CN115003680A

CN115003680A - 制备核酸寡聚物的方法

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Publication number: CN115003680A
Application number: CN202180011006.7A
Authority: CN
Inventors: 宫川卓也
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2020-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: US20230095584A1; JP7667788B2; JP2023514503A; DK4097117T3; KR20220133919A; CN115003680B; US12391716B2; EP4097117A1; ES2981209T3; WO2021153770A1; EP4097117B1

Abstract

本发明提供用于制备核酸寡聚物的高效的方法，即通过氧化具有亚磷酸三酯键的核酸前体而高效制备具有磷酸三酯键的核酸的方法。具体而言，本发明提供了用于通过亚磷酰胺法制备在其5'末端具有式(I)所示的核苷酸的核酸化合物的方法，该方法包括使式(II)(式(I)和式(II)的取代基的定义如说明书所述)所示的具有亚磷酸三酯键的前体与进行了热处理的含有碘、吡啶和水的氧化溶液反应的步骤。

Description

制备核酸寡聚物的方法

技术领域

本申请主张在2020年1月29日提出申请的日本专利申请2020-012789号的优先权及权益，其全部内容通过引用并入本申请。

本发明涉及用于制备核酸寡聚物的方法。

背景技术

作为核酸寡聚物的DNA和RNA可以用作DNA探针、RNA探针、反义物、核酶、siRNA或适体等，其是有用的材料。

核酸寡聚物可以通过固相合成法合成，在固相合成法中，将核苷酸的亚磷酰胺(以下，称为“酰胺(amidite)”)用作原料。将通过偶联步骤、氧化步骤和去保护步骤在固相载体上使核酸延伸而合成得到的核酸寡聚物从固相载体切下，然后将保护基去除以制备所期望的核酸寡聚物。然而，根据该方法合成得到的核酸寡聚物的纯度未必令人满意，合成方法也并非是高效的(参见非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Tetrahedron 69(2013)3615-3637

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于提供用于制备核酸寡聚物的高效的方法。

用于解决课题的手段

本申请的发明人为了达成上述目的进行了深入研究，结果发现，在核酸寡聚物的合成中，在亚磷酸酯的氧化中使用经热处理的含有碘、水和吡啶的氧化溶液作为氧化溶液，从而可以高效地制备核酸寡聚物，其中，该亚磷酸酯是通过使用亚磷酰胺进行的偶联反应而制备得到。本发明能够提供用于制备核酸寡聚物的高效的方法。

本发明包括以下方面，但并不限于此。

[1]方法，其是用于通过亚磷酰胺法制备核酸化合物的方法，所述核酸化合物在其5'末端具有式(I)所示的核苷酸，

[化学式1]

(其中，

G¹和G²各自独立地表示羟基的保护基，B^a表示可任选地被保护基保护的核酸碱基，

R表示被保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基或OQ’基，

Q'表示与核糖的4’位相连的碳原子的亚甲基、与核糖的4’位相连的碳原子的亚乙基、或与核糖的4’位相连的碳原子的乙叉基，并且

用符号*标记的键表示指向核酸的3'末端侧的键)，

所述方法包括：

使式(II)所示的具有亚磷酸三酯键的前体与于40℃以上进行了热处理的含有碘、吡啶和水的氧化溶液(以下，称为“本发明的氧化溶液”)反应的步骤，

[化学式2]

(其中，

G¹、G²、B^a、R和*与上述的定义相同)。

[2]根据[1]所述的方法，其中，所述具有亚磷酸三酯键的前体表示式(4)所示的核酸化合物，

[化学式3]

(其中，

G¹表示羟基的保护基，

G²相同或不同，各自独立地表示羟基的保护基，

B^a各自独立地表示相同或不同的可被保护基保护的核酸碱基，

R相同或不同，各自独立地表示被保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基或OQ’基，

Q'相同或不同，各自独立地表示与核糖的4’位的碳原子相连的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子相连的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子相连的乙叉基，

Y相同或不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，

n为1以上至200以下的任意整数，

当X表示OZ时，W表示OV基，V表示羟基的保护基，

当X表示R基，W表示OZ所示的基团，

Z表示具有包含固相载体和连接基团的结构的基团，并且

当n为2以上的整数时，式(4)所示的核酸化合物可介由非核苷酸接头组入以代替核酸化合物的5'末端的核苷酸和3'末端的核苷酸之间的至少一个核苷酸)，

含有磷酸三酯键的化合物表示式(5)所示的化合物，

[化学式4]

[其中，

G¹、G²、B^a、R、n、W、X和Y与上述的定义相同，并且

如式(4)中所定义的，可组入非核苷酸接头以代替核苷酸)

[3]根据[2]所述的用于制备核酸寡聚物的方法，其包括：

通过酰胺法将式(5)所示的核酸化合物的链强度延伸至任意链长，以得到式(5')所示的核酸的步骤，

[化学式5]

(其中，

G²、B^a、R、X和W与式(5)中的定义相同，

G⁵表示羟基的保护基、或氢原子，

m是满足m≥n的整数，

Y相同或不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，但至少一个Y为氧原子)；

从式(5')所示的化合物切出式(6)所示的化合物的步骤，

[化学式6]

(其中，

G⁵、R和m与上述的定义相同,

B^c相同或不同，各自独立地表示核酸碱基,

G⁴表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子或羟烷基铵离子，

Y彼此独立地表示氧原子或硫原子，并且其中至少一个是氧原子，且

X₁表示羟基，W₁表示OV基，其中V表示羟基的保护基，或

X₁表示R基且W₁表示羟基)；

以及，将式(6)所示的化合物去保护，以制备式(7)所示的去保护的核酸寡聚物的步骤，

[化学式7]

(其中，

m、Y、G⁴和B^c与上述的定义相同，

R'相同或不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基或OQ’基，

X₁₀和W₁₀各自独立地表示羟基，或

X₁₀表示R'基，W₁₀表示羟基)。

[4]根据上述[2]或[3]所述的方法，其中，所述非核苷酸接头是由氨基酸骨架形成的接头。

[5]根据[4]所述的方法，其中，所述包含氨基酸骨架的接头是具有选自下式(A14-1)、(A14-2)和(A14-3)的结构的接头，

[化学式8]

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，氧化溶液中碘的浓度为0.005至2M。

[7]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，氧化溶液中碘的浓度为0.005至0.2M。

[8]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，氧化溶液中碘的浓度为0.007至0.1M。

[9]根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，氧化溶液中碘的浓度为0.008至0.07M。

[10]根据[1]至[9]中任一项所述的方法，其中，所述氧化溶液是通过将碘、吡啶和水混合来制备的。

[11]根据[10]所述的方法，其中，所述氧化溶液是含有选自由乙腈和四氢呋喃组成的组中的至少一种溶剂的氧化溶液。

[12]根据[10]或[11]所述的方法，其中，所述氧化溶液是还含有乙腈溶剂的氧化溶液。

[13]根据[11]所述的方法，其中，所述氧化溶液的溶剂是通过将吡啶、水、乙腈和四氢呋喃以1至90：1至50：0至90：0至90的体积比混合而得到的溶剂的混合物。

[14]根据[11]或[12]所述的方法，其中，所述氧化溶液的溶剂是通过将吡啶、水和乙腈以1至90：1至50：0至90的体积比混合而得到的溶剂的混合物。

[15]根据[1]至[14]中任一项所述的方法，其中，将所制备的氧化溶液在储存中于40℃以上至60℃以下的范围内熟化直至其用于核酸合成的氧化反应。

[16]根据[1]至[15]中任一项所述的方法，其中，所述核酸化合物是含有核糖核苷(RNA)的核酸化合物。

[17]根据[2]至[16]中任一项所述的方法，其中，所述核酸是核糖核苷(RNA)，并且其2'保护基是式(12)所示的保护基，

[化学式9]

(其中，

Q是1至5的整数，

R^a和R^b相同或不同，各自独立地表示甲基、乙基或氢原子，用符号*标记的键表示OQ基的氧原子，并且

E_w基表示吸电子基团)。

[18]根据[17]所述的方法，其中，R^a和R^b同时为氢原子，E_w表示氰基。

[19]根据[1]至[18]中任一项所述的方法，其中，所述核酸是包含40个以上核苷酸的链长的核糖核苷(RNA)。

[20]根据[1]至[19]中任一项所述的方法，其还包括制备[1]中记载的氧化溶液的步骤。

发明的效果

本发明提供用于制备核酸寡聚物的高效的方法。根据本发明的方法，可以期待所制备得到的核酸寡聚物的纯度的提高。

附图说明

图1为示出本发明的方法中步骤(1)至(6)的路线的图。

具体实施方式

实施例

对下述方法进行说明：用于制备在其5'末端具有上述式(I)所示的核苷酸的核酸化合物的方法，所述方法是通过亚磷酰胺法制备具有高质量的核酸寡聚物的方法，

所述方法包括使前体与经热处理的含有碘、吡啶和水的氧化溶液(称为“本发明的氧化溶液”)反应的步骤，其中，该前体在前体的5'末端具有上式(II)所示的亚磷酸三酯。

对下述方法进行说明：用于制备核酸化合物的方法，其包括下述步骤：使具有亚磷酸三酯键的核酸前体与含有碘、吡啶和水的氧化溶液反应，从而亚磷酸三酯键转化为磷酸三酯键，其中，上述氧化溶液是进行了热处理的氧化溶液。

可以使用碘作为氧化剂，将含有碘、吡啶和水的氧化溶液中的碘浓度(以下，可简称为“浓度(conc.)”)调整至通常为0.005至2M、优选为0.005至0.2M、更优选为0.007至0.1M、进一步优选为0.008至0.07M的范围。

除了碘以外，氧化溶液含有水和吡啶，可使用的溶剂的例子包括乙腈、四氢呋喃(THF)或这些溶剂的任意比例的混合物，其优选的例子包括吡啶和水的混合物，或吡啶、水和乙腈的混合物。

可以使用的溶液具有典型的组成，其相对于溶液总体积而言，含有1至90体积％的吡啶、1至50体积％的水、0至90体积％的乙腈、以及0至90体积％的四氢呋喃，该溶液可以通过以任意比例混合溶剂而使溶液的总体积为100体积％来制备，优选包括其中以任意比例混合5至90体积％的吡啶、2至30体积％的水、0至80体积％的乙腈、和0至80体积％的四氢呋喃而使溶液的总体积为100体积％的溶剂，更优选包括其中混合有90体积％的吡啶和10体积％的水的溶剂，或者其中混合有6体积％的吡啶、30体积％的水和64体积％的乙腈的溶剂。

在制备氧化溶液时，虽然反应体系的搅拌不是必需的，但通常在搅拌功率Pv为0.0至0.5kW/m³的范围内进行搅拌，优选搅拌功率Pv为0.1至0.3kW/m³。

可以对具有高于最终使用的氧化溶液中的碘浓度的碘浓度的氧化溶液进行热处理。在这种情况下，在储存和熟化(aging)之后但使用之前，用溶剂将所得氧化溶液稀释至最终调整的碘浓度。

在其用于核酸合成中的氧化反应之前，将用于本发明方法的氧化步骤中的氧化溶液在20℃以上至80℃以下的温度范围，优选例如为40℃以上至60℃以下、典型地为60℃的温度范围内进行储存和熟化。溶液的储存和熟化期间也是1小时以上，优选例如在24小时至1周的范围内，典型地为24小时。

为了在容器中储存氧化溶液，可以使用玻璃容器、塑料容器或金属容器。塑料容器的例子包括由聚乙烯和聚丙烯等制成的容器，金属容器的例子包括SUS容器或哈氏合金(hastelloy)容器。

氧化溶液可以在空气气氛或惰性气体气氛下储存，并且可以使用的惰性气体的例子包括氩、氮、二氧化碳和氦。

含有磷(亚磷酸)三酯键(phosphorous(phosphite)triester bond)的化合物的例子包括上述式(4)的化合物。与氧化溶液反应而得到的核酸化合物的例子包括式(5)的核酸化合物。

式(4)和式(5)中，化合物的例子包括下式(8)的结构，其中，Q'相同或不同，各自独立地表示与核糖的4'位的碳原子相连的亚甲基、与核糖的4’位的碳原子相连的亚乙基、或与核糖的4’位的碳原子相连的乙叉基。

[化学式10]

(其中，B^a表示可任选地被保护的核酸碱基。)

Z表示的基团的例子包括，包含固相载体、和将固相载体与核酸寡聚物的3'末端的核糖的2'位或3'位的羟基的氧原子连接的连接部分的基团，更具体而言，Z表示式(9)所示的结构：

[化学式11]

式(9)中，Sp表示间隔物。

间隔物(Sp)的例子包括下式(10)所示的结构。

[化学式12]

接头例如可以具有下式(11)所示的结构、或下述式(11)的结构，其中，下式(11)所示的结构中不含有六亚甲基胺部分且因此丙胺基被连接至Si，或者接头可以具有下式(15)所示的结构。

[化学式13]

(其中，

A可以是羟基、烷氧基或烷基。烷氧基的例子包括甲氧基和乙氧基。烷基的例子包括甲基、乙基、异丙基、正丙基。Si表示其与载体表面的羟基的氧原子结合(bind))。

固相载体的例子包括无机多孔载体和有机树脂载体。无机多孔载体的例子包括可控多孔玻璃(CPG)。有机树脂载体的例子包括由聚苯乙烯制成的载体。

作为本发明使用的核酸寡聚物中含有的核苷(核糖和脱氧核糖)的例子，包括DNA、RNA、2'-O-MOE(2-O-甲氧基甲基)、2'-O-Me、2'-F RNA以及上述的LNA，但上述核苷并不限于此。

核酸寡聚物的合成方法包括通过固相合成法使用上述氧化溶液的氧化步骤，其典型地包括下述步骤。

(1)对通过接头被结合至固相载体的具有被保护羟基的核苷的5'位的羟基去保护的步骤，

(2)将上述步骤中得到的5'位的羟基与亚磷酰胺化合物进行偶联反应以得到亚磷酸三酯化合物的步骤，

(3)通过将上述步骤中制备得到的亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯键来制备经延伸的核酸的步骤，或将亚磷酸三酯转化成硫代磷酸三酯的任选步骤，

(4)在固相载体上制备核酸的步骤，其包括重复步骤(1)至(3)的反应循环的任选次数，即，所得核酸的5'位的羟基的去保护步骤、5'位的羟基与酰胺化合物的偶联步骤和所制备得到的亚磷酸三酯的氧化步骤，和

(5)将上述步骤(4)中在固相载体上制备得到的核酸切出，然后将得到的核酸进行去保护反应，以使其从固相载体游离，以制备去保护的核酸寡聚物的步骤，

其中，在上述核酸寡聚物的合成方法中，在步骤(2)或(3)之后，可以包括用亚磷酰胺化合物对未进行偶联反应的5'位的羟基进行封端(capping)的步骤，或者可以在步骤(4)的反应循环的任何步骤之间加入封端步骤。

更具体而言，上述步骤(5)如下进行：将步骤(4)中制备得到的固相载体上的核酸分子按其顺序进行下述反应步骤(5-1)和(5-2)，然后将所得到的反应产物供于反应步骤(5-3)。在此，反应步骤(5-1)可以任选地进行，反应步骤(5-2)可以根据日本专利4705716中描述的方法进行。结果，可以制备从固相载体脱离的核酸寡聚物，其中保护基从核酸分子中被去除，或者羟基被保护的核酸寡聚物。

(5-1)使核酸分子5'末端的羟基的保护基去保护的反应，

(5-2)通过从固相载体切出而使核酸分子游离的反应，和

(5-3)使核酸分子的核糖的2'位的羟基或位于3'末端的核糖的3'位的羟基的保护基去保护的反应。

上述步骤(1)～(6)的路线示于图1，图1所示的步骤(3)或步骤(4)的氧化反应通过使用上述氧化溶液进行。路线A中化学式所含有的取代基的定义与上述定义相同。

根据酰胺法，通过使用核苷酸类型或非核苷酸类型的接头，式(5)的核酸化合物可以进一步延伸至任意链长，然后可以用于制备上述式(5')所示的核酸化合物。另外，从结合至上述式(5')的固相载体的核酸化合物中可仅切出核酸寡聚物，以得到上述式(6)所示的核酸寡聚物，然后将得到的核酸寡聚物进一步去保护，以得到上述式(7)所示的核酸寡聚物。

在下文中，更详细地描述各式中的取代基。

对可以任选地用由B^a表示的保护基来保护的核酸碱基没有特别限制。核酸碱基的例子包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶等。另外，核酸碱基也可任选地被取代基取代。取代基的例子包括卤原子(诸如氟基、氯基、溴基和碘基)、酰基(诸如乙酰基)、烷基(诸如甲基和乙基)、芳烷基(诸如苄基、烷氧基(诸如甲氧基乙基)、氰烷基(诸如氰基乙基)、羟基、酰氧基甲基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基和硝基，以及这些取代基中的两种以上的组合。

在核酸碱基含有环外氨基的情况下，对氨基的保护基没有特别限制，可以使用公众已知的核酸化学领域中使用的保护基，保护基的例子包括苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基和(二甲基氨基)亚甲基，以及这些保护基中的两种以上的组合。

更具体而言，B^a表示下面所示的任一种基团。

[化学式14]

{其中，

R⁴表示氢原子、甲基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或苯甲酰基，

R⁵表示氢原子、乙酰基、异丁酰基或苯甲酰基，

R⁶表示氢原子、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯乙酰基、乙酰基或异丁酰基，

R⁷表示2-氰基乙基，

R⁸表示氢原子、甲基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基或4-甲基苯甲酰基，并且

R⁹表示二甲基氨基亚甲基)。

G¹只要可以作为保护基发挥作用，就可以没有任何特别限制地使用，可广泛使用用于酰胺化合物的公众已知的保护基

G¹优选地表示以下基团。

[化学式15]

(其中，R¹、R²、R³相同或不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基)

R¹、R²、R³之一表示氢原子，其余两个为相同或不同(优选为相同)的烷氧基，作为烷氧基，特别优选甲氧基。

G2只要可以作为保护基发挥作用，就可以没有任何特别限制地使用，并且可以广泛使用用于酰胺化合物的公众已知的保护基。G²的例子包括烷基、烯基、炔基、环烷基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、环烯基烷基、环烷基烷基、环烷基、羟烷基、氨基烷基、烷氧基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳烷基、甲硅烷基、甲硅烷氧基烷基、单烷基甲硅烷基、二烷基甲硅烷基或三烷基甲硅烷基、单烷基甲硅烷氧基烷基、二烷基甲硅烷氧基烷基或三烷基甲硅烷氧基烷基等，这些基团可任选地被一个以上的吸电子基团取代。

G2优选表示被吸电子基团取代的烷基。吸电子基团的例子包括氰基、硝基、烷基磺酰基、卤素原子、芳基磺酰基、三卤代甲基、三烷基氨基等，优选为氰基。

G²的特别优选的例子包括下述基团。

[化学式16]

对于G³而言，两个G³可以彼此结合以形成环结构。优选地，两个G³均为异丙基。

上述R¹、R²、R³和G²的定义中的烷基可以是直链基团或支链，优选地包括含有1至12个碳原子的烷基，更优选含有1至6个碳原子的烷基。烷基的具体例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和己基。由上述取代基定义中的烷氧基组成的烷基部分具有与本说明书中记载烷基定义中所记载的定义相同的定义。

此外，在本发明的方法中，酰胺化合物可以以游离状态或其成盐状态使用。酰胺化合物的盐的例子包括碱加成盐或酸加成盐，并不特别限定于此。碱加成盐的例子包括与诸如钠、镁、钾、钙、铝等的无机碱而成的盐；与诸如甲胺、乙胺、乙醇胺等而成的盐；与碱性氨基酸诸如赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸等的有机碱而成的盐)；以及铵盐。酸加成盐的具体例子包括诸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等的无机酸)；酸加成盐，例如与诸如甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、马来酸、柠檬酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、乙磺酸等的有机酸而成的盐，以及与诸如天冬氨酸、谷氨酸等的酸性氨基酸而成的盐。酰胺化合物的例子包括盐、水合物、溶剂化物、晶体多晶型物等。

当R表示被保护的羟基时，其保护基可以是可用于酰胺法的任一种保护基，例如，可以使用以下基团：除了2'-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、2'-双(2-乙酰氧基)甲基(ACE)、2'-(三异丙基甲硅烷基氧基)甲基(TOM)、2'-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE)、2'-(2-氰基乙氧基)甲基(CEM)、2'-对甲苯磺酰基乙氧基甲基(TEM)、2'-EMM基(WO2006/022323A1)之外，还有WO2013/027843A1和WO2019/208571A1中记载的那些基团。在这些核糖核苷(RNA)的2'保护基中，例举出式(12)所示的上述保护基作为优选的保护基。进一步优选地，作为E_w所示的吸电子基团，例举出式(13)所示的含有氰基的保护基。

[化学式17]

(其中，

q、R^a和R^b与上述定义相同，但R^a和R^b不同时表示氢原子)。

式(13)所示的保护基可以例如根据WO2013/027843A1和WO2019/208571A1中描述的方法合成，具有这种保护基的酰胺化合物可以用于制备核酸化合物。

对于核酸的延伸反应，使用图1的路线A中所示的式(3)所示的酰胺化合物。

作为非核苷酸接头，例举出由氨基酸骨架形成的接头(例如，JP5157168B2或JP5554881B2中记载的由氨基酸骨架形成的接头)。具体而言，作为非限制性例子，例举出式(A14-1)、式(A14-2)或式(A14-3)所示的接头。除了这些接头之外，还例举出WO2012/005368A1、WO2018/182008或WO2019/074110中记载的特定接头。

[化学式18]

核苷酸和酰胺(其中，式(3)中的R基和式(4)中的R'基)也可以从核苷出发进行制备，该核苷根据JP3745226B2等中或WO2001/053528B2、JP2014-221817A1等中记载的公众已知方法或者这些文件中引用的公众已知方法合成。此外，它们可以使用市售化合物，通过符合以下实施例中所述方法或对这些方法进行适当变更的方法来在线制备。

对于上述步骤(1)至(6)中的根据酰胺法的核酸合成，除了根据通常已知的方法(例如，上述JP5157168B2或JP5554881B2中记载的方法)的图1路线中的步骤(3)中涉及的本发明的氧化步骤之外，核酸的延伸反应可以通过重复每一步骤(诸如去保护步骤和缩合步骤)来进行。在下文中描述每一步骤。

G⁴表示氢原子、碱金属离子、铵离子、烷基铵离子或羟烷基铵离子。碱金属离子的例子包括钠离子和锂离子。烷基的具体例子还包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和己基，其具体例子包括铵离子、二乙基铵离子、三乙基铵离子、四丁基铵离子、己基铵离子、二丁基铵离子等。作为羟烷基铵离子，其羟烷基部分的具体例子包括羟甲基、羟乙基、羟正丙基、羟异丙基、羟正丁基和三羟甲基，羟烷基铵的更具体的例子包括三羟甲基铵离子等。

G⁵表示氢原子或保护基，当其表示保护基时，其与G¹中定义相同。当G⁵被去保护时，其为氢原子，在这种情况下，核苷酸化合物也可供于用于核酸延伸反应的一系列步骤。

(核酸延伸反应)

本说明书所使用的“核酸延伸反应”是指通过磷酸二酯键使核苷酸依次连接的用于使寡核苷酸延伸的反应。核酸延伸反应可以按照通常的亚磷酰胺法的工序来进行。核酸延伸反应可以使用应用亚磷酰胺法的核酸自动合成仪等来进行。

核酸寡聚物的链长例如可以是2至200mer、10至150mer、15至110mer。

步骤(1)中的5'去保护步骤是将担载于固相载体上的RNA链末端的5'羟基的保护基的步骤。使用4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMTr基)、4-单甲氧基三苯甲基和4,4',4＂-三甲氧基三苯甲基作为通常的保护基。可以通过使用酸来进行去保护反应。去保护反应的酸的例子包括三氟乙酸、二氯乙酸、三氟乙磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸、对甲苯磺酸等。

步骤(2)中的缩合步骤是图1的路线A中描述的式(3)所示的核苷亚磷酰胺与通过上述去保护步骤经去保护的寡核苷酸链末端的5'羟基连接的反应。使用式(3)或式(A12)所示的酰胺化合物作为用于核酸延伸的亚磷酰胺。另外，作为其他可利用的亚磷酰胺包括2'-OMe、2'-F、2'-o-叔丁基二甲基甲硅烷基、2'-O-甲氧基乙基、2'-H，2'-氟-2'-脱氧-β-D-阿拉伯呋喃糖基等。作为上述核苷亚磷酰胺，使用其中5'羟基被保护基(例如DMTr基)保护的核苷亚磷酰胺。缩合步骤可以通过使用激活上述核苷酸亚磷酰胺的激活剂来进行。激活剂的例子包括5-苄硫基-1H-四氮唑(BTT)、1H-四氮唑、4，5-二氰基咪唑(DCI)、5-乙硫基-1H-四氮唑(ETT)、N-甲基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-MeBIT)、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(BIT)、N-苯基咪唑鎓三氟甲磺酸盐(N-PhIMT)、咪唑鎓三氟甲磺酸盐(IMT)、5-硝基苯并咪唑鎓三氟甲磺酸盐(NBT)、1-羟基苯并三唑(HOBT)和5-(双-3,5-三氟甲基苯基)-1H-四氮唑等。

图1的路线A中所描述的式(3)所示的核苷酸亚磷酰胺(下文称作“酰胺”)如下所示。

由下式(3)表示的化合物：

[化学式19]

{其中

G¹、G²、G³、B^a和R与上述的定义相同)。

在缩合步骤之后，根据需要，可以对未反应的5'羟基进行封端。封端反应可以通过使用诸如乙酸酐-四氢呋喃溶液、苯氧基乙酸酐/N-甲基咪唑溶液的公众已知的封端溶液进行。

工序(3)的氧化工序是将通过上述缩合工序形成的亚磷酸基(phosphite group)转化为磷酸基(phosphate group)或硫代磷酸基(thiophosphate group)的工序。该步骤是使用氧化剂将三价磷转化为五价磷的反应，可以通过使氧化剂作用于担载于固相载体的寡核酸衍生物来进行。

当将亚磷酸基转化为磷酸基时，作为“氧化剂”，例如，可以使用碘。可以通过将其浓度调整至0.005至2M来使用氧化剂。水可以用作用于氧化的氧源，吡啶和其它成分可以用作用于使反应进行的碱。此外，溶剂只要不参与反应，就没有特别限制，并且可用作乙腈、四氢呋喃(THF)或这些溶剂的任意比例的混合溶剂。例如，可以使用碘/水/吡啶/乙腈、或碘/水/吡啶、或碘/水/吡啶/THF。反应温度优选为5℃至50℃，反应的反应时间通常适当地为1分钟至30分钟。相对于1摩尔的担载于固相载体的化合物而言，所用试剂的量在1至100摩尔范围内，优选在1至10摩尔范围内。

当亚磷酸三酯基转化成硫代磷酸基时，作为“氧化剂”，例如可使用硫、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物(Beaucage试剂)、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)、5-苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮(POS)、[(N,N-二甲基氨基次甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮([(N,N-dimethylaminomethyline)amino]-3H-1,2,4-dithiazoline-3-thione，DDTT)和苯乙酰二硫化物(phenylacetyldisulfide，PADS)。氧化剂可以通过用适当的溶剂将其稀释，从而使其浓度被调整至0.001至2M。作为使用的溶剂，只要不参与反应，就没有特别限定，其包括例如二氯甲烷、乙腈、吡啶或这些溶剂的任意混合溶剂。氧化步骤可以在上述封端工序之后进行，或者反之亦可，封端工序可以在氧化步骤之后进行，工序的顺序没有限制。

在步骤(5)中，在将磷基的保护基进行去保护的步骤中，当完成了具有期望序列的核酸的合成时，使胺化合物起作用，以将磷部分的保护基去保护。胺化合物的例子包括例如JP4705716B2中记载的二乙胺等。

在延伸的最后阶段引入的核苷的5'羟基的保护基可以在后述的从固相载体的切出和保护基的去保护的工序之后用于以5'保护基作为标记的柱纯化，或者可以在柱纯化之后将5'羟基的保护基进行去保护。

在步骤(5)中，通常通过使用浓氨水作为切出剂，来进行从固相载体的核酸寡聚物的切出，该核酸寡聚物在固相载体上被延伸成所期望的链。

进而使用氨或胺化合物等，例如从固相载体通过将其切出来回收低聚核苷酸链。胺化合物的例子包括甲胺、乙胺、异丙胺、乙二胺、二乙胺等。

在步骤(6)中，根据WO2006/022323A1、WO2013/027843A1或WO2019/208571A1中记载的方法，可以去除在步骤(5)中从固相载体切出的核酸化合物(6)的核糖的2位或3位的羟基的保护基，以得到去保护的核酸寡聚物(7)。

可以根据本发明的方法制备的核酸寡聚物的例子包括核酸寡聚物中所含有的核苷是RNA、DNA以及具有2'-O-MOE、2'-O-Me、2'-F的RNA、及LNA的核酸寡聚物，但不限于此。例如，包括下述文献中记载的各种核苷：Xulong，Shen等人，Nucleic Acids Research,2018,Vol.46,No.46,1584-1600；及Daniel O'Reilly等人，Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2,546-558。

作为在本发明方法中可使用的核酸寡聚物的典型例子，除了实施例中记载的例子之外，还示出了下述例子，但并不限于此。

在下文中，在序列的说明中，u是尿苷，c是胞苷，A是腺苷，或G是鸟苷。

例举出具有如WO2019/060442中记载的、具有下述序列(B)和(C)的核酸寡聚物。

序列(B)：5'-AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT-3'(反义)(序列号3)21mer

序列(C)：5'-GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAUmdTdT-3'(正义)(序列号4)21mer

序列(B)和序列(C)中，Um为2'-O-甲基尿苷，Cm为2'-o-甲基胞苷，或dt为胸苷。

例举出Daniel O'Reilly等人，Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2,546-558中记载的核酸寡聚物。其典型的例子包括具有下述序列(D)的核酸寡聚物。

序列(D)：5'-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3'(序列号5)36mer

例举出JP4965745B2中记载的核酸寡聚物。其典型的例子包括具有下述序列(E)的核酸寡聚物。

序列(E)：5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3'49mer。CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC(序列号6),GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU(序列号7)。

序列(E)中，“P”由在下式(A5)中用波浪线划分的局部结构表示。

例举出在Nucleic Acids Research,2019,Vol.47,No.2:547中记载的、具有下述序列(F)的核酸寡聚物。

序列(F)：5'-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3'(序列号8)67mer

例举出JP2015-523856，173中记载的、具有下述序列(G)的核酸寡聚物。

序列(E)：5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3'(序列号9)94mer

例举出JP2017-537626中记载的核酸寡聚物。其典型的例子包括具有下述序列(F)、(G)、(H)和(J)的核酸寡聚物。

序列(F)：5'-AGUCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'(序列号10)100mer

序列(G)：5'-GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3'(序列号11)113mer

序列(H)：5'-dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3'(序列号12)113mer

序列(H)中，dt是胸苷，dc是2'-脱氧胞苷，dA是2'-脱氧腺苷，或dG是2'-脱氧鸟苷。

序列(J)：5'-AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU-3'(序列13)113mer

序列(J)中，Um是2'-O-甲基尿苷，Cm是2'-O-甲基胞苷，Am是2'-O-甲基腺苷，Gm是2'-O-甲基鸟苷，或s是硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰。

实施例

以下，通过实施例来更详细地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

<测定方法>

首先，在以下试验中使用的各种测定方法如下所示。

通过HPLC测定寡核苷酸的纯度。

HPLC测定条件如下表1所示。

(测定方法1：寡核苷酸纯度的测定)

[表1]

(测定方法2：寡核苷酸收量的测定)

测定上述粗产物的OD260。OD260表示在1mL溶液(pH＝7.5)中每10mm光程长度的于UV260nm的吸光度。通常，已知对于RNA1 OD＝40μg，因此基于上述OD260的测定值计算收量。

<寡核苷酸的固相合成>

序列(I)：5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3'(序列号1、2)3mer

在上述序列(I)中，“A”由下式(A1)中用波浪线划分的局部结构表示。“C”由下式(A2)中用波浪线划分的局部结构表示。“G”由下式(A3)中用波浪线划分的局部结构表示。“U”由下式(A4)中用波浪线划分的局部结构表示。“P”由下式(A5)中用波浪线划分的局部结构表示。在此，5'末端的“A”由下式(A6)中用波浪线划分的局部结构表示。此外，3'末端的“G”由下式(A7)中用波浪线划分的局部结构表示。

AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC(序列号1)

GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC(序列号2)

[化学式20]

[化学式21]

[化学式22]

[化学式23]

[化学式24]

[化学式25]

[化学式26]

使用可控多孔玻璃(CPG)作为固相载体，使用NTS M-4MX-E(NIHON TECHNOSERVICE CO.LTD制)作为核酸合成仪，根据亚磷酰胺固相合成法，由3'端向5'端合成由上述序列(I)形成的寡核苷酸。当使用NTS M-4MX-E(NIHON TECHNO SERVICE CO.LTD制)时，以约1μmol的规模进行合成。另外，合成中使用US2012/0035246中的实施例2记载的尿苷EMM酰胺、其实施例3中记载的胞苷EMM酰胺、其实施例4中记载的腺苷EMM酰胺、其实施例5中记载的鸟苷EMM酰胺，以及WO2017/188042中记载的化合物(3)，并使用三氯乙酸甲苯的高纯度溶液作为解封闭(deblocking)溶液，使用5-苄巯基-1H-四氮唑作为缩合剂，碘溶液作为氧化剂，使用苯氧基乙酸酐溶液和N-甲基咪唑溶液作为封端溶液，

[化学式27]

[化学式28]

[化学式29]

[化学式30]

[化学式31]

接着，示出通过本发明的方法制备的核酸寡聚物的具体制备实施例。在此，在下列实施例中，根据本发明方法制备的寡核苷酸是具有上述序列号1和2的核酸寡聚物。

此外，下述实施例和比较例中描述的鸟苷衍生物表示下述结构式所示的化合物。下述结构式中所示的环示意性地表示CPG。

[化学式32]

(实施例1)

使用担载有1.07μmol鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)、和分别由式(A8)、式(A9)、式(A10)式(A11)或式(A12)所示的各酰胺，通过NTS M-4MX-E(NIHON TECHNO SERVICECO.LTD制)，由3’端向5’端自动地合成序列(I)所示的核酸寡聚物。对于用于自动合成的工序，首先，将3％三氯乙酸甲苯溶液以每次1.4mL液体转移(liquid-transfer)至CPG，5'位的三苯甲基保护基被去保护，随后，将0.3mL的各酰胺和0.4mL的作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑液体转移至CPG，并在5'位的羟基上进行偶联反应。随后，在含有17mM碘的乙腈：水：吡啶＝35.2：52.9：11.4(重量％)溶液于60℃储存161小时之后，且在合成前不久，向其中加入乙腈以制备含有10mM碘的乙腈：水：吡啶＝58.2：34.2：7.4(重量％)溶液，将0.7mL所得溶液进行液体转移，从而将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，使用0.5mL的0.1M苯氧基乙酸酐溶液和0.5mL的10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，从而在偶联反应未进行的反应点进行封端反应。再将这些步骤重复总计52次，从而在CPG载体上合成序列(I)所示的序列的核酸寡核苷酸，用3％三氯乙酸甲苯溶液将5'位的三苯甲基保护基去保护。然后，用752μL氨水和252μL乙醇处理其上担载有全部量寡核苷酸的CPG载体，以使核酸寡聚物从固相载体脱离，并通过氮喷雾去除氨水和乙醇。接着，将游离的寡核苷酸溶解于400μL二甲基亚砜，在其中加入硝基甲烷5.3μL和搅拌子后，在用搅拌器搅拌的条件下，于30℃向其中注入用分子筛4A进行了脱水处理的1M四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液530μL(相对于每1摩尔保护基而言为10.2摩尔TBAF)，将所得混合物保温4小时以进行2'-EMM保护基的保护基去保护。通过沉淀操作得到粗产物。收量为8.6mg，纯度为61％。对于得到的粗产物，通过使用上述测定方法1中的方法来测定寡核苷酸的纯度，此外，通过使用上述测定方法2的方法来测定寡核苷酸的收量。

(实施例2)

使用担载有1.02μmol鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)，和分别由式(A8)、式(A9)、式(A10)式(A11)或式(A12)所示的各酰胺，通过NTS M-4MX-E(NIHON TECHNO SERVICECO.LTD制)，由3’端向5’端自动地合成序列(I)所示的核酸寡聚物。对于用于自动合成的工序，首先，将3％三氯乙酸甲苯溶液以每次1.4mL液体转移至CPG，5'位的三苯甲基保护基被去保护，随后，将0.3mL的各酰胺和0.4mL的作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑液体转移至CPG，并在5'位的羟基上进行偶联反应。随后，在含有17mM碘的乙腈：水：吡啶＝35.2：52.9：11.4(重量％)溶液于60℃储存24小时之后，且在合成前不久，向其中加入乙腈以制备含有10mM碘的乙腈：水：吡啶＝58.2：34.2：7.4(重量％)溶液，将0.7mL所得溶液进行液体转移，从而将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，使用0.5mL的0.1M苯氧基乙酸酐溶液和0.5mL的10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，从而在偶联反应未进行的反应点进行封端反应。再将这些步骤重复总计52次，从而在CPG载体上合成序列(I)所示的序列的核酸寡核苷酸，用3％三氯乙酸甲苯溶液将5'位的三苯甲基保护基去保护。然后，用752μL氨水和252μL乙醇处理其上担载有全部量寡核苷酸的CPG载体，以使核酸寡聚物从固相载体脱离，并通过氮喷雾去除氨水和乙醇。接着，将游离的寡核苷酸溶解于400μL二甲基亚砜，在其中加入硝基甲烷5.3μL和搅拌子后，在用搅拌器搅拌的条件下，于30℃向其中注入用分子筛4A进行了脱水处理的1M四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液530μL(相对于每1摩尔保护基而言为10.2摩尔TBAF)，将所得混合物保温4小时，以进行2'-EMM保护基的保护基去保护。通过沉淀操作得到粗产物。收量为7.3mg，纯度为59％。对于得到的粗产物，通过使用上述测定方法1中的方法来测定寡核苷酸的纯度，此外，通过使用上述测定方法2的方法来测定寡核苷酸的收量。

(实施例3)

使用担载有1.03μmol鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)，和分别由式(A8)、式(A9)、式(A10)式(A11)或式(A12)所示的各酰胺，通过NTS M-4MX-E(NIHON TECHNO SERVICECO.LTD制)，由3’端向5’端自动地合成序列(I)所示的核酸寡聚物。对于用于自动合成的工序，首先，将3％三氯乙酸甲苯溶液以每次1.4mL液体转移至CPG，5'位的三苯甲基保护基被去保护，随后，将0.3mL的各酰胺和0.4mL的作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑液体转移至CPG，并在5'位的羟基上进行偶联反应。随后，在含有17mM碘的乙腈：水：吡啶＝35.2：52.9：11.4(重量％)溶液于40℃储存24小时之后，且在合成前不久，向其中加入乙腈以制备含有10mM碘的乙腈：水：吡啶＝58.2：34.2：7.4(重量％)溶液，将0.7mL所得溶液进行液体转移，从而将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，使用0.5mL的0.1M苯氧基乙酸酐溶液和0.5mL的10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，从而在偶联反应未进行的反应点进行封端反应。再将这些步骤重复总计52次，从而在CPG载体上合成序列(I)所示的序列的核酸寡核苷酸，用3％三氯乙酸甲苯溶液将5'位的三苯甲基保护基去保护。然后，用752μL氨水和252μL乙醇处理其上担载有全部量寡核苷酸的CPG载体，以使核酸寡聚物从固相载体脱离，并通过氮喷雾去除氨水和乙醇。接着，将游离的寡核苷酸溶解于400μL二甲基亚砜，在其中加入硝基甲烷5.3μL和搅拌子后，在用搅拌器搅拌的条件下，于30℃向其中注入用分子筛4A进行了脱水处理的1M四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液530μL(相对于每1摩尔保护基而言为10.2摩尔TBAF)，将所得混合物保温4小时以进行2'-EMM保护基的保护基去保护。通过沉淀操作得到粗产物。收量为8.1mg，纯度为57％。对于得到的粗产物，通过使用上述测定方法1中的方法来测定寡核苷酸的纯度，此外，通过使用上述测定方法2的方法来测定寡核苷酸的收量。

(参考例1)

使用担载有1.00μmol鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)，和分别由式(A8)、式(A9)、式(A10)式(A11)或式(A12)所示的各酰胺，通过NTS M-4MX-E(NIHON TECHNO SERVICECO.LTD制)，由3’端向5’端自动地合成序列(I)所示的核酸寡聚物。对于用于自动合成的工序，首先，将3％三氯乙酸甲苯溶液以每次1.4mL液体转移至CPG，5'位的三苯甲基保护基被去保护，随后，将0.3mL的各酰胺和0.4mL的作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑液体转移至CPG，并在5'位的羟基上进行偶联反应。随后，将含有50mM碘的吡啶：水＝88.7：10.0(重量％)的溶液于25℃储存24小时，将0.7mL所得溶液进行液体转移，从而将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，使用0.5mL的0.1M苯氧基乙酸酐溶液和0.5mL的10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，从而在偶联反应未进行的反应点进行封端反应。再将这些步骤重复总计52次，从而在CPG载体上合成序列(I)所示的序列的核酸寡核苷酸，用3％三氯乙酸甲苯溶液将5'位的三苯甲基保护基去保护。然后，用752μL氨水和252μL乙醇处理其上担载有全部量寡核苷酸的CPG载体，以使核酸寡聚物从固相载体脱离，并通过氮喷雾去除氨水和乙醇。接着，将游离的寡核苷酸溶解于400μL二甲基亚砜，在其中加入硝基甲烷5.3μL和搅拌子后，在用搅拌器搅拌的条件下，于30℃向其中注入用分子筛4A进行了脱水处理的1M四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液530μL(相对于每1摩尔保护基而言为10.2摩尔TBAF)，将所得混合物保温4小时，以进行2'-EMM保护基的保护基去保护。通过沉淀操作得到粗产物。收量为7.9mg，纯度为42％。对于得到的粗产物，通过使用上述测定方法1中的方法来测定寡核苷酸的纯度，此外，通过使用上述测定方法2的方法来测定寡核苷酸的收量。

(参考例2)

使用担载1.04μmol鸟苷衍生物的可控多孔玻璃(CPG)，和分别由式(A8)、式(A9)、式(A10)式(A11)或式(A12)所示的各酰胺，通过NTS M-4MX-E(NIHON TECHNO SERVICECO.LTD制)，由3’端向5’端自动地合成序列(I)所示的核酸寡聚物。对于用于自动合成的工序，首先，将3％三氯乙酸甲苯溶液以每次1.4mL液体转移至CPG，5'位的三苯甲基保护基被去保护，随后，将0.3mL的各酰胺和0.4mL的作为缩合剂的5-苄巯基-1H-四氮唑液体转移至CPG，并在5'位的羟基上进行偶联反应。随后，将含有10mM碘的乙腈：水：吡啶＝58.2：34.4：7.2(重量％)的溶液于25℃储存24小时，将0.7mL所得溶液进行液体转移，从而将亚磷酸基转化为磷酸基。接着，使用0.5mL的0.1M苯氧基乙酸酐溶液和0.5mL的10％N-甲基咪唑/10％2,6-二甲基吡啶乙腈溶液，从而在偶联反应未进行的反应点进行封端反应。再将这些步骤重复总计52次，从而在CPG载体上合成序列(I)所示的序列的核酸寡核苷酸，用3％三氯乙酸甲苯溶液将5'位的三苯甲基保护基去保护。然后，用752μL氨水和252μL乙醇处理其上担载有全部量寡核苷酸的CPG载体，以使核酸寡聚物从固相载体脱离，并通过氮喷雾去除氨水和乙醇。接着，将游离的寡核苷酸溶解于400μL二甲基亚砜，在其中加入硝基甲烷5.3μL和搅拌子后，在用搅拌器搅拌的条件下，于30℃向其中注入用分子筛4A进行了脱水处理的1M四正丁基氟化铵(TBAF)的二甲基亚砜溶液530μL(相对于每1摩尔保护基而言为10.2摩尔TBAF)，将所得混合物保温4小时，以进行2'-EMM保护基的保护基去保护。通过沉淀操作得到粗产物。收量为7.8mg，纯度为35％。对于得到的粗产物，通过使用上述测定方法1中的方法来测定寡核苷酸的纯度，此外，通过使用上述测定方法2的方法来测定寡核苷酸的收量。

实施例1至3和参考例1至2的试验结果示于表2。

[表2]

根据表中的上述结果，将使用于40℃以上的温度进行了热处理的本发明的氧化溶液的情况与使用参考例1和2的氧化溶液的情况进行比较，可以得到具有高纯度的核酸寡聚物。

产业上的可利用性

本发明提供了用于制备核酸寡聚物的高效方法。此外，可以期待提高根据核酸寡聚物的制备方法制备得到的核酸寡聚物的纯度的提高。

序列表自由文本

序列表的序列号1至13表示根据本发明的制备方法制备的寡核苷酸的核苷酸序列。

Claims

1.方法，其是用于通过亚磷酰胺法制备核酸化合物的方法，所述核酸化合物在其5'末端具有式(I)所示的核苷酸，

[化学式1]

其中，

R表示被保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基或OQ'基，

Q'表示与核糖的4'位相连的碳原子的亚甲基、与核糖的4'位相连的碳原子的亚乙基、或与核糖的4'位相连的碳原子的乙叉基，并且

用符号*标记的键表示指向核酸的3'末端侧的键，

所述方法包括：

使式(II)所示的具有亚磷酸三酯键的前体与于40℃以上进行了热处理的含有碘、吡啶和水的氧化溶液反应的步骤，

[化学式2]

其中，

G¹、G²、B^a、R和*与上述的定义相同。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述具有亚磷酸三酯键的前体表示式(4)所示的核酸化合物，

[化学式3]

其中，

G¹表示羟基的保护基，

G²相同或不同，各自独立地表示羟基的保护基，

B^a相同或不同，各自独立地表示可被保护基保护的核酸碱基，

R相同或不同，各自独立地表示被保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基或OQ'基，

Q'相同或不同，各自独立地表示与核糖的4'位的碳原子相连的亚甲基、与核糖的4'位的碳原子相连的亚乙基、或与核糖的4'位的碳原子相连的乙叉基，

Y相同或不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，

n为1以上至200以下的任意整数，

当X表示OZ时，W表示OV基，V表示羟基的保护基，

当X表示R基时，W表示OZ所示的基团，

Z表示具有包含固相载体和连接基团的结构的基团，并且

当n为2以上的整数时，式(4)所示的核酸化合物可介由非核苷酸接头组入以代替核酸化合物的5'末端的核苷酸和3'末端的核苷酸之间的至少一个核苷酸，

含有磷酸三酯键的化合物表示式(5)所示的化合物，

[化学式4]

其中，

G¹、G²、B^a、R、n、W、X和Y与上述的定义相同，并且

如式(4)中所定义的，可组入非核苷酸接头以代替核苷酸。

3.根据权利要求2所述的用于制备核酸寡聚物的方法，其包括：

[化学式5]

其中，

G²、B^a、R、X和W与式(5)中的定义相同，

G⁵表示羟基的保护基、或氢原子，

m是满足m≥n的整数，

Y相同或不同，各自独立地表示氧原子或硫原子，但至少一个Y为氧原子；

从式(5')所示的化合物切出式(6)所示的化合物的步骤，

[化学式6]

其中，

G⁵、R和m与上述的定义相同，

B^c相同或不同，各自独立地表示核酸碱基，

X₁表示羟基，W₁表示OV基，其中V表示羟基的保护基，或

X₁表示R基且W₁表示羟基；

[化学式7]

其中，

m、Y、G⁴和B^c与上述的定义相同，

R'相同或不同，各自独立地表示羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基或OQ'基，

X₁₀和W₁₀各自独立地表示羟基，或

X₁₀表示R'基，W₁₀表示羟基。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，所述非核苷酸接头是由氨基酸骨架形成的接头。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述包含氨基酸骨架的接头是具有选自下式(A14-1)、(A14-2)和(A14-3)的结构的接头，

[化学式8]

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，氧化溶液中碘的浓度为0.005至2 M。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，氧化溶液中碘的浓度为0.005至0.2M。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，氧化溶液中碘的浓度为0.007至0.1M。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，氧化溶液中碘的浓度为0.008至0.07M。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述氧化溶液是通过将碘、吡啶和水混合来制备的。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述氧化溶液是含有选自由乙腈和四氢呋喃组成的组中的至少一种溶剂的氧化溶液。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述氧化溶液是还含有乙腈溶剂的氧化溶液。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述氧化溶液的溶剂是通过将吡啶、水、乙腈和四氢呋喃以1至90：1至50：0至90：0至90的体积比混合而得到的溶剂的混合物。

14.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述氧化溶液的溶剂是通过将吡啶、水和乙腈以1至90：1至50：0至90的体积比混合而得到的溶剂的混合物。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，将所制备的氧化溶液在储存中于40℃以上至60℃以下的范围内熟化直至其用于核酸合成的氧化反应。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述核酸化合物是含有核糖核苷(RNA)的核酸化合物。

17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中，所述核酸是核糖核苷(RNA)，并且其2'保护基是式(12)所示的保护基，

[化学式9]

其中，

q是1至5的整数，

R^a和R^b相同或不同，各自独立地表示甲基、乙基或氢原子，

用符号*标记的键表示OQ基的氧原子，并且

E_w基表示吸电子基团。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，R^a和R^b同时为氢原子，E_w表示氰基。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中，所述核酸是包含40个以上核苷酸的链长的核糖核苷(RNA)。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其还包括制备权利要求1中记载的氧化溶液的步骤。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，G¹表示以下基团：

[化学式10]

其中，R¹、R²和R³相同或不同，各自独立地表示氢原子或烷氧基。

22.根据权利要求2至21中任一项所述的方法，其中，所述固相载体包括无机多孔载体。