CN114934112B - CaMKKβ及其抑制剂在制备诊断、预防、治疗多类型听力损失的产品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CaMKKβ及其抑制剂在制备诊断、预防、治疗多类型听力损失的产品中的用途。CaMKKβ可作为一种标志物，以诊断毛细胞损失和听力损失；通过抑制CaMKKβ，可显著保护外毛细胞、内毛细胞免受噪声性暴露导致的损失，对噪音性听力损失起到预防作用；除了噪声性听力损失外，通过抑制、沉默CAMKKβ，还可起到对氨基糖苷类药物耳毒性副作用的预防、减弱作用，可应用于多种类型听力损失中实现诊断、预防和治疗作用。从而为现有技术提供有效的听力损失预防、治疗药物，更能配合氨基糖苷类药物，克服其耳毒性副作用，促进氨基糖苷类药物在各类病症上的使用。

Description

CaMKKβ及其抑制剂在制备诊断、预防、治疗多类型听力损失的 产品中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种CaMKKβ及其抑制剂在制备诊断、预防、治疗多类型听力损失的产品中的用途。

背景技术

根据世界卫生组织报告，目前，世界上已有5%的人口患有听力损失，且预计到2050年，每10人中就有1人会出现某种程度的听力损失。获得性听力损失会在一生中累积，通常由噪音暴露等伤害或使用氨基糖苷类抗生素等耳毒性药物治疗引起的。与功能缺陷相对应的，感觉毛细胞的损失是获得性听力损失的主要病理。由于哺乳动物的毛细胞不会再生，因此这种听力损失是永久性的。听力损失会给患者带来生活不便和痛苦，且也需要患者耗费较多成本以治疗，针对听力损失以预防或治疗是目前个人健康领域亟需解决的一个问题。然而，尚无用于预防或减轻获得性听力损失的既定药物治疗。一方面，是由于响应有害挑战的感觉毛细胞死亡途径的复杂性和潜在分子靶标的不确定性；另一方面，是预防听力损失药物的最佳输送途径，因为内耳有血迷路屏障(BLB)，限制化合物进入内耳组织(Nyberg等人，2019)。因此，现有技术亟需提出一种有效预防噪音暴露或氨基糖苷类药物所致耳毒性的药物或治疗策略。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种CaMKKβ及其抑制剂在制备诊断、预防、治疗多类型听力损失的产品中的用途。CaMKKβ可作为一种标志物，以诊断毛细胞损失和听力损失，且通过抑制CaMKKβ，可显著保护外毛细胞、内毛细胞免受噪声性暴露导致的损失，对噪音性听力损失起到预防作用；除了噪声性听力损失外，通过抑制、沉默CAMKKβ，还可起到对氨基糖苷类药物耳毒性副作用的预防、减弱作用，可应用于多种类型听力损失中实现诊断、预防和治疗作用。

本发明的一个目的在于提供一种外毛细胞和/或内毛细胞损失病症的标志物，为相对上调的CaMKKβ。在本发明的一个以上实施例中，检测发现创伤性噪声暴露激活外毛细胞中的 CaMKKβ；创伤性噪声暴露会增加外毛细胞中CaMKKβ的mRNA 和蛋白质水平。实际上基于该上调的mRNA、蛋白质，其作为一种创伤性噪声暴露及毛细胞损失的标志物，可应用于诊断过程中。

本发明的又一目的在于提供CaMKKβ抑制剂在制备预防、治疗耳毒性的产品中的用途。

进一步地，CaMKKβ抑制剂包括siRNA、shRNA和/或KN93。

进一步地，shRNA序列包括5'-CCGGGTATCCACTTGGGCATGGAATCTCGAGATTCCATGCCCAAGTGGATACTTTTTG-3'。

本发明的再一目的在于提供一种预防、治疗耳毒性的药物，含有CaMKKβ抑制剂。

本发明的再一目的在于提供上述药物在制备预防、治疗噪声引起的毛细胞损失、噪音性听力损失和/或氨基糖苷类药物所致耳毒性的产品中的用途。

进一步地，噪声引起的毛细胞损失包括内毛细胞突触损失、外毛细胞损失。

进一步地，氨基糖苷类药物包括庆大霉素、那霉素和/或呋塞米。

进一步地，还包括用于输送CaMMKβ的载体。

进一步地，CaMKKβ抑制剂包括shRNA，载体包括腺相关病毒载体。更进一步地，腺相关病毒载体包括AAV2.7m8。在本发明的一个实施例中，AAV 载体可以感染感觉毛细胞，并安全转导相应的CaMKKβ shRNA以起到保护毛细胞的作用。

进一步地，CaMKKβ抑制剂包括siRNA、shRNA和/或KN93。在本发明的一个以上实施例中，通过siRNA或shRNA以抑制CaMKKβ，能够有效的输送到靶标位置并起效，且安全性高。通过局部药物输送，安全性更高于常规的化合物全身治疗。

本发明的再一目的在于提供一种药物组合物，其特征在于，包括CaMKKβ抑制剂和氨基糖苷类药物。

进一步地，氨基糖苷类药物包括庆大霉素、那霉素和/或呋塞米。

本发明的再一目的在于提供CaMKKβ抑制剂在制备抑制噪声对外毛细胞AMPKα激活的产品中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为： CaMKKβ可作为一种标志物，以诊断毛细胞损失和听力损失；通过抑制CaMKKβ，可显著保护外毛细胞、内毛细胞免受噪声性暴露导致的损失，对噪音性听力损失起到预防作用；除了噪声性听力损失外，通过抑制、沉默CAMKKβ，还可起到对氨基糖苷类药物耳毒性副作用的预防、减弱作用，可应用于多种类型听力损失中实现诊断、预防和治疗作用。从而为现有技术提供有效的听力损失预防、治疗药物，更能配合氨基糖苷类药物，克服其耳毒性副作用，促进氨基糖苷类药物在各类病症上的使用。从而为现有技术提供有效的听力损失预防、治疗药物，更能配合氨基糖苷类药物，克服其耳毒性副作用，促进氨基糖苷类药物在各类病症上的使用。

附图说明

图1显示创伤性噪声暴露激活基底转 OHC 中的 CaMKI。（A） 与未暴露的对照小鼠相比，在创伤噪声暴露完成1-3小时后处理，基底区OHCs中，结构受损OHCs的表皮板显示p-CaMKI（T177，红色）免疫标记。代表性图像显示了基底转相应于56、48和40kHz区域的敏感度，且每个图像代表6只小鼠；PTSN：永久阈值偏移噪声暴露；比例尺 = 10 μm。(A')放大的四个OHCs图，在结构受损的 OHC (2, 3) 中表现有 p-CaMKI (Th177) 免疫标记，但在完整的 OHC (1) 或丢失 OHC 的瘢痕 (4) 中没有；对耳蜗管下基底转（lower basal turn）处表现有 p-CaMKI (Thr177) 免疫标记的 OHCs 计数结果，证实 p-CaMKI (Thr177) 免疫标记 OHCs数量在PTSN 完成后 1-3 小时内显著增加。数据表示为平均值 + SD 并通过非配对 t 检验进行分析。每组中的动物数量显示在条形图中。 p<0.001。

图2显示创伤性噪声暴露会增加 OHC 中的 CaMKKβ mRNA 和蛋白质水平。(A) 代表性图像显示了暴露于 PTSN 的小鼠与未暴露的对照组之间顶端（apex）、中间（middle）、基底转（basal turn）：用CaMKKβ（红点）探测的RNAscope FISH；用肌球蛋白-VIIa（Myo7a，绿色）进行的免疫标记；在暴露于 PTSN 的小鼠暴露后 24 小时用 DAPI（蓝色）染色PTSN组、未暴露对照组（ctrl）。图中，为了更好地可视化，每行的下面板是上面板中白色矩形区域的OHC。图像由 30 个 Z 堆栈投影压缩而成。OHCs：外毛细胞，IHC：内毛细胞。比例尺 = 10 μm。（B） 红点计数显示CaMKKβmRNA 在PTSN暴露后24小时加倍；标签中标明了每组中的动物数量。（C） 与未暴露的对照组相比，PTSN暴露完成24小时后处理（PTSN暴露后24小时）的对应于30-32kHz敏感性的基底转OHC 中，CaMKKβ（红色）的免疫标记似乎更强；放大的OHC可以更好地观察CaMKKβ的点状标记；绿色：鬼笔环肽染色的OHC。比例尺=10μm。（D） OHC中相对CaMKKβ标记（灰度）的半定量分析证实，在24小时检查时显着增加，但在PTSN后1-3小时检查时没有。条形图中显示了每组动物的数量。数据（B和D）以平均值±SD表示，并通过单样本t检验进行分析p<0.05， p<0.01。

图3显示通过腺相关病毒转染应用shCaMKKβ显着降低内耳中CaMKKβ的表达。(A)代表性图像显示 eGFP（绿色）在 AAV 感染感觉毛细胞顶端、中间和基底转弯处的表达；通过免疫标记肌球蛋白VIIa（Myo7a，红色）共定位；在p1-2处将2μlAAV-shControl（shCtrl）或AAV-shCaMKKβ储备溶液（2.5×1013 GCs/mL）显微注射到FVB/NJ小鼠的左耳后，在p21收获耳蜗。eGFP：增强型绿色荧光蛋白，Myo7a：肌球蛋白 VIIa 抗体，用作感觉毛细胞的特异性标记物，shCtrl：乱序 shRNA，AAV-shCtrl：AAV2.7m8-U6-shControl-CMV-eGFP，和AAV-shCaMKKβ：AAV2.7m8-U6-shCaMKKβ-CMV-eGFP。比例尺 = 10 μm。(B) eGFP 阳性感觉毛细胞的计数显示 shCtrl 和 shCaMKKβ 在 OHC 和内毛细胞 (IHC) 中的感染率没有差异，在IHC 中的感染率接近 100%，在OHCs 的中转和基底转感染率为 90%，而 OHCs 顶转（apicalturn）的感染率为 40%。数据表示为平均值 + SD，通过非配对 t 检验进行分析。 ns：无统计学意义。(C) 内耳匀浆的蛋白质印迹结果显示，与 shCtrl 小鼠相比，通过病毒转染shCaMKKβ的小组，CaMKKβ 的表达显着降低了 70%。GAPDH 作为蛋白质上样对照，GFP 作为转染标记。数据以平均值 + SD 表示，通过单因素方差分析和多重比较进行分析。每组中的动物数量在标签 (B) 或条形图 (C) 中显示。(D) 说明了 AAV 载体质粒的示意图和 FVB/NJ 小鼠的实验时间线。

图4显示通过腺相关病毒转染应用 shCaMKKβ，可显着保护 FVB/NJ 小鼠免受噪音引起的 OHC 和 NIHL 损失。(A) 通过 AAV2.7m8 应用 shCaMKKβ 可显着降低噪声引起的OHC 损失；沿着耳蜗螺旋的整个长度计算 OHC 的损失。(B)表面处理显示AAV-shCtrl或aav- shCaMKK β小鼠在暴露后14 d被肌球蛋白via(红色)免疫标记。图像取自距耳蜗顶端5.25毫米处的耳蜗上皮；比例尺= 20 μm。（C） 噪声暴露后14 d，通过ABR测量，与AAV-shCtrl小鼠相比，AAV1153 shCaMKKβ小鼠的噪声诱发听觉阈值偏移显着降低。(D)噪声暴露后14 d，使用shCaMKKβ可以显著逆转噪声降低的DPOAE振幅。数据（A、C 和 D）以平均值 ± SD 表示，通过具有多重比较 (C) 的单向方差分析和具有事后检验的重复测量方差分析 (A 和D) 进行分析。在图中，A 和 D，表示 shCtrl + 噪声暴露与 shCaMKKβ + 噪声暴露之间比较的 p 值。详细的统计值列于表 1（对于图 4A）和表 2（对于图 4D）。每组中的动物数量在标签（A 和 D）中标明或显示为单个点（C）。p<0.05， p<0.01， p<0.001。

图5显示通过鼓室内递送CaMKKβsiRNA以预处理，可减少噪声引起的OHC、IHC突触的损失以及NIHL。(A) 代表性图像显示用 siControl 或 siCaMKKβ 预处理的组中 ，PTSN暴露后 14 天肌球蛋白-VIIa 标记、 DAB 染色的 OHC（棕色）；图像是从距顶点4 mm的基部转弯处拍摄的；比例尺=10μm。(B) 沿耳蜗管整个长度的 OHC 损失计数表明，用 siCaMKKβ预处理显着降低了噪声引起的 OHC 损失。(C) 用 siCaMKKβ 预处理显着降低了 16 和 32kHz 噪声引起的听觉阈值偏移。(D) 用 siCaMKKβ 预处理显着减弱了 8–36 kHz 的 PTS噪声降低的DPOAE 振幅。(E) 代表性图像显示，在完成 PTSN 暴露后 14 天，耳蜗上皮细胞22 kHz 区域中 CtBP2 (红色) 和 GluA2 (绿色) 的免疫标记。图像由 30 个 Z 堆栈投影压缩而成。比例尺 = 10 μm。（F） 对应于6、8、16、22和32 kHz的IHC中CtBP2/GluA2免疫标记突触颗粒的量化，显示PTSN在22和32 kHz时显着降低，而用siCaMKKβ预处理可防止噪声诱导的IHC突触损失。沿耳蜗管的频率相关性如F下部分所示；数据表示为单个品脱（C）和平均值±SD（B）或±SD（D和F），并通过重复测量ANOVA与事后检验（B和D）和单向ANOVA进行多重分析比较（C）。详细的统计值列于图5B的表S3和图5D的表S4中。标签（B，D和F）中标明了每组动物的数量。在图中，B、 D和F，表示siCtrl+PTSN与siCaMKKβ+PTSN之间比较的p值p<0.05， p<0.01， p<0.001， p<0.0001。

图6显示在KM-FU处理后14天评估，通过PSC递送siCaMKKβ以预处理，几乎完全防止KM-FU诱导的OHC损失和听力损失。（A） 在KM+FU处理后14天，在siCtrl和siCaMKKβ两个组别中，顶端、中间和基底转的代表性图像，显示肌球蛋白VIIa标记的、DAB染色的感觉毛细胞；以10倍放大率拍摄图像；放大后的图像显示为63倍，以便更好地显示；比例尺=10μm。（B） 沿耳蜗螺旋整个长度的OHC计数显示，在siCaMKKβ处理的小鼠中，几乎完全预防了KM-FU诱导的OHC丢失；沿着耳蜗管的距离对应于对8,16和32kHz的灵敏度。（C） KM-FU治疗后14天评估，siCaMKKβ（0.3μg或0.6μg）治疗几乎完全阻止了KM-FU诱导的听觉阈值变化。（D） KM-FU处理后14 D评估，siCaMKKβ预处理可完全防止KM-FU降低的DPOAE幅度。数据表示为平均值±SD（B，C和D），通过具有事后检验的重复测量ANOVA（B和D），具有多重比较的单向ANOVA（C）进行分析。详细的统计值列于图6B的表S5和图6D的表S6中。每组中的动物数量在标签（B和D）中指出或作为单独的点（C）呈现。在图D中，表示siCtrl+KM+FU与shCaMKKβ+KM+FU之间比较的p值 p<0.001， p<0.0001，ns：无统计学意义。

图7显示与CaMKKβ抑制剂KN93联合治疗完全防止了庆大霉素诱导的毛细胞损失，并阻断庆大霉素诱导的AIF易位至耳蜗外植体OHC核。（A） 代表性图像显示在四组中施用对照、GM、KN93和GM+KN93后24小时的顶端、中间和基底转中的感觉毛细胞。红色：用于感觉毛细胞的Alexa-594鬼笔环肽染色。（B） 顶端、中间和基底转的OHC损失计数表明，与KN93共同治疗可完全防止GM诱导的中间、基底转中OHC完全丧失以及顶端50%丧失。数据表示为平均值±SD，n=5。（C）使用 KN93 进行 24 小时治疗时 OHC 损失的剂量反应曲线。数据表示为平均值 ± SD，n = 5。（D） 与应用AIF（红色）和DAPI（蓝色）免疫标记染色细胞核的培养基对照相比，在应用GM、KN93和GM+KN93 18小时后从耳蜗外植体的基底转取得的代表性图像。死 OHC 核中的 AIF 标记示例用箭头表示。这些图像代表 5 次重复。比例尺 = 10 μm。（E）使用耳蜗外植体匀浆的蛋白质印迹，与对照相比，施用GM、KN93和GM+KN93 18小时后显示AIF和GAPDH的条带。四组之间的带密度没有差异。数据表示为平均值±SD，n=4。

图8显示CaMKKβ是AMPKα上游的一个激酶。(A)具有代表性的图像显示，暴露后1-3h, ohc中p-AMPKα (T172)升高。(B)对基底弯OHCs中p-AMPKα (T172)的半定量表明，暴露于PTSN后，OHCs显著增加。(C) 代表性图像显示，与暴露后 1-3 小时检查的 siControl 小鼠相比，siCaMKKβ 减少了 PTSN 诱导的 p-AMPKα (T172) 免疫标记 (红色) 增加。（D） 基底转中p-AMPKα（T172）的半定量证实了siCaMKKβ处理的耳蜗显着减少。所有代表性图像均来自基底转，对应于30–32 kHz的灵敏度。绿色：鬼笔环肽染色的OHC。比例尺=10μm。所有条形图的数据均以平均值±SD表示，并通过单样本t检验（B，D和F）进行分析。每组中的动物数量在条形图中表示， p<0.01。

图9显示p-CaMKI (T177) 定位于 OHC 的静纤毛和表皮板，但在创伤性噪声暴露后 1-3 小时检查的 CBA/J 小鼠的整个耳蜗组织匀浆中，p-CaMKI (T177) 或 CaMKKβ 没有变化；(A)共聚焦图像（20个Z叠层）取自下基底转，重建以定位OHCs中的p-CaMKI（T177）。使用蔡司Aim图像浏览器投影功能重建侧视图。 A' 和 A'' 是图像 A 的水平部分的侧视图。三个图像（A、A' 和 A"）中的白框标记着在不同视图中显示的相同 OHC。白色箭头突出显示 p-CaMKI (T177) 的表达仅位于 OHC 的静纤毛和表皮板。比例尺 = 10 µm。

(B) 全耳蜗组织匀浆的蛋白质印迹显示 CaMKKβ 和 p-CaMKI (T177) 的特异性，但与未暴露的对照相比，在噪声暴露后 1-3 小时检查的 CaMKKβ 或 p-CaMKI (T177) 的带密度没有变化。GAPDH 用作加载控制。分子量显示在条带的右侧。 Dara 表示为平均值 +SD，通过非配对 t 检验进行分析（A：t4 = 0.959，p = 0.392，B：t4 = 0.063，p = 0.953）。每组中的动物数量显示在条形图中。

图10显示向 p1-2 FVB/NJ 小鼠注射 AAV-shCtrl 和 AAV-shCaMKKβ 不会影响听觉阈值和 DPOAE 振幅。（A） 在小鼠出生后第21天断奶，检测的所有测试频率（8、16和32kHz）下，三组（未注射的对照小鼠、注射AAV shCtrl-的小鼠和AAV shCaMKKβ-的小鼠）之间的听觉基线阈值没有显著差异。数据表示为具有平均值 ± SD 的单个点，并通过单向方差分析和事后检验（8 kHz：F2、21 = 0.687、p = 0.514；16 kHz：F2、21 = 1.108、p = 0.349；32 kHz：F2，21 = 0.061，p = 0.941）。 ns：不显着。(B) 在上述三组中，DPOAE 幅度在 4-36kHz 之间显示出相似的波形。数据表示为平均值 ± SD 并通过重复测量方差分析 (F2,17 = 0.353, p = 0.707) 进行分析。标签中标明了每组中的动物数量。

图11显示暴露后 14 天， FVB/NJ 小鼠的顶端、基部和钩状区域出现 PTSN 诱导的 OHC 损失。用 Myosin7a免疫标记进行表面处理，然后用 DAB 染色，以显示感觉毛细胞。代表性图像取自顶端、中间、底部和钩状区域，每组代表六只小鼠。比例尺 = 10 µm。

图12显示通过PSC的siCaMKKβ的沉默效果高于通过WRM传递的siCaMKKβ。(A) 代表性图像显示，与 siControl 小鼠相比，在将 siCaMKKβ 鼓室内递送至小鼠左耳后 72 小时后， OHC 中 CaMKKβ 相关免疫反应性（红色）降低。比例尺 = 10 µm。

（B-C）相比于对照组siControls，对RWM（B）和PSC（C）给药相应的基底转OHCs中CaMKKβ免疫标记进行半定量，证实了siCaMKKβ治疗（通过RWM和PSC分别为40%和74%）后CaMKKβ免疫反应性的显著降低。数据以平均值+SD表示，n=5， p<0.01， p<0.0001

图13显示卡那霉素加呋塞米 (KM-FU) 治疗后 24 小时，耳蜗 OHC 中 CaMKKβ 和p-AMPKα 的免疫标记增加。（A） 与未经治疗的小鼠相比，KM-FU小鼠基底转OHCs中CaMKKβ（红色）的免疫标记增加。绿色：鬼笔环肽染色的 OHC。比例尺=10µm。（B） 对OHCs中CaMKKβ标记的灰度密度进行半定量分析，其对应于对30–32 kHz的灵敏度，证实其显著增加。

图14显示在 siCtrl 和 siCaMKKβ 处理的小鼠之间，耳蜗 OHC 中 FM1-43 的摄取没有差异。(A) 绿色荧光图像显示 FM1-43 在 OHC 中的摄取； phalloidin-594 染色（红色）显示 HC 结构。 在 FM1-43 摄取前 48 小时通过 PSC 递送 siRNA 以测量 OHC 中的 MTC 功能。 比例尺 = 10 µm。(B) 绿色荧光灰度的半定量分析显示 siCtrl 和siCaMKKβ 组之间没有显着差异。 数据表示为平均值 + SD 并通过一个样本 t 检验进行分析，每组 n = 5，ns：不显着。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容（如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到）。

实施例1

一.材料和方法

（1）动物

6 周龄的雄性 CBA/J 小鼠（库存 #00656）和 4 周龄的 FVB/NJ 小鼠（库存 #001800）购自Jackson Laboratory。所有小鼠都可以自由饮水和常规小鼠饮食（IrradiatedLab Diet#5V75），并在 MUSC 的特定无病原体动物设施以标准 12:12 小时明暗循环条件下饲养，房间保持在 22±1℃，背景环境声级保持在 50 dB SPL 左右。CBA/J 小鼠在基线听觉脑干反应 (ABR) 测量之前有一周的适应期。FVB/NJ 小鼠在 MUSC 动物设施中饲养，并在噪声暴露前 3-4 天测量基线 ABR。所有研究方案均经 MUSC 机构动物护理和使用委员会批准。动物护理在 MUSC 实验动物资源部的监督下进行。

（2）噪音暴露

在这项研究中，将 8 周龄的 CBA/J 小鼠和 4 周龄的 FVB/NJ 小鼠暴露在 100dB 声压级 (SPL) 下、频谱为 2-20 kHz 的宽带噪声 (BBN) 中 2 小时，在噪声暴露后 14天诱导 IHC 突触带丢失、OHC 丢失和永久阈值偏移 (PTS)。这些被称为我们的 PTS 噪声条件 (PTSN)。一般来说，4只不受约束的小鼠早晨暴露在声音室中2小时，每只不锈钢丝笼(约9 cm3)一只小鼠。噪声暴露的声级在声室内的多个位置用声级计测量，以确保声场的均匀性，并在暴露前后测量以确保稳定性。声音暴露室装有一个扬声器（型号2450H；JBL），由一个功率放大器（型号XLS 202D；Crown Audio）驱动，该功率放大器由一个CD播放器（型号CD-200；Tascam TEAC American）供电。音频CD声音文件由音频编辑软件（Audition 3；Adobe Systems，Inc.）创建并均衡。通过声级计（1200型；Quest Technologies）测量，笼子周围环境的背景声强度为65 dB。对照组小鼠在同一室内的笼子中保持沉默（不使用扬声器）2小时。

（3）卡那霉素-速尿 (KM-FU) 给药

硫酸卡那霉素 (KM) 购自 Thermo Scientific (#25389-94-0)，注射用药物级呋塞米 (FU) (Baxter, #AIN00218 at 10 mg/mL) 购自 MUSC 医院药房。6周龄时，在腹腔注射200 mg/kg氟尿嘧啶（IP）后，立即将溶解于0.9%生理盐水中的KM以每千克体重900 mg碱的剂量（SQ）皮下注射给CBA/J小鼠。例如，一只20克的小鼠将接受200μL的KM和400μL的FU。

（4）在出生后第1-2天将AAV载体送入FVB/NJ幼崽的内耳

AAV2.7m8 衣壳质粒、骨架载体质粒和辅助质粒购自 Addgene（#64839、#85451 和#112867）。对照和 CaMKKβ shRNA 的序列获自 Sigma Aldrich（对照：5'-CCGGGCGCGATAGCGCTAATAATTTCTCGAGAAATTATTAGCGCTATCGCGCTTTTTG-3'，CaMKKβ：5'-CCGGGTATCCACTTGGGCATGGAATCTCGAGATTCCATGCCCAAGTGGATACTTTTTG-3') 并由 Synbio Technologies 重建为载体质粒。最终的 AAV 生产由vector core of the University of Pennsylvania进行，滴度为 2.5 × 10¹³GC/mL，并在使用前储存在 -80℃。AAV 载体质粒和实验方案的示意图如图 3D 所示。简单地说，FVB/NJ幼崽（p1–2）使用斜面玻璃微量注射移液管注入RWM。用P-2000移液器 (Sutter Instrument, Novato, CA) 从毛细管玻璃(WPI, Sarasota, FL)中取出移液器。将吸头切割成大约 30°角。通过在冰/水中快速诱导低温 2 分钟以麻醉幼犬直至失去知觉，然后在手术期间将其置于冷却平台上约 10 分钟。手术部位（左耳区域）用70% 乙醇擦拭消毒。在左耳后做一个 0.6 厘米的耳后切口以暴露透明的耳泡，并手动将玻璃微量移液器尖端穿过耳泡、覆盖的筋膜和 RWM。在 5 分钟内注射约 2 μL 上述浓度的病毒（由 MICRO4 控制器控制的纳升注射器，World Precision Instruments）。皮肤切口用5-0 尼龙线缝合。让幼崽在温暖的垫子上（约 37℃）从麻醉中恢复约 5 分钟，然后回到它们的母本身边接受护理，直到断奶。

（5）噪声暴露前 72 小时鼓室内递送 siRNA

如前所述，siCaMKKβ（Invitrogen，#n437808）或乱序 RNA 对照（siControl，Invitrogen，#4390843）通过鼓室内给药局部输送到RWN上。(Oishi et al., 2013) 简单地说，麻醉后，左耳耳后区域被剃毛并用 10% 聚维酮碘消毒。在手术显微镜下，做一个耳后切口（约1.0 cm）接近颞骨。耳大疱位于面神经腹侧，并用 30-G 针在耳大疱的薄部分开一个浅孔，并将其扩大到 2 毫米的直径，以显示 RWN。将定制的无菌微型医疗管插入 RWN 正上方的孔中，以缓慢输送 10 μL（每耳 0.6 μg 或 0.3 μg）预先设计的 siCaMKKβ 或siControl。递送 siRNA 后，耳大疱中的孔被周围的肌肉覆盖并用组织粘合剂（3M VetbondTissue Adhesive）粘合。最后，用组织粘合剂封闭皮肤切口，并在麻醉恢复期间（约 1 小时）将小鼠保持在手术位置。siRNA 递送后 72 小时，将动物暴露于 PTSN。

（6）在 KM-FU 药物注射前 48 小时，后半规管递送 siRNA

siCaMKKβ (Invitrogen, #n437808)、siAMPKα1 (Invitrogen, #s98535) 和siControl (Invitrogen, #4390843) 通过 PSC 局部递送。简而言之，麻醉后，将左耳耳后区域剃毛并用 10% 聚维酮碘消毒。在手术显微镜下，做一个耳后切口（约1.0 cm）接近颞骨。分离胸锁乳突肌以暴露 PSC。在 PSC 上用 30-G 针的尖端打一个小孔，放置约 1-2 分钟，直到没有明显的内淋巴渗漏。然后将定制的聚酰亚胺管（HPC01862，ID：0.0025 英寸，OD：0.0031 英寸，HPC Medical）的尖端朝向壶腹插入 PSC，并在 2 分钟内缓慢地显微注射1 μL siRNA（由 MICRO4 控制器控制的纳升注射器，World Precision Instruments）。在递送 siRNA 后，将管子切成约 1.5 mm 的长度。剩余的管子用加热的镊子密封，并用周围的肌肉覆盖并用组织粘合剂（3M Vetbond Tissue Adhesive）粘合。最后，用5-0尼龙线缝合皮肤切口。总手术时间约为 30 分钟。siRNA递送后48小时，动物被注射一次KM-FU。

（7）听性脑干反应和畸变产物耳声发射的测量

听觉脑干反应(ABR)测定分别于噪声暴露或KM-FU处理前一周和噪声损伤后14 d进行。简而言之，通过腹膜内 (IP) 注射甲苯噻嗪 (10 mg/kg) 和氯胺酮 (100 mg/kg) 的混合物对小鼠进行麻醉，然后将其置于隔音和电屏蔽室 (Acoustic Systems ，德克萨斯州奥斯汀）。用加热垫将小鼠体温保持在 37℃左右。声学刺激通过单耳传递到拜尔耳机上，耳机连接着一个插入耳道的定制塑料窥镜。电极被插入到头骨顶点的皮下组织以及左耳和右耳（地面）下方的乳突区域。ABR 在 8、16 和 32 kHz 下测量。Tucker Davis Technology(TDT) System III 硬件和 SigGen/Biosig 软件用于呈现刺激（持续时间为 15 ms 的音调突发，上升-下降时间为 1 ms）并记录响应。每个刺激水平平均有多达 1024 个响应。每个频率的阈值通过降低10分贝的强度增量来确定，直到检测到没有组织的响应。在观察到反应的最低刺激水平和无反应的最高刺激水平之间估计阈值。ABR wave II 用于确定每个频率的阈值，阈值由对治疗条件不知情的专家指定。DPOAE 测试是在 ABR 测量之后进行的。使用 TDT RZ6 系统和 SigGen 软件测量。包含连接到两个传感器的 ER-10B+ 麦克风的声学组件，被紧紧地放置在耳道中。主音以 L1= 65 dB SPL 和 L2 = 55 dB SPL 的固定强度水平呈现，f2/f1 比率为 1.2。分析每只小鼠的生理反应的各个频率，并对 4 kHz 到36 kHz 这些频率中的每一个进行平均。

（8）用于毛细胞计数的耳蜗表面处理：肌球蛋白 VIIa 标记和 DAB 染色

耳蜗上皮细胞的表面处理和二氨基联苯胺 (DAB) 染色程序如前所述（Chen 等人，2012；Fang 等人，2019）。

（9）使用蔡司显微镜上的 20 倍放大镜捕捉从 DAB 染色表面处理的顶端到底部的图像。耳蜗上皮的长度以毫米为单位进行测量和记录。由于在我们的 PTS 噪声条件或KM-FU 治疗中没有或只有非常轻微的内毛细胞 (IHC) 损失，因此仅沿小鼠耳蜗螺旋的整个长度从顶点到底部计数 OHC。将每个 0.25 或 0.5 毫米长度的上皮细胞中 OHC 损失的百分比作为耳蜗长度的函数绘制为细胞耳蜗图（Chen 等人，2012）。使用 Müller 论文中的公式 [d (%) = 156.582.5 × log (f)] 计算沿耳蜗螺旋整个长度的频率与距离的关系图。（Muller 等人，2005）

（10）用于耳蜗表面处理的免疫细胞化学

表面处理和样品安装技术与上述“肌球蛋白 VIIa 标记和耳蜗上皮细胞的 DAB染色”部分中描述的相同。用 10% 山羊血清封闭后，将标本与一抗孵育：1:200 的多克隆兔抗 CaMKKβ（Invitrogen，#PA5-30399），1:50 的多克隆兔抗 p-CaMKI（Thr 177）（Invitrogen, #PA5-38434)，单克隆兔抗 p-AMPKα (Thr 172) 以 1:200 (Cell SignalingTechnology, # 2535) 在黑暗中 4 °C 孵育 24 小时，然后与 Alexa-Fluor-594 一起孵育-偶联二抗（Thermofisher Scientific，#A11012），在 4 °C 下以 1:200的浓度过夜，然后与 Alexa-Flour-488-phalloidin（Invitrogen，#A12379）在黑暗中室温孵育 1 小时。常规处理二抗对照，不与一抗孵育。对于免疫标记IHC突触，将样本在 37 °C 、黑暗中与 1:200 的初级单克隆小鼠抗 CtBP2 IgG1（BD Biosciences，#612044）和 1:2,000 的小鼠抗GluA2 IgG2a（Millipore，# MAB397)一起孵育过夜，然后Alexa-Fluor-594 山羊抗小鼠IgG1 和 Alexa-Fluor-488 山羊抗小鼠 IgG2a (1:1,000)，在 37 °C 黑暗中 1 小时。使用 Zeiss LSM 880 在相同的 Z 堆叠条件下，使用 63 倍放大镜拍摄免疫标记图像。

（11）来自表面处理免疫荧光信号的半定量

当仔细考虑这些测定的实用性和半定量性质时，免疫组织化学已被广泛接受为半定量方法 (Taylor&Levenson, 2006; Walker, 2006) 。我们首先通过蛋白质印迹分析检测抗体的特异性。将仅显示具有正确分子量的单条带的抗体用于表面处理免疫标记和 OHC中免疫标记的定量。CaMKKβ、p-CaMKI (T177) 和 p-AMPKa (T172) 在表面处理上的免疫荧光从原始共聚焦图像中量化，每个图像在相同条件下使用 63 倍放大镜拍摄，激光增益和PMT 增益的参数设置相同，使用 ImageJ 软件(National Institutes of Health,Bethesda, MD)。不同组的耳蜗用相同的溶液同时固定和染色，并平行处理。所有的表面处理都用 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽（绿色）进行复染，以标记毛细胞结构，以便在共聚焦图像中识别毛细胞的可比部分。使用基于鬼笔环肽染色的圆形工具勾勒出单个OHC的目标区域。在OHC中确定灰度值以量化荧光强度的变化。目标蛋白的免疫荧光分别在耳蜗上皮的顶端（相当于对8-10khz的敏感性）、中间（相当于对16-18khz的敏感性）和上基底（相当于对30-32khz的敏感性）区域测量，每个区域包含约60ohc。减去背景强度，然后计算每个细胞的平均灰度强度。对于每次重复，通过将比率标准化为对照来确定相对灰度值。由于对照小鼠与 PTS 噪声暴露后 3 小时或 24 小时或 KM-FU 处理后 24 小时的耳蜗 OHC 中，CaMKKβ和 p-AMPKα 的免疫标记没有明显差异，并且在顶端和中转的 OHC 中也没有 p-CaMKI 免疫标记，所以，我们仅对 OHC 中 CaMKKβ 和 p-AMPKα 免疫标记进行半定量，并计数了基底转中阳性 p-CaMKI 标记的 OHC。

（12）使用 RNAscope 进行整体荧光原位杂交

RNAscope 多重荧光试剂盒 v2 (cat #323100) 和 CaMKKβ 探针 (cat #529851)购自 ACD。使用 RNAscope 进行 FISH 的程序是在无 RNase 的条件下进行的，并按照制造商的说明和如前所述进行操作。（Kersigo 等人，2018 年；Salehi 等人，2018 年）。

（13）从表面处理上的 Z 投影中，量化免疫标记带或 RNAscope puncta

我们遵循了前面描述的程序 (Hill et al., 2016)。

（14）从小鼠耳蜗或外植体中提取总蛋白

在冰冷的 PBS（pH 7.4）中迅速取出并解剖耳蜗，其中含有完整的 Mini 无 EDTA蛋白酶抑制剂cocktail片剂（Sigma Aldrich，#11836170001）。为了从小鼠耳蜗或外植体中提取总蛋白，使用玻璃/玻璃微组织研磨杵和容器，在冰冷的 RIPA 裂解缓冲液（SigmaAldrich，#R0278）中用cocktail蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂cocktail II 和 III（ SigmaAldrich，#P5726 和 31 #P0044）均质化单个小鼠或四个外植体的耳蜗组织5 分钟。通过在4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟去除组织碎片，并保留上清液作为总蛋白质组分。使用 Bio-Rad Protein Assay 染料试剂 (Bio-Rad, #500-0114) 以牛血清白蛋白作为蛋白质标准品测定蛋白质浓度。每只小鼠各取2只耳或4个外植体，保存在-80℃。

（15）蛋白质印迹分析

通过 SDS-PAGE 分离来自小鼠耳蜗匀浆的蛋白质样品 (30 μg)。电泳后，将蛋白质转移到 PVDF 膜 (Bio-rad, #1620177) 上，并用 5% 牛血清白蛋白 (Sigma Aldrich,#A7906) 在 PBS-0.1% Tween-20 (PBS-T) (Sigma Aldrich, #P1379) 中封闭。将膜与抗CaMKKβ (1:1,000, Invitrogen, #PA5-30399)、抗 p-CaMKI (T177) (1:1,000,Invitrogen, #PA5-38434) 或抗 GAPDH (1:5,000 , Millipore, #ABS16) 在 4 °C 下过夜，然后用 PBS-T 缓冲液洗涤 3 次（每次 10 分钟）。将膜与二抗（(Cell signalingtechnology，#7074 或 #7076）在室温下以 1:3,000 的浓度在RT下孵育 1 小时。在充分清洗膜后，通过 SuperSignal West Dura Extended Duration (Thermo Scientific, #34075) 观察免疫反应带。通过 LI-COR Odyssey Fc 成像系统扫描蛋白质印迹带，并使用Image J 软件进行分析。首先，从条带密度中减去每个条带的背景染色密度。接下来，根据在同一凝胶上运行的条带密度计算探测蛋白/GAPDH 比率，以标准化蛋白质加载的差异。最后，对对照带和实验带比率的差异进行统计学显著性检验。

（16）FM1-43摄取实验

在对照组、CaMKKβ或AMPKa1 siRNA治疗48小时后，通过PSC递送获得小鼠耳囊，并将其置于Hanks平衡盐溶液（HBSS）中。FM1-43 FX（Thermo Fisher，#F35355）是 N-（3-三乙基铵丙基）-4-（4-（二丁基氨基）苯乙烯基）二溴化吡啶的可固定类似物，在 HBSS 中稀释至5 μM，并通过椭圆形和 圆形窗口，用于在 RT 下缓慢灌注每个窗口 1 分钟。在用 HBSS 立即洗涤 3 次后（每次洗涤 10 秒），将耳蜗在 4°C 下固定在 4% 多聚甲醛中过夜，然后在4°C 下用 4% EDTA 脱钙 48 小时。表面准备和安装如上所述。用 Alexa Fluor 594phalloidin (Invitrogen, #A12381, 1:200) 对样本进行复染 1 小时，并用配备 ZEN 软件的 LMS 510 共聚焦显微镜进行观察。

（17）耳蜗外植体

将出生后第 3 天的 FVB/NJ 小鼠用于制备耳蜗外植体 (Chen et al.,2009)。将解剖的耳蜗上皮细胞置于预先准备好的大鼠尾胶原蛋白培养皿中，培养皿中加入 1 mL 无血清基础培养基 Eagle +无血清补充剂 (Invitrogen)、1% BSA、2 mM 谷氨酰胺和 5 mg/mL 葡萄糖。将外植体孵育约 2 小时（37°C，5% CO2），再添加 1 mL 培养基以完全浸没外植体。孵育过夜后，将培养基更换为含有药物的新培养基，根据实验将外植体孵育18小时或24小时。将培养物在 4 °C 下在 4% (vol/vol) 多聚甲醛中固定过夜，然后在 PBS 中用 3%(vol/vol) Triton X-100 渗透 30 分钟，并用 PBS 洗涤 3 次。在 4°C 下与 Alexa-594phalloidin 或 Alexa-488 phalloidin 孵育过夜后，在安装前用 PBS 再次洗涤外植体至少 3 次，每次 10 分钟。通过使用蔡司荧光显微镜评估表皮板上鬼笔环肽染色的纤毛束和圆周 F-肌动蛋白环，以确定毛细胞的存在或丢失。对于 AIF 免疫标记或免疫印迹，将外植体与药物一起孵育 18 小时，然后固定。使用了 AIF (D39D2) 的一抗（1:200 用于免疫标记，1:1000 用于蛋白质印迹，Cell signaling technology #5318）。

（18）人工耳蜗的药物治疗

将庆大霉素 (GM) 10 mM (Sigma-Aldrich #G3632) 或 KN93 磷酸盐 3.3 mM(Selleckchem #S7423) 原液溶解在双蒸水 (ddH2O) 中，分装并储存在 -80℃ 冰箱中。在施用至培养皿之前，将储备溶液用培养基稀释至最终浓度为 0.2 mM 的 GM 和 10 μM 的KN93，处理 24 小时以评估对 GM 诱导毛细胞损失的保护作用或 18 小时以通过蛋白质印迹分析评估 AIF OHC 核易位和 AIF 表达。在治疗24小时内，评估5–50µM的KN93剂量曲线。

（19）统计分析

使用 Windows 的 SYSTAT 8.0 和 GraphPad 5.0 软件分析数据。通过重复测量方差分析 (ANOVA) 分析沿耳蜗螺旋长度的 OHC 损失和突触损失的数据，并使用 SYSTAT8.0 进行事后比较。其余分析使用 GraphPad 5.0 完成。通过具有多重比较的单向方差分析评估多重比较的差异。使用双尾非配对学生 t 检验分析单对比较的差异。单对比较的相对比率数据采用单样本t检验进行分析。p 值<0.05 被认为具有统计学意义。根据样本量和组内变异性，数据表示为平均值 + 或 ± SD。每个图都标明了样本大小。

（20）部分缩写

AAV：腺相关病毒；ABR：听觉脑干反应；AMPKα：AMP依赖性蛋白激酶α亚基；CaMKKβ：Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶-β；DMSO：二甲基亚砜；DPOAE：畸变产物耳声发射；eGFP：增强型绿色荧光蛋白；FISH：荧光原位杂交；FU：速尿；HC：毛细胞；IHC：内毛细胞；IP：腹腔注射；KM：卡那霉素；KO：敲除小鼠；LKB1：肝激酶 B1；MTC：机械传感器通道；NIHL：噪音引起的听力损失；OHC：外毛细胞；PBS：磷酸盐缓冲盐水；PBS-T：含 0.1% Tween 20 的 PBS；PSC：后半规管；PTS：永久阈值变化；PTSN：PTS-噪声；ROS：活性氧；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；SPL：声压级；siRNA：小干扰 RNA 沉默；shRNA：短发夹 RNA 沉默；siControl：乱序 siRNA；TDT：塔克戴维斯技术；RWM：圆窗膜。

二、创伤性噪声暴露激活外毛细胞中的 CaMKKβ

之前的研究表明，噪音会激活p-AMPKα T172，且沉默AMPKα1则能预防NIHL。由于CaMKKβ是AMPKα上游的激酶之一，本发明人首先对CaMKKβ的激活进行评估。磷酸化 CaMKI(p-CaMKI T177) 是 CaMKKβ 活化的标志物之一，因此，在创伤性噪声暴露后通过免疫组织化学方法评估了几个时间点下OHCs中的 p-CaMKI (T177)。结果发现，代表p-CaMKI 的免疫标记出现在结构受损 OHCs 的静纤毛和表皮板中，而不是出现在完整的OHCs中或丢失OHCs产生的瘢痕中；在创伤性噪声暴露后1、3、5和8小时检测，发现p-CaMKI在暴露后随时间延长而减少，直至暴露后24小时没有观察到p-CaMKI阳性OHCs。在各个检查时间点下，发现p-CaMKI阳性OHCs仅出现在耳蜗上皮40–56 kHz之间的基底区域。具有20个Z叠层的共聚焦图像表明， p-CaMKI 定位于 OHC 静纤毛和表皮板（图 9A）。噪声暴露完成后1-3小时内的p-CaMKI146 阳性OHCs计数显示，在下基底转弯 40-56 kHz 之间的区域中，平均 18% 的OHCs 呈阳性标记（图 1B，t10 = 5.791，p = 0.0002，通过非配对 t 检验分析）。同样的，在创伤性噪声暴露后，CBA/J 和 FVB/NJ 两种小鼠在损伤情况下 OHCs呈现出与前述状况相似的 p-CaMKI 免疫标记状态。

此外，为了确定免疫组织化学中抗体的特异性，使用小鼠全耳蜗组织匀浆进行蛋白质印迹。代表CaMKKβ和p-CaMKI的单个蛋白条带分别具有与CaMKKβ、p-CaMKI对应的55kDa、45 kDa正确分子量，证实了抗体的特异性。条带密度的半定量结果显示，在暴露或假暴露后 1-3 小时检查，对照组和创伤性噪声暴露小鼠之间没有差异（图 9B-C，p-CaMKI：t4= 0.063，p = 0.953；CaMKKβ：t4 = 0.959, p = 0.392）。这些结果表明，创伤性噪声暴露会激活 OHCs 中的 CaMKKβ。

三、创伤性噪声暴露会增加外毛细胞中CaMKKβ的mRNA 和蛋白质水平

为了确定创伤性噪声暴露是否会改变 CaMKKβ mRNA 水平，如先前报道中所述（Kersigo等，2018；Salehi等，2018）在耳蜗表面制剂上使用具有RNAscope的FISH。通常，在没有暴露的对照小鼠中，感觉毛细胞中CaMKKβmRNA表达水平较低。由于OHCs的丢失发生在暴露完成后的1小时和24小时的下基底转弯处及紧接着的基底-顶端的梯度中，因此，无法量化下基底转弯处的OHC CaMKKβ mRNA水平。因此，本发明人在噪声暴露完成后1-3小时或24小时分析了上基底区域（对应于32kHz的灵敏度）、中间区域（对应于16kHz的灵敏度）和顶端区域（对应于8kHz的灵敏度）sOHC中的CaMKKβmRNA（如图2A所示）。我们发现，在初步实验中，代表CaMKKβ mRNA标记的斑点在24小时比1-3小时更明显。然后，本发明人专注于比较暴露后 24 小时的小鼠与未暴露于创伤性噪声的对照组小鼠；发现与没有噪声暴露的对照小鼠相比，暴露后24h的小鼠其顶端（t6=3.528，p=0.0124）、中间（t5=3.4612，p=0.018）和基底转角（t6=5.247，p=0.0019）OHCs CaMKKβmRNA表达水平显著增加约2倍（图2B，通过单样本t检验分析）。然后，在暴露完成后1-3小时和24小时检查点对OHCs进行CaMKKβ免疫标记，发现在暴露后24小时，基底转角区域（对应于对32kHz的敏感性）的OHCs CaMKKβ免疫标记很强（图2C），而在1-3小时检查点中，CaMKKβ免疫标记仅微弱增强。对基底区域 OHCs 中 CaMKKβ灰度强度的半定量检测结果证实，暴露后 24 小时CaMKKβ水平显着增加至对照组的两倍（t5 = 3.098，p = 0.0269），但暴露后 1-3 小时与对照组无显著差异（图2D，通过单样本t检验分析）。这些结果表明，创伤性噪声诱导的 CaMKKβ mRNA、CaMKKβ蛋白质水平的增加与CaMKKβ 激活无关。创伤性噪音激活 CaMKKβ 可能是由于钙超载进入 OHCs。

四、通过AAV2.7m8转染shRNA以介导CaMKKβ沉默，显著保护防止创伤性噪声引起的毛细胞损失和听力损失

为了评估创伤性噪声暴露后 OHCs 中 CaMKKβ mRNA 和蛋白质水平增加的作用，通过病毒(AAV2.7m8) 转导短发夹 RNA (shCaMKKβ)介导CaMKKβ沉默。由于 FVB/NJ 小鼠在至少 10 周龄时表现出正常的基线听力，并且对噪声引起的基底转弯处 OHCs 损失具有与CBA/J 小鼠相似的敏感性，因此，本实验中使用了 FVB/NJ 小鼠进行 shCaMKKβ 操作，且实验过程中 FVB/NJ 母本正常照顾注射AAV的幼崽。基于 AAV2.7m8 能高效感染耳蜗 IHC 和OHC的报告（Isgrig 等人，2019），本试验通过AAV2.7m8转染shScrambled-RNA (shControl)或shCaMKKβ，具体地，将携带相应发夹RNA的病毒载体注射到出生后1-2 d（p1-2）幼崽左耳RWM中进行转导。病毒注射后三周，eGFP 阳性感觉毛细胞计数显示：沿整个耳蜗螺旋的IHCs感染率为 100%；基底和中间转弯区域的OHCs感染率为90%；在顶端区域的OHCs感染率为40%。感觉毛细胞中 shControl 和 shCaMKKβ 之间的感染率没有差异（图 3A-B，通过非配对 t 检验分析）。在病毒注射3周后，对全耳蜗匀浆进行蛋白质印迹检测，相比于shControl小鼠，shCaMKKβ显示出约70%的CaMKKβ沉默效率（图 3C，F2，15 = 67.28，p<0.001，通过单因素方差分析和多重比较分析）。shControl小鼠和未注射病毒的对照小鼠之间， CaMKKβ 表达没有差异（p>0.05）。shControl 和 shCaMKKβ 对小鼠的 AAV 转染产生了相似的 GFP 条带密度，证实了感染率没有差异。此外，在注射后3周内进行有 ABR 和 DPOAE 测量，发现将病毒载体注射到 p1-2 幼崽中不会引起听力损失。在对照组（初始对照组）、shControl和shCaMKKβ组之间，三个测试频率（8,16和32 kHz）下的听觉阈值、4-36 kHz的DPOAE幅度都具有相似性（图10，A:ABR数据通过单向ANOVA进行多重比较，B：通过重复测量ANOVA分析的DPOAE数据）。然后，通过将 4 周大的 FVB/NJ 小鼠暴露在 96 到 100 dB SPL 的噪声强度下 2 小时来表征噪声条件。在噪声暴露后 14 天评估时，暴露于 100 dB SPL 后的小鼠发生永久性阈值偏移 (PTS)，且伴随着顶端和基底部的 OHCs 丢失。在此基础上，使用这种PTS 条件进行体内实验，以评估 shCaMKKβ 是否会减弱噪声引起的感觉毛细胞损失和NIHL。没有噪声暴露的FVB/NJ对照小鼠除了在顶端转弯开始处（从顶端开始0~0.25 mm范围内）有5%的OHCs损失外，在中间区域和基底转弯处均未出现OHC损失。而对于暴露于100 dB噪声后14天的小鼠，OHC的损失出现在顶端和基底转弯处，且钩状区域的OHC损失明显更大；中间转弯处没有OHCs损失（图11）。沿耳蜗螺旋整个长度的OHC损失计数显示，噪声引起的基底转弯中OHC的损失始于距顶点3.75 mm处，且在朝钩状区域的方向上损失逐渐增加，直到在5.5 mm处达到65%的OHC损失。此外，暴露后，在距顶点 0.25 毫米处，顶端区域中的 OHC损失也达到约 20%（图 4A）。在 shControl 小鼠中，噪音引起 OHC 损失的发生模式与非病毒转导小鼠中发生模式相似（从 0.25-1.25 mm：F1，11 = 0 .878，p = 0.369；从 3.75-5.5mm：F1，11 = 0.232，p = 0.639），表明单独的 AAV2.7m8 感染在 FVB/NJ 小鼠对噪声引起OHC 损失的敏感性这一方面没有影响。相比之下，在 shCaMKKβ 沉默的小鼠中，噪音引起的OHC 损失在顶端（0.25-1.25 mm：F1,13 = 14.586，p = 0.002）和基底转弯处（3.75-5.5mm：F1，13 = 148.532，p<0.001，图 4A，通过重复测量方差分析和事后检验进行分析；有关详细统计值，请参见表 1））均显着降低。相比之下，在 shCaMKKβ 沉默的小鼠中，噪音引起的 OHC 损失在顶端（0.25-1.25 mm：F1,13 = 14.586，p = 0.002）和基底转（3.75-5.5 mm：F1，13 = 148.532）均显着降低，p<0.001，图 4A，通过重复测量方差分析和事后检验进行分析；有关详细统计值，请参见表 1）。即使在较低的基底钩状区域（距顶点5.25–5.5 mm），噪声引起的OHC损失百分比也从平均50%降低到了低于10%，如代表性图像所示（图4B）。

表 1 Post-hoc analysis of OHC loss（OHC损失的事后检验分析, Fig.4A）

此外，shCaMKKβ 小鼠在所有测试的三个频率下都显示出对 PTS 噪声诱导的听觉阈值变化的显著预防（图 4C，通过单向方差分析和 Bonferroni 的多重比较，AAV-shCtrl+ PTS 与 AAV-shCaMKKβ + PTS：8 kHz ：F2，21 = 8.895，p<0.01；16 kHz：F2，21 = 25.26，p<0.0001，32 kHz：F2，21 = 24.64，p<0.0001）。此外，在暴露后14天，在AAV-shControl小鼠和没有AAV转导的对照小鼠之间，在所有三个测量频率（8、16和32kHz）下，由PTS噪声暴露引起的听觉阈值偏移是相似的。

通过DPOAE测量进行的OHC功能测试显示，在没有暴露的对照小鼠中，振幅在16kHz处达到峰值，而在暴露后14d，在4-36kHz的所有测试频率下，峰值消失并且波以低于-10dBSPL的振幅变平（图4D，Ctrl vs Ctrl+PTSN，F1,13=211.077，p<0.001）。

shControl 小鼠在 PTS 噪声暴露后显示出与没有病毒转染的小鼠相似的 DPOAE幅度（图 4D，F1,12 = 0.099，p = 0.759）；shCaMKKβ 沉默的小鼠显示 PTS 噪声降低的DPOAE 振幅在 8kHz-36 kHz 发生显著逆转，振幅峰值在 16 kHz，但低于没有暴露的对照小鼠（图 4D，AAV-shCtrl + PTSN 与 AAV- shCaMKKβ + PTSN，F1，13 = 56.405，p<0.001，通过重复测量方差分析进行分析；有关详细统计值，请参见表 2）。

所有这些结果表明，通过AAV载体的CaMKKβ沉默对FVB/NJ小鼠中的NIHL具有显着的预防作用。

表 2 Post-hoc analysis of DPOAE amplitudes（DPOAE振幅的事后检验分析,Fig.4D）

五、用 CaMKKβ 小干扰 RNA 预处理可减轻噪声引起的内毛细胞突触损失、外毛细胞损失和 NIHL。

为了测试沉默 CaMKKβ 是否也会减弱 CBA/J 小鼠的 NIHL，我们在噪声暴露前72 小时将乱序 siRNA（siControl）或 siCaMKKβ 应用于小鼠的 RWM。递送0.6μg siCAMKKβ小组与siControl小组相比，siCaMKKβ处理小鼠中OHC的沉默效率约40%（图 12A，B，t5 =5.1711，p = 0.0036，通过单样本 t 检验分析）。本实验选择0.6μg siCAMKKβ是基于我们的初步结果。此外，我们对12周龄CBA/J小鼠的噪声条件进行了详细的表征；为了诱导 IHC 突触损失和 OHC 损失的 PTS，将小鼠暴露于 101 dB 2 小时。肌球蛋白 VIIa 标记、 DAB 染色表面处理耳蜗螺旋，沿耳蜗螺旋全长的 OHC 计数显示，用 siCaMKKβ 预处理显着降低了噪音引起的 OHC 损失（图 5A、B、F1、11 = 9.213，p = 0.011，通过重复测量方差分析和事后检验进行分析；有关详细统计值，请参见表 3）。

表3 Post-hoc analysis of OHC loss（OHC损失的事后检验分析, Fig.5B）

在 siControl 处理的小鼠中，噪声引起的 OHC 损失自距顶点 3.0 mm 处开始，且在朝基底的方向上损失逐渐增加，直到距顶点 5.5 mm处OHC 完全损失，而在 siCaMKKβ处理的小鼠中，噪声引起的OHC损失自顶点 4 mm处开始，并在距顶点 5.5 毫米处下降到平均 40%，OHC 损失在距顶点 3.5 毫米（p = 0.044）、4 毫米（p<0.001）和 4.5 毫米（p =0.001）处显着减少。同样，相比于暴露后14天siControl处理的小鼠，用siCaMKKβ预处理显着降低了在8kHz（F2,37=4.106，p=0.0245）、16kHz（F2,37=69.55，p<0.0001）和32 kHz（F2,37=28.11，p<0.0001）处噪声引起的听觉阈值偏移（图 5C，通过单向方差分析和Bonferroni 的多重比较测试）。此外，噪声引起的听觉阈值变化在 siCtrl 组和无手术组之间相似（图 5C）。此外，噪声暴露显着降低了 8-36 kHz 的 DPOAE 幅度（F1, 9 =111.894, p<0.001），并且通过 siCaMKKβ 处理显着缓解了这种降低（图 5D，F1, 9 =58.829，p<0.001，通过重复分析 测量方差分析；有关详细统计值，请参见表 4）。

表4 Post-hoc analysis of DPOAE amplitudes（DPOAE振幅的事后检验分析,Fig.5D）

噪声诱导的IHC突触丢失已经通过突触前带的CtBP2和突触后末端的Glu2A的共免疫标记得到充分证明（Wan等，2014；Hill等，2016；Fang等，2019）。我们评估了在噪声暴露后14天，用siCaMKKβ预处理是否也可以防止噪声引起的IHC突触损失。以前，我们发现与初始组（对照组）相比，单独使用 siControl 治疗且没有噪声暴露时，不会改变 IHC 突触的数量（Hill 等人，2016）。在 siControl 处理小鼠中，噪声引起的 IHC 突触损失发生在暴露后 14 天的 22kHz、32 kHz 处，没有出现大量孤儿带（以 CtBP2 与 GluA2 标记的分离为标志）（图 5E）。噪声暴露后，距顶点 0.4、1.0、2.4、3.3 和 3.9 毫米（对应于 6、8、16、22和 32 kHz）各区域的 IHC 突触计数显示，与未暴露的siControl 小鼠相比，IHC突触在22kHz(F2, 17= 29.04, p<0.0001)和32kHz (F2,15 = 22.83, p<0.0001)处发生显著损失，但在6、8和16kHz处没有显著损失（图 5F，通过具有多重比较的单向 ANOVA 分析），而用siCaMKKβ 预处理显着减少了 22-kHz 和 32-kHz 区域中由噪声引起的突触损失（p<0.0001），siCaMKKβ 处理的小鼠中 IHC 突触的数量与没有噪声暴露的对照小鼠相似。所有这些结果都与 shCaMKKβ 处理 FVB/NJ 小鼠以防止 NIHL 一致。

六、siCaMKKβ 预处理完全预防卡那霉素及呋塞米处理所诱导的耳毒性

由于感觉毛细胞的丧失是噪声和氨基糖苷类所致听力损失的共同病理特征，在此基础上，本发明人测试沉默CaMKKβ是否可以预防氨基糖苷类所致听力损失。基于文献报告(Taylor et al.， 2008;Ruhl等人，2019)，我们首先在6周龄的CBA/J小鼠中测试了KM-FU诱导的听力损失，具体地，在初步实验中使用600-900 mg/kg剂量的KM base，然后使用100-400 mg/kg剂量的FU。我们发现，单独应用900 mg/kg KM base（SQ 注射），然后使用200 mg/kg 的 FU（IP 注射），会导致明显的听力损失；在8, 16kHz下的听力阈值平均为50 dB，且药物治疗14天后，在32 kHz下，中间、基底弯OHC完全丢失，耳蜗顶转OHC部分丢失（无药物治疗引起的死亡）(图6A)。我们选择此剂量来测试是否可以通过 siCaMKKβ 预处理来预防 KM-FU 诱导的毛细胞损失和听力损失。

在我们评估保护作用之前，我们发现，与未用药的对照小鼠相比，在治疗后24小时进行检查时，KM-FU治疗也显著增加了OHCs中CaMKKβ的免疫标记（t4=2.896，p=0.0443，通过单样本t检验进行分析）（图13），而KM或FU单独使用并没有改变CaMKKβ的免疫标记，也没有OHC损失。我们还发现，通过后半规管（PSC）对CaMKKβ（0.6μg/耳）的沉默效果为74%，而通过RWM的沉默效果为40%（图12）。然后，我们选择通过PSC输送siCaMKKβ，以评估siCaMKKβ预处理是否可以预防KM-FU诱发的听力损失。在KM-FU给药前48小时，通过PSC以0.3μg或0.6μg/耳的剂量以进行siCaMKKβ预处理，几乎完全阻止了大量KM-FU诱导的OHC损失（图6A-B，siCaMKKβ与siCtrl:F1，15=1593.468，p<0.001）。

在一些小鼠的钩状区域中，只有少量的OHC丢失。在所有测量的三个频率（8、16和32 kHz）下，KM-FU诱发的听阈偏移也被完全阻止（图6C，通过单因素方差分析和多重比较分析的数据；详细的统计值见表5）。此外，通过DPOAE测量OHC功能，结果表明，使用0.3μg或0.6μg剂量的siCaMKKβ预处理完全阻止了在8–36 kHz的所有测试频率下KM-FU 降低的 DPOAE幅度，而用 siControl 预处理不影响 KM -FU 降低的 DPOAE 幅度（图 6D，通过重复测量ANOVA 和事后测试进行分析；有关详细统计值，请参见表 6）。由于氨基糖苷类抗生素主要通过机械转导通道 (MTCs) 进入 OHCs，为了确定siCaMKKβ 预处理的这种保护作用是否是由于阻断 KM-FU 进入 OHCs而实现的，我们根据文献(Meyers et al ., 2003; Taylor 等人, 2008; Nakanishi 等人, 2018)使用 FM1-43FX 评估了 OHC MTCs。我们的研究结果表明，与对照组相比，PSC给药的siCaMKKβ预处理并没有改变FM1-43FX对OHCs的摄取（图14）。

这些结果表明，siCaMKKβ预处理可完全防止KM-FU引起的耳毒性。

表 5 Statistical analysis of ABR（ABR的数据分析，Fig. 6C）

表 6 Post-hoc analysis of DPOAE amplitudes（DPOAE振幅的事后检验分析，Fig. 6D）

七、与 CaMKKβ 抑制剂联合治疗可阻断庆大霉素诱导的细胞凋亡诱导因子易位至外毛细胞核，并完全防止庆大霉素诱导的耳蜗外植体毛细胞损失

由于在体内通过沉默CaMKKβ来预防毛细胞丢失在暴露于噪声和KM-FU治疗的病变之间是一致的，我们评估了与CaMKKβ抑制剂KN93联合治疗是否可以阻断庆大霉素（GM）诱导的耳蜗外植体毛细胞死亡和毛细胞丢失。根据我们之前发表的文章(Chen et al.， 2009)，我们用0.2 mM GM处理出生后第3天(p3)的FVB/NJ小鼠外植体8、16、18、20和24小时。在 GM应用18 - 24小时后出现毛细胞丢失，但8和16小时后没有出现毛细胞丢失。毛细胞损失开始于基部转弯的 18 小时，并在基底至顶点之间呈梯度变化，在24h达到85%的损失（图 7A-B）。然后，我们确定了用于与GM联合治疗的KN93剂量。在p3外植体上施用5-10μM KN93 24小时，没有毛细胞损失，但在20μM KN93中出现毛细胞损失，在50μM处理中达到40%的损失（图7C）。

因此，我们选择10μM KN93与0.2 mM GM共处理24小时，以评估其保护效果。我们发现，与KN93联合治疗几乎完全防止了GM诱导的毛细胞丢失（图7A-B）。接下来，我们通过免疫组织化学和免疫印迹法评估AIF的表达，因为它与噪声和氨基糖苷诱导的毛细胞死亡有关。GM治疗18小时后，死亡OHC细胞核中AIF的免疫标记很强（图7D）。其他组（细胞培养基对照组、仅KN93组和GM+KN93联合治疗组）没有AIF核标记（图7D）。此外，使用外植体匀浆进行的免疫印迹显示，在给药18小时后，各组AIF在67 kDa时出现单一条带，条带密度没有差异（图7E）。这些结果进一步支持了CaMKKβ的抑制可预防急性内耳创伤诱导的毛细胞死亡，并与AIF参与氨基糖苷类药物诱导的听力损失的文献一致。

八、抑制CaMKKβ可降低噪声对外毛细胞中AMPKα的激活

为了评估CaMKKβ的抑制是否会减少内耳AMPKα的激活，我们根据之前的报告（Oishi等人，2013年）通过将siCaMKKβ输送到RWM上对小鼠进行预处理。尽管通过PSC传递siCaMKKβ比通过RWM传递siCaMKKβ表现出更高的沉默效率（图12），但在PSC传递后，小鼠出现了一些前庭功能障碍（在5-7天内恢复）。所以，为了避免噪声暴露这种潜在的混淆因素，将siRNA传递到RWM上，并评估噪音诱导的ohc中AMPKα (T172)激活是否在暴露后1-3小时内被siCAMMKβ处理减弱。与之前的出版物一致(Hill et al.， 2016; Wu等人，2020)，创伤性噪声暴露导致OHCs中p- ampkα显著增加(图8C, D, t7 = 5.095, p = 0.0014，单样本t检验分析)。且ohcs中p-AMPKα (T172)免疫标记增加的情况，在siCAMMKβ预处理下被抑制(图8E)。免疫标记p- ampk α (T172)灰度半定量分析证实OHCs减少25%(图8F，t4 =5.024，p =0.0074，通过单样本t检验分析)。

这些结果支持CAMMK β是AMPKα上游的一种激酶，且CAMMK β在一定程度上参与了ohc中噪声诱导的AMPKα激活。

总体上，本实施例发现包括暴露于创伤性噪声或KM-FU治疗在内的急性内耳损伤会激活CaMKKβ，从而引起与CaMKKβ级联激活有关的病理信号变化，例如CaMKKβ-AMPKα途径。通过AAV转导沉默CaMKKβ或通过鼓膜内递送siCaMKKβ以预处理能显着减弱NIHL；通过PSC递送siCaMKKβ以预处理，几乎完全防止KM FU诱导的大量OHC损失和听力损失。此外，与CaMKKβ抑制剂KN93共同治疗可完全阻断GM诱导的耳蜗外植体毛细胞丢失。所有这些结果表明，急性内耳创伤激活CaMKKβ是导致毛细胞丢失和听力丧失的原因。此外，本研究采用成年小鼠整体FISH和体内经AAV2.7m8转导的shRNA研究噪声和耳毒性药物所致的听力损失，证明了将这些尖端技术应用于成年小鼠获得性听力损失研究的可行性。

（1）暴露于创伤性噪音或卡那霉素呋塞米治疗可激活 CaMKKβ，而抑制 CaMKKβ 可保护小鼠免受噪音和氨基糖苷类引起的听力损失

我们的结果表明，CaMKKβ 在创伤性噪声暴露后以时间依赖性方式被激活，并且如暴露后 1-3 小时下基底转中 p-CaMKI（T177）免疫标记的 OHC 所示，与初始 OHC 死亡相关，并且标记数量随着时间的推移下降，直到在暴露后 24 天没有看到标记的 OHC。

我们使用不同内耳创伤的功能、形态学证据，包括从暴露于噪音、 KM-FU 治疗中通过 AAV 转导shCaMKKβ、在体内用 siCaMKKβ 沉默，到外植体中通过GM与特定 CaMKKβ 抑制剂 KN93 共同治疗 ，进一步支持 CaMKKβ是预防急性内耳损伤引起 OHC 死亡和听力损失的关键目标。此外，CaMKKβ的激活参与了噪声诱导的IHC突触、OHC病理损失，但是，OHC和IHC突触之间的保护程度存在差异。例如，通过 RWM 递送，将 OHC 中的 CaMKKβ 抑制 40%，可以减少噪声诱导的OHC损失，而噪声诱导的突触损失则完全被阻止。保护 OHC 和 IHC突触的这种差异表明，完全防止 OHC 丢失比保护 IHC 突触更难实现。有趣的是，OHCs 的损失与 ABR 测量的听觉阈值并不完全相关。例如，曝光后距离顶点2.4 mm处没有OHC损失（对应于16 kHz的灵敏度），而在16 kHz处出现明显的听觉阈值偏移。这种差异可能是由于形态完整但生理受损的OHC所致，如DPOAE的OHC功能测量所证明。创伤性噪声暴露使DPOAE振幅在8-36 kHz下从+ 20 dB SPL左右降到0以下，而通过AAV转导shCaMKKβ 治疗或sicamkβ预处理，使DPOAE振幅显著升高，表明OHC功能得到了保留。令人惊讶的是，通过 PSC 递送用 CaMKKβ 预处理几乎完全阻止了 KM-FU 诱导的大量 OHC 损失和听力损失，表明急性KM-FU 病变中 OHC 损失的机制主要通过激活 CaMKKβ 发生的。此外，沉默 CaMKKβ 不会抑制氨基糖苷类抗生素摄入 OHC，因为每次使用 FM1-43 进行评估时对 MTC 没有影响（Meyers 等人，2003；Taylor 等人，2008；Nakanishi 等人，2018）。与 KN93 共同处理完全阻断了外植体中 GM 诱导的 AIF 易位至 OHC 核，并完全阻止了 GM 诱导的毛细胞损失，这与体内保护结果一致，并支持了公认的观点，即不依赖于半胱天冬酶的细胞死亡途径参与噪声和氨基糖苷类引起的听力损失（Jiang et al., 2006; Zheng et al., 2014）。

（2）基于 RNAi 的治疗具有预防内耳创伤引起的听力损失的治疗潜力

我们的结果支持这一观点，证明 AAV 载体对 CaMKKβ 的 RNA 沉默转导可以防止NIHL。由于 shRNA 的大小通常约为 80 个碱基对，因此 AAV 对小包装容量（约 4.5 kb）的内在限制不是问题。我们的研究结果表明，AAV2.7m8 载体在 FVB/NJ 小鼠感觉毛细胞中的感染率非常高，在 IHCs中感染率为 100% ，在OHC基底和中转感染率为90%，OHC顶转中感染率较低，为 40%；之前的出版物一致，通过耳蜗中庭给FVB/NJ p1-2幼鼠注射AAV2.7m8并不影响听觉阈值(Wang et al.， 2013;Yu等人，2014;兰德格等人，2017; Isgrig等人，2019)。此外，我们发现AAV2.7m8单独感染或shControl转导不会改变OHC对创伤性噪声暴露的敏感性。在这项研究中，我们选择 FVB/NJ 小鼠进行 shCaMKKβ AAV 转导，因为 FVB/NJ 小鼠在至少 10 周龄时表现出正常的基线听力，并且对噪声引起的基底转 OHCs 损失的敏感性与CBA /J 小鼠相似，与之前的报告一致（Ho 等人，2014）。通常，幼崽的AAV感染率高于成年人，FVB/NJ小鼠育种者多产，在p1-2注射AAV后，母本继续哺乳幼崽。此外，在病毒注射到FVB/NJ p1-2幼仔后8周内，我们没有看到eGFP诱导的耳毒性，而最近的一份报告显示，当注射到成年CBA/CaJ小鼠中时，Anc80驱动GFP过表达5周会引起耳毒性。（Hashimoto等，2019）。虽然创伤性噪声暴露确实会诱发FVB/NJ小鼠的OHC损失和听力损失，但我们需要提到的是，在FVB/NJ和CBA/J小鼠之间噪声诱导的顶转OHC损失存在差异。虽然我们观察到 FVB/NJ 小鼠的顶端转处 OHCs 的损失，但在 CBA/J 小鼠中未观察到。FVB/NJ小鼠顶端 OHC 对噪声损伤的这种敏感性可能是一种内在更广泛的脆弱性，因为没有噪声暴露的对照 FVB/NJ 小鼠，在顶端转开始处（0-0.25 毫米）显示出一些 OHC 损失（约 5%），即使是在 4 周大时。

与通过AAV转导显示shCaMKKβ减弱NIHL的结果一致，使用鼓膜内通过RWM将siRNA递送到中耳，用siCaMKKβ预处理也显着减弱噪声诱导的IHC突触和OHC和NIHL的损失。此外，通过PSC递送用siCaMKKβ预处理几乎完全防止了由KM-FU处理诱导的大量OHC损失，表明siRNA应用于抗急性内耳损伤的治疗潜力。

总之，我们的研究强调了 CaMKKβ 激活的病理结果。检测了不同内耳损伤模型OHCs的反应。通过 shCaMKKβ AAV 转导或传递 siCaMKKβ 显着减弱了创伤性噪声引起的功能缺陷和 IHC 突触、 OHC 的形态损失，这表明 CaMKKβ 是促成 NIHL 的关键因素。此外，通过 PSC 递送用 siCaMKKβ 预处理完全防止 KM-FU 诱导的大量 OHC 损失和听力损失，证明靶向 CaMKKβ 治疗内耳损伤的重要性。与 CaMKKβ 抑制剂 KN93 共同治疗以对抗 GM诱导的耳蜗外植体毛细胞损失进一步支持了这一观点。基于本发明实施例结果，有利于未来开发用于预防内耳损伤的药物及更佳的治疗策略。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (1)

1.KN93在制备预防庆大霉素所致耳毒性的产品中的用途。