CN112972752A - 一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合提高硅藻壳止血性能的方法，包括下列步骤：（1）制备藻泥；（2）酸热法处理藻泥；（3）洗涤烘干得到硅藻壳；（4）将不同结构特征的硅藻壳按一定比例充分混合，提高单种硅藻壳的止血效果。本发明方法采用多种硅藻壳混合的方法提高其止血性能，不需特殊的化学基团修饰，操作工艺简单易行，无有害物质残留，节能环保。将不同结构特征的硅藻壳混合，可充分利用硅藻壳的本身的结构优势，发挥出硅藻壳的最大止血潜能，为人们探索最佳止血材料提供一定的参考。
Description
技术领域
本发明涉及混合硅藻壳的止血领域，具体的说是一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合，提高止血效果的方法。
背景技术
硅藻，一种存在于淡水和海水中的单细胞真核生物，早在18世纪就被人们观察到。硅藻最显著的特征是其纳米级的硅质细胞壁，它由上下两壳面及被称为环带结构的箍状硅质结构连接。硅藻是研究硅矿化的首选模式生物，其层次分明的硅质壁包含无定形的二氧化硅(amorphous silica)以及特殊的生物分子。这种壳体结构机械强度良好,种类丰富,具有多级微纳米孔隙、巨大的比面积和多种光学特性,是生物制造领域的新素材。伴随硅藻的纳米级多孔壳面结构的发现，越来越多有关硅藻壳的潜在应用被开发出来，例如：仿生材料合成、水质监测、吸附、光催化、基因工程、药物缓释等。
近来的研究表明，硅藻壳作在止血材料的开发领域具有重要的应用价值。中国海洋大学冯超等人于2016年(DOI:10.1021/acsami.6b12317)的研究发现，圆筛藻的硅藻壳具有优良的液体吸附性能，并且由于表面硅醇基的存在使得硅藻壳携带大量负电荷，在促进凝血方面具有明显的效果。
目前，国内外以硅藻壳作为止血材料的研究很少，为了克服硅藻壳自身结构的不足，进一步提高其止血性能，冯超等人(DOI:10.1021/acsami.6b12317)选择对圆筛藻藻壳进行化学基团修饰。例如，用壳聚糖对圆筛藻硅藻壳进行修饰，使其表面携带部分正电荷，利用静电作用使其体内、体外止血效果都有所提高；此外，由于Ca2+可作为一种凝血因子，在凝血级联反应中其重要作用，李静等(DOI:10.1039/c8tb00667a)选择对圆筛藻的硅藻壳进行Ca2+修饰，使Ca2+与硅藻壳耦合，进一步提高了圆筛藻藻壳的止血性能；王雅楠等(DOI:10.1016/j.carbpol.2018.07.065)2018年的研究结果表明，将圆筛藻藻壳与多巴胺、壳聚糖进行交联形成的复合微球可显著缩短体外止血时间并提高硅藻壳的生物相容性；李静等人(10.1002/adhm.202000951)以多巴胺为交联剂，通过简单的碱性沉淀和叔丁醇置换，制备了壳聚糖/硅藻壳凝胶颗粒，通过控制叔丁醇的浓度来改变凝胶颗粒的孔隙率，进而提高了硅藻壳的止血性能。以上修饰方式不足之处在于：
1)费时费力，修饰过程较为繁琐且会导致壳体结构破裂。
2)硅藻壳表面具有层级分明的微纳米级结构，经过化学修饰后，会导致层级多孔结构的堵塞，影响硅藻壳的吸液性能，在一定程度上影响止血效果。
3)对壳体进行修饰过程涉及化学药品的使用，不环保，还要考虑修饰后有无有害试剂残留的问题，效率不高。
近来，我们对硅藻壳的止血效果和理化特征进行皮尔逊线性相关分析结果显示，硅藻壳的比表面积、粒径、孔径、液体吸附性能、形状指数是影响其止血性能的主要因素(表1)。例如：硅藻壳的凝血启动时间同硅藻壳的比表面积、液体吸附性能呈显著的负相关关系，而与孔径呈显著的正相关关系；凝血速率同粒径、孔径、形状指数呈显著的负相关关系。若能在不涉及化学药品的使用及保持硅藻壳原有形貌和微观结构的前提下，充分利用硅藻壳的本身的结构优势，不仅可以发挥出硅藻壳的最大止血潜能，还能为人们提高硅藻壳的止血性能、探索最佳止血材料提供一定的参考。
发明内容
本发明基于现有技术的不足，以提供一种将具有不同结构特征(优势互补)的硅藻壳混合，进一步提高止血效果的方法。该方法将具有合适比表面积、粒径、孔径、液体吸附性能、形状指数的两种硅藻壳进行混合，充分利用其自身优势，进一步提高单种硅藻壳的止血效果。该方法操作简单，不会破坏壳体结构，无需使用化学药品，节能环保，效率高。
本发明首先是改进了硅藻壳的提取方法，获得一种完整、纯净的硅藻壳，然后研究了不同结构特征的硅藻壳的止血效果，将具有不同结构特征的硅藻壳混合，进一步提高单种硅藻壳的止血效果。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合，进一步提高止血效果的方法，包括下列步骤：
(1)制备藻泥；
(2)酸热法处理藻泥；
(3)洗涤烘干得到硅藻壳。
(4)将不同结构特征的硅藻壳按一定比例充分混合。
步骤(1)制备藻泥的具体方法为通过离心或过滤方式沉淀海洋单细胞硅藻的藻液，得到藻泥。
步骤(2)酸热法处理藻泥的具体方法为：在藻泥中加入浓硫酸和浓硝酸混合液进行酸热法处理。
所述浓硫酸和浓硝酸的质量分数分别为98％和65％。
所述浓硫酸和浓硝酸的混合液按体积比为：硫酸：硝酸＝1:1(V/V)。
所述酸热法为先向海洋单细胞硅藻中加入浓硫酸，充分混匀后于60℃水浴加热15-60min，利用浓硫酸的强氧化性、脱水性、腐蚀性碳化硅藻壳表面大部分的有机质，于室温放置24-48h；加入等体积浓硝酸，60℃加热至澄清，利用浓硝酸的强氧化性再次氧化硅藻壳表面残留的有机质及色素，室温放置12-24h。
步骤(3)洗涤烘干的具体方法是：为避免离心力对硅藻壳的破坏，通过筛绢自然过滤酸处理后的硅藻壳，先用蒸馏水洗涤3-10次，去除硅藻壳里残留的酸；再用无水乙醇洗涤3-10次，去除残留的水分和极少量的有机质，60℃烘至干燥即可得到纯净的硅藻壳。
所述的海洋单细胞硅藻为含硅质壳的海洋单细胞类生物，具体包括：舟形藻(Navicula avium)、舟形藻(Navicula sp.)、卵形藻(Cocconeiopsis orthoneoides)、斜纹藻(Pleurosigma indicum)中的任意两种。
所述不同结构特征的硅藻壳为粒径(10μm-120μm)、孔径(7nm-11nm)、孔容(0.2ccg-1-0.5cc g-1)、比表面积(43m2 g-1-190m2 g-1)、液体吸附性能(2600％-3500％)、电位(-24mV--33mV)、形状指数(14-26)均不同的硅藻壳。
所述不同结构的硅藻壳按A:B＝1-4:1-4(M:M)的比例充分混合。
更进一步的优选为：
通过离心或过滤收集1L藻液，在硅藻泥中加入25mL浓硫酸，充分混匀后于60℃加热45min，室温放置24h。继续加入等体积的浓硝酸，60℃加热至澄清，室温放置24h。通过过滤收集处理后的藻细胞，用蒸馏水洗涤5次，再用无水乙醇洗涤5次，60℃烘至干燥即可得到纯净的硅藻壳。将硅藻壳粘在双面胶带上进行喷金，在扫描电子显微镜下观察硅藻壳的结构完整，无有机质残留。利用能量色谱X射线光谱仪分析硅藻壳的主要成分为Si和O，可视为较纯的SiO2材料。
将比表面积为120m2 g-1、粒径为10μm、平均孔径为7.25μm、形状指数为15、液体吸附率为3010％、孔容为0.2202cc g-1、电位为-24.6mV的舟形藻壳体与比表面积为190m2 g-1、粒径为22μm、平均孔径为7.27μm、形状指数为14、液体吸附率为3500％、孔容为0.3475cc g-1、电位为-32.7mV的卵形藻壳体与按1:2(M:M)的比例充分混合,分别进行体外、体内凝血试验，发现混合藻壳与单一硅藻壳相比可显著缩短体外、体内凝血时间。
本发明的有益效果：
1)操作过程简单。本发明所用材料为处理好的硅藻壳，操作工艺简单易行，不需要特殊加工处理步骤。
2)不涉及化学药品使用。本发明只需将多种硅藻壳混合即可提高其止血性能，整个过程不需要添加特殊试剂，不用考虑有害物质残留，节能环保。
3)效率高。将理化特征不同的硅藻壳混合，可充分发挥单种藻壳的止血优势，实现优势互补，经过混合后的硅藻壳能显著提高止血效果。
4)为进一步发掘具有优良止血效果的优势藻种奠定了基础。
附图说明
图1为卵形藻(a-b)和舟形藻(c-d)完整的壳体结构。
图2为卵形藻(a)和舟形藻(b)壳体的能谱图。
图3为4种硅藻及混合硅藻壳的体外凝血时间统计图。
图4为4种羽纹硅藻及混合硅藻壳的体内凝血(大鼠断尾)止血时间(a)和出血量(b)统计图。
图5为4种羽纹硅藻及混合硅藻壳的体内凝血(股动脉损伤)总出血量(a)和重复出血量(b)统计图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
将实验所用4种海洋硅藻按一定比例接种到f/2液体培养基中(Guillard RL(1975)Culture of Phytoplankton for Feeding Marine Invertebrates,in Culture ofMarine Invertebrates Animals,eds Smith WL,Chanley MH(Plenum,New York),pp 29-60.)，于23℃通空气培养(通气量为150毫升/分钟)，光照强度为40μmol m-2s-1，光暗周期为12h:12h。
实施例1
将培养好的1L舟形藻(Navicula sp.)、卵形藻(Cocconeiopsis orthoneoides)分别装至100mL离心管中进行离心，离心力为2000g，离心时间为5分钟。待离心完成后，倒掉上清液，合并各离心管中的硅藻泥,用蒸馏水洗涤3次去除无机盐和杂质。加入25mL浓硫酸作为处理液，使藻细胞与浓硫酸充分混匀，然后放到60℃水浴中加热45min。将加热后的混合液放置于室温中24h。再次向混合液中加入等体积的浓硝酸，60℃加热至澄清，室温放置24h。将处理完的藻细胞通过过滤的方法收集，用蒸馏水洗涤5次，再用无水乙醇洗涤5次，置于60℃烘箱中烘干，收集到的白色粉末即为硅藻壳。将两种藻的硅藻壳分别粘在双面胶带上，对其进行喷金，在扫描电子显微镜下进行观察。
图1为两种硅藻的扫描电镜图结果。由图1可以看出，经过本实施例提供的方法得到的硅藻壳体结构完整，孔隙分明，基本无有机质残留。
图2为采用能量色散X射线光谱仪(EDXS)对舟形藻和卵形藻壳体元素组成的分析结果，从图中可以看出，采用该方法提纯得到的硅藻壳体主要成分为Si和O，可视为纯的SiO2。
将比表面积为120m2 g-1、粒径为10μm、平均孔径为7.25μm、形状指数为15、液体吸附率为3010％、孔容为0.2202cc g-1、电位为-24.6mV的舟形藻壳体与比表面积为190m2 g-1、粒径为22μm、平均孔径为7.27μm、形状指数为14、液体吸附率为3500％、孔容为0.3475cc g-1、电位为-32.7mV的卵形藻壳体与按舟形藻:卵形藻＝1-4:1-4(M:M)的比例充分混合，评估混合硅藻壳的体外凝血效果。
具体评估方法为：
准确称取2.5mg混合硅藻壳于2mL ep管中，向其中加入500μL血液，迅速加入50μLCaCl2，将ep管放入37℃水浴锅中，每隔10s将ep管翻转180度，直到血液凝固，记录凝固时间，结果见图3。图3结果显示，与单一硅藻壳相比，混合硅藻壳可显著缩短单种硅藻壳的凝血时间，可将体外凝血时间缩短40-60s。
表1为硅藻壳的理化特征与止血时间的皮尔逊相关性分析(*代表p＜0.05)具体结果如下：
表1硅藻壳的理化特征与止血时间的皮尔逊相关性分析(*代表p＜0.05)
实施例2
将培养好的舟形藻(Navicula sp.)、卵形藻(Cocconeiopsis orthoneoides)分装至100mL离心管中进行离心，离心力为2000g，离心时间为5分钟。待离心完成后，倒掉上清液，合并各管中的藻泥，用蒸馏水洗涤3次。硅藻壳的获取和表征方式同实施例1。
将比表面积为120m2 g-1、粒径为10μm、平均孔径为7.25μm、形状指数为15、液体吸附率为3010％、孔容为0.2202cc g-1、电位为-24.6mV的舟形藻壳体与比表面积为190m2 g-1、粒径为22μm、平均孔径为7.27μm、形状指数为14、液体吸附率为3500％、孔容为0.3475cc g-1、电位为-32.7mV的卵形藻壳体与按1:2(M:M)的比例充分混合，评估断尾模型中混合硅藻壳的止血效果。
具体评估方法为：
将250-300g麻醉雄性SD大鼠置于解剖架固定，用手术剪剪掉一半长度的大鼠尾巴，将断尾末端置于空气中10s保证正常出血，紧接着将断尾置于100mg混合硅藻壳(舟形藻:卵形藻＝1:2)中，记录止血时间和失血量。
图4为混合硅藻壳的止血时间和失血量的情况。结果显示，与单一硅藻壳相比，混合硅藻壳可明显缩短止血时间并减少出血量。
实施例3
将培养好的舟形藻(Navicula sp.)、卵形藻(Cocconeiopsis orthoneoides)藻液分装至100mL离心管中进行离心，离心力为2000g，离心时间为5分钟。待离心完成后，倒掉上清液，合并各管中的藻泥，用蒸馏水洗涤3次。硅藻壳的获取和表征方式同实施例1。硅藻壳的混合方法同实施例1，评估混合藻壳股动脉模型中的止血效果。
具体评估方法为：
将250-300g麻醉雄性SD大鼠置于解剖台固定，用手术剪剪开右下肢皮肤，暴露股动脉；用手术刀将股动脉切开，迅速敷上50mg混合硅藻壳(舟形藻:卵形藻＝1:2)，用提前称重的滤纸吸取流下的血液，每隔15s换一次滤纸，及时称重并记录湿滤纸的重量，整个过程持续15min。根据湿滤纸的重量计算出血量和止血时间，结果见表2。
表2股动脉损伤后单一硅藻壳和混合硅藻壳的止血时间和出血量情况
由表2可知，在股动脉损伤模型中，混合硅藻壳的止血时间最短(180s)，且总出血量最低。图5为股动脉损伤后，混合硅藻壳的出血情况。图5结果显示混合硅藻壳总失血量最低，且二次出血量极少。
以上将不同结构的硅藻壳混合以提高止血效果的方法同样适用于其它含硅质壳的海洋单细胞类生物，如：舟形藻(Navicula avium)、舟形藻(Navicula sp.)、卵形藻(Cocconeiopsis orthoneoides)、斜纹藻(Pleurosigma indicum)中的任意两种。
Claims (10)
1.一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）制备藻泥；
（2）酸热法处理藻泥；
（3）洗涤烘干得到硅藻壳。
（4）将不同结构特征的硅藻壳按一定比例充分混合。
2. 根据权利要求 1 所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于：所述硅藻壳的结构特征选自下列范围：
粒径为10 μm-120 μm、
孔径为7 nm-11 nm、
孔容为0.2 cc g-1-0.5 cc g-1、
比表面积为43 m2 g-1-190 m2 g-1、
液体吸附率为2600%-3500%、
电位为-24 mV- -33 mV、
形状指数为14-26。
3. 根据权利要求 1 所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于：所述混合硅藻壳的比例为A:B=1-4:1-4 (M:M)。
4.根据权利要求1所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于，步骤（1）制备藻泥的具体方法为通过离心或过滤方式浓缩海洋单细胞硅藻的藻液，得到藻泥。
5.根据权利要求1所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于，步骤（2）酸热法处理藻泥的具体方法为：在藻泥中加入浓硫酸（98%）和浓硝酸（65%）混合液进行酸热法处理。
6.根据权利要求5所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于，所述浓硫酸和浓硝酸的混合液按体积比为：硫酸：硝酸=1:1（V/V）。
7. 根据权利要求6所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于，所述酸热法为向海洋单细胞硅藻中加入浓硫酸，充分混匀后于60℃水浴加热15-60min，于室温放置 24-48 h；加入浓硝酸，60℃加热至澄清，室温放置12-24 h。
8.根据权利要求1所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于，步骤（3）洗涤烘干的具体方法是：过滤收集酸处理后的硅藻壳，先用蒸馏水洗涤3-10次，再用无水乙醇洗涤3-10次，60℃烘至干燥即可得到纯净的硅藻壳。
9.根据权利要求1所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于，所述的海洋单细胞硅藻为含硅质壳的海洋单细胞类生物。
10. 按权利要求9所述的一种将具有不同结构特征的硅藻壳混合止血方法，其特征在于：所述含有硅质壳的海洋单细胞生物为：舟形藻（Navicula avium）、舟形藻（Naviculasp.）、卵形藻（Cocconeiopsis orthoneoides）、斜纹藻（Pleurosigma indicum）中的任意两种。
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