CN112986367A - 毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酸性乳寡糖分离检测领域的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法。本发明提供一种用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，包括缓冲溶液和添加剂，所述添加剂包括甲醇和/或乙腈；所述缓冲溶液的浓度为50‑100mM，pH为7.0‑7.5。本发明还提供毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，包括，预处理以去除哺乳动物乳中的蛋白质和脂肪；然后采用所述运行缓冲液对所述预处理后的哺乳动物乳进行毛细管电泳分析。本发明提供的用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液能够提高酸性乳寡糖的分离度，使酸性乳寡糖有效分离。
Description
技术领域
本发明涉及酸性乳寡糖分离检测领域，具体涉及毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法。
背景技术
乳源低聚糖可以促进婴儿大脑发育、增强婴儿记忆力，并且乳源低聚糖还能促进益生菌-双歧杆菌在婴儿肠道内的生长。乳源低聚糖根据组成的不同分为两类：中性乳寡糖和唾液酸化的乳寡糖。中性乳寡糖是人乳中含量最高的一类寡糖，它可以刺激肠道内有益菌的生长、抑制有害菌对小肠上皮细胞的粘附、减少炎症发生、提高机体免疫力，其主要由岩藻糖通过α-1,3，α-1,2糖苷键与葡萄糖、半乳糖、乳糖、N－乙酰氨基葡萄糖等的还原端相连接而成。唾液酸化的乳寡糖作为牛乳中含量最高的一类寡糖，广泛存在于牛乳、羊乳等哺乳动物的乳汁中，其分子结构中含有唾液酸，对婴儿大脑发育具有重要的调节作用，其主要由半乳糖或者乳糖通过α-2,3，α-2,6糖苷键与唾液酸相连接而成。
目前生物方法和化学方法仅能合成低分子量的乳寡糖，部分合成的乳寡糖目前已应用于婴幼儿奶粉中，但其在安全性方面存在争议。因为牛乳寡糖与人乳寡糖有相似成分和相似的生物学功能，因此牛乳寡糖有望成为潜在的母乳寡糖替代物。
目前关于乳寡糖相关研究较少，没有成熟的乳寡糖分离检测技术。而且由于乳寡糖种类多(母乳约有200多种乳寡糖，牛乳约有60多种乳寡糖)，且在成熟乳中含量低，所以检测较为困难。另一方面，由于低聚糖难以与乳糖分离，且在牛乳中乳糖含量远大于低聚糖，在分离检测时会对乳寡糖信号产生干扰，影响检测结果。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法。
一种用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，包括缓冲溶液和添加剂，所述添加剂包括甲醇和/或乙腈；
所述缓冲溶液的浓度为50-100mM，pH为7.0-7.5。
所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。
所述甲醇和/或乙腈在运行缓冲液中的体积百分比为10-35％。
所述添加剂还包括十二烷基硫酸钠；
所述十二烷基硫酸钠在所述缓冲溶液与十二烷基硫酸钠形成的混合液中的浓度为25-50mM。
本发明还提供毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，包括，
预处理以去除哺乳动物乳中的蛋白质和脂肪；然后采用所述运行缓冲液对所述预处理后的哺乳动物乳进行毛细管电泳分析。
所述预处理方法为，
对哺乳动物乳进行离心，除去上层脂肪和下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理和纳滤处理，收集截留液，旋转蒸发至干燥后用水溶解；
或，
对哺乳动物乳进行离心，除去上层脂肪和下层沉淀，向中间脱脂乳中加入氯仿和乙醇的混合液，混匀后离心，所得上清液加入无水乙醇，于4℃静置6-12h后离心，所得上清液旋转蒸发至干燥后用水溶解。
所述超滤处理的截留分子量为5000-10000Da；
所述纳滤处理的截留分子量为300-500Da；
所述氯仿和乙醇的体积比为2:1-1:1；
所述离心的转速为8000-12000r/min，时间为20-40min。
毛细管电泳分析时，进样方式采用压力进样，进样压力为0.1-0.3psi，进样时间为3-8s。
毛细管电泳分析时，毛细管选用未涂层的石英毛细管柱；检测波长为200-220nm；分离电压为15-30kv；毛细管柱温为25℃。
所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，还包括对所述毛细管进行预处理：
依次用0.05-0.2M NaOH溶液冲洗2-10min，0.05-0.2M HCl冲洗2-10min，蒸馏水冲洗5-15min，最后用所述运行缓冲液冲洗2-10min。
所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，还包括，
配制酸性乳寡糖标准品溶液，进行毛细管电泳分析，以标准品的浓度为横坐标，以峰面积的平均值为纵坐标绘制标准曲线，计算标准曲线方程；
将哺乳动物乳中酸性乳寡糖所对应的峰面积代入标准曲线方程中，计算哺乳动物乳中酸性乳寡糖的浓度。
所述哺乳动物乳为牛乳或羊乳。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供的用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，包括缓冲溶液和添加剂，所述添加剂包括甲醇和/或乙腈；所述缓冲溶液的浓度为50-100mM，pH为7.0-7.5，该运行缓冲液能够提高酸性乳寡糖的分离度，使酸性乳寡糖快速、有效分离。
该运行缓冲液能够将酸性乳寡糖中的3’唾液酸化乳寡糖(3’SL)快速分离，实现对3’SL快速、准确的定性和定量分析。
2、本发明提供的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，其运行缓冲液和毛细管电泳条件的配合，使得酸性乳寡糖的分离效能高、分析速度快、样品用量少，可以快速准确的定性定量检测酸性乳寡糖。该检测方法精明度好、重复性高。以信噪比3作为标准，3’SL的最低检出限为40μg/mL。
3、对哺乳动物乳进行离心，除去上层脂肪和下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理和纳滤处理，收集截留液，旋转蒸发至干燥后用水溶解，该预处理方法能够有效去除哺乳动物乳中的蛋白质和脂肪，减少对酸性乳寡糖检测的干扰，对酸性乳寡糖检测的重复性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中电泳图谱；
图2是本发明实施例2中电泳图谱；
图3是本发明实施例3中电泳图谱；
图4是本发明实施例4中电泳图谱；
图5是本发明实施例5中电泳图谱；
图6是本发明实施例6中电泳图谱；
图7是本发明实施例7中电泳图谱；
图8是本发明实施例8中电泳图谱；
图9是本发明实施例9中电泳图谱；
图10是本发明实施例10中电泳图谱；
图11是本发明实施例11中电泳图谱；
图12是本发明实施例12中电泳图谱；
图13是本发明实施例13中电泳图谱；
图14是本发明实施例14中电泳图谱；
图15是本发明实施例15中得到的标准曲线图；
图16是本发明对比例1中电泳图谱；
图17是本发明对比例2中电泳图谱；
其中，3’SL为3’唾液酸乳糖；6’SLN为6’唾液酸化-N-乙酰乳糖；6’SL为6’唾液酸乳糖。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液，缓冲溶液中未添加SDS。所得缓冲溶液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为35:65，即得运行缓冲液。备用。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图1所示，3’唾液酸化乳寡糖(3’SL)峰出现在28.6min。
实施例2
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。所得混合液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为35:65，即得运行缓冲液。备用。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图2所示。获得的电泳图谱各个峰之间很好的分离，其中，3’SL峰出现在38.2min。
实施例3
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：50mM pH7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。所得混合液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为30:70，即得运行缓冲液。备用。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.1psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图3所示。获得的电泳图谱各个峰之间很好的分离，其中，3’SL峰出现在37.1min。
实施例4
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH 7.5的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。所得混合液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为35:65，即得运行缓冲液。备用。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图4所示。3’SL峰出现在35.5min。
实施例5
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为25mM。所得混合液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为35:65，即得运行缓冲液。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.3psi，进样时间为8s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图5所示，3’SL峰出现在28.2min。
实施例6
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为8000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为300Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：50mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。所得混合液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为35:65，即得运行缓冲液。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为20kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图6所示，3’SL峰出现在48.2min。
实施例7
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为10000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为300Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。所得混合液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为15:85，即得运行缓冲液。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图7所示，3’SL峰出现在17.7min。
实施例8
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为8000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为400Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：50mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。所得混合液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为25:75，即得运行缓冲液。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图8所示，3’SL峰出现在32min。
实施例9
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH 7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为25mM。甲醇与混合液体积比为35:65，即得运行缓冲液。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图9所示，3’SL峰出现在28.6min。
实施例10
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：50mM pH 7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。甲醇与混合液体积比为35:65，即得运行缓冲液。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图10所示，3’SL峰出现在35.2min。
实施例11
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。所得混合液中添加乙腈，乙腈与混合液体积比为30:70，即得运行缓冲液。备用。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图11所示。获得的电泳图谱各个峰之间很好的分离，3’SL峰出现在38.2min。
实施例12
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为25mM。所得混合液中添加乙腈，乙腈与混合液体积比为10:90，即得运行缓冲液。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图12所示，3’SL峰出现在11.6min。
实施例13
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：50mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为25mM。所得混合液中添加乙腈，乙腈与混合液体积比为20:80，即得运行缓冲液。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图13所示，3’SL峰出现在27.2min。
实施例14
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳，转移至离心管中，加入氯仿和乙醇的混合液(氯仿和乙醇的体积比为2:1)，充分混匀，10000r/min离心30min，吸取所得样品上清液，向其中加入无水乙醇，充分混匀，于4℃静置12h后10000r/min离心30min，吸取上清液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为50mM。所得混合液中添加乙腈，乙腈与混合液体积比为30:70，即得运行缓冲液。备用。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图14所示，3’SL峰出现在37.8min。
实施例15
精确称取0.02g 3’SL标准品粉末，溶解于10mL超纯水中，配制成2000μg/mL的标准品溶液，分别加入超纯水稀释至1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL，不同的标准品进样2次。毛细管电泳条件同实施例1。
以标准品的浓度为横坐标，以2次进样峰面积的平均值为纵坐标绘制标准曲线，计算标准曲线方程。y＝108.41x-1200.8，如图15，标准品在62.5-2000μg/mL范围内与峰面积的线性关系较好。
将待测样品中酸性乳寡糖所对应的峰面积代入标准曲线方程中，即可计算待测样品中酸性乳寡糖的浓度。
对比例1
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：100mM pH 7.0的磷酸缓冲溶液中添加SDS，即得运行缓冲液，最终SDS浓度为50mM。备用。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图16所示。获得的电泳图谱分离度较差，3’SL峰出现在10.3min，未检测到6’SLN和6’SL峰。
对比例2
牛乳预处理：牛乳经10000r/min离心30min，除去上层脂肪及下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理(超滤的截留分子量为5000Da)和纳滤处理(纳滤的截留分子量为500Da)，收集截留液，旋转蒸发至干燥，用超纯水溶解，备用。
运行缓冲液配制：200mM pH 7.05的磷酸缓冲溶液中添加SDS，得到混合液，混合液中SDS浓度为100mM。所得混合液中添加甲醇，甲醇与混合液体积比为45:55，即得运行缓冲液。备用。
选用未涂层的石英毛细管柱(50cm x 50μm)，新毛细管柱依次用0.1M NaOH溶液冲洗5min，0.1M HCl冲洗5min，蒸馏水冲洗10min，最后用运行缓冲液冲洗5min，备用。
对预处理后的牛乳进行毛细管电泳分析：检测波长为200nm；进样方式为压力进样，进样压力为0.2psi，进样时间为6s；分离电压为30kv；毛细管柱温为25℃。
毛细管电泳图谱如图17所示。获得的电泳图谱分离度比较低，20-25min之间的低聚糖的峰没有完全分离，3’SL、6’SLN和6’SL三个峰也没有完全分离，3’SL峰出现在37.6min。本对比例中磷酸缓冲溶液浓度较高，缓冲溶液浓度增加时，容易导致溶液过热，引起电泳区带展宽，使分辨率降低。
实验例1：回收率实验
取3份牛乳样品，采用实施例2的方法进行牛乳预处理和毛细管电泳检测，将3’SL所对应的峰面积代入实施例15所得标准曲线方程中，计算其原始质量浓度。然后分别向3份牛乳样品中加入500μg/mL(加标质量浓度)的3’SL标准品溶液，得到混合溶液。采用实施例2的方法进行毛细管电泳检测，将3’SL所对应的峰面积代入实施例15所得标准曲线方程中，计算加标后质量浓度。计算加标回收率，加标回收率＝(加标后质量浓度-原始质量浓度)/加标质量浓度，结果如表1所示，平均回收率为93.8％，表明样品在检测过程中损失较少。
表1
实验例2：精密度实验
取200μg/mL的3’SL的标准品溶液，采用实施例2的毛细管电泳条件，重复进样6次，测得6次峰面积分别为9095、9128、9387、9072、9334和9254，计算得相对标准偏差为1.3％，检测精密度较好。
实验例3：重复性实验
(1)分别量取同一份牛乳，共6份，按照实施例11进行毛细管电泳检测，得6个峰面积分别为10673、10359、10758、10548、10152、和10489，计算得RSD为1.9％
(2)分别量取同一份牛乳，共6份，按照实施例14进行毛细管电泳检测，得6个峰面积分别为10342、9251、9745、9352、9164、9324，计算得RSD为4.3％。
本发明毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法重复性好。采用实施例11预处理方法，酸性乳寡糖检测的重复性更好。
实验例4：最低检出限实验
取3’SL标准品溶液，加水倍比稀释，采用实施例2的方法进行毛细管电泳检测，直至被测标准品浓度所对应信噪比为3，重复进样5次，以信噪比3作为标准确定检出限。3’SL的最低检出限为40μg/mL。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (12)
1.一种用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，其特征在于，包括缓冲溶液和添加剂，所述添加剂包括甲醇和/或乙腈；
所述缓冲溶液的浓度为50-100mM，pH为7.0-7.5。
2.根据权利要求1所述的用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，其特征在于，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，其特征在于，所述甲醇和/或乙腈在运行缓冲液中的体积百分比为10-35％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的运行缓冲液，其特征在于，所述添加剂还包括十二烷基硫酸钠；
所述十二烷基硫酸钠在所述缓冲溶液与十二烷基硫酸钠形成的混合液中的浓度为25-50mM。
5.毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，包括，
预处理以去除哺乳动物乳中的蛋白质和脂肪；然后采用权利要求1-4任一所述运行缓冲液对所述预处理后的哺乳动物乳进行毛细管电泳分析。
6.根据权利要求5所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，其特征在于，所述预处理方法为，
对哺乳动物乳进行离心，除去上层脂肪和下层沉淀，吸取中间脱脂乳依次进行超滤处理和纳滤处理，收集截留液，旋转蒸发至干燥后用水溶解；
或，
对哺乳动物乳进行离心，除去上层脂肪和下层沉淀，向中间脱脂乳中加入氯仿和乙醇的混合液，混匀后离心，所得上清液加入无水乙醇，于4℃静置6-12h后离心，所得上清液旋转蒸发至干燥后用水溶解。
7.根据权利要求6所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，其特征在于，所述超滤处理的截留分子量为5000-10000Da；
所述纳滤处理的截留分子量为300-500Da；
所述氯仿和乙醇的体积比为2:1-1:1；
所述离心的转速为8000-12000r/min，时间为20-40min。
8.根据权利要求5-7任一项所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，其特征在于，毛细管电泳分析时，进样方式采用压力进样，进样压力为0.1-0.3psi，进样时间为3-8s。
9.根据权利要求5-8任一项所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，其特征在于，毛细管电泳分析时，毛细管选用未涂层的石英毛细管柱；检测波长为200-220nm；分离电压为15-30kv；毛细管柱温为25℃。
10.根据权利要求5-9任一项所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，其特征在于，还包括对所述毛细管进行预处理：
依次用0.05-0.2M NaOH溶液冲洗2-10min，0.05-0.2M HCl冲洗2-10min，蒸馏水冲洗5-15min，最后用所述运行缓冲液冲洗2-10min。
11.根据权利要求5-10任一项所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，其特征在于，还包括，
配制酸性乳寡糖标准品溶液，进行毛细管电泳分析，以标准品的浓度为横坐标，以峰面积的平均值为纵坐标绘制标准曲线，计算标准曲线方程；
将哺乳动物乳中酸性乳寡糖所对应的峰面积代入标准曲线方程中，计算哺乳动物乳中酸性乳寡糖的浓度。
12.根据权利要求5-11任一项所述的毛细管电泳分离检测哺乳动物乳中酸性乳寡糖的方法，其特征在于，所述哺乳动物乳为牛乳或羊乳。
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