CN114058636A - 一种转甲状腺素蛋白基因的克隆、表达与纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TTR基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，具体为，通过化学合成和双酶切方法得到TTR重组质粒，诱导蛋白大量表达后，通过盐析、缓冲液置换透析、阴离子交换柱及凝胶过滤层析柱等步骤后得到精度纯化的TTR蛋白。该蛋白纯化方法是基于AKTA蛋白纯化系统，操作简便，可同时实现样品的自动洗涤、在线监测、实时观察等，能够及时根据样品情况和后续对纯化样本的要求来调整纯化过程，获得纯度高的TTR蛋白，可最大程度节约了宝贵的血浆资源，同时也为今后TTR基因的体外研究奠定了基础。

Description

一种转甲状腺素蛋白基因的克隆、表达与纯化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转甲状腺素蛋白(TTR)基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法。
技术背景
转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)，又称前白蛋白(prealbumin，PA)，是一种由4个完全相同的亚基通过非共价键连接形成的四聚体蛋白，每个亚基是由127个氨基酸组成，相对分子质量为55kDa。在体内，TTR主要是由肝脏和大脑的脉络丛产生，也有少量由视网膜上皮细胞合成，主要存在于血液和脑脊液中，在血液中含量约为3.4-5μmol/L，在脑脊液中含量约为0.04-0.4μmol/L。该蛋白的主要生理功能是转运甲状腺素，以及结合视黄醇结合蛋白转运维生素A。
在正常生理条件下，TTR是以稳定的四聚体形式行使其功能，但当编码TTR的基因发生突变或随着年龄的增长，均可导致TTR的蛋白四聚体结构不稳定，TTR单体在外周神经系统、心脏、眼、肾脏、脑膜等组织中病理聚集，形成不溶性淀粉样沉积，导致转甲状腺素蛋白淀粉样变性(transthyretin amyloidosis，ATTR)疾病的发生。研究报道，ATTR疾病具有发病率低、进行性加重、临床表现多样、临床诊断及鉴别诊断难度大等特点，确诊后患者的生存期一般仅有2-12年，并且大部分患者会死于心脏受累。
目前，在临床上对于ATTR疾病的治疗中，肝脏移植已经成为一线的治疗方法，移植不仅可以使变异的TTR减少，同时也能提高总体生存率。但肝脏移植存在供体短缺、手术风险、急性排斥反应、需长期使用免疫抑制剂、受患者病情限制等影响。近年来，鉴于蛋白的表达与纯化技术和蛋白稳定性研究技术的日益成熟，越来越多的研究团队将ATTR疾病的治疗策略集中于抑制TTR四聚体的解离，即减缓淀粉样物质的形成速率。因此，TTR蛋白的高效纯化方案对于疾病的研究和治疗具有显著的现实意义和应用价值。
目前，已报道的TTR蛋白提取纯化方法(EP0711786A2、US5310878A1)，公开了一种纯化人血浆前白蛋白的方法，该方法需在特定的环境下，运用包括离子交换、免疫扩散、亲和层析、分子排阻层析以及多步缓冲液置换、浓缩在内的11步提取方法。此外，CN103833843A也公开了一种从正常人血浆中提取纯化前白蛋白PA的方法，该方法需采用溶液萃取、缓冲液置换透析，以及AKTA系统中三种层析柱的纯化。以上这些方法都是直接从人血浆中提取并纯化TTR蛋白，其步骤繁琐，且操作复杂，难以满足工业生产或临床研究的需求。
发明内容
鉴于目前TTR蛋白纯化存在的局限性，本发明提供一种全新的TTR纯化方法，该通过化学合成和双酶切的方法得到TTR重组质粒，诱导蛋白大量表达后，通过盐析、缓冲液置换透析、阴离子交换柱等步骤，对TTR蛋白进行初步纯化，再配合凝胶过滤层析柱最终得到了高度纯化的TTR蛋白。该方法的建立，不仅大大节约了宝贵的血浆资源，同时也大力推进了对ATTR疾病的发病机制及治疗相关研究的进展。
为实现上述技术效果，本发明具体提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种克隆、表达、分离纯化转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)的方法，该方法包括以下步骤：
(1)TTR基因的克隆：
通过拼接化学合成并纯化的TTR基因载体，设计出NdeⅠ-TTR-Xho I序列并进行PCR扩增。优选的，所述NdeⅠ-TTR-Xho I序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
(2)重组表达质粒的构建：
用限制酶消化表达载体，将TTR编码序列插入载体相应位点，获得重组表达质粒。
(3)TTR蛋白的表达与纯化：
将转入重组表达质粒的感受态BL21(DE3)在37℃培养，加入IPTG诱导蛋白表达，然后进行超声波细胞破碎、盐析和透析，再用强阴离子交换层析柱和凝胶过滤层析柱纯化TTR蛋白。
在一种实施方式中，步骤(1)中，其中N端和C端的酶切位点分别为NdeⅠ和Xho I。
在一种实施方式中，化学合成的TTR基因片段长度为396bp。
在一种实施方式中，步骤(2)中，表达载体为pET-29b(+)。
在一种实施方式中，步骤(3)中，IPTG浓度为0.2-2mM。
在一种实施方式中，步骤(3)中，所述的超声波细胞破碎的条件为100-200W、1s、停5s；细菌裂解液为50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5。
在一种实施方式中，步骤(3)中，盐析所用的试剂为硫酸铵。
在一种实施方式中，步骤(3)中，所述的强阴离子交换层析柱和缓冲液的条件如下：
层析柱：50mL Source 15Q。
阴离子交换缓冲液A：25mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0。
洗脱缓冲液B：350mM NaCl。
在一种实施方式中，步骤(3)中，强阴离子交换层析纯化TTR蛋白的条件为：50mL A液冲洗层析柱；B液进行线性梯度洗脱(160mL，50-350mM)，后用B液冲洗。
在一种实施方式中，步骤(3)中，所述的凝胶过滤层析柱和缓冲液的条件如下：
层析柱：120mL Supperdex 200。
SEC缓冲液：10mM sodium phosphate，100mM KCl，1mM EDTA，pH 7.4。
在一种实施方式中，步骤(3)中，凝胶过滤层析纯化TTR蛋白的条件为：洗脱流速为1mL/min，SEC缓冲液洗脱体积120mL。
本发明相对于现有技术获得了如下优益的技术效果：
(1)建立了能够用于大量表达TTR蛋白的原核生物基因表达系统；
(2)利用蛋白质的盐析特性，通过两次沉淀纯化，极大的减少了杂蛋白；
(3)基于AKTA蛋白纯化系统，操作简便，同时实现了样品的自动洗涤、在线监测、实时观察等多个步骤，能够及时根据样品情况和后续对纯化样本的要求来调整纯化过程。
附图说明
图1强阴离子交换层析纯化TTR图谱；
图2凝胶过滤层析纯化TTR图谱；
图3TTR蛋白纯化后的电泳结果图；其中，从左到右，通道1为蛋白Marker；通道2为强阴离子交换层析纯化后样品；通道3为凝胶过滤层析纯化后样品；
图4UPLC纯度检测；
图5质谱分析TTR的分子量大小；
图6四聚体TTR蛋白活性的结果示意图。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明做进一步说明，实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
下述的实施例中所使用的实验方法无特殊说明均为常规方法。
下述的实施例中所使用的实验耗材等无特殊说明均可从商业用途购买。
实施例1：重组克隆载体NdeⅠ-TTR-Xho I的构建
1.TTR的引物设计
以pET-29b(+)为模板，通过拼接化学合成并纯化的TTR基因载体，设计出NdeⅠ-TTR-Xho I序列并进行PCR扩增，所述NdeⅠ-TTR-Xho I序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列由内切酶位点NdeⅠ-TTR蛋白编码序列-内切酶位点Xho I组成。
2.NdeⅠ-TTR-Xho I与酶切后的pET-29b(+)质粒模板克隆连接
取1μL NdeⅠ-TTR-Xho I，加入2μL酶切后的pET-29b(+)质粒模板，再加入5μL的连接缓冲液，2μL无菌水补足至10μL体系，于16℃连接2h。
3.pET-29b(+)-TTR质粒模板克隆转化
将上述连接产物2μL转移到50μLDH5α感受态细胞中，冰上静置30min；42℃热激45s；冰上再静置5min；加入450μL LB(Tryptone 10g/L，Yeast extract 5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.5)，37℃摇床220rpm摇1h；4000rpm离心3min；在超净台中移去大部分上清，轻悬沉淀，涂布于含有50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板中；LB平板倒置于37℃培养箱培养过夜。
4.pET-29b(+)-TTR克隆的鉴定
随机挑选4个阳性克隆，接入4mL LB(Kan+)中；37℃摇床220rpm摇过夜；抽提质粒pET-29b(+)-TTR，保存于-80℃，并以T7引物进质粒测序。
实施例2：重组表达质粒pET-29b(+)-TTR的构建
1.酶切与回收
TTR基因序列中加入有NdeⅠ与Xho I酶切位点，用NdeⅠ与Xho I双酶切NdeⅠ-TTR-Xho I及pET-29b(+)质粒，用1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目标片段。
2.T4 DNA连接酶连接及转化
连接体系为：1μL 10×连接酶缓冲液，1μL 10双酶切pET-29b(+)质粒，7μL NdeⅠ-TTR-Xho I片段，1μL T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。
将连接产物转入DH5α感受态，转化后涂布于含50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
3.阳性克隆鉴定
随机挑选4个阳性克隆，接入4mL LB(Kan+)中；37℃摇床220rpm摇过夜；抽提质粒进行T7引物引导的质粒测序。
实施例3：TTR蛋白的诱导表达
1.材料与试剂
卡那霉素：碧云天，中国
异丙基硫代半乳糖苷：碧云天，中国
2.仪器和设备：
培养箱：Thermo，美国
UV-5100紫外可见光广度计：上海无析仪器有限公司，中国
3.实验步骤：
(1)重组质粒转化大肠杆菌
将重组质粒pET-29b(+)-TTR转入感受态BL21(DE3)，涂布于含有卡那霉素(Kan)的LB平板上，37℃倒置培养过夜。
(2)异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达
挑取重组菌的单菌落接种于LB(Kan+)中，37℃摇床，220rpm培养过夜；再按照1:20-40比例接种2L LB(Kan+)，37℃摇床、220rpm培养至OD600nm达到0.6-0.8时，加入IPTG(0.2-2mM)以诱导蛋白表达。
实施例4：TTR蛋白的纯化与鉴定
1.材料与试剂
Tris：碧云天，中国
EDTA：碧云天，中国
NaCl：西陇科学股份有限公司，中国
考马斯亮蓝G250：碧云天，中国
2.仪器和设备：
PH计：MettlerToledo，瑞士
低温冷冻离心机：Thermo，美国
超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司，中国
磁力搅拌器：大龙兴创实验仪器有限公司，中国
蛋白纯化仪：AKTA，美国
电泳仪：北京六一生物科技有限公司，中国
AB Sciex 5800MALDI-TOF/TOFTM仪：AB SCIEX,USA
多功能酶标仪：Tecan，瑞士
3.TTR蛋白的诱导表达
挑取重组菌的单菌落接种于LB(Kan+)中，37℃摇床，220rpm培养过夜；再按照1:20-40比例接种2L LB(Kan+)，37℃摇床、220rpm培养至OD600nm达到0.6-0.8时，加入IPTG(0.2-2mM)以诱导蛋白表达。
4℃，4000g，离心30min，弃去上清液，沉淀用细菌裂解液悬浮。
4.细胞破碎、盐析与透析
将上述菌液通过超声波充分裂解，然后将破碎后的菌液于4℃离心机内，转速为16000g离心30min。弃去沉淀，上清液进行硫酸铵盐析。最终将离心后的沉淀悬浮于40mL阴离子交换缓冲液A(25mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)中，并在4℃条件下用缓冲液A透析过夜。
5.强阴离子交换层析纯化TTR
50mL Source 15Q强阴离子交换层析：A液(25mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)，B液(350mM NaCl)；待纯化组分泵入层析柱后，首先在AKTATM快速蛋白层析仪purifier100系统上用50mL A液冲洗层析柱，洗掉非特异性吸附的杂蛋白，然后设定程序，B液进行线性梯度洗脱(160mL，50-350mM)，后用B液冲洗(50mL，350mM)。洗脱峰中含TTR，收集吸收峰二，即TTR洗脱液约25mL，弃峰一，其图谱结果见附图1。取样进行SDS-PAGE，结果见图3。
6.凝胶过滤层析纯化TTR
120mL Supperdex 200凝胶过滤层析柱：SEC缓冲液(10mM sodium phosphate，100mM KCl，1mM EDTA，pH 7.4)；纯化条件为：待纯化组分泵入层析柱后，洗脱流速为1mL/min，SEC缓冲液洗脱120mL，收集最大的吸收峰组分15mL，得到高纯度的TTR，其图谱结果见附图2。取样进行SDS-PAGE，见附图3，结果显示经凝胶过滤层析纯化后，TTR蛋白纯度得到进一步提高；其中，从左到右，通道1为蛋白Marker；通道2为强阴离子交换层析纯化后样品；通道3为凝胶过滤层析纯化后样品。
7.纯化TTR纯度的鉴定
SDS-PAGE凝胶电泳经激光灰度扫描仪测定其纯度达到99％及以上，且显示纯化的TTR蛋白单体的分子质量约为14kDa，结果见附图3。此外，UPLC纯度鉴定结果也显示为单一峰，结果见附图4，并且通过计算峰面积的百分比得到TTR蛋白的纯度可高达99.5％。
8.TTR的分子量大小分析
本实施例得到的TTR蛋白终产物，经脱盐处理后，通过AB Sciex 5800MALDI-TOF/TOFTM质谱仪检测以确定其分子量，结果如附图5所示，表明纯化得到的TTR蛋白的单体分子量约为14kDa。与SDS-PAGE的单体TTR分子量结果相符。
9.纯化TTR蛋白的活性分析
为了对纯化TTR蛋白进行活性分析，先将终产物TTR蛋白配制成不同浓度梯度的溶液，即0、0.5、1、2.5、5、10μM，分别向其中加入定量的只与四聚体TTR结合的荧光小分子A2(S-(4-fluorophenyl)(E)-3-(dimethylamino)-5-(4-hydroxy-3,5-dimethylstyryl)benzothioate)[Choi S,Ong DS,Kelly JW.“Astilbene that binds selectively totransthyretin in cells and remains dark until it undergoes a chemoselectivereaction to create abrightblue fluorescent conjugate”J.Am.Chem.Soc.2010；132:16043-16051]，进行孵育，随后使用激发光328nm、发射光430nm的条件下，监测A2修饰的TTR缀合物荧光，每个浓度做3个复孔。最后，以四聚体TTR浓度为横坐标、TTR缀合物荧光强度为纵坐标，建立线性回归模型。结果显示，所有点均落在线性回归趋势线上，且R2为0.9989，二者具有较高的线性关系，表明纯化的四聚体TTR蛋白具有极高的活性。
应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQ ID NO:1
CATATGGGTCCTACGGGCACCGGTGAATCCAAGTGTCCTCTGATGGTCAAAGTTCTAGATGCTGTCCGAGGCAGTCCTGCCATCAATGTGGCCGTGCATGTGTTCAGAAAGGCTGCTGATGACACCTGGGAGCCATTTGCCTCTGGGAAAACCAGTGAGTCTGGAGAGCTGCATGGGCTCACAACTGAGGAGGAATTTGTAGAAGGGATATACAAAGTGGAAATAGACACCAAATCTTACTGGAAGGCACTTGGCATCTCCCCATTCCATGAGCATGCAGAGGTGGTATTCACAGCCAACGACTCCGGCCCCCGCCGCTACACCATTGCCGCCCTGCTGAGCCCCTACTCCTATTCCACCACGGCTGTCGTCACCAATCCCAAGGAATGACTCGAG
序列表
<110> 大连润生康泰医学检验实验室有限公司
<120> 一种转甲状腺素蛋白基因的克隆、表达与纯化方法
<130> CP211042
<141> 2021-11-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catatgggtc ctacgggcac cggtgaatcc aagtgtcctc tgatggtcaa agttctagat 60
gctgtccgag gcagtcctgc catcaatgtg gccgtgcatg tgttcagaaa ggctgctgat 120
gacacctggg agccatttgc ctctgggaaa accagtgagt ctggagagct gcatgggctc 180
acaactgagg aggaatttgt agaagggata tacaaagtgg aaatagacac caaatcttac 240
tggaaggcac ttggcatctc cccattccat gagcatgcag aggtggtatt cacagccaac 300
gactccggcc cccgccgcta caccattgcc gccctgctga gcccctactc ctattccacc 360
acggctgtcg tcaccaatcc caaggaatga ctcgag 396

Claims (10)

1.一种转甲状腺素蛋白基因(TTR)的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)TTR基因的克隆：
通过拼接化学合成并纯化的TTR基因载体，设计出NdeⅠ-TTR-Xho I序列并进行PCR扩增。
(2)重组表达质粒的构建：
用限制酶消化表达载体，将TTR编码序列插入载体相应位点，获得重组表达质粒。
(3)TTR蛋白的表达与纯化：
将转入所述重组表达质粒的BL21(DE3)感受态大肠杆菌在37℃培养，加入IPTG诱导蛋白表达，然后进行超声波细胞破碎、盐析和透析，再用强阴离子交换层析柱和凝胶过滤层析柱纯化TTR蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NdeⅠ-TTR-Xho I序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述载体为pET-29b(+)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，IPTG浓度为0.2-2mM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的超声波细胞破碎的条件为100-200W、1s、停5s；细菌裂解液为50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，盐析所用的试剂为硫酸铵。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的强阴离子交换层析柱和缓冲液的条件如下：
层析柱：50mL Source 15Q；
阴离子交换缓冲液A：25mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0。
洗脱缓冲液B：350mM NaCl。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，强阴离子交换层析纯化TTR蛋白的条件为：50mL A液冲洗层析柱；B液进行线性梯度洗脱，洗脱条件为160mL，50-350mM，后用B液冲洗。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的凝胶过滤层析柱和缓冲液的条件如下：
层析柱：120mL Supperdex 200。
缓冲液：10mM sodium phosphate，100mM KCl，1mM EDTA，pH 7.4，所述缓冲液为SEC缓冲液。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，凝胶过滤层析纯化TTR蛋白的条件为：洗脱流速为1mL/min，SEC缓冲液洗脱体积120mL。
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