CN114891663B - 植物乳杆菌lp1406及分离培养方法 - Google Patents

植物乳杆菌lp1406及分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种可以发酵降解海带的植物乳杆菌的培养方法。所述的植物乳杆菌于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M20211500。本发明提供的植物乳杆的培养方法，包括以下的步骤：S1：植物乳杆菌的分离及培养；S2：发酵海带的植物乳杆菌的菌筛选；S3：海带发酵；S4:发酵效果评价。本发明提供的植物乳杆菌，能够利用天然海带进行快速生长，其发酵海带性能优异，且代谢物的产量增加，为发酵海带提高海带生物活性提供了一种新的微生物处理方法；本发明的菌株，发酵海带效果显著，可使发酵后样品中的抗氧化和降血糖活性提升，ABTS的抑制能力为82%，α‑葡萄糖苷酶的抑制能力达到75.40%。

Description

植物乳杆菌LP1406及分离培养方法
技术领域
本发明属于微生物培养领域，具体涉及一种植物乳杆菌，还涉及上述的植物乳杆菌的培养方法。
背景技术
植物乳杆菌是乳杆菌科中的一种乳杆菌属，能在各种环境中生存，与人类生活密切相关。植物乳杆菌具有很强的抗酸能力,且大部分可耐受5%浓度以上的NaCl。具有繁殖快，生长周期短，且菌体营养丰富等特点。其生理功能主要有免疫调节，拮抗致病菌，降低胆固醇，降血糖，预防心脑血管等，是应用广泛的一种益生菌。此外，植物乳杆菌酶系丰富，代谢旺盛，具有利用海带成分进行发酵的潜力。乳酸菌降血糖机制主要通过调节人体肠道平衡和机体的免疫功能、提高抗氧化能力、调节糖代谢和脂代谢等方面作用，降低血糖水平。
关于植物乳杆菌的应用，以下的专利文献进行过披露：
CN114231473A一株益生植物乳杆菌及其在低盐发酵肉食品制备中的应用；CN114196600A一种对肠易激综合征具有缓解作用的植物乳杆菌及其应用；CN114134089A一种具有高活性的复合菌剂及其在食品生产中的应用。关于植物乳杆菌应用于海带降解中的文献，鲜有披露。
海带含有丰富的化学成分和生物活性物质，还含有海带中含有丰富的褐藻多糖，在功能性食品和药品的加工应用中具有非常高的价值，此外还含有多种维生素和矿物质等。研究证明，海带具有降血脂、降血糖、调节免疫、抗凝血、抗肿瘤、排铅解毒和抗氧化等多种生物学功能。但我国海带产业仍处在以传统的粗放加工及初级加工品为主的低附加值和低效益的初级状态，海带产业的发展空间还远远没有发掘出来。
因此，创新性发展海带加工发酵产业，研发具有营养保健价值的海带产品，符合健康中国战略需求，促进海带产业链持续发展。若是寻找并培养一种合适的植物乳杆菌，使其能够发酵降解海带并提高发酵对海带降血糖和抗氧化功能，必然为海带的精深加工提供规模化生产和应用的基础。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了能利用天然海带快速生长、且具有降解海藻酸能力的植物乳杆菌LP1406，通过该植物乳杆菌LP1406能够提高海带发酵样品降糖和抗氧化能力，为海带的精深加工提供了良好的基础。
本发明还提供了上述菌株在发酵海带中应用的具体方法，并且对应用后所获得的产品的降糖、抗氧化能力进行了评价。
本发明所述及的植物乳杆菌LP1406，于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏编号CCTCC NO：M20211500，分类命名为：植物乳杆菌LP1406 Lactiplantibacillus plantarumLP1406。
本发明的植物乳杆菌LP1406（以下简称植物乳杆菌）的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，在MRS培养基中于37℃培养24h后，表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色；菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一；菌体细胞杆状，单个或成链；革兰氏染色呈阳性，H2O2实验阳性，甲基红试验阳性，明胶液化实验阳性，V.P.实验阴性，硫化氢实验阴性，氧化酶实验阴性，葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖实验均为阳性；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌具有明显的抑菌效果；pH耐受范围2.0-6.0。
在分离及培养植物乳杆菌时，采用的是固体MRS培养基，含有：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20g/L，柠檬酸铵2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.75g/L，吐温80 1mL，四水硫酸锰0.25g/L。
植物乳杆菌LP1406在发酵海藻制品中的应用，尤其是在发酵海带中的应用，是本发明所要重点保护的内容。
植物乳杆菌LP1406在发酵海带中的应用，其具体的步骤是：首先，筛选发酵海带的植物乳杆菌，然后再发酵海带；
筛选发酵海带的植物乳杆菌时，将固体平板上的单菌落接种于种子培养基中培养，然后再接种在海带酶解液培养基中培养；所述的种子培养基为液体MRS培养基，含有：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L,葡萄糖20g/L，柠檬酸铵2g/L.七水硫酸镁0.58g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.75g/L，吐温80 1mL，四水硫酸锰0.25g/L；
海带酶解液培养基的制备方法如下：海带经水洗、干燥、研磨，将粉末通过40目筛，收集，然后以1:50 (w/v)的比例溶解在蒸馏水中，将pH调至4.8，加入纤维素酶和果胶酶进行酶解，纤维素酶和果胶酶的添加量分别为2.5wt%和0.26 wt%，在50℃搅拌反应溶液2小时，调整pH至8.0后，加入0.3wt%碱性果胶酶，在60℃再孵育1.5小时，最后，将反应产物离心，收集酶解上清液为海带酶解液；
发酵海带时，将MRS平板上的单菌落接种于种子培养基中，在37℃下培养24h；然后按照5%-10%的接种量接种于海带酶解液培养基中，在37℃下培养48h。
发酵海带时，将MRS平板上的单菌落接种于种子培养基中，在37℃下培养24h；然后按照5%-10%的接种量接种于海带发酵培养基时，先将海带酶解液中补葡萄糖至3%，121℃灭菌20min后接入3%含量的植物乳杆菌置于37℃静置培养，发酵时间为48h。
利用植物乳杆菌LP1406发酵海带的方法，包括以下的步骤：
S1：植物乳杆菌的分离及培养
在分离及培养植物乳杆菌时，具体步骤为：
（1）取1mL奶制品，放入装有9mL生理盐水的试管中，涡旋振荡器充分涡旋振荡，使样品充分混合均匀；
（2）用移液枪充分吸取混合后的样品1mL，加入含有9mL生理盐水的试管中，依次类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的悬液；
（3）用移液枪从浓度为10-2，10-4，10-6的试管中充分吸取0.1mL混合液,分别稀释涂布于已灭菌的固体MRS培养基中，37℃培养24h；
（4）培养结束后，观察菌落形态，挑取乳白色光滑湿润的单菌落进行镜检；
（5）镜检为杆状的菌落进行分离纯化培养，待菌落长好后，检查是否有杂菌，若有则需再一次进行分离纯化，直到获得纯菌株培养物；
S2：发酵海带的植物乳杆菌的筛选
筛选发酵海带的植物乳杆菌，具体步骤为：将固体平板上的单菌落接种于种子培养基中，在37℃下培养24h，然后按照5-10%的接种量接种于筛选培养基中，在37℃下培养40-60h；
S3：发酵海带
发酵海带，具体操作步骤为：将MRS平板上的单菌落接种于种子培养基中，在37℃下培养24h；然后按照5%-10%的接种量接种于海带发酵培养基时，先将海带酶解液中补葡萄糖至3%，121℃灭菌20min后接入3%含量的植物乳杆菌置于37℃，静置培养，发酵时间为48h。
本发明的有益效果是：
（1）本发明提供的植物乳杆菌LP1406，能够快速的对天然海带进行发酵，并且在发酵过程中，具有强大的降解海藻酸的能力；
（2）获得的发酵产品具有优异的降糖和抗氧化的能力，通过体外降血糖评价和体外抗氧化实验，结果表明，本发明的发酵产品对α-葡萄糖苷酶的抑制能力达到75.40%、对ABTS的抑制率为82%，这是普通的植物乳杆菌所远远不能达到的效果；
（3）本发明提供的植物乳杆菌发酵降解海带，与传统方法相比，高效、节能、省时、操作简单可实现高附加值的生产。
附图说明
图1为植物乳杆菌的菌落形态照片；
图2为植物乳杆菌的镜检照片。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
本发明所提供的植物乳杆菌，于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20211500。
实施例1
植物乳杆菌的培养方法，包括以下的步骤：
S1：植物乳杆菌的分离及培养
在分离及培养植物乳杆菌时，具体步骤为：
（1）取1mL奶制品，放入装有9mL生理盐水的试管中，涡旋振荡器充分涡旋振荡，使样品充分混合均匀；
（2）用移液枪充分吸取混合后的样品1mL，加入含有9mL生理盐水的试管中，依次类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的悬液；
（3）用移液枪从浓度为10-2，10-4，10-6的试管中充分吸取0.1mL混合液,分别稀释涂布于已灭菌的固体MRS培养基中，37℃培养24h；
固体MRS培养基中，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L,葡萄糖20g/L，柠檬酸铵2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.75g/L，吐温801mL，四水硫酸锰0.25g/L；
接种环经过酒精灯灼烧冷却后，挑取一环菌落，将平板置于酒精灯旁用接种环按“Z”划3-4条连续的直线。然后灼烧菌种环冷却，转动平板从第一个划线区域的末端在另一个区域按同样方法划线，划3-4个区域。划线结束后，于37℃恒温培养箱中倒置培养24h；
（4）培养结束后，观察菌落形态，挑取乳白色光滑湿润的单菌落进行镜检；
（5）镜检为杆状的菌落进行分离纯化培养，待菌落长好后，检查是否有杂菌，若有则需再一次进行分离纯化，直到获得纯菌株培养物。
（6）符合条件的菌落进行16S rDNA测序分析，测序结果用BLAST进行比对，获得植物乳杆菌。
实施例2
植物乳杆菌的保藏方法如下：
将植物乳杆菌接种于液体培养基中培养至对数期，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。取1mL灭菌甘油放入与菌液充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-80℃下冻存。
上述保藏方法的液体培养基如下组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L,葡萄糖20g/L，柠檬酸铵2g/L.七水硫酸镁0.58g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.75g/L，吐温80 1mL，四水硫酸锰0.25g/L。
实施例3
植物乳杆菌纯化方法如下：
在超净台用经酒精灼烧后的接种环挑取分离得到的单菌落，接种于植物乳杆菌固体培养基平板，37℃恒温培养24h停止培养。通过观察菌落形态及镜检等方法检查是否有杂菌，如有杂菌，继续挑取单菌落纯化，直至获得植物乳杆菌的纯培养物。
通过上述方法获得的植物乳杆菌的特点如下：
革兰氏染色呈阳性，H2O2实验阳性，甲基红试验阳性，明胶液化实验阳性，V.P.实验阴性，硫化氢实验阴性，氧化酶实验阴性，葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖实验均为阳性。对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌具有明显的抑菌效果；pH耐受范围2.0-6.0。
实施例4.1
通过向海带酶解液中添加植物乳杆菌，来验证植物乳杆菌对海带发酵后抗氧化及降血糖的效果。
具体的步骤如下：
S2：筛选发酵海带的植物乳杆菌
筛选发酵海带的植物乳杆菌，具体步骤为：将固体平板上的单菌落接种于种子培养基中，在37℃下培养24h，然后按照5-10%的接种量接种于筛选培养基（海带酶解液）中，在37℃下培养40-60h；
以上的种子培养基为液体MRS培养基，其中包含：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L,葡萄糖20g/L，柠檬酸铵2g/L.七水硫酸镁0.58g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.75g/L，吐温80 1mL，四水硫酸锰0.25g/L；
S3：发酵海带
发酵海带，具体操作步骤为：将MRS平板上的单菌落接种于种子培养基中，在37℃下培养24h；然后按照5%-10%的接种量接种于海带发酵培养基时，先将海带酶解液中补葡萄糖至3%，121℃灭菌20min后接入3%含量的植物乳杆菌置于37℃，静置培养，发酵时间为48h；
以上的S2和S3中，海带酶解液的具体制备工艺如下：海带经水洗、干燥、研磨，将粉末通过40目筛，收集，然后以1:50 (w/v)的比例溶解在蒸馏水中，将pH调至4.8，加入纤维素酶和果胶酶进行酶解，纤维素酶和果胶酶的添加量分别为2.5wt%和0.26 wt%，在50℃搅拌反应溶液2小时，调整pH至8.0后，加入0.3wt%碱性果胶酶，在60℃再孵育1.5小时，最后，将反应产物离心，收集酶解上清液为海带酶解液。
通过上述的工艺所获得的发酵产品，对其进行发酵效果评价。
发酵效果评价主要是从体外降血糖评价和体外抗氧化这两个方面来进行：
关于体外降血糖评价和体外抗氧化评价，具体的步骤如下：
体外降血糖评价具体操作方法为：将发酵海带样品分别溶解在pH6.8的PBS中，然后将样品稀释成不同浓度于试管中，分别加入0.2U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，将试管在37℃的水浴锅中预热40min，预热结束后向试管中加入PNPG底物发生反应，反应温度为37℃，反应时间为20min，最后向试管中加入3倍液体体积的1mol/L碳酸钠溶液终止反应。测定α-葡萄糖苷酶抑制率；
体外抗氧化实验具体操作方法为：通过将ABTS储备溶液（7 mM）和过硫酸钾溶液（4.9 mM）以1：1的比例混合制备工作溶液；将混合物在黑暗中于室温孵育过夜；之后，用蒸馏水稀释，在734nm下的吸光度为0.7±0.02；将样品与ABTS工作溶液混合，在室温下于黑暗中放置8分钟，然后用分光光度计在734 nm处记录吸光度，并置空白和抗坏血酸阳性对照。
具体的步骤如下：
发酵样品对ABTS的清除效率分别可达到87.63%，对α-葡萄糖苷酶的抑制能力分别可达到80.40%。
结果表明，通过植物乳杆菌发酵海带，发酵后样品抗氧化及降血糖能力有显著提升。
实施例4.2
海带酶解液中补葡萄糖至3%，121℃灭菌20min后接入3%含量的植物乳杆菌置于37℃、180 r/min 摇床培养，发酵时间为36h。发酵样品对ABTS的清除效率分别可达到80.63%，对α-葡萄糖苷酶的抑制能力分别可达到76.40%。
实施例4.3
海带酶解液中补葡萄糖至3%，121℃灭菌20min后接入3%含量的植物乳杆菌置于37℃静置培养，发酵时间为72h。发酵样品对ABTS的清除效率分别可达到77.21%，对α-葡萄糖苷酶的抑制能力分别可达到73.25%。
对比例
从以上表格中的数据可以看出，本发明的产品无论是ABTS的清除效率，还是对α-葡萄糖苷酶的抑制能力均要远远的优于其它的菌种。
序列表
<110> 山东筱萤生物科技有限公司
齐鲁工业大学
山东卓苒生物科技有限公司
笙笙向荣生物科技（山东）有限公司
山东晨彰生物科技有限公司
<120> 植物乳杆菌LP1406及分离培养方法
<141> 2022-04-13
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌 LP1406(Lactiplantibacillus plantarum LP1406)
<400> 1
cctaatacat gcagtcgaac gaactctggt attgattggt gcttgcatca tgatttacat 60
ttgagtgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc tgcccagaag cgggggataa 120
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gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct 1260
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ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg gtaacctttt aggaaccagc 1440
ctgctaaggt gacaa 1455

Claims (1)

1.植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LP1406在发酵海带中的应用，其特征在于，利用所述植物乳杆菌LP1406发酵海带提高发酵产品的抗氧化及降血糖的功效；
所述的植物乳杆菌LP1406，于2021年11月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 20211500，分类命名为：植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LP1406；
发酵海带的具体步骤如下：
将MRS平板上的植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LP1406单菌落接种于种子培养基中，在37℃下培养24h；然后按照5%-10%的接种量接种于海带发酵培养基时，先将海带酶解液中补葡萄糖至3%，121℃灭菌20min后接入植物乳杆菌LP1406置于37℃静置培养，发酵时间为48h；
所述的海带酶解液的具体制备工艺如下：海带经水洗、干燥、研磨，将粉末通过40目筛，收集，然后以1:50（w/v）的比例溶解在蒸馏水中，将pH调至4.8，加入纤维素酶和果胶酶进行酶解，纤维素酶和果胶酶的添加量分别为2.5wt%和0.26 wt%，在50℃下搅拌反应溶液2小时，调整pH至8.0后，加入0.3wt%碱性果胶酶，在60℃再孵育1.5小时，最后，将反应产物离心，收集酶解上清液为海带酶解液。
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