定上述纯化具体步骤，能够获得最佳纯度的Lyso-GM1。
在一些更优选实施方式中，所述步骤S3中，所述合成反应的反应体系pH值控制在7.5，反应体系中需要包括DME和SCDase，所述DME质量百分比浓度控制在10％，SCDase质量百分比浓度控制在0.1mg/mL；所述Lyso-GM1和脂肪酸的添加量控制在Lyso-GM1浓度0.75～10mM、脂肪酸质量百分比1～10mg/mL。
优选的，所述Lyso-GM1浓度1～10mM。
优选的，所述步骤S3中，所述合成反应的反应体系还包括50mM的Tris-HCl。
上述反应体系的构建主要是利用SCDase水解反应的可逆性，利用Lyso-GM1和脂肪酸合成GM1。反应条件的选择主要是基于将反应进程向合成方向进行优化。控制在7.5能够利于脂肪酸溶解，同时使SCDase获得较佳的合成活性。反应体系中未加入表面活性剂和金属离子，一方面为了让SCDase处于较佳的合成活性，另一方面是避免引入杂质。经过实验研究后，发明人发现，在上述反应条件下，合成的收率最高，能够达到75％以上，而且纯度较佳。
本发明的另一个核心点在于SCDase水解反应的条件优化，在本发明中，采用了控制Lyso-GM1浓度的方式来调节。本发明的Lyso-GM1浓度可以控制在0.75～10mM，优选可以达到1～10mM，这能够极大的提高反应产率。而上述反应条件的优化，是依赖于本发明设计了合理的反应配比，特别是精确控制了SCDase的添加量。
在一些更优选实施方式中，所述步骤S3中，所述纯化采用先纳滤法除盐，然后用Sep-Pak tC 18固相萃取柱纯化。
优选的，所述步骤S3中，所述固相萃取柱纯化的具体步骤为：先用纳滤法除盐，然后将除盐后的反应混合液流过一个500mg的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；再将流穿液流过一个5g的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；用水洗50mL，再用50％的甲醇洗50mL，然后用100％的甲醇洗下带有特定脂肪酸模块的GM1；最后蒸发浓缩并冻干，制得带有特定脂肪酸模块的纯化后的GM1。
本发明最后的纯化步骤是要纯化得到纯化后的GM1。现有技术纯化一般采用Sep-Pak tC 18固相萃取柱直接纯化。
例如：
可以首先将反应混合液先流过一个小的Sep-Pak tC18固相萃取柱(500mg)，反应体系中剩余的lyso-GM1及不饱和脂肪酸都会挂在固相萃取柱上，而大部分GM1衍生物会流下，再将流穿液流过一个大的Sep-Pak tC18固相萃取柱(5g)，将合成的GM1衍生物全部挂上，用水洗及50％的甲醇洗除杂，最后用100％甲醇洗脱出目标产物。
另外，也可先过一个大的Sep-Pak tC18固相萃取柱(5g)，此时衍生物、lyso-GM1及不饱和脂肪酸均挂在柱上，用水洗及50％的甲醇洗，除去buffer及反应体系中的甘油等杂质，再用90～100％的甲醇洗下GM1衍生物、lyso-GM1及不饱和脂肪酸的混合物，将混合物旋转蒸发并冻干，溶于水，再过一个小的Sep-Pak tC18固相萃取柱(500mg)，此时lyso-GM1及不饱和脂肪酸挂在柱子上，而大部分GM1衍生物则在流穿液中，收集流穿液即为GM1衍生物纯品。
而现有技术的纯化方法最终的产率均不足70％，而纯度很难达到95％以上。发明人详细分析了纯度无法提高的各种原因，并进行了大量实验研究后推测，导致纯化纯度无法提高的主要原因很可能是反应液中的试剂和盐对GM1衍生物的挂柱率存在影响，导致GM1衍生物挂柱率降低，并且会存在有杂质一并挂柱，而后续的除杂较难去除这部分杂质。
依据发明人的推测，发明人设计了全新的纯化步骤，首先采用纳滤法除盐，去除反应液中的试剂和盐等成分，然后再采用Sep-Pak tC18固相萃取柱将反应体系中剩余的lyso-GM1、不饱和脂肪酸和GM1衍生物分离，这样就避免了试剂和盐等杂质成分对挂柱的影响。经过实验检测，采用本方法纯化，反应总体收率能够超过70％，最终GM1衍生物的纯度能够达到98％以上。
本发明中，Lyso-GM1纯化步骤也同样可以采用先纳滤法除盐，然后再用Sep-PaktC18固相萃取柱纯化的方式，以进一步提高纯度和收率。
以下为本发明具体实施例
实施例1：
本实施例1提供了猪脑提取制备碳20脂肪酸模块的GM1的制备工艺
具体采用如下方法制备：
1、丙酮处理：新鲜猪脑在-80℃冷冻后去除脑膜和血管，加丙酮后打碎搅拌；对所得的溶液进行抽滤，除去丙酮溶液，收集丙酮不溶物，并将收集的丙酮不溶物置于环境中，充分干燥，得到丙酮不溶物干粉，在4℃下保存备用。
2、总脂抽提：氯仿-甲醇-水以5:5:1的比例混合，配置成为混合溶液，以混合溶液为抽提液；将丙酮不溶物干粉按照1kg丙酮不溶物干粉10L抽提液的比例加入到抽提液中搅拌均匀，在4℃下持续搅拌过夜，对丙酮不溶物干粉进行抽提；抽提后离心除去不溶物，收集上清液，上清液为脱脂后的神经节苷脂溶液，置于4℃下保存备用。
3、Folch分配：将上清液加15％蒸馏水充分混合，而后静置分层，取上层；而后向剩余下层溶液中添加10％蒸馏水充分混合后静置分层，取上层，重复2次；合并三次上层溶液，得到含有神经节苷脂的甲醇水溶液；将含有神经节苷脂的甲醇水溶液，置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，得神经节苷脂水溶液；使用Sephadex-G25对上述神经节苷脂水溶液进行脱盐，收集脱盐后溶液，置于冷冻干燥机中进行浓缩，浓缩至原体积的1/4，得到神经节苷脂粗提取物，4℃下保存备用。
4、柱层析纯化：将神经节苷脂粗提取物先进行弱阴离子交换层析，而后进行凝胶排阻层析，最后冻干得纯化后的GM1。
5、纯化后的GM1的水解：构建水解反应体系，以35mM的乙酸钠为缓冲液，pH值5.8，加入质量体积浓度0.4％的TDC，和100mM的CaCl2，SCDase浓度控制在74mU以上；按照每20mL反应体系添加100mg GM1的比例添加纯化后的GM1，而后在37℃条件下反应12h，充分水解。
6、Lyso-GM1纯化：先用100％甲醇和纯水洗涤Sep-Pak tC 18固相萃取柱，而后将水解反应液经Sep-Pak tC 18固相萃取柱萃取；萃取后先用8～10个柱体积的水洗；水洗后用65％甲醇洗脱TDC，直至TLC检测完全洗脱TDC，然后用85％的甲醇洗脱Lyso-GM1，直至TLC检测完全洗脱Lyso-GM1；洗脱液置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，冻干后制得纯化后的Lyso-GM1。
7、碳20脂肪酸模块的GM1合成：构建反应体系，pH7.5，脂肪酸浓度1mg/mL，质量百分比浓度10％的DME，SCDase浓度控制在150～200U；以每20mL反应体系加入20mg的纯化后的Lyso-GM1的比例加入Lyso-GM1；脂肪酸选用碳链长度为20的不饱和脂肪酸，检测直至脂肪酸消失完成合成反应。
8、碳20脂肪酸模块的GM1纯化：先采用纳滤法去除反应液中的盐和试剂等杂质成分；然后将反应液流过一个500mg的Sep-Pak tC 18固相萃取柱，再将流穿液流过一个5g的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；对5g的Sep-Pak tC 18固相萃取先用水洗50mL，再用50％的甲醇洗50mL，而后用100％的甲醇洗脱碳20脂肪酸模块的GM1；洗脱液置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，后置于冷冻干燥机中进行浓缩，得到碳20脂肪酸模块的纯化后的GM1。
经检测和计算，采用本方法水解率97％，合成收率76％，最终制得的碳20脂肪酸模块的纯化后的GM1的纯度98.7％。
实施例2：
本实施例1提供了猪脑提取制备碳22脂肪酸模块的GM1的制备工艺
具体采用如下方法制备：
1、丙酮处理：新鲜猪脑在-80℃冷冻后去除脑膜和血管，加丙酮后打碎搅拌；对所得的溶液进行抽滤，除去丙酮溶液，收集丙酮不溶物，并将收集的丙酮不溶物置于环境中，充分干燥，得到丙酮不溶物干粉，在4℃下保存备用。
2、总脂抽提：氯仿-甲醇-水以5:5:1的比例混合，配置成为混合溶液，以混合溶液为抽提液；将丙酮不溶物干粉按照1kg丙酮不溶物干粉10L抽提液的比例加入到抽提液中搅拌均匀，在4℃下持续搅拌过夜，对丙酮不溶物干粉进行抽提；抽提后离心除去不溶物，收集上清液，上清液为脱脂后的神经节苷脂溶液，置于4℃下保存备用。
3、Folch分配：将上清液加15％蒸馏水充分混合，而后静置分层，取上层；而后向剩余下层溶液中添加10％蒸馏水充分混合后静置分层，取上层，重复2次；合并三次上层溶液，得到含有神经节苷脂的甲醇水溶液；将含有神经节苷脂的甲醇水溶液，置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，得神经节苷脂水溶液；使用Sephadex-G25对上述神经节苷脂水溶液进行脱盐，收集脱盐后溶液，置于冷冻干燥机中进行浓缩，浓缩至原体积的1/4，得到神经节苷脂粗提取物，4℃下保存备用。
4、柱层析纯化：将神经节苷脂粗提取物先进行弱阴离子交换层析，而后进行凝胶排阻层析，最后冻干得纯化后的GM1。
5、纯化后的GM1的水解：构建水解反应体系，以35mM的乙酸钠为缓冲液，pH值5.8，加入质量体积浓度0.07％的TDC，和25mM的CaCl2，SCDase浓度控制在74mU以上；按照每20mL反应体系添加100mg GM1的比例添加纯化后的GM1，而后在37℃条件下反应12h，充分水解。
6、Lyso-GM1纯化：先用100％甲醇和纯水洗涤Sep-Pak tC 18固相萃取柱，而后将水解反应液经Sep-Pak tC 18固相萃取柱萃取；萃取后先用8～10个柱体积的水洗；水洗后用65％甲醇洗脱TDC，直至TLC检测完全洗脱TDC，然后用85％的甲醇洗脱Lyso-GM1，直至TLC检测完全洗脱Lyso-GM1；洗脱液置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，冻干后制得纯化后的Lyso-GM1。
7、碳22脂肪酸模块的GM1合成：构建反应体系，pH7.5，脂肪酸浓度10mg/mL，质量百分比浓度10％的DME，SCDase浓度控制在150～200U；以每20mL反应体系加入200mg的纯化后的Lyso-GM1的比例加入Lyso-GM1；脂肪酸选用碳链长度为22的不饱和脂肪酸，检测直至脂肪酸消失完成合成反应。
8、碳22脂肪酸模块的GM1纯化：先采用纳滤法去除反应液中的盐和试剂等杂质成分；然后将反应液流过一个500mg的Sep-Pak tC 18固相萃取柱，再将流穿液流过一个5g的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；对5g的Sep-Pak tC 18固相萃取先用水洗50mL，再用50％的甲醇洗50mL，而后用100％的甲醇洗脱碳22脂肪酸模块的GM1；洗脱液置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，后置于冷冻干燥机中进行浓缩，得到碳22脂肪酸模块的纯化后的GM1。
采用本方法水解率91％，合成收率75％，最终制得的碳22脂肪酸模块的纯化后的GM1的纯度98.6％。
实施例3：
本实施例1提供了猪脑提取制备碳18脂肪酸模块的GM1的制备工艺
具体采用如下方法制备：
1、丙酮处理：新鲜猪脑在-80℃冷冻后去除脑膜和血管，加丙酮后打碎搅拌；对所得的溶液进行抽滤，除去丙酮溶液，收集丙酮不溶物，并将收集的丙酮不溶物置于环境中，充分干燥，得到丙酮不溶物干粉，在4℃下保存备用。
2、总脂抽提：氯仿-甲醇-水以5:5:1的比例混合，配置成为混合溶液，以混合溶液为抽提液；将丙酮不溶物干粉按照1kg丙酮不溶物干粉10L抽提液的比例加入到抽提液中搅拌均匀，在4℃下持续搅拌过夜，对丙酮不溶物干粉进行抽提；抽提后离心除去不溶物，收集上清液，上清液为脱脂后的神经节苷脂溶液，置于4℃下保存备用。
3、Folch分配：将上清液加15％蒸馏水充分混合，而后静置分层，取上层；而后向剩余下层溶液中添加10％蒸馏水充分混合后静置分层，取上层，重复3次；合并四次上层溶液，得到含有神经节苷脂的甲醇水溶液；将含有神经节苷脂的甲醇水溶液，置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，得神经节苷脂水溶液；使用Sephadex-G25对上述神经节苷脂水溶液进行脱盐，收集脱盐后溶液，置于冷冻干燥机中进行浓缩，浓缩至原体积的1/4，得到神经节苷脂粗提取物，4℃下保存备用。
4、柱层析纯化：将神经节苷脂粗提取物先进行弱阴离子交换层析，而后进行凝胶排阻层析，最后冻干得纯化后的GM1。
5、纯化后的GM1的水解：构建水解反应体系，以35mM的乙酸钠为缓冲液，pH值5.8，加入质量体积浓度0.5％的TDC，和25mM的CaCl2，SCDase浓度控制在2.7U；按照每20mL反应体系添加100mg GM1的比例添加纯化后的GM1，而后在37℃条件下反应12h，充分水解。
6、Lyso-GM1纯化：先用100％甲醇和纯水洗涤Sep-Pak tC 18固相萃取柱，而后将水解反应液经Sep-Pak tC 18固相萃取柱萃取；萃取后先用8～10个柱体积的水洗；水洗后用65％甲醇洗脱TDC，直至TLC检测完全洗脱TDC，然后用85％的甲醇洗脱Lyso-GM1，直至TLC检测完全洗脱Lyso-GM1；洗脱液置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，冻干后制得纯化后的Lyso-GM1。
7、碳18脂肪酸模块的GM1合成：构建反应体系，pH7.5，脂肪酸浓度5mg/mL，质量百分比浓度10％的DME，SCDase浓度控制在150～200U；以每20mL反应体系加入100mg的纯化后的Lyso-GM1的比例加入Lyso-GM1；脂肪酸选用碳链长度为18的不饱和脂肪酸，检测直至脂肪酸消失完成合成反应。
8、碳18脂肪酸模块的GM1纯化：先采用纳滤法去除反应液中的盐和试剂等杂质成分；然后将反应液流过一个500mg的Sep-Pak tC 18固相萃取柱，再将流穿液流过一个5g的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；对5g的Sep-Pak tC 18固相萃取先用水洗50mL，再用50％的甲醇洗50mL，而后用100％的甲醇洗脱碳16脂肪酸模块的GM1；洗脱液置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，后置于冷冻干燥机中进行浓缩，得到碳18脂肪酸模块的纯化后的GM1。
采用本方法水解率98％，合成收率77％，最终制得的碳16脂肪酸模块的纯化后的GM1的纯度98.2％。
实施例4：
本实施例1提供了猪脑提取制备碳20脂肪酸模块的GM1的制备工艺
具体采用如下方法制备：
1、丙酮处理：新鲜猪脑在-80℃冷冻后去除脑膜和血管，加丙酮后打碎搅拌；对所得的溶液进行抽滤，除去丙酮溶液，收集丙酮不溶物，并将收集的丙酮不溶物置于环境中，充分干燥，得到丙酮不溶物干粉，在4℃下保存备用。
2、总脂抽提：氯仿-甲醇-水以5:5:1的比例混合，配置成为混合溶液，以混合溶液为抽提液；将丙酮不溶物干粉按照1kg丙酮不溶物干粉10L抽提液的比例加入到抽提液中搅拌均匀，在4℃下持续搅拌过夜，对丙酮不溶物干粉进行抽提；抽提后离心除去不溶物，收集上清液，上清液为脱脂后的神经节苷脂溶液，置于4℃下保存备用。
3、Folch分配：将上清液加15％蒸馏水充分混合，而后静置分层，取上层；而后向剩余下层溶液中添加10％蒸馏水充分混合后静置分层，取上层，重复3次；合并四次上层溶液，得到含有神经节苷脂的甲醇水溶液；将含有神经节苷脂的甲醇水溶液，置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，得神经节苷脂水溶液；使用Sephadex-G25对上述神经节苷脂水溶液进行脱盐，收集脱盐后溶液，置于冷冻干燥机中进行浓缩，浓缩至原体积的1/4，得到神经节苷脂粗提取物，4℃下保存备用。
4、柱层析纯化：将神经节苷脂粗提取物先进行弱阴离子交换层析，而后进行凝胶排阻层析，最后冻干得纯化后的GM1。
5、纯化后的GM1的水解：构建水解反应体系，以35mM的乙酸钠为缓冲液，pH值5.8，加入质量体积浓度0.7％的TDC，和25mM的CaCl2，SCDase浓度控制在3.9mU；按照每20mL反应体系添加100mg GM1的比例添加纯化后的GM1，而后在37℃条件下反应12h，充分水解。
6、Lyso-GM1纯化：先用100％甲醇和纯水洗涤Sep-Pak tC 18固相萃取柱，而后将水解反应液经Sep-Pak tC 18固相萃取柱萃取；萃取后先用8～10个柱体积的水洗；水洗后用65％甲醇洗脱TDC，直至TLC检测完全洗脱TDC，然后用85％的甲醇洗脱Lyso-GM1，直至TLC检测完全洗脱Lyso-GM1；洗脱液置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，冻干后制得纯化后的Lyso-GM1。
7、碳20脂肪酸模块的GM1合成：构建反应体系，pH7.5，脂肪酸浓度6mg/mL，质量百分比浓度10％的DME，SCDase浓度控制在150～200U；以每20mL反应体系加入120mg的纯化后的Lyso-GM1的比例加入Lyso-GM1；脂肪酸选用碳链长度为20的不饱和脂肪酸，检测直至脂肪酸消失完成合成反应。
8、碳20脂肪酸模块的GM1纯化：先采用纳滤法去除反应液中的盐和试剂等杂质成分；然后将反应液流过一个500mg的Sep-Pak tC 18固相萃取柱，再将流穿液流过一个5g的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；对5g的Sep-Pak tC 18固相萃取先用水洗50mL，再用50％的甲醇洗50mL，而后用100％的甲醇洗脱碳20脂肪酸模块的GM1；洗脱液置于减压旋转蒸发仪，40℃条件下减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，后置于冷冻干燥机中进行浓缩，得到碳20脂肪酸模块的纯化后的GM1。
采用本方法水解率92％，合成收率78％，最终制得的碳20脂肪酸模块的纯化后的GM1的纯度98.9％。
通过图1可以看出，本发明实施例2的纯度极高，杂质含量极低。通过对本发明实施例1～4的纯度、水解率和合成收率的分析可知，本发明的方法水解率较高，最终制得的产品纯度极高，合成过程的收率能够控制在75％以上，十分利于工业化生产。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于采用如下纯化合成路线：
首先，从动物脑组织提取纯化得到GM1；
然后，
最后，
2.根据权利要求1所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
S1.提取纯化GM1：将动物脑组织经丙酮处理、总脂抽提和神经节苷脂的Folch分配后制得GM1粗品，而后经过柱层析纯化制得纯化后的GM1；
S2.纯化后的GM1的水解：将步骤S1制得的纯化后的GM1经SCDase催化的水解反应，使纯化后的GM1鞘氨醇部分中的多羟基脂肪胺的脂肪酸模块水解去除，而后经纯化制得纯化后的Lyso-GM1；
S3.纯碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的GM1的合成：将步骤S2制得的纯化后的Lyso-GM1和碳18或碳20或碳n脂肪酸在SCDase催化条件下反应，合成碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的GM1，而后经纯化制得碳18或碳20或碳n脂肪酸模块的纯化后的GM1。
3.根据权利要求2所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于所述步骤S1包括以下步骤：
1)丙酮处理：将动物脑组织冷冻后去除脑膜和血管，加丙酮后打碎搅拌，而后抽滤、干燥，得到丙酮不溶物干粉；
2)总脂抽提：以氯仿-甲醇-水的混合溶液为抽提液，将步骤1)得到的丙酮不溶物干粉加入到抽提液中搅拌均匀，对丙酮不溶物干粉进行抽提，抽提后离心除去不溶物，收集上清液；
3)Folch分配：将步骤2)得到的上清液加蒸馏水充分混合，而后静置分层，取上层，而后向剩余下层溶液中添加蒸馏水充分混合后静置分层，取上层并多次重复后合并首次和之后的上层溶液，对合并的上层溶液减压旋转蒸发去除甲醇，直至溶液体积不再减少，得GM1水溶液，而后脱盐浓缩，得到GM1粗提物；
4)柱层析纯化：将步骤3)得到的GM1粗提物先进行弱阴离子交换层析，而后进行凝胶排阻层析，最后冻干得纯化后的GM1。
4.根据权利要求3所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中，抽提液中氯仿、甲醇和水的体积比为5：5：1；以10L抽提液添加1kg丙酮不溶物干粉的比例添加。
5.根据权利要求3所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中，首次添加蒸馏水需要添加上清液体积15％的蒸馏水；之后添加蒸馏水需要添加下层溶液体积10％的蒸馏水；重复2～4次。
6.根据权利要求2所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述水解反应的反应体系pH值控制在5.8，反应体系中需要包括表面活性剂TDC、金属离子Ca2+和SCDase，所述TDC质量体积浓度控制在0.07～0.7％，Ca2+的浓度控制在2.5～100mM，SCDase浓度控制在每mol底物4000U以上。
7.根据权利要求2所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述纯化采用先离心去沉淀，而后取上清液用Sep-Pak tC 18固相萃取柱纯化。
8.根据权利要求7所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于，所述固相萃取柱纯化的具体步骤为：先用65％的甲醇洗脱出TDC，最后用85％甲醇洗脱Lyso-GM1，洗脱得到的Lyso-GM1经蒸发去甲醇后冻干，最终制得纯化后的Lyso-GM1。
9.根据权利要求2所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述合成反应的反应体系pH值控制在7.5，反应体系中需要包括DME和SCDase，所述DME质量百分比浓度控制在10％，SCDase浓度控制在150～200U；所述Lyso-GM1和脂肪酸的添加量控制在Lyso-GM1浓度0.75～10mM、脂肪酸质量百分比1～10mg/mL。
10.根据权利要求2所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述纯化采用先纳滤法除盐，然后用Sep-Pak tC 18固相萃取柱纯化。
11.根据权利要求2所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备及纯化方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述固相萃取柱纯化的具体步骤为：先用纳滤法除盐，然后将除盐后的反应混合液流过一个500mg的Sep-Pak tC18固相萃取柱；再将流穿液流过一个5g的Sep-Pak tC 18固相萃取柱；用水洗50mL，再用50％的甲醇洗50mL，然后用100％的甲醇洗下带有特定脂肪酸模块的GM1；最后蒸发浓缩并冻干，制得带有特定脂肪酸模块的纯化后的GM1。
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