CN113710192B

CN113710192B - 无机盐类蛋白复合医疗器械

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Publication number: CN113710192B
Application number: CN202080025282.4A
Authority: CN
Inventors: 大野忠夫; 安永茉由; 伊藤敦夫; 十河友; 小林文子
Original assignee: Nihon Parkerizing Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Cell-Medicine Inc; University of Tsukuba NUC
Current assignee: Nihon Parkerizing Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Cell-Medicine Inc; University of Tsukuba NUC
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-30
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2040-01-30
Also published as: EP3919022A4; WO2020158833A1; KR20210132054A; US20220193308A1; CN113710192A; KR102723087B1; JP6976501B2; JPWO2020158833A1; EP3919022B1; JP7445901B2; JP2022001262A; US12178939B2; EP3919022A1

Abstract

本发明提供了一种医疗器械，其配置成将包埋了肽类激素等的磷灰石等无机盐类固体涂敷于金属等，上述无机盐类固体通过在不稳定磷酸钙过饱和溶液中的受控的延迟共沉淀等来提供，上述医疗器械暴露于足以进行灭菌的剂量的电离辐射。

Description

无机盐类蛋白复合医疗器械

技术领域

本发明涉及一种具有电离辐射灭菌耐性的医疗器械，其包含无机盐类的结晶或无机盐类的无定形固体(以下，在本说明书中有时仅称作“无机盐类固体”)和具有生物活性的蛋白。

更具体而言，本发明涉及一种用于包括人在内的哺乳动物的医疗器械，该医疗器械包含无机盐类固体，该无机盐类固体包埋了不被该动物识别为异物的具有生物活性的蛋白，利用通过包埋获得的电离辐射灭菌耐性，在保持蛋白的生物活性的状态下通过电离辐射进行灭菌。

背景技术

包埋(embedding)是病理学中使用的术语。包埋是指将作为病理检查对象的生物体组织埋入能固化的液态的石蜡、树脂中进行固化，从而固定生物体组织。在病理检查中，用切片机等将包埋组织块切成薄片，制成组织染色用的切片(标本)，进行显微镜检查等。在本说明书中，对该概念进行了扩展，将蛋白分子全部或一部分埋入无机盐类固体中、或用无机盐类固体致密地包裹蛋白分子全部或一部分而将蛋白分子固定在无机盐类固体中称作“包埋”。“包埋”不同于蛋白分子在该无机盐类固体中仅为“吸附”或“接触”的状态、或者“混合”的状态。

作为蛋白分子“包埋”在无机盐类固体中的实例，能够举出从共存有蛋白的磷酸钙过饱和溶液中使该蛋白分子和磷酸钙共沉淀，该蛋白分子以纳米级的间隔分散配置在磷酸钙基质中的组合物(非专利文献1)。

另一方面，在要求无菌性的医疗领域中使用的药物、医疗器械等产品、原料在制造工序中通过各种方式进行灭菌。在灭菌法之中，利用了容易透过物质这一辐射特性的灭菌法是电离辐射灭菌法。尤其是电离辐射灭菌法容易在制造的最终工序中应用，在不存在电离辐射照射造成对象物的变性、失活问题的情况下，电离辐射灭菌法作为最终灭菌法被广泛地使用。

根据预计待灭菌的对象物中存在的菌种、菌数、存在形态，使用的电离辐射的类型和剂量不同，对于医疗用的器具类，经常使用物质透过性高的伽马射线，作为合适的灭菌剂量，广泛使用以25kGy为代表的其前后的剂量。此外，在要对对象物的表面进行灭菌的情况下，剂量率大且短时间照射即可的电子束被广泛地使用。

但是，所有灭菌法都容易引起具有生物活性的物质的失活。在电离辐射灭菌中，尤其是核酸、蛋白由于分子尺寸大而容易失活，例如作为生物体内的蛋白的活性结构域的分子量测定法，确立了辐射失活法(非专利文献2)。此外，通常“生物制剂由于不能应用最终灭菌法，所以其为在应用无菌制造工序进行制造时的无菌管理非常困难的产品”(非专利文献3)这一概念为常识，European Medicines Agency关于药物的灭菌法的指南的公开草案(非专利文献4)中记载了“For highly sensitive products such as biological productswhere terminal sterilization of the drug product is not possible，asepticprocessing under controlled conditions provides a satisfactory quality of thedrug product(对于无法进行药物的最终灭菌的生物制剂这样的高度敏感的产品，基于受控条件下的无菌操作法的加工可使该药物具有令人满意的质量)”。公开了“关于通过最终灭菌法制造无菌药物的指南”(非专利文献5)。然而，完全没有提及保护需要灭菌的药物活性的方法。

与辐射类型无关，电离辐射非特异性地击中各种化合物而生成自由基。自由基产生部位有时会发生自由基电子的转移，在与原始化合物完全不同的化合物中发生自由基反应。作为自由基反应的结果，当对DNA、膜脂、细胞而言重要的化合物产生非自然的变化时，对细胞是有害的(非专利文献6)。如果这样的有害作用作用于细菌、病毒，则为灭菌。同样地，如果具有生物活性的蛋白与自由基反应，则蛋白失活。

作为使有害的自由基失活的辐射防护剂，已知半胱氨酸、谷胱甘肽这样的硫醇类，作为代表例有氨基硫醇衍生物。一直以来，已知半胱胺(巯基乙基胺)、WR-2721(S-2-(3-氨基丙基氨基)乙基硫代磷酸)等(非专利文献7)。另外，文献中还记载了2-巯基乙胺、醇(乙醇)(非专利文献8)。此外，在以细胞毒性为指标的筛选中，作为显示辐射防护效果的物质，记载了(+)儿茶素、姜黄素、维生素C、白藜芦醇、咖啡酸、槲皮素(非专利文献9)。进而，作为显示辐射防护效果的物质，记载了含氮化合物类(非专利文献10)。除此之外，已知氨基酸混合物也具有对生物活性蛋白的辐射防护作用(专利文献1、2)。进而，作为在使用电离辐射灭菌时抑制蛋白失活的方法，公开有与纤维素醚衍生物、特定氨基酸组共存进行抑制的方法(专利文献3、4)，使脂肪族聚酯共存的方法(专利文献5)，使明胶等外源蛋白共存的方法(专利文献6)。然而，这些都是有机物的辐射防护剂。此外，虽然公开有使生物活性蛋白与胶原蛋白海绵、吸收性聚合物共存的方法(专利文献7、8)，但未公开在使用电离辐射灭菌时抑制失活的方法。

另一方面，对于无机物的辐射防护剂，已知硒(非专利文献11)、钒酸钠(非专利文献12)、硫酸锌(非专利文献13)、锰化合物(专利文献9、10)。但是，作为针对哺乳动物的医疗器械，许多无机盐类存在毒性方面的问题，因此无机盐类没有成为作为面向医疗用的辐射防护剂的开发对象。

在无机物之中，磷酸钙的安全性、生物相容性高，Ca离子与PO₄离子的摩尔比不同的磷灰石(Ca/P摩尔比1.67)、磷酸三钙(Ca/P摩尔比1.50)等的结晶、无定形磷酸钙(Ca/P摩尔比1～1.8)被用于医疗器械等。

开发有一种使用了烧结磷灰石的剂量测定法，其通过电子自旋共振对磷酸钙受到电离辐射照射时产生的自由基进行分析(专利文献11)。但是，记载的剂量范围为0～60Gy左右，对于以高达其1000倍以上的适合电离辐射灭菌的剂量范围(数kGy以上、通常多为10～30kGy)进行照射的情况、对共存的其他生物活性分子的辐射防护作用没有任何提及。

此外，作为提及了在对作为无机盐类的磷灰石或羟基磷灰照射适合灭菌的放射剂量的情况、对生物活性蛋白的防护效果的文献，已知日本特表平11-506360号公报(专利文献12)。在该文献中，作为含有生物活性成骨蛋白的不溶性的合成聚合物载体材料之一，记载了“能够有利地使用(没有限制地)包括陶瓷(例如，羟基磷灰石、磷酸三钙和其他磷酸钙以及它们的组合)的材料中的任一种或组合”，记载了用于移植入哺乳动物的最终灭菌成骨装置。

然而，该文献中完全没有提及生物活性成骨蛋白与包含陶瓷的材料的“任一种或组合”应为何种方式。作为生物活性成骨蛋白与材料的组合方式，存在“混合”、“吸附”、“接触”、“包埋”等种类(以下统称为“组合方式的种类”)，根据组合方式的种类的不同，最终灭菌后的蛋白的生物活性大不相同，这一点并没有公开，更没有公开或教导能够以维持成骨蛋白的生物活性的状态进行最终灭菌的最佳的组合方式为何种组合方式。

日本特表2007-513083号公报(专利文献13)公开了作为医疗用移植片的包含无机盐类和生物活性蛋白的灭菌性组合物。但是，同样地也没有公开或教导根据无机盐类与生物活性蛋白的组合方式的不同则最终灭菌后的生物活性蛋白的生物活性大不相同、以及能够以维持生物活性蛋白的活性的状态进行最终灭菌的最佳的组合方式为何种组合方式。

在日本特表2007-515196号公报(专利文献14)中，虽然公开了作为用于控制骨出血的填充物的包含作为无机盐类的羟基磷灰石和骨生长诱导物质的组合物，但是记载了在该骨生长诱导物质为去矿化骨基质、骨形态发生蛋白这样的辐射敏感性的生物活性蛋白的情况下，不能进行最终灭菌。

日本特表2002-501786号公报(专利文献15)中虽然公开了包含经加热或辐射灭菌的明胶、再生生长因子等骨形成成分、磷酸钙陶瓷等无机盐类的骨糊组合物，但并没有记载或教导在形成该组合物后最终使用辐射照射和热处理进行灭菌。

日本特表2002-529201号公报(专利文献16)中虽然公开了作为植入人体的移植片的、包含作为无机盐类的陶瓷、生长因子等生物活性物质、以及包含这些的同种异体/自体/异种移植组织的移植片，但最终灭菌进行了“对组织特性无有害影响的公知剂量的γ射线或其他种类的照射”、或者“不产生毒性或不降低期望的生物活性”的电子束灭菌、环氧乙烷灭菌。即，认为允许为了维持生物活性而牺牲辐射的灭菌效果，通过限制照射剂量防止有害影响、生物活性降低。作为解决方案，仅记载了根据需要在最终灭菌之前“作为进一步增强，将期望的生物活性物质注入移植片”。

日本特表平10-511957号公报(专利文献17)中虽然公开了一种经辐射灭菌的纳米微粒，其包含生物活性剂并将其与磷灰石、骨陶瓷组合，上述生物活性剂为平均粒径小于约300nm的生物相容性、生物降解性聚合物的核形成的纳米微粒，但并没有涉及防止因辐射灭菌引起的生物活性剂失活的方法、能够以维持了活性的状态进行最终灭菌的最佳的组合方式为何种组合方式。

日本特表2003-503423号公报(专利文献18)中虽然记载了一种载体，其将生物活性结合到无机、有机或包含有机和无机物质的载体的基质内，在合成后进行灭菌，但对于无机、有机或包含有机和无机物质的载体的基质在任意组合方式的种类的情况下生物活性是否在灭菌后得以维持、或在任意灭菌法时生物活性是否在灭菌后得以维持这一方面既没有记载也没有启示。

日本专利5221132号公报(专利文献19)记载了一种方法，其通过使包含含有钙、镁、磷酸、碳酸氢根离子和生物活性物质的盐水混合物的被酸化的组合物与基体接触，增加pH来产生盐和生物活性物质的共沉淀，得到涂敷的基体。虽然在权利要求所记载的发明中没有提及，但在发明的详细说明的栏内记载了也能够在最后的工序之后进行伽马射线照射(段落编号[0020]中记载了“在工序c)之后的最后阶段中，在非防腐(aseptic)和非无菌(sterilize)状态的条件下，能够使用伽马射线照射进行该方法”)。然而，对于该伽马射线照射仅仅提及了其作为通常灭菌方法的一个例子的可能性，并没有公开通过照射伽马射线进行灭菌的具体的实验例。此外，基体中存在金属、陶瓷、聚合物这样的材质不同的基体，但对于是否对所有材质的基体照射伽马射线后都维持了生物活性、或者仅在对特定材质的基体照射伽马射线时生物活性在照射后也得以维持这一方面、或者以何种方式照射伽马射线时生物活性在照射后也得以维持这一方面既没有记载也没有启示。

国际公开WO2006/004778(专利文献33)记载了具有涂敷层的植入物，该植入物将具有细胞粘附促进效果的肽掺入纳米结晶性磷灰石层，实施例中记载了在肽存在下，使羟基磷灰石电化学沉积在钛制盘，在磷灰石层内掺入肽的植入物在25kgrey的γ射线照射后细胞粘附促进效果未降低，另一方面，仅在磷灰石层表面吸附肽的植入物在γ射线照射后失去细胞粘附促进效果(实施例1和2)。

然而，上述专利文献公开的植入物是使羟基磷灰石电化学沉积而成的，并不是通过在磷酸钙过饱和溶液中与肽共沉淀制造的复合物。通过电化学沉积将肽掺入磷灰石层内的情况与使肽与磷灰石一起共沉淀得到的复合物的微观结构、结晶性完全不同。

即，电化学沉积形成的磷灰石的结晶性高，在粉末X射线衍射法中的(002)(211)(112)(300)衍射线分离(例如，非专利文献18)，即使是结晶形态也容易形成磷灰石晶体中特征性的六角针状、六角板状的形态。由于结晶性高，所以磷灰石的溶解性低(专利文献33)。溶解性低的磷灰石适合与不需要缓释、仅着重于在表面固定的肽、蛋白进行复合化。不需要缓释、仅着重于在表面固定的肽、蛋白的一个例子是具有细胞粘附促进效果的肽、蛋白。实际上，该专利文献也记载了形成的针状的磷灰石、该磷灰石的溶解性低且稳定、具有细胞粘附促进效果的肽稳定地牢固地结合在表面。另一方面，具有细胞增殖活性、组织形成活性、细胞分化促进活性、对抗体的反应活性、激动作用活性和拮抗作用活性的肽、蛋白通过缓释对周围组织产生效果，因此不适合掺入结晶性高且溶解性低的磷灰石。反而需要适当降低磷灰石、磷酸钙的溶解性来使掺入的肽、蛋白进行缓释。

从根本上说，基于电化学沉积的涂敷能够适用于导电性的金属而不能适用于非导电性的陶瓷。进而，该专利文献未公开来自细胞外基质且其自身不具有直接的细胞增殖分化活性的多糖类(例如肝素)与肽共存而在羟基磷灰石的层内掺入肽的例子。

另一方面，在以诱导生物体免疫应答为目的的疫苗中，有时一起使用无机盐类的免疫佐剂和抗原。作为无机盐类的免疫佐剂，除了氢氧化铝之外，长期以来通用氯化铝、磷酸铝、硫酸铝等铝盐，也使用磷酸钙。作为磷酸钙免疫佐剂，记载了将来自生物体的癌特异性抗原与作为无机盐类的β-磷酸三钙组合作为癌特异性抗原疫苗的疫苗·佐剂(专利文献20、21)、与抗原一起使用的磷酸钙免疫佐剂(专利文献22、23)，但均未提及与作为蛋白的抗原组合后进行辐射灭菌。铝盐免疫佐剂与细菌、病毒等抗原组合用于感染症预防用疫苗有着悠久的历史，其中也有经过利用辐射的最终灭菌而制造出的疫苗(非专利文献14)。

然而，细菌、病毒等抗原对于疫苗施用对象的动物是异种的生物或异种生物的生物体分子，是被给药或移植对象动物识别为异物的蛋白。因此，这些文献没有公开对未被给药或移植对象动物识别为异物的蛋白进行辐射灭菌。从根本上说，细菌、病毒等抗原对于给药对象动物来说是异物，会被免疫系统清除。因此，即使因辐射灭菌引起非自然的分子变化也仍然为异物，因此可认为对预期效果(通过免疫系统的清除)的不良影响较小。另一方面，认为在想要利用未被给药或移植对象动物识别为异物的蛋白来得到组织再生等效果的情况下，因辐射灭菌引起的非自然的分子变化而被识别为异物、不发生与受体的结合等，对该蛋白具有的功能造成不良影响，难以得到预期效果。

基于这样的状况，作为生物活性蛋白、尤其不是氨基酸残基数小于50左右的短链肽而是氨基酸残基数为50以上的长链蛋白的、应用了基于辐射的最终灭菌法的生物制剂仅已知胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶的例子(非专利文献15、16)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO01/043143；

专利文献2：日本特开2016-53063号公报；

专利文献3：日本特许第5872032号公报；

专利文献4：日本特许第6317307号公报；

专利文献5：日本特许第5746430号公报；

专利文献6：美国专利第5730933号；

专利文献7：欧州专利公开0562864A1；

专利文献8：欧州专利0562864B1；

专利文献9：日本特开2016-106104号公报；

专利文献10：日本特开2017-222687号公报；

专利文献11：日本特开平09-133770号公报；

专利文献12：日本特表平11-506360号公报；

专利文献13：日本特表2007-513083号公报；

专利文献14：日本特表2007-515196号公报；

专利文献15：日本特表2002-501786号公报；

专利文献16：日本特表2002-529201号公报；

专利文献17：日本特表平10-511957号公报；

专利文献18：日本特表2003-503423号公报；

专利文献19：日本专利5221132号公报；

专利文献20：日本专利6082901号公报；

专利文献21：国际公开WO2012/105224；

专利文献22：国际公开WO2017/047095；

专利文献23：日本专利第4569946号公报；

专利文献24：日本特愿2016-173357号公报；

专利文献25：欧州专利公开806212；

专利文献26：日本特开2000-93503号公报；

专利文献27：欧州专利1786483B1(专利文献17的对应欧洲专利)；

专利文献28：国际公开WO2006/016807；

专利文献29：日本特许4478754号公报；

专利文献30：美国专利第6136369号；

专利文献31：美国专利第6143948号；

专利文献32：美国专利第6344061号；

专利文献33：国际公开WO2006/004778。

非专利文献

非专利文献1：Biomaterials，27，pp.167-175，2006；

非专利文献2：辐射化学，57，3，1994；

非专利文献3：PDA无菌制品GMP委员会“对社会有贡献的无菌药品的制造和质量管理”，PDA Journal of GMP and Validation in Japan，16，pp.9-14，2014；

非专利文献4：European Medicines Agency，Guideline on the sterilizationof the medicinal product，active substance，excipient and primary container_Draft，April 11，2016；

非专利文献5：“通过最终灭菌方法制造无菌药品的指南”，平成23年度厚生劳动科学研究(药品·医疗器械等监管科学综合研究项目)、厚生劳动省医药食品安全局监督指导·麻药对策科事务联络，2011；

非专利文献6：RADIOISOTOPES，24，pp.894-901，1975；

非专利文献7：日本原子力学会刊，35，pp.688-693，1993；

非专利文献8：铃鹿医疗科学大学期刊，9，pp.87-96，2002；

非专利文献9：Isotope News，710，pp.2-6，2013；

非专利文献10：RADIOISOTOPES，30，pp.258-262，1981；

非专利文献11：Adv.Space Res.，12，pp.223-231，1992；

非专利文献12：Cancer Res.，70，pp.257-265，2010；

非专利文献13：Ertekin MV，et al.，J.Radiat.Res.，45，pp.543-548，2004；

非专利文献14：EMA的Non-compliance Report(疫苗)-DICM/INSP/AMG/MBP/ACS，GMP信息摘要，虚拟制药工厂2017.1.8，http://ncogmp.com/blog/emanoncompliancereport-vaccine-dicminspamgmbpacs/；

非专利文献15：“药品、医疗器械的灭菌新趋势”，“辐射灭菌”[第3回]，2015.09.17http：//www.gmp-platform.com/topics_detail1/id＝1010；

非专利文献16：“伽马辐射对药物物质的影响”-辐射利用技术数据库(RADA),1996；

非专利文献17：“通过最终灭菌方法制造无菌药品的指南的修订”，厚生劳动省事务联络，平成24年11月9日；

非专利文献18：Materials，11，1897，2018。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供一种包含即使实施辐射灭菌也保持生物活性的生物活性蛋白的用于动物的医疗器械。

本发明的另一课题在于提供一种制造医疗器械的方法，上述医疗器械为包含即使实施辐射灭菌也保持生物活性的生物活性蛋白的用于哺乳动物的医疗器械。

本发明的再一课题在于提供作为包含即使实施辐射灭菌也保持生物活性的生物活性蛋白的用于哺乳动物的医疗器械的、例如骨组织修复用医疗器械或人工关节等。

本发明的再一课题在于提供一种制造医疗器械的方法，上述医疗器械为作为包含即使实施辐射灭菌也保持生物活性的生物活性蛋白的用于哺乳动物的医疗器械的、例如骨组织修复用医疗器械或人工关节等。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现，在将生物活性蛋白包埋到无机盐类固体中时，使无机盐类和生物活性蛋白共沉淀形成复合物，由此即使照射适于灭菌的剂量的辐射，也可大幅地抑制该蛋白的失活。即，发现无机盐类固体本身具有有用的辐射防护作用。

例如，磷酸钙能够根据条件容易地制成过饱和溶液。当对该过饱和溶液施加一些(物理或化学的)刺激时，过饱和状态迅速消除，磷酸钙析出而产生沉淀。此时，通过在过饱和溶液中预先添加生物活性蛋白作为溶质，沉淀的磷酸钙会卷入该蛋白，生成包埋了该蛋白的状态的磷灰石等磷酸钙共沉淀析出组合物。对于将该沉积冷冻干燥得到的组合物，即使照射适于灭菌的剂量的伽马射线，该生物活性蛋白的失活也得到大幅抑制。同样地，在将生物活性蛋白包埋在氯化钠中、进行真空干燥而得到的组合物中，因照射适于灭菌的剂量的伽马射线导致的该生物活性蛋白的失活也得到大幅抑制。这些发现表明如果抑制照射时的自由基产生，则能够防止生物活性蛋白的失活，本发明是基于这些见解而完成的。

即，本发明包括以下发明。

[1]一种医疗器械，其为用于包括人的哺乳动物的医疗器械，

所述医疗器械配置成将包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体涂敷于金属、陶瓷或这两者的一部分或全部，

(a)上述包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体通过在产生自发成核的中性或弱碱性的不稳定磷酸钙过饱和溶液中的受控的延迟共沉淀(Controlled DelayedCoprecipitation)或覆盖夹心法或干燥法的工序来提供，

(b)上述医疗器械通过暴露于足以灭菌的剂量的电离辐射、由此制成具有选自细胞增殖活性、血管增殖活性、软组织形成活性、骨组织形成活性、骨分化促进活性、对抗体的反应活性、激动作用活性及拮抗作用活性中的1种或2种以上的生物活性的最终灭菌医疗器械的工序进行制造，

(c)上述无机盐类为选自磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙及碳酸钙中的1种或2种以上的无机盐类，且

(d)上述具有生物活性的蛋白为选自肽类激素、生长因子及成骨蛋白中的1种或2种以上的蛋白。

[2]根据上述[1]所述的医疗器械，其中，磷灰石为低结晶磷灰石。

[3]根据上述[1]或[2]所述的医疗器械，其中，延迟共沉淀包括通过控制作为不稳定磷酸钙过饱和溶液的pH为7.0～9.0的水溶液中的KCl浓度来人为地控制延迟磷酸钙析出时间，上述水溶液包含0.5～2.5mM的Ca离子、1.0～20mM的磷酸根离子、0～40mM的K离子、0～200mM的Na离子、0～200mM的Cl离子。

[4]根据上述[1]或[2]所述的医疗器械，其中，延迟共沉淀包括通过控制作为不稳定磷酸钙过饱和溶液的pH为7.0～9.0的水溶液中的KCl浓度来人为地控制延迟磷酸钙析出时间，上述水溶液包含1.2～2.75mM的Ca离子、0.6～15mM的磷酸根离子、0～30mM的K离子、30～150mM的Na离子、0.1～3.0mM的Mg离子、30～150mM的Cl离子、0～60mM的HCO₃离子。

[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的医疗器械，其中，包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体还包埋了来自细胞外基质的、其自身不具有直接的细胞增殖分化活性的多糖类、优选肝素。

[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的医疗器械，其中，金属为选自钛、钛合金、不锈钢及钴铬合金中的1种或2种以上的金属。

[7]根据上述[1]～[5]中任一项所述的医疗器械，其中，陶瓷为选自磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙、氧化铝、氧化锆及这些的复合物中的1种或2种以上的陶瓷。

[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的医疗器械，其中，电离辐射为伽马射线和/或电子束。

[9]根据上述[8]所述的医疗器械，其中，基于伽马射线和/或电子束的灭菌在抑制自由基产生的条件下进行，该条件为选自：(a)在大气压50kPa以下的脱气状态下的灭菌；(b)在将空气交换为氮气或非活性气体的状态下的灭菌；(c)在0℃～-196℃的范围的低温的灭菌；(d)在包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体中进一步添加抗坏血酸或抗坏血酸盐的状态下的灭菌；中的1种或2种以上的条件。

[10]根据上述[9]所述的医疗器械，其中，抗坏血酸或抗坏血酸盐选自抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙二水合物及抗坏血酸磷酸酯镁盐n水合物。

[11]根据上述[8]～[10]中任一项所述的医疗器械，其中，伽马射线的剂量为3～40kGy。

[12]根据上述[1]～[11]中任一项所述的医疗器械，其中，肽类激素为选自来自下丘脑的肽类激素、加压素、催产素、垂体中间叶激素、促性腺激素、生长激素、甲状旁腺激素、抑制素、活化素、松弛素、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、促胰液素、胃动素、心房钠尿肽、促红细胞生成素、瘦素、内皮素、胃饥饿素、脂联素、胰岛素样生长因子、降钙素基因相关肽中的1种或2种以上的肽类激素。

[13]根据上述[1]～[11]中任一项所述的医疗器械，其中，生长因子为选自FGF-2及其功能等同物中的1种或2种以上的生长因子。

[14]根据上述[1]～[11]中任一项所述的医疗器械，其中，成骨蛋白为选自OP-1、OP-2、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-8、BMP-9、DPP、Vg1、Vgr-1、以及它们的功能等同物中的1种或2种以上的成骨蛋白。

[15]根据上述[1]～[14]中任一项所述的医疗器械，其中，通过足以灭菌的剂量的电离辐射而最终灭菌后的生物活性相对于灭菌前的生物活性为13％以上。

[16]根据上述[1]～[15]中任一项所述的医疗器械，其用于组织修复。

[17]根据上述[16]所述的医疗器械，其为选自体内固定销、体内固定用螺钉、人工骨、骨填充材料、牙科用骨内植入体、脊椎内固定装置、髄内钉及脊柱笼中的1种或2种以上的医疗器械。

[18]根据上述[1]～[15]中任一项所述的医疗器械，其用作人工关节。

[19]一种方法，其为制造用于包括人的哺乳动物的医疗器械的方法，

上述医疗器械配置成包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体涂敷于金属、陶瓷或这两者的一部分或全部，

上述方法包括：

(a)通过在产生自发成核的中性或弱碱性的不稳定磷酸钙过饱和溶液中的受控的延迟共沉淀或覆盖夹心法或干燥法制造上述包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的工序；和

(b)将上述医疗器械暴露于足以灭菌的剂量的电离辐射，由此制成具有选自细胞增殖活性、血管增殖活性、软组织形成活性、骨组织形成活性、骨分化促进活性、对抗体的反应活性、激动作用活性及拮抗作用活性中的1种或2种以上的生物活性的最终灭菌医疗器械的工序。

[20]一种方法，其为制造用于包括人的哺乳动物的医疗器械的方法，

上述方法包括：

(b)将上述医疗器械暴露于足以灭菌的剂量的电离辐射，由此制成具有选自细胞增殖活性、血管增殖活性、软组织形成活性、骨组织形成活性、骨分化促进活性、对抗体的反应活性、激动作用活性及拮抗作用活性中的1种或2种以上的生物活性的最终灭菌医疗器械、且该最终灭菌医疗器械的生物活性至少为灭菌前的约13％以上的工序。

[21]根据上述[19]或[20]所述的方法，其中，无机盐类为选自低结晶磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙及碳酸钙中的1种或2种以上的无机盐类。

[22]根据上述[19]～[21]中任一项所述的方法，其中，延迟共沉淀包括通过控制作为不稳定磷酸钙过饱和溶液的pH为7.0～9.0的水溶液中的KCl浓度来人为地控制延迟磷酸钙析出时间，上述水溶液包含0.5～2.5mM的Ca离子、1.0～20mM的磷酸根离子、0～40mM的K离子、0～200mM的Na离子、0～200mM的Cl离子。

[23]根据上述[19]～[21]中任一项所述的方法，其中，延迟共沉淀包括通过控制作为不稳定磷酸钙过饱和溶液的pH为7.0～9.0的水溶液中的KCl浓度来人为地控制延迟磷酸钙析出时间，上述水溶液包含1.2～2.75mM的Ca离子、0.6～15mM的磷酸根离子、0～30mM的K离子、30～150mM的Na离子、0.1～3.0mM的Mg离子、30～150mM的Cl离子、0～60mM的HCO₃离子。

[24]根据上述[19]～[23]中任一项所述的方法，其中，制造包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的工序包括制造以下无机盐类固体的工序，

上述无机盐类固体除了包埋了具有生物活性的蛋白以外，包埋了来自细胞外基质的其自身不具有直接的细胞增殖分化活性的多糖类、优选肝素。

[25]根据上述[19]～[24]中任一项所述的方法，其中，金属为选自钛、钛合金、不锈钢及钴铬合金中的1种或2种以上的金属。

[26]根据上述[19]～[24]中任一项所述的方法，其中，陶瓷为选自磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙、氧化铝、氧化锆、及这些的复合物中的1种或2种以上的陶瓷。

[27]根据上述[19]～[26]中任一项所述的方法，其中，电离辐射为伽马射线和/或电子束。

[28]根据上述[27]所述的方法，其中，基于伽马射线和/或电子束的灭菌在抑制自由基产生的条件下进行，该条件为选自(a)在大气压50kPa以下的脱气状态下的灭菌、(b)在将空气交换为氮气或非活性气体的状态下的灭菌、(c)在0℃～-196℃的范围的低温的灭菌以及(d)在包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体中进一步添加抗坏血酸或抗坏血酸盐的状态下的灭菌中的1或2以上的条件。

[29]根据上述[28]所述的方法，其中，抗坏血酸或抗坏血酸盐选自抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙二水合物及抗坏血酸磷酸酯镁盐n水合物。

[30]根据上述[27]～[29]中任一项所述的方法，其中，伽马射线的剂量为3～40kGy。

[31]根据上述[19]～[30]中任一项所述的方法，其中，肽类激素为选自来自下丘脑的肽类激素、加压素、催产素、垂体中间叶激素、促性腺激素、生长激素、甲状旁腺激素、抑制素、活化素、松弛素、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、促胰液素、胃动素、心房钠尿肽、促红细胞生成素、瘦素、内皮素、胃饥饿素、脂联素、胰岛素样生长因子、降钙素基因相关肽中的1种或2种以上的肽类激素。

[32]根据上述[19]～[30]中任一项所述的方法，其中，生长因子为选自FGF-2及其功能等同物中的1种或2种以上的生长因子。

[33]根据上述[19]～[30]中任一项所述的方法，其中，成骨蛋白为选自OP-1、OP-2、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-8、BMP-9、DPP、Vg1、Vgr-1及它们的功能等同物中的1种或2种以上的成骨蛋白。

[34]一种方法，其为用于组织修复的医疗器械的制造方法，上述方法包括上述[19]～[33]中任一项所述的方法。

[35]根据上述[34]所述的方法，其中，上述用于组织修复的医疗器械为选自体内固定销、体内固定用螺钉、人工骨、骨填充材料、牙科用骨内植入体、脊椎内固定装置、髄内钉及脊柱笼中的1种或2种以上的医疗器械。

[36]一种方法，其为用作人工关节的医疗器械的制造方法，上述方法包括上述[19]～[33]中任一项所述的方法。

发明效果

本发明的医疗器械能够避免工序管理繁杂的无菌制造工序，本发明的医疗器械的一个方式为利用基于辐射的最终灭菌法(能够在待灭菌物被收纳于最终包装的状态下进行辐射照射、定量地测定或推测该灭菌后的微生物的死亡的灭菌法)进行灭菌的医疗器械。

在配置成包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体涂敷于金属、陶瓷或这两者的一部分或全部的本发明的医疗器械中，由于能够抑制因辐射灭菌引起的该蛋白的生物活性的失活，所以在利用该蛋白的生物活性的各种医疗器械的制造工序中能够应用基于辐射的简便的最终灭菌法，能够避免无菌制造方法，因此能够大幅降低成本。

附图说明

图1为示出当将用磷灰石包埋了的FGF-2涂敷于骨修复用钛制外固定销(Externalfixation pin)时，即使照射适于灭菌的剂量的伽马射线，FGF-2的细胞增殖活性也得以维持、受到防护而免于辐射失活的图。伽马射线照射后的FGF-2的细胞增殖率与未照射伽马射线的FGF-2的细胞增殖率无显著差异。

图2为示出在使FGF-2吸附于经磷灰石涂敷的骨修复用钛制外固定销的情况下，当照射适于灭菌的剂量的伽马射线时，FGF-2失去细胞增殖活性，未受到防护而辐射失活的图。伽马射线照射后的FGF-2的细胞增殖率在统计学上显著低于未照射伽马射线的FGF-2的细胞增殖率。

图3为示出在将用明胶包埋了的FGF-2涂敷于骨修复用钛制外固定销的情况下，当照射适于灭菌的剂量的伽马射线时，FGF-2失去细胞增殖活性，未受到防护而辐射失活的图。伽马射线照射后的FGF-2的细胞增殖率在统计学上显著低于未照射伽马射线的FGF-2的细胞增殖率。

图4为示出当涂敷用磷灰石包埋了的FGF-2并照射适于灭菌的剂量的伽马射线时，能够使用移植用陶瓷作为FGF-2的细胞增殖活性得以维持的医疗器械的构件的图。伽马射线照射后的FGF-2的细胞增殖率与未照射伽马射线的FGF-2的细胞增殖率无显著差异。

图5为示出将用磷灰石包埋了的FGF-2涂敷于骨修复用钛制外固定销并照射适于灭菌的剂量的伽马射线时，当脱气进行伽马射线照射时，能够抑制FGF-2对抗FGF-2抗体的反应活性的消失的图。

图6为示出在将用磷灰石包埋了的FGF-2涂敷于骨修复用钛制外固定销并照射适于灭菌的剂量的伽马射线时，当在脱气且干冰存在下的低温进行伽马射线照射时，能够抑制FGF-2对抗FGF-2抗体的反应活性的消失的图。

图7为示出在将用磷灰石包埋了的BMP-2涂敷于磷灰石制盘并照射适于灭菌的剂量的伽马射线时，BMP-2在Dex存在下残存间充质干细胞的分化诱导能力的图。

图8为示出在将用磷灰石包埋了的FGF-2涂敷于骨修复用钛制外固定销并照射适于灭菌的剂量的伽马射线时，当对该涂敷添加抗坏血酸盐并进行伽马射线照射时，能够抑制FGF-2对抗FGF-2抗体的反应活性的消失的图。

图9为示出在钛制外固定销上制作用磷灰石包埋了FGF-2和肝素两者的涂敷层、和吸附了FGF-2和肝素两者的磷灰石的涂敷层，当照射适于灭菌的剂量的伽马射线后比较FGF-2的细胞增殖活性时，与吸附了FGF-2和肝素两者的磷灰石的涂敷层相比，用磷灰石包埋了FGF-2和肝素两者的涂敷层能够抑制FGF-2的细胞增殖活性的消失的图。

图10为示出在人工关节/人工骨用氧化锆上制作用磷灰石包埋了FGF-2和肝素两者的涂敷层、和吸附了FGF-2和肝素两者的磷灰石的涂敷层，当照射适于灭菌的剂量的伽马射线后比较FGF-2的细胞增殖活性时，与吸附了FGF-2和肝素两者的磷灰石的涂敷层相比，用磷灰石包埋了FGF-2和肝素两者的涂敷层能够抑制FGF-2的细胞增殖活性的消失的图。

图11为示出显示出在氧化锆上制作用磷灰石包埋了FGF-2和肝素两者的涂敷层时的共沉淀物为以低结晶磷灰石、无定形磷酸钙、碳酸钙为主要成分的无机盐类固体的粉末X射线衍射图的图。

具体实施方式

本发明提供的医疗器械及其制造方法的特征在于，其为用于包括人在内的哺乳动物的医疗器械及其制造方法，上述医疗器械配置成包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体涂敷于金属、陶瓷或这两者的一部分或全部，

(a)上述包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体通过在产生自发成核的中性或弱碱性的不稳定磷酸钙过饱和溶液中的受控的延迟共沉淀或覆盖夹心法或干燥法的工序来提供，

(b)上述医疗器械通过暴露于足以进行灭菌的剂量的电离辐射，由此制成具有选自细胞增殖活性、血管增殖活性、软组织形成活性、骨组织形成活性、骨分化促进活性、对抗体的反应活性、激动作用活性及拮抗作用活性中的1种或2种以上的生物活性的最终灭菌医疗器械的工序来制造，

如上所述，“包埋(embedding)”这一术语通常意为将作为病理检查对象的生物体组织埋入能固化的液状石蜡、树脂中进行固化来固定生物体组织，但在本说明书中，“包埋”意为将蛋白分子全部或一部分埋入无机盐类固体中，或用无机盐类固体致密地包裹蛋白分子全部或一部分，将蛋白分子固定在无机盐类固体中。因此，“包埋”不同于该蛋白分子在无机盐类固体中仅为“吸附”或“接触”的状态、或者“混合”的状态。作为蛋白分子“包埋”在无机盐类固体中的实例，能够举出从共存有蛋白的磷酸钙过饱和溶液中使该蛋白分子和磷酸钙共沉淀，并且该蛋白分子以纳米级的间隔分散配置在磷酸钙的基质中的组合物(非专利文献1)。

更详细地进行说明，在本说明书中，“包埋”这一术语包括：无机盐类和蛋白分子两者同时从液相中结晶或析出进行固相化，由此将蛋白分子全部或一部分埋入无机盐类固体中，或用无机盐类固体致密地包裹蛋白分子全部或一部分，将蛋白分子固定在无机盐类固体中。

同样地，包埋”这一术语也包括：明胶等有机物和蛋白分子两者同时从液相中结晶或析出进行固相化，由此将蛋白分子全部或一部分埋入固体状的有机物中，或用固体状有机物致密地包裹蛋白分子全部或一部分，将蛋白分子固定在固体状有机物中。

但是，“包埋”这一术语应该以包括上述定义的方式进行最广义方式的解释，并且在任何意义上上述定义都不能解释为限定。

另一方面，“吸附”或“接触”意为如下得到的状态：无机盐类或者明胶等有机物预先通过结晶或析出而固相化，其后液相中存在的蛋白分子固定于固体状的无机盐类或者有机物。因此，通常在蛋白分子仅为“吸附”或“接触”状态时，固定化的蛋白分子特异性地存在于无机盐类固体、固体状有机物的表面。

此外，“混合”是以下任一状态：无机盐类和蛋白分子两者预先通过结晶或析出而固相化，其后使两者接近而得到的状态，或者明胶等有机物和蛋白分子两者预先通过结晶或析出而固相化，其后使两者接近而得到的状态。作为“混合”的例子，有无机盐类的粉末颗粒和蛋白的粉末颗粒在宏观上均匀的共存状态，和有机物固体粉末的颗粒和蛋白的粉末颗粒在宏观上均匀的共存状态。

蛋白是否包埋在无机盐类固体中能够容易地通过例如免疫电子显微镜法确认。即，如果利用标记有金胶体、铁蛋白这样的电子密度高的物质或其前体的抗体，将无机盐类固体中的蛋白染色/可视化为电子显微镜观察用，则能够使用电子显微镜确认蛋白是否包埋在无机盐类固体中。如果蛋白包埋在无机盐类固体中，则能够确认分离的蛋白在无机盐类固体基质中分散存在(非专利文献1)。

在本说明书中，无机盐类固体是适合用作医疗器械、具有生物相容性的无机盐类固体，具体而言，是选自磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙及碳酸钙中的1种或2种以上的无机盐类。

无机盐类固体可以是结晶无机盐类固体或无定形无机盐类固体中的任一者。此外，还可以是无定形无机盐类固体和结晶无机盐类固体混合存在的状态，也可以是组成不同的多个无机盐类固体混合存在的状态。是结晶还是无定形通常能够用粉末X射线衍射法容易地进行区别，如果无机盐类固体完全是无定形的，则粉末X射线衍射图中出现一个宽的衍射晕，如果是结晶则出现多个衍射峰。

在本说明书中，“低结晶磷灰石”是具有低结晶性的磷灰石，其特征在于，在粉末X射线衍射图中，(211)、(112)、(300)这3条衍射线不分离而作为一个峰或衍射晕出现。这3条衍射线在结晶性高的磷灰石(例如，纯结晶羟基磷灰石)中，在用CuKα射线测定时，在衍射角31.8°、32.2°、32.9°的位置分离为3条而出现。

磷酸钙、碳酸钙、碳酸氢钙、磷酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙及无定形磷酸钙也可以是其他无机元素、离子团作为杂质固溶而成的物质。作为这样的例子，可举出固溶有镁的碳酸钙、固溶有碳酸的磷酸钙、磷酸钠、固溶有锌的磷酸钙、固溶有钾的氯化钠等，但并不限于此。作为固溶的元素、离子团，能够举出镁、铁、锌、钾、氢离子、氢氧根离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等，通过使它们与包埋时的原材料共存，能够使它们固溶于无机盐类。

在本说明书中，作为具有生物活性的蛋白，能够使用选自肽类激素、生长因子及成骨蛋白中的1种或2种以上的蛋白。具有生物活性的蛋白只要是对于使用医疗器械的哺乳类动物而言不被识别为异物、且不被该哺乳类动物生物学排斥的蛋白即可。包括例如：基于使用医疗器械的哺乳类动物本来存在的这些蛋白而人工制备的、具有同样的生理功能的基因重组蛋白、通过物理或化学处理而改性但处于没有失去原本生物活性的状态的蛋白等。本说明书中使用的具有生物活性的蛋白的术语在任何意义上都不能解释为限定，而应以最广义的方式解释。作为生物活性，能够举出例如选自细胞增殖活性、血管增殖活性、软组织形成活性、骨组织形成活性、骨分化促进活性、对抗体的反应活性、激动作用活性及拮抗作用活性中的1种或2种以上的生物活性，但不限定于此。

在本说明书中，医疗器械意味着用于包含人在内的哺乳动物的疾病的诊断、治疗、预防的器械，意味着例如对包含人在内的哺乳动物的身体的结构、功能等产生影响的器械。在本说明书中，哺乳动物包括人和非人哺乳动物，作为非人哺乳动物，包括例如：猴、猫科动物、犬科动物、马科动物，兔科动物、豚鼠等啮齿目动物等，但不限定于这些特定的动物。一部分医疗器械由政令指定，但本发明的医疗器械也包括政令指定之外的医疗器械，例如还包括口罩等。包括例如：起搏器、冠状动脉支架、人工血管、PTCA导管、中枢静脉导管、吸收性体内固定用螺栓、手术用无纺布等，但并不限定于这些特定的方式。优选用于组织修复的医疗器械、用于恢复关节功能的医疗器械，能够举出例如人工关节等，但不限定于此。优选例如用于包含穿刺在内的除了注射之外的外科手术来输送并留置到体内的医疗器械。体内这一术语还包括例如牙齿。对留置的期间没有特别限定，例如除了24小时以内的暂时留置之外，也可以是1～30日左右的短/中期留置或30日以上的长期留置等。

根据本发明的优选方式，能够举出例如：在作为使用了金属制杆、陶瓷制骨头、超高分子量聚乙烯制内衬的人工髋关节的、与骨直接接触的金属制杆部分涂敷包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的器械。此外，作为其它例子，能够举出：仅在作为骨固定用金属制螺钉的、螺钉的脊的部分涂敷包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的器械；仅在作为牙科用骨内植入体的、与骨和牙周组织相接触的部分涂敷包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的器械；仅在作为脊椎内固定装置、脊柱笼的、与骨相接触的部分涂敷包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的器械；或者在作为骨填充用陶瓷制人工骨的、人工骨整体涂敷包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的器械；在作为金属与陶瓷的复合材料的、人工骨整体涂敷包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的器械等。但是，本发明的范围并不限定于这些特定的方式。

公开了通过使生理活性物质与无机盐共沉淀，将其涂敷于基体，在最后阶段使用伽马射线照射灭菌的方法(专利文献19)，但在该文献中，并没有记载或教导在灭菌后保留生理活性物质的特定的生物活性，更没有记载或教导用于在灭菌后保留生理活性物质的特定的生物活性的最佳的基体。本发明人发现，在涂敷于高分子材料的基体的情况下，灭菌后难以保留生理活性物质的生物活性，但通过将包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体涂敷于金属或陶瓷的基体，即使在电离辐射灭菌后也能够高度保留蛋白的特定的生物活性。

陶瓷在狭义上意为经过人工热处理制成的非金属无机质固体材料，但在本说明书中，包含医疗、医疗器械领域中能够利用的未经热处理的非金属无机质固体材料在内，也称作陶瓷。在本说明书中，陶瓷只要是非金属无机质固体材料即可，包括经过人工热处理制备而成的材料、或未经热处理制备的材料等通过任意制备方法得到的材料。

作为本发明的优选方式，提供一种医疗器械及其制造方法，其包含例如配置成将不仅包埋了具有生物活性的蛋白、还包埋了多糖类、优选肝素的无机盐类固体涂敷在移植用金属、移植用陶瓷或这两者的一部分或全部的构成体。以肝素为例的来自细胞外基质的多糖类是其自身不具有直接的细胞增殖分化活性的生物体高分子，但由于其有助于维持具有生物活性的蛋白的生物活性，因此价值高。

作为本发明的优选方式，提供一种医疗器械及其制造方法，其包含例如配置成将包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体涂敷在选自钛、钛合金、不锈钢、钴铬合金中的移植用金属的一部或整体的构成体。钛、钛合金、不锈钢、钴铬合金是生物相容性高的金属，在整形外科、牙科中广泛使用，因此作为整形外科、牙科领域的医疗器械的价值高。

作为本发明的进一步优选的其他方式，提供一种医疗器械及其制造方法，其配置成将包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体涂敷于在选自磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙及这些的复合物中的移植用陶瓷的一部分或整体。上述移植用陶瓷中可以包含氧化铝和/或氧化锆等。这些陶瓷也是生物相容性高的材料，在整形外科、牙科中广泛使用，因此作为整形外科、牙科领域的医疗器械的价值高。这些陶瓷中还包含其他无机元素、离子团以杂质形式固溶的陶瓷。作为这样的例子，可举出固溶有碳酸、硅的磷灰石、固溶有硅的磷酸三钙、固溶有镁的无定形磷酸钙、固溶有钇的氧化锆等，但并不限于此。作为复合物的例子，能够例示出有磷灰石和磷酸三钙制成的二相性陶瓷、氧化铝和氧化锆的复合陶瓷，但并不限定与这些特定的方式。

包含包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体的上述医疗器械能够以实质上保持该生物活性蛋白的活性的状态照射适于灭菌的充分的电离辐射剂量进行灭菌，制成最终灭菌的医疗器械。

作为用于灭菌的电离辐射，优选伽马射线和/或电子束。如果利用容易透过物质的伽马射线，则即使是包埋了具有生物活性的蛋白的无机盐类固体也能够容易地灭菌。在无机盐类固体中包埋的蛋白中，对于露出固体表面的部分等还能够根据本领域技术人员所周知的方法通过电子射线照射进行灭菌。如果预先将该医疗器械的整体适当包装成密封状态，然后用本领域技术人员所周知的方法照射伽马射线或电子射线，则能够得到将灭菌的医疗器械进行密封内包的产品，能够作为无菌地密封包装的医疗器械提供给医疗现场(非专利文献17)。但是，本发明的实施方式并不限定于这些特定的方式。

灭菌所需的剂量通常为确保无菌性保证水平(SAL：Sterility Assurance Level)10^-6时所需的最低剂量即可。该无菌性保证水平由ISO(ISO 11137-1、1137-2)、JIS(JIS T0806-1、0806-2)等标准确定，为美国FDA、日本PMDA(医药品医疗器械综合机构)等各国的管理机构所采用。

在使用伽马射线灭菌的情况下，作为确保无菌性保证水平10^-6而对本发明的医疗器械进行灭菌的剂量，例如能够选择10～40kGy左右、优选15～30KGy的剂量。作为实现无菌性保证水平的辐射剂量，有时优选约25kGy。但是，并不限定于这些特定的辐射剂量。

作为本发明的进一步优选的一个方式，在使用伽马射线和/或电子束的灭菌工序中，为了抑制自由基产生，能够在大气压50kPa以下，优选在小于50Pa，进一步优选在20Pa以下的脱气状态进行灭菌。或者，也优选在用氮气、非活性气体置换了空气的状态下进行灭菌。进而，有时优选在0℃～-196℃，优选在-20℃～-80℃，进一步优选在干冰共存下的-20℃～-80℃的低温的灭菌。或者，有时优选在包埋了蛋白的无机盐类固体中添加抗坏血酸、抗坏血酸盐然后进行灭菌。为了使抗坏血酸、抗坏血酸盐均匀地分散而进行添加，通过浸渍在5-50mM、优选浸渍在10-30mM的抗坏血酸、抗坏血酸盐的溶液中并进行干燥来实现，但并不限定于此。

从其他观点出发，作为本发明的优选的一个方式，提供一种用于哺乳动物的医疗器械及其制造方法，其中包含包埋了肽类激素的无机盐类固体，该肽类激素选自来自下丘脑的肽类激素、加压素、催产素、垂体中间叶激素、促性腺激素、生长激素、甲状旁腺激素、抑制素、活化素、松弛素、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、促胰液素、胃动素、心房钠尿肽、促红细胞生成素、瘦素、内皮素、胃饥饿素、脂联素、胰岛素样生长因子及降钙素基因相关肽。

此外，作为其他优选方式，提供一种用于哺乳动物的医疗器械及其制造方法，其包含包埋了作为生长因子的FGF-2(成纤维细胞生长因子-2)的无机盐类固体。FGF-2是对软组织再生、血管形成、骨形成有用的生长因子，因此这样的医疗器械在促进组织再生的用途是有用的。

作为再另一种优选的方式，提供一种用于哺乳动物的医疗器械及其制造方法，其包含作为成骨蛋白，包埋了选自OP-1、OP-2、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-8、BMP-9、DPP、Vg1、Vgr-1及它们的功能等同物中的1种或2种以上的成骨蛋白的无机盐类固体。这样的医疗器械在促进骨再生的用途中是有用的。

从另一个观点出发，作为本发明的优选的一个方式，提供一种医疗器械及其制造方法，其中，具有生物活性的蛋白的生物活性是选自细胞增殖活性、血管增殖活性、软组织形成活性、骨组织形成活性、骨分化促进活性、对抗体的反应活性及激动作用活性中的生物活性。蛋白、医疗器械具有这些生物活性能够通过细胞培养中的细胞数量、分化标记物、产生物质、基因表达、细胞形态、血管样结构形成等细胞集合形态来进行评价。在动物实验中，能够通过使用组织标本的组织形态观察、X射线、MRI等组织图像、基因表达等进行评价。在具有生物活性的蛋白作为抗原、激动剂或拮抗剂起作用的情况下，能够通过使用与蛋白的生物活性部位相关的单克隆抗体、标记了的单克隆体的蛋白印迹法等各种方法进行评价。在具有生物活性的蛋白为抗体的情况下，预先标记抗体后与抗原结合，使用标记物质的活性、量，评价与抗原结合的抗体的量、结合活性，由此能够评价生物活性。在具有生物活性的蛋白为酶的情况下，也能够通过使用酶底物，评价酶与酶底物的反应产物的方法来评价生物活性。但是，只要是与要评价的特定的生物活性对应的评价法即可，并不限定于此。在任一评价法中，例如，通过在包含蛋白的无机盐类固体的组和不包含蛋白的无机盐类固体的组之间比较特定的生物活性，能够验证该蛋白、医疗器械是否具有生物活性。用于比较两组的生物活性的样品可以直接使用含有或不含蛋白的无机盐类固体、医疗器械、移植片，也可以用使用适当的提取液溶解无机盐类固体而提取蛋白的提取液。

利用上述生物活性及其评价法进行定量评价的方法，能够用于评价通过足以进行灭菌的剂量的电离辐射灭菌后的医疗器械的生物活性。本发明的医疗器械在确保无菌性保证水平为10^-6的灭菌之后，至少具有灭菌前的生物活性的约13％以上、优选65％以上、进一步优选70％以上的生物活性。

作为将具有生物活性的蛋白包埋在无机盐类固体中的优选方法，能够采用例如使用了氯化钠溶液、磷酸钠溶液、含有碳酸根离子的钙溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液的共沉淀析出法、覆盖夹心法或干燥法。

共沉淀析出法是如下方法：使所期望的生物活性蛋白共存于所期望的无机盐类过饱和溶液中，在使该无机盐类的结晶或无定形固体从该过饱和溶液中析出时同时捕捉该蛋白、或使无机盐类固体致密地包裹该蛋白分子的同时使其析出，由此进行包埋。此外，共沉淀析出也包括使包埋了该蛋白的无机盐类的结晶或无定形固体以涂敷其他种类的固体表面的方式析出的方法。

覆盖夹心法是使所期望的生物活性蛋白吸附或接触所期望的无机盐类固体表面，并用包埋了生物活性蛋白的同种或不同种的无机盐类固体包覆该表面的方法。作为其他方法，能够举出干燥法，例如能够在所期望的无机盐类溶液中溶解所期望的生物活性蛋白，将该溶液冷冻干燥或浓缩干燥，由此用无机盐类固体致密地包埋该蛋白。这些方法可以单独采用，也可以将2种以上适当组合，可以根据需要重复适当次数。通过采用这些方法，优选以能够从辐射灭菌防护所期望的生物活性蛋白的状态，能够配置多层无机盐类固体包埋蛋白组合物的层。这样制造的包埋生物活性蛋白的无机盐类固体作为从溶液中沉淀或在溶液中悬浮的状态得到，还能够如上所述作为涂敷移植用金属、移植用陶瓷的层的形式得到，能够适当地从溶液中分离或干燥。

作为将具有生物活性的蛋白包埋在无机盐类固体中的优选方法，能够采用在使用中性或弱碱性溶液的产生自发成核的不稳定磷酸钙过饱和溶液中，进行具有生物活性的蛋白和磷酸钙的受控的延迟共沉淀的共沉淀析出法或覆盖夹心法。作为在含有蛋白的高浓度磷酸钙溶液中、抑制磷酸钙的自发成核、结晶化或沉淀生成而以高浓度状态的溶液的形式使其稳定化、并在所期望的时刻使蛋白和磷酸钙共沉淀的方法，已知有如下方法：通过二氧化碳的鼓泡、酸的添加来降低pH而降低过饱和度、完全溶解后，通过二氧化碳的脱气、碱的添加、水分子的电化学还原产生OH^－离子来使pH缓慢上升而提高过饱和度，使磷酸钙缓慢结晶，由此引起与蛋白的共沉淀(专利文献19、专利文献25、专利文献26、专利文献27、专利文献33)。认为在该方法中，通过使在酸性时完全溶解的不产生自发成核的稳定磷酸钙过饱和溶液的pH上升，提高过饱和度，从而引起共沉淀。

然而，大多数蛋白有在酸性pH、高碱性pH下变性而失去活性的问题。为了避免上述问题，作为产生自发成核的不稳定磷酸钙过饱和溶液，制备在可立刻形成大量沉淀的中性或弱碱性的高浓度磷酸钙溶液中大量添加了K离子、Na离子的溶液，提高结晶化的活化能，由此能够减少成核频率，延迟结晶的时间，使磷酸钙缓慢结晶并引起与蛋白的共沉淀。该方法不是调节溶液的过饱和度，而是通过改变结晶的活化能来进行具有生物活性的蛋白和磷酸钙的受控延迟共沉淀的方法，更具体而言，通过调节磷酸钙浓度、pH、以及与过饱和度无关的KCl浓度，控制并延长自发成核的时间，从而能够进行延迟共沉淀。

例如，上述延迟共沉淀作为不稳定磷酸钙过饱和溶液使用包含0.5～2.5mM的Ca离子、1.0～20mM的磷酸根离子、0～40mM的K离子、0～200mM的Na离子、0～200mM的Cl离子且pH为7.0～9.0的水溶液，优选使用包含1.2～2.75mM的Ca离子、0.6～15mM的磷酸根离子、0～30mM的K离子、30～150mM的Na离子、0.1～3.0mM的Mg离子、30～150mM的Cl离子、0～60mM的HCO₃离子且pH为7.0～9.0的水溶液，优选通过控制该水溶液中的KCl浓度来人为控制延迟磷酸钙析出时间。由于Mg离子、HCO₃离子是磷酸钙结晶的抑制剂，因此在除了添加K离子、Na离子之外还添加了Mg离子和HCO₃离子的不稳定磷酸钙过饱和溶液中，能够进一步人为控制延迟磷酸钙析出时间(专利文献29)。

实施例

以下，通过实施例来进一步具体地说明本发明，但本发明的范围并不限定于下述实施例。本实施例中的术语、概念基于该领域中惯用的术语的含义，为了实施本发明而使用的技术，除了特别明示其出处的技术以外，是本领域技术人员能够基于公知的文献等容易且可靠地实施的。此外，各种分析等使用所使用的分析仪器或试剂、试剂盒的使用说明书、目录等中记载的方法进行。

例1：用包埋了FGF-2的磷灰石涂敷的外固定销的辐射灭菌后的细胞增殖活性

用包埋了具有细胞增殖活性的FGF-2的无机盐类固体涂敷骨折固定中使用的钛制体内固定用销，对整体进行电离辐射灭菌后，研究FGF-2是否具有细胞增殖活性。

使用了包含4.89mM的Ca离子、1.28mM的磷酸根离子、6.13mM的K离子、138.8mM的Na离子、0.23mM的Mg离子、136.6mM的Cl离子、15.09mM的HCO₃离子且pH为7.8的、即使直接在37℃放置也能在4-5小时左右通过自发成核使磷酸钙结晶化的不稳定磷酸钙过饱和溶液(该不稳定磷酸钙过饱和溶液与专利文献19的液体不同)。在该不稳定的磷酸钙过饱和溶液中按照4μg/ml和0μg/ml的浓度添加成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)。在37℃将钛制体内固定销(Synthes，Inc.Cell Drill 4.0/3.0mmTi，20mm-80mm)在其中浸渍48小时，使FGF-2与磷灰石一起共沉淀、进行涂敷，由此制作6根或8根共沉淀磷灰石FGF-2(共沉淀ApFGF)销。同样地，使用不含FGF-2的不稳定磷酸钙过饱和溶液制备6或8根Ap销。将制作的共沉淀ApFGF销放入管中，在12.4Pa、室温进行2小时真空干燥。在干燥后立即为装有销的管盖上盖子，利用由气体阻隔性的保存袋、氧吸收剂、合成沸石干燥剂构成的无氧/干燥保存系统(ISO公司)进行包装。

以⁶⁰Co作为辐射源、以25±0.5kGy的剂量对这些ApFGF销的半数进行γ射线照射。照射在常温实施，包括运输期间在内在4℃保管。未照射γ射线的共沉淀ApFGF销在4℃保管。为了评价照射和未照射γ射线的共沉淀ApFGF销上担载的FGF-2的细胞增殖活性，将销在10mM的柠檬酸钠中浸渍30分钟进行溶解。作为对照，将不含FGF-2的Ap销也在10mM的柠檬酸钠溶液中浸渍30分钟，溶解涂敷层。溶解液中的钙促进细胞增殖，因此进行ICP发光分光分析后，使样品间的钙浓度一致地添加到小鼠成纤维细胞系NIH3T3中，使用Cell CountingKit-8测定增殖率。将不含FGF-2的Ap销作为对照，将其增殖率设为1，将在统计学上增殖率显著高的共沉淀ApFGF销判断为“有活性”。重复进行4次利用共沉淀的涂敷、真空干燥、照射或不照射γ射线、增殖率测定的操作。

表1示出在4次的重复试验中判断为“有活性”的共沉淀ApFGF销的根数。此外，图1示出测定的增殖率的值。

[表1]

如表1所示，在4次重复试验中，共沉淀ApFGF销的γ射线照射组中10/13根、未照射组中10/13根被判定为具有细胞增殖活性，具有细胞增殖活性的销在γ射线照射组和未照射组中数量相同。此外，如图1所示，在共沉淀ApFGF销中，γ射线照射组和未照射组均显示Ap销的约1.5倍的增殖率，未照射γ射线组的增殖率相对于Ap销的增殖率(增殖率＝1)在统计学上显著地高(p＝0.021)，γ射线照射组的增殖率与Ap销的增殖率(增殖率1)之差为极其接近显著水平的水平(p＝0.058)。在照射组和未照射组的增殖率之间没有观察到显著差异(p＝0.436)。即，判明将用磷灰石包埋了FGF-2的组合物涂敷于作为移植用金属的钛制体内固定销的情况下，蛋白通过包埋获得电离辐射灭菌耐性，换言之，利用磷灰石的包埋对生物活性蛋白显示辐射防护作用。另外，在25±0.5kGy的伽马射线照射的条件下，利用磷灰石的包埋对生物活性蛋白显示出辐射防护作用，因此当然对小于25±0.5kGy的伽马射线照射也发挥辐射防护作用。

例2：用吸附了FGF-2的磷灰石涂敷的外固定销的辐射灭菌后的细胞增殖活性

用吸附了具有细胞增殖活性的FGF-2的无机盐类固体涂敷骨折固定中使用的钛制体内固定用销，对整体进行电离辐射灭菌后，研究FGF-2是否具有细胞增殖活性。

使用与例1相同的不稳定磷酸钙过饱和溶液，制备不含FGF-2的过饱和磷酸钙溶液，在37℃将6或8根钛制体内固定用销(Synthes，Inc.Cell Drill4.0/3.0mmTi，20mm-80mm)在其中浸渍48小时，制作表面涂敷磷灰石的Ap销。将该Ap销在含有12μg/ml的FGF-2的过饱和磷酸钙中浸渍数秒，在-18℃冷冻，制作用吸附了FGF-2的磷灰石涂敷的吸附磷灰石FGF-2(吸附ApFGF)销。在与例1完全相同的条件下在室温进行真空干燥、照射或不照射γ射线、保管、细胞增殖活性评价。重复进行5次吸附了FGF-2的磷灰石的涂敷、照射或不照射γ射线、增殖率测定的操作。

表2示出在5次的重复试验中判断为“有活性”的吸附ApFGF销的根数。此外，图2示出测定的增殖率的值。

[表2]

如表2所示，在5次试验中，吸附ApFGF销的γ射线照射组中2/16根、未照射组中11/16根被判定为具有细胞增殖活性，γ射线照射组中具有细胞增殖活性的销数为未照射组的约1/5。对两组进行卡方检验，结果确认γ射线照射组与未照射组之间存在显著性差异(p＝0.001)，因此可知吸附ApFGF销因γ射线照射灭菌而丧失FGF-2的生物活性。此外，如图2所示，在吸附ApFGF销中，未照射组显示出Ap销的约1.7倍(p＝0.003)的增殖率，但γ射线照射组减少至Ap销的1.1倍的增殖率，与Ap销无显著性差异(p＝0.087)，可知通过γ射线照射，FGF-2的细胞增殖活性显著(p＝0.0004)地消失约35％左右。另一方面，如上述图1所示，在共沉淀ApFGF销中，γ射线照射组和未照射组均显示Ap销的约1.5倍的增殖率，照射组与未照射组未见显著差异(p＝0.436)。即，专利文献12、13、17中虽然记载了将具有生物活性的蛋白与无机盐类组合而成的组合物进行辐射灭菌，但作为组合的方式，有“混合”、“吸附”、“接触”、“包埋”等方式，可知组合方式不同则最终灭菌后的蛋白的生物活性产生大的差异，以及在“包埋”这样的方式中能够以高效率维持蛋白的生物活性。

例3：用包埋了FGF-2的明胶涂敷的外固定销的辐射灭菌后的细胞增殖活性

在含有4μg/ml的FGF-2的1％明胶溶液中浸渍与例1相同的钛制体内固定用销数秒钟，在-18℃冷冻，制作用包埋了FGF-2的明胶涂敷的销(明胶FGF)。在与例1完全相同的条件下在室温进行真空干燥、照射或不照射γ射线、保管、细胞增殖活性评价。重复进行4次包埋了FGF-2的明胶的涂敷、照射或不照射γ射线、增殖率测定的操作。

表3示出在4次的重复试验中判断为“有活性”的明胶FGF销的根数。此外，图3示出测定的增殖率的值。

[表3]

如表3所示，在4次试验中，用包埋了FGF-2明胶涂敷的明胶FGF销的γ射线照射组中13/13根、未照射组中13/13根被判定为具有细胞增殖活性，具有细胞增殖活性的销在γ射线照射组和未照射组中数量相同。然而，如图3所示，明胶FGF销中，未照射组显示Ap销的约12倍的增殖率，γ射线照射组减少至Ap销的约8倍的增殖率，判定因γ射线照射FGF-2的细胞增殖活性在统计学上显著(p＝0.011)地消失约30％左右。即，可知包埋具有生物活性的蛋白的基质为像明胶那样的有机物的情况下，与用无机盐类固体包埋的例1图1的情况不同，辐射防护作用小。专利文献18中记载了在无机、有机或包含有机和无机物质的载体的基质内掺入生物活性、并在合成后灭菌的载体，但没有记载无机、有机或包含有机和无机物质的载体的基质为怎样的组合、材质时，可在灭菌后维持生物活性，或者在怎样的灭菌法时，可在灭菌后维持生物活性。本发明的实施例表明，将具有生物活性的蛋白包埋在无机盐固体基质中的情况比掺入有机基质中的情况显示极其优异的辐射防护作用。推测可能是由于与无机盐类固体不同，有机物因辐射照射会产生大量的自由基。

例4：用包埋了FGF-2的磷灰石涂敷的人工骨用磷灰石陶瓷的辐射灭菌后的细胞增殖活性

将含有3％的聚乙烯醇的粒径70微米以下的羟基磷灰石粉末压制成型，在1150℃烧结1小时，制成致密质的磷灰石制盘(椭圆直径5mm×宽度3mm×厚度1mm)。该制造方法本质上与制造人工骨用磷灰石陶瓷的方法相同。以与例1相同的方式将共沉淀ApFGF涂敷在该磷灰石制盘上，进行真空干燥、γ射线照射，然后在盘上培养NIH3T3细胞，测定细胞增殖率。在盘上直接培养NIH3T3细胞的情况下，由于蛋白的影响，细胞粘附性发生变化，因此将作为对照的未照射组的磷灰石制盘浸渍于代替FGF-2而添加了牛血清白蛋白(BSA)的不稳定磷酸钙过饱和溶液中，涂敷ApBSA。重复进行三次涂敷、照射或不照射γ射线、增殖率测定的操作。

表4示出在3次的重复试验中判断为“有活性”的共沉淀ApFGF磷灰石制盘的个数。此外，图4示出测定的增殖率的值。

[表4]

如表4所示，在3次重复试验中，共沉淀ApFGF磷灰石制盘的γ射线照射组中18/18根、未照射组中18/18根被判定为具有细胞增殖活性，具有细胞增殖活性的磷灰石制盘在γ射线照射组和未照射组中数量相同。此外，如图4所示，在共沉淀ApFGF磷灰石制盘中，γ射线照射组和未照射组均显示出Ap销的约1.4倍的增殖率，照射组与未照射组的不存在显著差异(p＝0.415)。即，即使在将用磷灰石包埋了FGF-2的组合物涂敷于移植用陶瓷的情况下，也与涂敷于移植用金属的情况相同，通过包埋，蛋白获得电离辐射灭菌耐性，换言之，可知通过利用磷灰石的包埋对生物活性蛋白显示辐射防护作用。

例5：用包埋了FGF-2的磷灰石涂敷的聚合物的辐射灭菌后的细胞增殖活性

使用作为聚合物的聚醚醚酮(PEEK)制圆棒(直径6mm×长8cm)，在与例1相同的条件下将共沉淀ApFGF涂敷于表面，进行真空干燥、照射或不照射γ射线、保管、细胞增殖率测定。聚醚醚酮是用于移植的聚合物。

表5示出在3次的重复试验中判断为“有活性”的共沉淀ApFGF-PEEK制圆棒的个数。

[表5]

如表5所示，在3次试验中，共沉淀ApFGF-PEEK圆棒的γ射线照射组中6/9根、未照射组中9/9根被判定为具有细胞增殖活性，γ射线照射组中具有细胞增殖活性的销的数量为未照射组的2/3。可知共沉淀ApFGF-PEEK圆棒因γ射线照射灭菌而丧失FGF-2的生物活性。专利文献19记载有一种方法，其通过使包含含有钙、镁、磷酸、碳酸氢根离子及生物活性物质的盐水混合物的酸性化的组合物与基体接触，增加pH来产生盐和生物活性物质的共沉淀，得到涂敷的基体。虽然在权利要求记载的发明中没有提及但在正文中记载了也可以在最后的工序之后进行伽马射线照射。然而，本发明的实施例表明，在将具有生物活性的蛋白共沉淀涂敷在移植用聚合物上的情况下，不能实现充分的辐射防护作用，在共沉淀涂敷在移植用金属、陶瓷上时，显示出极其优异的辐射防护作用。推测可能是由于与金属、陶瓷不同，聚合物因辐射照射会产生大量的自由基。

例6：辐射灭菌时的环境对包埋在无机盐固体中的蛋白的生物活性的影响

在与例1相同的条件下，将包埋了FGF-2的磷灰石涂敷于作为移植用金属的外固定用钛销，以25±0.5kGy的剂量照射γ射线，研究γ射线照射时的环境对于对抗FGF-2抗体具有反应活性的FGF-2产生何种影响。

与例1同样地使用钛制体内固定用销来制作共沉淀ApFGF销并进行密封包装。此时，应用(i)与例1相同的无氧/干燥包装、(ii)脱气包装、(iii)氮填充包装这3种环境条件。脱气在29.2kPa进行5秒钟的真空脱气处理。氮置换是使高纯度氮气流入而进行的。此后，以25±0.5kGy的剂量进行γ射线照射。以与例1相同的无氧/干燥包装的未照射γ射线的共沉淀ApFGF销(未照射组)作为对照。将γ-照射/未照射的共沉淀ApFGF销在10mM的柠檬酸钠中浸渍30分钟来溶解涂敷层，并通过使用抗FGF-2抗体的蛋白印迹法检测销上担载的FGF-2。溶解液通过冷冻干燥浓缩20倍后供于蛋白印迹法。抗体使用与FGF-2的生物活性相关的人FGF-2小鼠单克隆抗体(Thermo Fisher Scientific Inc.)。获得的图像数据使用Imge Lab(Bio-Rad公司)，对在17kDa(FGF-2分子量：17000)的位置检测出的信号强度进行定量并比较。

在未照射组中，在17kDa的位置明确地检测出带的信号。在将作为对照的未照射组的信号强度设为100％时，照射组的信号强度为：(i)与例1相同的无氧/干燥包装照射的情况为13％，(ii)脱气包装照射的情况为19％，(iii)氮填充包装照射的情况为14％(图5)。因此可知，在脱气状态或氮环境下的γ射线照射可抑制对于抗FGF-2抗体具有反应活性的FGF-2减少，特别是脱气状态与氮气环境下相比，γ射线照射中的FGF-2的防护作用高。另外，在无氧/干燥包装的照射中，即使对于抗FGF-2抗体具有反应活性的FGF-2减少至13％，如例1所述，FGF-2的细胞增殖活性也与未照射组等同。

例7：辐射灭菌时的温度对包埋在无机盐固体中的蛋白的生物活性的影响

在与例1相同的条件下，将包埋了FGF-2的磷灰石涂敷于作为移植用金属的外固定用钛销，在室温和低温以25±0.5kGy的剂量进行γ射线照射，研究γ射线照射时的温度对于FGF-2对抗FGF-2抗体的反应活性产生何种影响。

与例1同样地使用钛制体内固定销来制作共沉淀ApFGF销，用与例6相同的脱气包装进行密封包装。在低温进行γ射线照射的销与约3.8kg的干冰共存，在室温进行γ射线照射的销在没有干冰的情况下进行γ射线照射。干冰的升华温度在大气压下为-78.5℃。因此，干冰自身的温度为负78.5℃以下的温度。照射剂量与例6相同。此后，用与例6同样的方法，通过蛋白印迹法检测γ射线照射后的销上担载的FGF-2。

图6显示辐射灭菌时的温度对包埋在磷灰石中的对于抗FGF-2抗体具有反应活性的17kDaFGF-2的影响。在两组中都检测到17kDa处的带。进而，可知用干冰在-80℃附近的低温照射与室温照射相比，信号强度增加为2倍(图6)。由此可知，除脱气包装外还共存有干冰的低温的γ射线照射可抑制对于抗FGF-2抗体具有反应活性的FGF-2的减少，与室温的照射相比，γ射线照射中的FGF-2的防护作用高。

例8：用包埋了人重组BMP-2(rhBMP-2)的磷灰石涂敷的人工骨用磷灰石陶瓷在辐射灭菌后的骨分化促进活性

将例1的FGF-2变更为rhBMP-2，对致密质的磷灰石制盘进行共沉淀ApBMP涂敷、以25±0.5kGy的剂量照射γ射线，研究BMP-2对γ射线照射的防护作用的有无。

使用与例4同样地制作的致密质的磷灰石制盘，将例4的FGF-2变更为作为成骨蛋白的人重组BMP-2(rhBMP-2)，进行共沉淀ApBMP涂敷。作为对照，使用牛血清白蛋白(BSA)代替rhBMP-2进行共沉淀ApBSA涂敷。将涂敷了共沉淀ApBMP和共沉淀ApBSA的致密质磷灰石盘进行真空干燥、γ射线照射后，将来自大鼠骨髄的间充质干细胞接种于盘上，在骨分化诱导12天后测定骨分化标记物。使用从7周龄F344/NSlc大鼠的骨髓中分离的原代间充质干细胞作为间充质干细胞，接种在盘上的间充质干细胞在接种后立刻在不添加或添加10nM的地塞米松(Dex)的条件下，在添加了10mMβ的甘油磷酸酯、0.28mM的抗坏血酸的成骨细胞分化诱导基质中培养12天。培养基的更换为更换一半的量、每2天进行1次。培养12天后，将细胞在含有0.1％的Triron-X的PBS中冻融，使用实验室分析ALP(Wako公司)对作为骨分化标记物的碱性磷酸酶(ALP)活性进行定量。为了评价单位细胞数量的活性，使用Quant-iT(注册商标)PicoGreen(注册商标)dsDNA Reagent and Kits(Thermo Fisher Scientific Inc.)对细胞裂解液中的DNA量进行定量。

图7示出在用包埋了BMP-2的磷灰石涂敷的γ射线照射磷灰石制盘中，在Dex不存在或存在的条件下进行分化诱导后的单位DNA量的ALP活性。如图7所示，在共沉淀ApBMP磷灰石制盘中，关于在不存在Dex的条件下的分化诱导后的单位DNA量的ALP活性，在未照射γ射线组中相对于ApBSA显著高(p＝0.02)，在照射组中显示出与ApBSA同等的活性(p＝0.46)。另一方面，关于在Dex存在的条件下诱导分化后的每单位DNA量的ALP活性，在γ射线照射组和未照射组中均显著高于ApBSA(p＝0.02，0.0001)。即，当用磷灰石包埋作为成骨蛋白的BMP-2时，即使进行γ射线灭菌，也可以维持作为BMP-2的生物活性之一的Dex存在下的骨分化促进作用。即，即使在将用磷灰石包埋了BMP-2的组合物涂敷于移植用陶瓷的情况下，也与用磷灰石包埋FGF-2的情况相同，通过包埋获得电离辐射灭菌耐性，维持蛋白的特定的生物活性，换言之，判明了用磷灰石包埋对蛋白的特定生物活性显示辐射防护作用。

例9：辐射灭菌时的L-抗坏血酸磷酸酯镁盐n水合物的共存对包埋在无机盐类固体中的蛋白的生物活性的影响

在与例1相同的条件下，将包埋了FGF-2的磷灰石涂敷于作为移植用金属的外固定用钛销上，并在L-抗坏血酸磷酸镁n水合物的溶液(AsMg溶液)中浸渍数秒，并进行真空干燥。以25±0.5kGy的剂量对制作的共沉淀ApFGF销进行γ射线照射，研究γ射线照射时的AsMg的共存对于抗FGF-2抗体具有反应活性的FGF-2产生何种影响。

与例1同样地使用钛制体内固定用销，涂敷包埋了FGF-2的磷灰石后，在25mM的AsMg溶液中两次浸渍数秒并进行真空干燥，在包埋了FGF-2的磷灰石中添加AsMg。将制作的共沉淀ApFGF销用与例6相同的脱气包装进行密封包装，以25±0.5kGy的剂量照射γ射线。其后，用与例6同样的方法，通过蛋白印迹法检测γ射线照射后的销上担载的FGF-2。

图8示出在辐射灭菌时向包埋了FGF-2的磷灰石中添加AsMg对包埋的FGF-2对抗FGF-2抗体的反应活性的影响。在未照射γ射线、AsMg存在下的γ射线照射、AsMg不存在下的γ射线照射的任一组中，都在17kDa的位置检测出带。在将未照射γ射线组的信号强度设为100％时，AsMg存在下的γ射线照射组的信号强度为55％。但是，AsMg不存在下的γ射线照射组的信号强度为13％，是AsMg存在下的γ射线照射组的约1/4的信号强度。因此可知，在包埋了FGF-2的磷灰石中添加AsMg的条件下的γ射线照射可抑制对于抗FGF-2抗体具有反应活性的FGF-2减少，与AsMg不存在的情况相比，γ射线照射中的FGF-2的防护作用高。由于AsMg是具有抗氧化作用的抗坏血酸的化合物之一，因此认为优异的防护作用是由于抑制了辐射照射引起的自由基生成。

例10：用除了包埋了FGF-2外还包埋或吸附了肝素的磷灰石涂敷的外固定钛销的辐射灭菌后的细胞增殖活性

制作包埋了FGF-2和肝素两者的磷灰石涂敷的外固定钛销、以及吸附了FGF-和肝素两者的磷灰石涂敷的外固定钛销，以25±0.5kGy的剂量对它们进行γ射线照射，研究γ射线照射后FGF-2是否具有细胞增殖活性。

将肝素钠以0.5单位/ml的浓度加入到例1的以4μg/ml和0μg/ml的浓度添加了FGF-2的不稳定的磷酸钙过饱和溶液中。以下，在与例1同样的条件下，在该不稳定磷酸钙过饱和溶液中浸渍外固定钛销(Synthes，Inc.Cell Drill4.0/3.0mmTi，20mm-80mm)，使FGF-2和肝素与磷灰石一起共沉淀而进行涂敷(共沉淀ApFGF肝素销)。另一方面，将肝素钠以0.5单位/ml的浓度加入到例2的含有12μg/ml的FGF-2的过饱和磷酸钙溶液中。以下，在与例2同样的条件下，将外固定钛销在该不稳定磷酸钙过饱和溶液中浸渍数秒钟，用吸附了FGF-2和肝素的磷灰石进行涂敷(吸附ApFGF肝素)。在与例1相同的条件下进行真空干燥、照射或不照射γ射线、保管、细胞增殖活性评价。

表6示出在3次的重复试验中判断为“有活性”的共沉淀或吸附ApFGF肝素销的根数。

[表6]

如表6所示，在3次试验中，共沉淀ApFGF肝素销的γ射线照射组中9/9根、未照射组中9/9根被判定为具有细胞增殖活性，具有细胞增殖活性的销在γ射线照射组和未照射组中数量相同。另一方面，吸附ApFGF肝素销的γ射线照射组中3/9根、未照射组中9/9根被判定为有细胞增殖活性，γ射线照射组中有细胞增殖活性的销数为未照射组的约1/3。对两组进行卡方检验，然后确认γ射线照射组与未照射组之间存在显著性差异(p＝0.003)。即，发现吸附ApFGF肝素销因γ射线照射灭菌而丧失FGF-2生物活性的倾向强。

此外，如图9所示，以未照射γ射线组的细胞增殖率为100％进行了归一化的γ射线照射组的细胞增殖率在共沉淀ApFGF肝素销中约为23％，在吸附ApFGF肝素销中仅为4％，两者的值在统计学上存在显著性差异(p＝0.0002)。即，将FGF-2和肝素两者用磷灰石包埋的组合物涂敷在作为移植用金属的钛制体内固定销上时，与涂敷吸附了FGF-2和肝素两者的磷灰石的情况相比，电离辐射灭菌耐性高，换言之，磷灰石不仅在包埋具有生物活性的蛋白的情况下，在包埋没有生物活性的肝素的情况下，也显示辐射防护作用。

例11：用包埋了FGF-2的磷灰石涂敷的外固定钛销和用包埋了FGF-2和肝素两者的磷灰石涂敷的外固定钛销在辐射灭菌后细胞增殖活性的比较

对例1的共沉淀ApFGF销的细胞增殖率和例10的共沉淀ApFGF肝素销的辐射灭菌后的细胞增殖率进行比较，研究除了包埋FGF-2之外还包埋肝素的效果。

在例1中，将用10mM的柠檬酸钠溶液溶解辐射灭菌后的共沉淀ApFGF销的涂敷层而制作的溶解液添加到小鼠成纤维细胞系NIH3T3中，定量评价细胞增殖率。结果，得到细胞增殖率的值为1.53±0.27(图1)。与此相对，当将用10mM的柠檬酸钠溶液溶解辐射灭菌后的共沉淀ApFGF肝素的涂层而制作的溶解液添加到小鼠成纤维细胞株NIH3T3中时，细胞增殖率高达定量限以上。因此，将溶解液稀释30倍，添加到小鼠成纤维细胞系NIH3T3中，定量评价细胞增殖率，结果得到细胞增殖率的值为1.67±0.07。即，表示将肝素这样的来自细胞外基质且其自身不具有直接的细胞增殖分化活性的多糖类与生物活性蛋白一起包埋时，能够更高地维持辐射灭菌后的生物活性。

例12：用除了包埋了FGF-2外还包埋或吸附了肝素的磷灰石涂敷的人工关节/人工骨用氧化锆的辐射灭菌后的细胞增殖活性

制作用包埋了FGF-2和肝素两者的磷灰石涂敷的人工关节/人工骨用氧化锆、以及用吸附了FGF-和肝素两者的磷灰石涂敷的人工关节/人工骨用氧化锆，以25±0.5kGy的剂量对它们进行γ射线照射，研究γ射线照射后FGF-2是否具有细胞增殖活性。

使用氧化锆方棒(2.4mm方棒殖活性。吸附了胞外)，在与例10相同的条件下进行涂敷、真空干燥、照射或不照射γ射线、保管、细胞增殖率测定。

表7示出在2次重复试验中判断为“有活性”的共沉淀或吸附ApFGF肝素氧化锆的根数。

[表7]

如表7所示，在2次试验中，共沉淀ApFGF肝素氧化锆的γ射线照射组中6/6根、未照射组中6/6根被判定为具有细胞增殖活性，具有细胞增殖活性的氧化锆在γ射线照射组和未照射组中数量相同。另一方面，吸附ApFGF肝素氧化锆的γ射线照射组中2/6根、未照射组中6/6根被判定为有细胞增殖活性，γ射线照射组中有细胞增殖活性的销的数量为未照射组的约1/3。对两组进行卡方检验，然后确认γ射线照射组与未照射组之间存在显著性差异(p＝0.014)。即，可知吸附ApFGF肝素氧化锆因γ射线照射灭菌而丧失FGF-2的生物活性的倾向强。

此外，如图10所示，以未照射γ射线组的细胞增殖率为100％进行归一化的γ射线照射组的细胞增殖率在共沉淀ApFGF肝素氧化锆中约为76％，在吸附ApFGF肝素氧化锆仅为29％，两者的值在统计学上存在显著差异(p＝0.008)。即，在将用磷灰石包埋了FGF-2和肝素两者而成的组合物涂敷于作为移植用陶瓷的氧化锆时，与涂敷吸附了FGF-2和肝素两者的磷灰石的情况相比，电离辐射灭菌耐性高，换言之，磷灰石不仅在包埋具有生物活性的蛋白的情况下，在包埋没有生物活性的肝素的情况下，也显示辐射防护作用。

例13：用包埋了FGF-2的磷灰石涂敷的外固定销的辐射灭菌后的涂敷层的组成分析

将例1中制作的γ射线照射和未照射的共沉淀ApFGF销、以及例2中制作的γ射线照射和未照射的吸附ApFGF销在10mM的柠檬酸钠溶液中浸渍30分钟，溶解作为涂敷层的共沉淀ApFGF和吸附ApFGF。用ICP发光分光分析法对溶解液进行化学分析，对共沉淀ApFGF和吸附ApFGF的钙和磷进行定量。结果示于表8。

[表8]

从表8可知，作为涂敷层的共沉淀ApFGF以磷酸钙为主要成分。共沉淀ApFGF的Ca/P摩尔比(1.70-1.71)是接近不含杂质元素的磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)的理论Ca/P摩尔比(1.67)的值。可知当将磷灰石的磷酸根置换为杂质时，Ca/P摩尔比变为高于1.67，置换磷酸根的代表性杂质为碳酸根。由于例1和例2的共沉淀ApFGF是在含有碳酸根离子的溶液中制备的，因此认为含有碳酸根的磷灰石与FGF-2共沉淀来包埋FGF-2，或者磷灰石和碳酸钙与FGF-2共沉淀来包埋FGF-2。

例14：在Ca-PO₄-K-Na-Cl系的不稳定磷酸钙过饱和溶液中的制造

使用包含1.00mM的Ca离子、1.00mM的磷酸根离子、2.00mM的K离子、16.7mM的Na离子、2.00mM的Cl离子、16.7mM的HCO₃离子且pH为8.3的、即使直接在37℃放置也能在4-5小时左右通过自发成核使磷酸钙结晶化的不稳定磷酸钙过饱和溶液。浸渍时间为24小时，除此以外，在与例12完全相同的条件下制造共沉淀ApFGF肝素氧化锆，进行真空干燥、γ射线照射、保管、细胞增殖率测定。

表9示出被判断为“有活性”的共沉淀ApFGF肝素氧化锆的根数。

[表9]

如表9所示，共沉淀ApFGF肝素氧化锆的γ射线照射组中3/3根、未照射组中3/3根被判定为具有细胞增殖活性，具有细胞增殖活性的氧化锆在γ射线照射组和未照射组中数量相同。即可判明，使用Ca-PO₄-K-Na-Cl系的不稳定磷酸钙过饱和溶液，将包埋了FGF-2和肝素两者的磷灰石的组合物涂敷在作为移植用陶瓷的氧化锆上的情况下，利用磷灰石的包埋也显示辐射防护效果。

例15：用包埋了FGF-2和肝素两者的磷灰石涂敷的氧化锆涂敷层的分析

用与例13相同的方式对例14中制备的共沉淀ApFGF肝素涂敷层进行组成分析。此外，将在例14中制造共沉淀ApFGF肝素氧化锆时的共沉淀物放置在硅无反射板，用粉末X射线衍射法进行分析。粉末X射线衍射使用CuKα射线在40kV、100mA的条件下进行。表10示出组成分析的结果。

[表10]

从表10可知，作为涂敷层的共沉淀ApFGF包含磷酸钙。共沉淀ApFGF的Ca/P摩尔比在γ射线未照射组中为1.70-1.82，在照射组为1.51-1.79。

由Ca/P比可以认为，与例13同样，含有碳酸根的磷灰石包埋了FGF-2和肝素，或者磷灰石和碳酸钙包埋了FGF-2和肝素。进而，无定形磷酸钙的Ca/P摩尔比通常为1.5，因此这也表明析出无定形磷酸钙。

图11示出用粉末X射线衍射法分析的结果。已知无定形磷酸钙在30°附近出现半值宽度大的宽峰。如图11所示，在共沉淀物的粉末X射线衍射图中，在30°附近观察到相当于无定形磷酸钙的半值宽度大的宽峰。此外，在31.8°、32.2°、32.9°出现的结晶性磷灰石所特有的3条强衍射线((211)、(112)、(300))未分离而形成一个宽峰，出现在32°附近。因此，共沉淀物磷灰石是低结晶磷灰石。并且，在29.4°处观察到碳酸钙峰。即，共沉淀物含有无定形磷酸钙、低结晶磷灰石、碳酸钙作为主要成分。共沉淀物不含低溶解性的结晶性磷灰石，以溶解性较高的无定形磷酸钙、低结晶磷灰石、碳酸钙为主要成分，因此适合于缓释包埋的蛋白。

产业上的可利用性

在配置成包埋了具有生物活性的生长因子等蛋白的磷灰石等无机盐类固体涂敷于金属或陶瓷的本发明的医疗器械由于能够抑制因辐射灭菌引起的该蛋白的生物活性的失活，所以在利用该蛋白的生物活性的各种医疗器械的制造工序中能够应用利用辐射的简便的最终灭菌法，能够避免无菌的制造法，因此能够大幅降低成本。

Claims

1.一种医疗器械，其是用于包括人的哺乳动物的骨组织修复用医疗器械，

所述医疗器械配置成包埋了具有生物活性的蛋白和肝素的无机盐类固体涂敷于金属、陶瓷或这两者的一部分或全部，

(a)所述包埋了具有生物活性的蛋白和肝素的无机盐类固体通过在产生自发成核的中性或弱碱性的不稳定磷酸钙过饱和溶液中的受控的延迟共沉淀的工序来提供，

(b)所述医疗器械通过暴露于足以灭菌的剂量的伽马射线和/或电子束、由此制成具有选自细胞增殖活性、血管增殖活性、软组织形成活性、骨组织形成活性、骨分化促进活性、对抗体的反应活性、激动作用活性及拮抗作用活性中的一种或两种以上的生物活性的最终灭菌医疗器械的工序来进行制造，基于所述伽马射线和/或电子束的灭菌是在抑制自由基产生的条件下进行的，所述条件为在大气压50kPa以下的脱气状态下的灭菌，

(c)所述无机盐类固体以低结晶磷灰石、无定形磷酸钙以及碳酸钙作为主要成分，且

(d)所述具有生物活性的蛋白为肽类激素和/或生长因子。

2.根据权利要求1所述的医疗器械，其中，金属为选自钛、钛合金、不锈钢及钴铬合金中的一种或两种以上的金属。

3.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其中，陶瓷为选自磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙、氧化铝、氧化锆、及这些的复合物中的一种或两种以上的陶瓷。

4.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其中，伽马射线的剂量为3～40kGy。

5.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其中，肽类激素为选自来自下丘脑的肽类激素、加压素、催产素、垂体中间叶激素、促性腺激素、生长激素、甲状旁腺激素、抑制素、活化素、松弛素、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、促胰液素、胃动素、心房钠尿肽、促红细胞生成素、瘦素、内皮素、胃饥饿素、脂联素、胰岛素样生长因子、降钙素基因相关肽中的一种或两种以上的肽类激素。

6.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其中，生长因子为选自FGF-2和其功能等同物中的一种或两种以上的生长因子。

7.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其中，生物活性为选自细胞增殖活性、血管增殖活性、软组织形成活性、对抗体的反应活性、激动作用活性及拮抗作用活性中的一种或两种以上的生物活性。

8.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其中，通过足以灭菌的剂量的电离辐射而最终灭菌后的生物活性相对于灭菌前的生物活性为13％以上。

9.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其中，具有生物活性的蛋白和肝素通过(a)使用了氯化钠溶液、磷酸钠溶液、氯化钙溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液的共沉淀析出法包埋在无机盐类固体中。

10.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其中，具有生物活性的蛋白和肝素通过(a)基于受控延迟共沉淀的共沉淀析出法包埋在无机盐类固体中，

所述受控延迟共沉淀是使用了中性或弱碱性溶液的产生自发成核的不稳定磷酸钙过饱和溶液中的具有生物活性的蛋白与磷酸钙的受控延迟共沉淀。

11.根据权利要求10所述的医疗器械，其中，延迟共沉淀包括：

作为不稳定磷酸钙过饱和溶液的包含0.5～2.5mM的Ca离子、1.0～20mM的磷酸根离子、0～40mM的K离子、0～200mM的Na离子、0～200mM的Cl离子且pH为7.0～9.0的水溶液中的KCl浓度的控制、以及

人为地控制并延迟磷酸钙析出时间。

12.根据权利要求10所述的医疗器械，其中，延迟共沉淀包括：

作为不稳定磷酸钙过饱和溶液的包含1.2～2.75mM的Ca离子、0.6～15mM的磷酸根离子、0～30mM的K离子、30～150mM的Na离子、0.1～3.0mM的Mg离子、30～150mM的Cl离子、0～60mM的HCO₃离子且pH为7.0～9.0的水溶液中的KCl浓度的控制、以及

人为地控制并延迟磷酸钙析出时间。

13.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其用于组织修复。

14.根据权利要求13所述的医疗器械，其为选自体内固定销、体内固定用螺钉、人工骨、骨填充材料、牙科用骨内植入体、脊椎内固定装置、髄内钉及脊柱笼中的一种或两种以上的医疗器械。

15.根据权利要求1或2所述的医疗器械，其用作人工关节。

16.一种方法，其为权利要求1～15中任一项所述的医疗器械的制造方法，所述方法包括将所述具有生物活性的蛋白和肝素通过(a)使用了氯化钠溶液、磷酸钠溶液、氯化钙溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钠溶液的共沉淀析出法包埋在无机盐类固体中的步骤。

17.一种制造方法，其是用于包括人的哺乳动物的骨组织修复用医疗器械的制造方法，

所述制造方法包括如下工序：

在基体的一部分或全部涂敷包埋了具有生物活性的蛋白和肝素的无机盐类的结晶或无定形固体的工序；以及

将涂敷了的所述基体在抑制自由基产生的条件下暴露于足以灭菌的剂量的伽马射线和/或电子束的工序，所述条件为在大气压50kPa以下的脱气状态下的灭菌，

所述基体包含金属、陶瓷或这两者，

所述无机盐类的结晶或无定形固体以低结晶磷灰石、无定形磷酸钙及碳酸钙作为主要成分，

所述具有生物活性的蛋白为肽类激素和/或生长因子。

18.根据权利要求17所述的制造方法，其中，所述金属为选自钛、钛合金、不锈钢及钴铬合金中的一种或两种以上的金属。

19.根据权利要求17或18所述的制造方法，其中，所述陶瓷为选自磷灰石、磷酸三钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙、氧化铝、氧化锆、及这些的复合物中的一种或两种以上的陶瓷。

20.根据权利要求17或18所述的制造方法，其中，所述伽马射线的剂量为3～40kGy。

21.根据权利要求17或18所述的制造方法，其中，所述蛋白为生长因子。

22.根据权利要求21所述的制造方法，其中，所述生长因子为FGF-2。