ES2981209T3 - Proceso de preparación de oligómero de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un procedimiento eficaz para preparar un oligómero de ácido nucleico, es decir, un procedimiento para preparar un ácido nucleico que tiene un enlace triéster de fosfato de manera eficaz mediante la oxidación de un precursor de ácido nucleico que tiene un enlace triéster de fosfito. En concreto, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un compuesto de ácido nucleico que tiene en su extremo 5' un nucleótido representado por la fórmula (I) mediante un método de fosforamidita, que comprende una etapa de reacción de un precursor que tiene un enlace triéster de fosfito representado por una fórmula (II) (las definiciones de sustituyentes de las fórmulas (I) y (II) se describen en la Descripción) con una solución de oxidación sometida a un tratamiento térmico que contiene yodo, piridina y agua. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso de preparación de oligómero de ácido nucleico

Campo técnico

Esta solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la Solicitud de patente japonesa n.° 2020-012789 presentada el 29 de enero de 2020.

La presente invención se refiere a un proceso para preparar un oligómero de ácido nucleico.

Antecedentes de la técnica

El ADN y el ARN, que son un oligómero de ácido nucleico, se pueden aplicar como una sonda de ADN, una sonda de ARN, un antisentido, una ribozima, un siARN o un aptámero, etc., que es un material útil.

Un oligómero de ácido nucleico puede sintetizarse mediante una síntesis en fase sólida, y en la síntesis en fase sólida, se usa una fosforamidita de un nucleótido (en lo sucesivo, denominada "amidita") como materia prima. Un oligómero de ácido nucleico que se sintetiza alargando un ácido nucleico a través de una etapa de acoplamiento, una etapa de oxidación y una etapa de desprotección en un soporte sólido, se corta de un soporte sólido, y luego se elimina un grupo protector para preparar un oligómero de ácido nucleico deseado. Sin embargo, la pureza del oligómero de ácido nucleico sintetizado de acuerdo con este método no fue necesariamente satisfactoria y, por lo tanto, el método de síntesis no fue eficiente (véase la Bibliografía no de patente 1).

Listado de citas

Bibliografía no de patente

BNP 1: Tetrahedron 69 (2013) 3615-3637

Sumario de la invención

Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso eficaz para preparar un oligómero de ácido nucleico.

Solución al problema

Los presentes inventores han estudiado intensamente para lograr el objetivo anterior y, como resultado, pueden descubrir que en una síntesis de oligómero de ácido nucleico, una solución de oxidación tratada térmicamente que contiene yodo, agua y piridina se usa como una solución de oxidación en una oxidación de éster de fosfito que se produce mediante una reacción de acoplamiento usando fosforamidita, de este modo se puede preparar eficazmente un oligómero de ácido nucleico. La presente invención puede proporcionar un proceso eficiente para preparar un oligómero de ácido nucleico.

La presente invención abarca los siguientes aspectos, pero no se limita a los mismos.

[1] Un proceso para preparar un compuesto de ácido nucleico que tiene en su extremo 5' un nucleótido representado por la fórmula (I):

(en donde

cada uno de G1 y G2 representa independientemente entre sí un grupo protector para el grupo hidroxi, y Ba representa una base de ácido nucleico que puede protegerse opcionalmente con un grupo protector,

R representa un grupo hidroxi protegido, un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo metoxi, un grupo 2-metoxietilo o un grupo OQ',

Q' representa un grupo metileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, un grupo etileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa o un grupo etilideno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, y

un enlace marcado con el símbolo * representa un enlace que se dirige al lado extremo 3' de un ácido nucleico) mediante un método de fosforamidita,

que comprende una etapa de hacer reaccionar un precursor que tiene un enlace triéster de fosfito representado por una fórmula (II):

(en donde

G1, G2, Ba, R y * son los mismos que se han definido anteriormente)

con una solución de oxidación sometida a un tratamiento térmico a 40 °C o más que contiene yodo, piridina y agua (en lo sucesivo, denominada "solución de oxidación de la presente invención").

[2] El proceso de acuerdo con [1] en donde el precursor que tiene un enlace triéster de fosfito representa un compuesto de ácido nucleico representado por la fórmula (4):

G1 representa un grupo protector para el grupo hidroxi,

G2 es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo protector para el grupo hidroxi, Ba representa independientemente entre sí la misma o diferente base de ácido nucleico que puede protegerse con un grupo protector,

R es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo hidroxi protegido, un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo metoxi, un grupo 2-metoxietilo o un grupo OQ',

Q' es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo metileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, un grupo etileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa o un grupo etilideno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa,

Y es igual o diferente y cada uno representa independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, n es cualquier número entero de 1 o más a 200 o menos,

cuando X representa OZ, W representa un grupo OV y V representa un grupo protector para el grupo hidroxi, cuando X representa un grupo R, W representa un grupo representado por OZ,

Z representa un grupo que tiene una estructura que comprende un soporte sólido y un grupo de conexión, y cuando n es un número entero de 2 o más, el compuesto de ácido nucleico representado por la fórmula (4) puede incorporarse mediante un enlazador no nucleotídico en lugar de al menos un nucleótido entre nucleótidos en el extremo 5' y el extremo 3' del compuesto de ácido nucleico), el compuesto que contiene un enlace triéster de fosfato representa un compuesto representado por la fórmula (5):

[en donde

G1, G2, Ba, R, n, W, X e Y son los mismos que se han definido anteriormente, y

como se define en la fórmula (4), se puede incorporar un enlazador no nucleotídico en lugar de un nucleótido)

[3] El proceso para preparar oligómero de ácido nucleico de acuerdo con [2], que comprende

una etapa de alargamiento de una resistencia de cadena de un compuesto de ácido nucleico representado por la fórmula (5) a cualquier longitud de cadena mediante un método de amidita para obtener un ácido nucleico representado por la fórmula (5'):

(en donde

G2, Ba, R, X y W son los mismos que los definidos en la fórmula (5),

G5 representa un grupo protector para el grupo hidroxi, o un átomo de hidrógeno,

m es un número entero que satisface m>n,

Y es igual o diferente y cada uno representa independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, con la condición de que al menos uno de Y sea un átomo de oxígeno),

una etapa de cortar el compuesto representado por la fórmula (6):

(en donde

G5, R y m son los mismos que se han definido anteriormente,

Bc es igual o diferente y cada uno representa independientemente una base de ácido nucleico,

G4 representa un átomo de hidrógeno, un ion de metal alcalino, un ion de amonio, un ion de alquil amonio o un ion de hidroxialquil amonio,

Y representa independientemente entre sí un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, y al menos uno de los mismos es un átomo de oxígeno, y

Xi representa un grupo hidroxi, y Wi representa un grupo OV en donde V representa un grupo protector para el grupo hidroxi, o

Xi representa un grupo R y Wi representa un grupo hidroxi)

del compuesto representado por la fórmula (5'),

adicionalmente, una etapa de desprotección del compuesto representado por la fórmula (6) para preparar un oligómero de ácido nucleico desprotegido representado por la fórmula (7):

(en donde

m, Y, G4, y Bc son los mismos que se han definido anteriormente,

R' es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo hidroxi, un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo metoxi, un grupo 2-metoxietilo o un grupo OQ',

Q' es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo metileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, un grupo etileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa o un grupo etilideno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, cada uno de X<10>y W<10>representa independientemente entre sí un grupo hidroxi, o

X<10>representa un grupo R', y W<10>representa un grupo hidroxi).

[4] El proceso de acuerdo con los puntos [2] o [3] anteriores, en donde el enlazador no nucleotídico es un enlazador compuesto por una cadena principal de aminoácidos.

[5] El proceso de acuerdo con [4] en donde el enlazador que comprende una cadena principal de aminoácidos es un enlazador que tiene una estructura seleccionada de las siguientes fórmulas (A14-1), (A14-2) y (A14-3).

[6] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5] en donde una concentración de yodo en una solución de oxidación es de 0,005 a 2 M.

[7] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5] en donde una concentración de yodo en una solución de oxidación es de 0,005 a 0,2 M.

[8] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5] en donde una concentración de yodo en una solución de oxidación es de 0,007 a 0,1 M.

[9] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5] en donde una concentración de yodo en una solución de oxidación es de 0,008 a 0,07 M.

[10] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [9] en donde la solución de oxidación se prepara mezclando yodo, piridina y agua.

[11] El proceso de acuerdo con [10] en donde la solución de oxidación es una solución de oxidación que contiene al menos un disolvente seleccionado de un grupo que consiste en acetonitrilo y tetrahidrofurano.

[12] El proceso de acuerdo con [10] u [11] en donde la solución de oxidación es una solución de oxidación que contiene además disolvente de acetonitrilo.

[13] El proceso de acuerdo con [11] en donde un disolvente de la solución de oxidación es una mezcla de disolventes que se obtiene mezclando piridina, agua, acetonitrilo y tetrahidrofurano en una relación en volumen de 1 a 90:1 a 50:0 a 90:0 a 90.

[14] El proceso de acuerdo con [11] o [12] en donde un disolvente de la solución de oxidación es una mezcla de disolventes que se obtiene mezclando piridina, agua y acetonitrilo en una relación en volumen de 1 a 90:1 a 50:0 a 90.

[15] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [14] en donde la solución de oxidación preparada se deja envejecer en almacenamiento hasta su uso en la reacción de oxidación para la síntesis de ácido nucleico dentro de un intervalo de 40 °C o superior a 60 °C o menos.

[16] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [15] en donde el compuesto de ácido nucleico es un compuesto de ácido nucleico que contiene un ribonucleósido (ARN).

[17] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [2] a [16] en donde el ácido nucleico es ribonucleósido (ARN), y su grupo protector 2' es un grupo protector representado por la fórmula (12):

(en donde

q es un número entero de 1 a 5,

Ra y Rb son iguales o diferentes y cada uno representa independientemente un grupo metilo, un grupo etilo o un átomo de hidrógeno,

un enlace marcado con el símbolo * representa un átomo de oxígeno del grupo OQ, y el grupo Ew representa un grupo atractor de electrones).

[18] El proceso de acuerdo con [17] en donde Ra y Rb son un átomo de hidrógeno al mismo tiempo, y Ew representa un grupo ciano.

[19] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [18] en donde el ácido nucleico es un ribonucleósido (ARN) que comprende 40 o más nucleótidos en longitudes de cadena.

[20] El proceso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [19], que comprende además una etapa de preparación de una solución de oxidación descrita en [1].

Efecto de la invención

La presente invención proporciona un proceso eficaz para preparar un oligómero de ácido nucleico. De acuerdo con un proceso de la presente invención, se puede esperar una mejora en la pureza de un oligómero de ácido nucleico preparado.

Breve descripción de los dibujos

[fig.1] La figura 1 es una figura que muestra un esquema de las etapas (1) a (6) en el proceso de la presente invención.

Modo para llevar a cabo la invención

Se describe el siguiente proceso: el proceso para preparar un compuesto de ácido nucleico que tiene en su extremo 5' el nucleótido representado por la fórmula (I) anterior, siendo dicho proceso un proceso para preparar un oligómero de ácido nucleico con alta calidad, mediante un método de fosforamidita,

que comprende una etapa de hacer reaccionar el precursor que tiene un triéster de fosfito representado por la fórmula (II) anterior en un extremo 5' del precursor con una solución de oxidación tratada térmicamente que contiene yodo, piridina y agua (denominada "solución de oxidación de la presente invención").

Se describe el siguiente proceso: el proceso para preparar un compuesto de ácido nucleico que comprende una etapa de hacer reaccionar un precursor de ácido nucleico que tiene un enlace triéster de fosfito con una solución de oxidación que contiene yodo, piridina y agua, y de este modo el enlace triéster de fosfito se convierte en un enlace triéster de fosfato, en donde la solución de oxidación anterior es la solución de oxidación que se somete a un tratamiento térmico.

El yodo se puede usar como agente oxidante, y la concentración (en lo sucesivo, puede abreviarse como "conc.") de yodo en la solución de oxidación que contiene yodo, piridina y agua se ajusta a un intervalo de normalmente 0,005 a 2 M, preferiblemente 0,005 a 0,2 M, más preferiblemente de 0,007 a 0,1 M, y más preferiblemente de 0,008 a 0,07 M.

La solución de oxidación contiene agua y piridina además de yodo, y los ejemplos del disolvente o disolventes que pueden usarse incluyen acetonitrilo, tetrahidrofurano (THF) o una mezcla de estos disolventes en una relación arbitraria de los mismos, y ejemplos preferidos de los mismos incluyen un mezcla de piridina y agua, o una mezcla de piridina, agua y acetonitrilo.

La solución que se puede usar tiene una composición típica que contiene del 1 al 90 % en volumen de piridina, del 1 al 50 % en volumen de agua, del 0 al 90 % en volumen de acetonitrilo, y del 0 al 90 % en volumen de tetrahidrofurano hasta un volumen total de la solución, que se puede preparar mezclando los disolventes en una relación arbitraria para hacer un volumen total de la solución del 100 % en volumen, e incluyen preferiblemente un disolvente en donde del 5 al 90 % en volumen de piridina, del 2 al 30 % en volumen de agua, del 0 al 80 % en volumen de acetonitrilo y del 0 al 80 % en volumen de tetrahidrofurano se mezclan en una relación arbitraria para hacer un volumen total de la solución del 100 % en volumen, e incluyen más preferiblemente un disolvente en donde se mezclan 90 % en volumen de piridina y 10 % en volumen de agua, o un disolvente en donde se mezclan 6 % en volumen de piridina, 30 % en volumen de agua y 64 % en volumen de acetonitrilo.

La agitación del sistema de reacción no es esencial para preparar la solución de oxidación, sin embargo, normalmente la agitación se realiza dentro de un intervalo de 0,0 a 0,5 kW/m3 como la potencia de agitación Pv, preferiblemente de 0,1 a 0,3 kW/m3.

Se puede realizar un tratamiento térmico a una solución de oxidación que tenga una concentración de yodo más alta que la de la solución de oxidación finalmente utilizada. En ese caso, la solución de oxidación resultante se diluye con disolvente o disolventes después del almacenamiento y el envejecimiento, pero antes de su uso, hasta una concentración de yodo finalmente ajustada.

La solución de oxidación que se utilizará en la etapa de oxidación en el proceso de la presente invención se almacena y envejece a una temperatura dentro de un intervalo de 20 °C o superior a 80 °C o menos, preferiblemente, por ejemplo, 40 °C o superior a 60 °C o menos, típicamente 60 °C, antes de su uso en la reacción de oxidación en una síntesis de ácido nucleico. Además, el período de almacenamiento y envejecimiento de la solución es de 1 hora o más, preferiblemente, por ejemplo, dentro de un intervalo de 24 horas a 1 semana, típicamente 24 horas.

Para el almacenamiento de la solución de oxidación en un recipiente, se puede usar un recipiente de vidrio, un recipiente de plástico o un recipiente metálico. Los ejemplos del recipiente de plástico incluyen un recipiente hecho de polietileno y polipropileno, etc., y los ejemplos del recipiente metálico incluyen un recipiente de SUS o un recipiente de hastelloy.

La solución de oxidación se puede almacenar en atmósfera de aire o atmósfera de gas inerte, y los ejemplos del gas inerte que se pueden usar incluyen argón, nitrógeno, dióxido de carbono y helio.

Los ejemplos de los compuestos que contienen un enlace triéster de fósforo (fosfito) incluyen el compuesto de fórmula (4) anterior. Los ejemplos del compuesto de ácido nucleico resultante de la reacción con la solución de oxidación incluyen el compuesto de ácido nucleico de fórmula (5).

En las fórmulas (4) y (5), ejemplos de los compuestos, en donde Q' es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo metileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, un grupo etileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, o un grupo etilideno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, incluyen las siguientes estructuras de fórmula (8).

(en donde Ba representa una base de ácido nucleico que puede estar opcionalmente protegida).

Los ejemplos del grupo representado por Z incluyen, un grupo que comprende un soporte sólido y un resto de conexión que conecta el soporte sólido y un átomo de oxígeno de un grupo hidroxi en la posición 2' o 3' de una ribosa en el extremo 3' del oligómero de ácido nucleico y, más específicamente, Z representa una estructura representada por la fórmula (9):

en la fórmula (9), Sp representa un espaciador.

Los ejemplos del espaciador (Sp) incluyen la estructura representada por la siguiente fórmula (10).

El Enlazador puede tener, por ejemplo, una estructura representada por la siguiente fórmula (11), o una estructura de la fórmula (11) en donde un resto de hexametilenamina no está contenido en la estructura representada por la siguiente fórmula (11) y, por lo tanto, el grupo aminopropilo está enlazado a Si, o el Enlazador puede tener una estructura representada por la siguiente fórmula (15).

[Quím. 13]

(en donde

A puede ser un grupo hidroxi, un grupo alcoxi o un grupo alquilo. Los ejemplos del grupo alcoxi incluyen un grupo metoxi y un grupo etoxi. Los ejemplos del grupo alquilo incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo isopropilo, un grupo n-propilo. Si representa que se une a un átomo de oxígeno de un grupo hidroxi en una superficie de soporte). Los ejemplos del soporte sólido incluyen un soporte poroso inorgánico y un soporte de resina orgánica. Los ejemplos del soporte poroso inorgánico incluyen vidrio de poro controlado (CPG). Los ejemplos del soporte de resina orgánica incluyen un soporte hecho de poliestireno.

Los ejemplos del nucleósido (ribosa y desoxirribosa) contenido en un oligómero de ácido nucleico que se utilizará en la presente invención incluyen ADN, ARN, 2-O-MOE (2-O-metoximetilo), 2'-O-Me, ARN 2'-F y el L<n>A anterior, y el nucleósido anterior no se limita a los mismos.

Un método de síntesis de oligómero de ácido nucleico que comprende la etapa de oxidación usando la solución de oxidación anterior mediante una síntesis en fase sólida comprende típicamente las siguientes etapas.

(1) una etapa de desprotección del grupo hidroxi en la posición 5' de un nucleósido que tiene hidroxilo protegido que está unido a un soporte sólido a través de un enlazador,

(2) una etapa de someter el grupo hidroxilo resultante en la posición 5' en la etapa anterior a una reacción de acoplamiento con un compuesto de fosforamidita para obtener un compuesto de triéster de fosfito,

(3) una etapa de preparación de un ácido nucleico alargado oxidando el triéster de fosfito producido en la etapa anterior a un enlace de triéster de fosfato, o una etapa opcional de conversión del triéster de fosfito en un triéster de tiofosfato,

(4) una etapa de preparación de un ácido nucleico sobre el soporte sólido, que comprende repetir un número opcional del ciclo de reacción de las etapas (1) a (3), es decir, la etapa de desprotección de un grupo hidroxi en la posición 5' del ácido nucleico resultante, una etapa de acoplamiento del grupo hidroxi en la posición 5' con un compuesto de amidita y una etapa de oxidación del triéster de fosfito producido, y

(5) una etapa de cortar el ácido nucleico producido en el soporte sólido en la etapa anterior (4), y luego someter el ácido nucleico resultante a una reacción de desprotección, para liberarlo del soporte sólido y preparar un oligómero de ácido nucleico desprotegido, en donde en el método de síntesis del oligómero de ácido nucleico anterior, la etapa (2) o (3), puede ir seguida de una etapa de taponado de un grupo hidroxi en la posición 5' que no ha procedido con una reacción de acoplamiento con un compuesto de fosforamidita, o la etapa de taponado puede añadirse entre cualquier etapa del ciclo de reacción en la etapa (4).

Más específicamente, la etapa (5) anterior se lleva a cabo sometiendo una molécula de ácido nucleico sobre un soporte sólido que se produce en la etapa (4) a las siguientes etapas de reacción (5-1) y (5-2) en el orden de las mismas y luego sometiendo los productos de reacción resultantes a la etapa de reacción (5-3). En este caso, la etapa de reacción (5-1) puede realizarse opcionalmente, y la etapa de reacción (5-2) puede realizarse de acuerdo con un método descrito en la patente JP n.° 4705716. Como resultado, se puede producir un oligómero de ácido nucleico en donde se elimina un grupo protector de una molécula de ácido nucleico procedente del soporte sólido, o un oligómero de ácido nucleico en donde se protege un grupo hidroxi.

(5-1) una reacción de desprotección de un grupo protector para el grupo hidroxi en el extremo 5' de una molécula de ácido nucleico,

(5-2) una reacción de liberación de la molécula de ácido nucleico mediante el corte de un soporte sólido, y (5-3) una reacción de desprotección de un grupo protector para un grupo hidroxi en la posición 2' de una ribosa de una molécula de ácido nucleico o en la posición 3' de una ribosa ubicada en el extremo 3'.

Los esquemas de las etapas anteriores (1) a (6) se muestran en la figura 1. La reacción de oxidación en la etapa (3) o la etapa (4) como se representa en la Figura 1 se lleva a cabo usando la solución de oxidación anterior. La definición de los sustituyentes contenidos en la fórmula química en el Esquema A es la misma que se definió anteriormente.

El compuesto de ácido nucleico de fórmula (5) puede alargarse adicionalmente a cualquier longitud de cadena usando un tipo nucleotídico o un tipo no nucleotídico de Enlazador de acuerdo con un método de amidita, y puede usarse a continuación en una preparación de un compuesto de ácido nucleico representado por la fórmula anterior (5'). Además, solo se puede cortar un oligómero de ácido nucleico de un compuesto de ácido nucleico que está unido a un soporte sólido de la fórmula (5') anterior para obtener un oligómero de ácido nucleico representado por la fórmula (6) anterior, y el oligómero de ácido nucleico resultante se desprotege adicionalmente a continuación para obtener un oligómero de ácido nucleico representado por la fórmula (7) anterior.

En lo sucesivo en el presente documento, el sustituyente en cada fórmula se describe con más detalle.

Una base de ácido nucleico que puede protegerse opcionalmente con un grupo protector representado por Ba no está particularmente limitada. Los ejemplos de la base de ácido nucleico incluyen adenina, citosina, guanina, uracilo, timina, 5-metil citosina, pseudo uracilo, 1-metil pseudo uracilo y los otros. También la base de ácido nucleico puede estar opcionalmente sustituida por uno o más sustituyentes. Los ejemplos del sustituyente incluyen un átomo de halógeno (tal como grupo fluoro, grupo cloro, grupo bromo y grupo yodo), grupo acilo (tal como grupo acetilo), grupo alquilo (tal como grupo metilo y grupo etilo), grupo arilalquilo (tal como grupo bencilo; grupo alcoxi (tal como grupo metoxietilo), grupo cianoalquilo (tal como grupo cianoetilo), grupo hidroxi, grupo aciloximetilo, grupo amino, grupo monoalquilamino, grupo dialquilamino, grupo carboxi, grupo ciano y grupo nitro, así como una combinación de estos dos o más de los sustituyentes.

En el caso en el que una base de ácido nucleico contiene un grupo amino exocíclico, el grupo protector para el grupo amino no está particularmente limitado, y se puede usar el grupo protector usado en un campo de química de ácidos nucleicos conocido públicamente, y los ejemplos del grupo protector incluyen grupo benzoílo, grupo 4-metoxibenzoílo, grupo acetilo, grupo propionilo, grupo butirilo, grupo isobutirilo, grupo fenilacetilo, grupo fenoxiacetilo, grupo 4-terc-butilfenoxiacetilo, grupo 4-isopropilfenoxiacetilo y grupo (dimetilamino)metileno, así como una combinación de dos o más de estos grupos protectores.

Ba representa más específicamente cualquier grupo indicado a continuación.

(en donde

R4 representa un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo fenoxiacetilo, un grupo 4-terc-butilfenoxiacetilo, un grupo 4-isopropilfenoxiacetilo, un grupo fenilacetilo, un grupo acetilo o un grupo benzoílo,

R5 representa un átomo de hidrógeno, un grupo acetilo, un grupo isobutirilo o un grupo benzoílo,

R6 representa un átomo de hidrógeno, un grupo fenoxiacetilo, un grupo 4-terc-butilfenoxiacetilo, un grupo 4-isoproilfenoxiacetilo, un grupo fenilacetilo, un grupo acetilo o un grupo isobutirilo,

R7 representa un grupo 2-cianoetilo,

R8 representa un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, un grupo benzoílo, un grupo 4-metoxibenzoílo o un grupo 4-metilbenzoílo, y

R9 representa un grupo dimetilaminometileno).

G1 se puede usar sin ninguna limitación particular siempre que pueda funcionar como un grupo protector, y un grupo protector conocido públicamente usado para el compuesto de amidita se puede usar ampliamente G1 representa preferiblemente los siguientes grupos.

(en donde R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y cada uno representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alcoxi).

Uno de R1, R2 y R3 representa un átomo de hidrógeno, y los dos restantes de los mismos son el mismo o diferente (preferiblemente el mismo) grupo alcoxi, y como un grupo alcoxi, se prefiere particularmente un grupo metoxi.

G2 se puede usar sin ninguna limitación particular siempre que pueda funcionar como un grupo protector, y se puede usar ampliamente un grupo protector conocido públicamente para un compuesto de amidita. Ejemplos de G2 incluyen un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo haloalquilo, un grupo arilo, un grupo heteroarilo, un grupo arilalquilo, un grupo cicloalquenil alquilo, un grupo cicloalquilalquilo, un grupo cicloalquilalquilo, un grupo hidroxialquilo, un grupo aminoalquilo, un grupo alcoxialquilo, un grupo heterociclilalquenilo, un grupo heterociclilalquilo, un grupo heteroarilalquilo, un grupo sililo, un grupo sililoxialquilo, un grupo mono, di o tri-alquilsililo, un mono, di o tri-alquilsilil-loxialquilo y los demás, y estos grupos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos atractores de electrones.

G2 representa preferiblemente un grupo alquilo sustituido por un grupo atractor de electrones. Los ejemplos del grupo atractor de electrones incluyen un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo alquilsulfonilo, un átomo de halógeno, un grupo arilsulfonilo, un grupo trihalometilo, un grupo trialquilamino y los demás, y preferiblemente un grupo ciano. Como ejemplo particularmente preferible de G2 se incluyen los siguientes grupos.

Para G3, dos G3 pueden combinarse entre sí para formar una estructura cíclica. Preferiblemente, ambos G3 son un grupo isopropilo.

El grupo alquilo según las definiciones de los anteriores R1, R2, R3 y G2 puede ser un grupo de cadena lineal o una cadena ramificada, y preferiblemente incluyen un grupo alquilo que contiene de 1 a 12 átomos de carbono, y más preferiblemente un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos específicos de grupo alquilo incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo n-propilo, un grupo isopropilo, un grupo n-butilo, un grupo isobutilo, un grupo terc-butilo, un grupo n-pentilo, un grupo isopentilo, y un grupo hexilo. Una parte de grupo alquilo compuesta por el grupo alcoxi en la definición de los sustituyentes anteriores tiene la misma definición que la descrita en la definición de grupo alquilo descrita en el presente documento.

Además, en el proceso de la presente invención, se puede usar un compuesto de amidita en un estado libre o en un estado de sal del mismo. Los ejemplos de sales del compuesto de amidita incluyen una sal de adición de base o una sal de adición de ácido, que no se limitan particularmente a las mismas. Los ejemplos de la sal de adición de base incluyen sales con bases inorgánicas tales como sodio, magnesio, potasio, calcio, aluminio y otras; sales con base orgánica tales como metilamina, etilamina, etanolamina y otras; sales con aminoácidos básicos tales como lisina, ornitina, arginina y los demás); y sal de amonio. Los ejemplos específicos de sales de adición de ácido incluyen ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y los otros); sales de adición de ácido, por ejemplo, sales con ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido láctico, ácido maleico, ácido cítrico, metanosulfónico ácido, ácido trifluorometansulfónico, ácido etanosulfónico y los otros, y sales con aminoácidos ácidos tales como ácido aspártico, ácido glutámico y los otros. Los ejemplos de los compuestos de amidita abarcan sales, hidratos, solvatos, polimorfos cristalinos y los otros.

Cuando R representa un grupo hidroxi protegido, su grupo protector puede ser cualquiera que pueda usarse en un método de amidita y, por ejemplo, pueden usarse los siguientes: los descritos en el documento WO 2013/027843 A1 y el documento WO 2019/208571 A1, además del grupo 2-terc-butildimetilsililo (TBDMS), grupo 2'-bis(2-acetoxi)metilo (ACE), grupo 2'-(triisopropilsililoxi)metilo (TOM), grupo 2'-(2-cianoetoxi)etilo (CEE), grupo 2'-(2-cianoetoxi)metilo (CEM), grupo 2'-para-toluilsulfoniletoximetilo (TEM), grupo 2'-EMM (WO 2006/022323 A1). Entre el grupo protector 2' de estos ribonucleósidos (ARN), el grupo protector mencionado anteriormente representado por la fórmula (12) se ejemplifica como un grupo protector preferible. Más preferiblemente, como el grupo atractor de electrones representado por Ew, se ejemplifica un grupo protector que contiene un grupo ciano representado por la fórmula (13).

(en donde

q, Ra y Rb son los mismos que se han definido anteriormente, con la condición de que Ra y Rb no representan un átomo de hidrógeno al mismo tiempo).

El grupo protector representado por la fórmula (13) se puede sintetizar, por ejemplo, de acuerdo con un método descrito en el documento WO 2013/027843 A1 y el documento WO 2019/208571 A1, y el compuesto de amidita que tiene dicho grupo protector se puede usar en una preparación de un compuesto de ácido nucleico.

Para una reacción de elongación de ácido nucleico, se usa el compuesto de amidita de fórmula (3) a mostrado en el Esquema A de la Figura 1.

Como enlazador no nucleotídico, se ejemplifica un enlazador compuesto por una cadena principal de aminoácidos (por ejemplo, un enlazador compuesto por una cadena principal de aminoácidos como se describe en JP 5157168 B2 o JP 5554881 B2). Específicamente, como un ejemplo no limitante, se ejemplifica un enlazador representado por la fórmula (A14-1), la fórmula (A14-2) o la fórmula (A14-3). Además de estos enlazadores, se ejemplifica un enlazador particular como se describe en WO 2012/005368 A1, WO 2018/182008 o WO 2019/074110.

Un nucleótido y una amidita en donde un grupo R en la fórmula (3) y un grupo R' en la fórmula (4) también se pueden preparar a partir de nucleósidos que se sintetizan de acuerdo con métodos conocidos públicamente descritos en JP 3745226 B2 y así sucesivamente, o WO 2001/053528 B2, JP 2014-221817 A1 o públicamente métodos a los que se hace referencia en estos documentos. Además, pueden prepararse usando un compuesto disponible comercialmente de acuerdo con el método descrito en los Ejemplos a continuación o métodos con modificaciones apropiadas para estos métodos.

Para una síntesis de ácido nucleico de acuerdo con el método de amidita en las etapas (1) a (6) mencionadas anteriormente, se puede llevar a cabo una reacción de elongación de ácido nucleico repitiendo cada etapa, tal como una etapa de desprotección y una etapa de condensación, excepto para la etapa de oxidación relacionada con la presente invención en la etapa (3) en el esquema de la Figura 1 de acuerdo con un método generalmente conocido (por ejemplo, el método descrito en los documentos anteriores JP 5157168 B2 o JP 5554881 B2). En lo sucesivo en el presente documento, se describe cada etapa.

G4 representa un átomo de hidrógeno, un ion de metal alcalino, un ion de amonio, un ion de alquil amonio o un ion de hidroxialquilamonio. Los ejemplos del ion de metal alcalino incluyen un ion de sodio y un ion de litio. También ejemplos específicos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo, npentilo, isopentilo y hexilo, y ejemplos específicos de los mismos incluyen ion amonio, ion dietilamonio, ion trietilamonio, ion de tetrabutilamonio, ion de hexilamonio, ion de dibutilamonio y los demás. También como ion hidroxialquilamonio, ejemplos específicos de parte hidroxialquilo del mismo incluyen hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxi n-propilo, hidroxi isopropilo, hidroxi n-butilo y tris hidroxi metilo, y ejemplos más específicos de hidroxialquil amonio incluyen ion tris hidroximetil amonio y los demás.

G5 representa un átomo de hidrógeno o un grupo protector, y cuando representa un grupo protector, es el mismo que se define en G1. Cuando G5 se desprotege, es un átomo de hidrógeno, y el compuesto nucleotídico en el caso también se proporciona en una serie de etapas para la reacción de elongación de ácido nucleico.

(Reacción de elongación de ácido nucleico)

Como se usa en el presente documento, "reacción de elongación de ácido nucleico" significa una reacción para alargar el oligonucleótido uniendo el nucleótido secuencialmente a través del enlace fosfodiéster. La reacción de elongación de ácido nucleico se puede llevar a cabo de acuerdo con los procedimientos del método general de fosforamidita. La reacción de elongación de ácido nucleico puede llevarse a cabo con un sintetizador automático de ácido nucleico, y así sucesivamente, que aplica un método de fosforamidita.

La longitud de cadena de un oligómero de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, de 2 a 200 meros, de 10 a 150 meros, y de 15 a 110 meros.

Una etapa de desprotección 5' en la etapa (1) es una etapa en la que un grupo protector de un grupo hidroxilo 5' en el extremo de la cadena de ARN está soportado en el soporte sólido. Como grupo protector general, se usan el grupo 4,4'-dimetoxitritilo (grupo DMTr), el grupo 4-monometoxitritilo y el grupo 4,4',4"-trimetoxitritilo. Se puede llevar a cabo una reacción de desprotección usando un ácido. Los ejemplos del ácido para la reacción de desprotección incluyen ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético, ácido trifluoroetansulfónico, ácido tricloroacético, ácido metansulfónico, ácido trifluorometansulfónico, ácido tricloroacético, ácido metansulfónico, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido p-toluensulfónico y los demás.

La etapa de condensación en la etapa (2) es una reacción en la que una fosforamidita de nucleósido representada por la siguiente fórmula (3) como se describe en el Esquema A de la Figura 1 se une a un grupo hidroxilo 5' en el extremo de la cadena de oligonucleótido desprotegido por la etapa de desprotección anterior. Como la fosforamidita a usar en la elongación de ácido nucleico, se usa un compuesto de amidita representado por la fórmula (3) o la fórmula (A12). Además, como otra fosforamidita disponible, 2'-OMe, 2'-F, grupo 2'-o-terc-butildimetilsililo, grupo 2'-O-metoxietilo, 2'-H, 2'-fluoro-2'-desoxi-p-D-arabinofuranosilo y los demás están incluidos. Como la fosforamidita de nucleósido anterior, se usan aquellas en las que el grupo hidroxilo 5' está protegido por un grupo protector (por ejemplo, el grupo DMTr). La etapa de condensación se puede llevar a cabo usando un activador que activa la fosforamidita de nucleótido mencionada anteriormente. Los ejemplos del activador incluyen 5-benciltio-1H-tetrazol (BTT), IH-tetrazol, 4,5-dicianoimidazol (DCI), 5-etiltio-1H-tetrazol (ETT), N-metilbencimidazoliotriflato (N-MeBIT), triflato de bencimidazolio (BIT), triflato de N-fenilimidazolio (N-PhIMT), triflato de imidazolio (IMT), triflato de 5-nitrobencimidazolio (NBT), 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) y 5-(bis-3,5-trifluorometilfenil)-1H-tetrazol, y los demás. La fosforamidita de nucleótido representada por la fórmula (3) como se describe en el Esquema A de la Figura 1 (en lo sucesivo, denominada "amidita") se muestra a continuación.

Un compuesto representado por la fórmula:

(en donde

G1, G2, G3, Ba, y R son los mismos que se han definido anteriormente).

Después de la etapa de condensación, según sea necesario, el grupo hidroxilo 5' sin reaccionar puede taponarse. La reacción de taponado puede llevarse a cabo utilizando una solución de taponado conocida públicamente, tal como una solución de anhídrido acético-tetrahidrofurano y una solución de anhídrido fenoxiacético/N-metilimidazol. La etapa de oxidación de la etapa (3) es una etapa para convertir un grupo fosfito que se forma mediante la etapa de condensación anterior en un grupo fosfato o un grupo tiofosfato. Esta etapa es una reacción de conversión de un fósforo trivalente en fósforo pentavalente usando un agente oxidante, que puede llevarse a cabo actuando un agente de oxidación en derivados de ácido oligonucleico soportados sobre un soporte sólido.

Cuando un grupo fosfito se convierte en un grupo fosfato, como "agente de oxidación", por ejemplo, se puede usar un yodo. El agente de oxidación se puede usar ajustando una concentración del mismo de 0,005 a 2 M. El agua se puede usar como fuente de oxígeno para la oxidación, y la piridina y los otros se pueden usar como base para continuar con la reacción. Además, los disolventes no están particularmente limitados siempre que no impliquen la reacción, y pueden usarse como acetonitrilo, tetrahidrofurano (THF) o disolventes mixtos de estos disolventes en una relación arbitraria. Por ejemplo, se puede usar yodo/agua/piridina/acetonitrilo, o yodo/agua/piridina, o yodo/agua/piridina/THF. La temperatura de reacción es preferiblemente de 5 °C a 50 °C. El período de reacción de la reacción suele ser apropiado que sea de 1 min. a 30 min. La cantidad del reactivo usado está dentro de un intervalo de 1 a 100 mol(es), preferiblemente de 1 a 10 mol(es), en oposición a 1 mol del compuesto soportado como soporte sólido.

Cuando un grupo triéster de fosfito se convierte en un grupo tiofosfato, como "agente de oxidación", por ejemplo, también se pueden usar, un azufre, 3H-1,2-benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido (reactivo de Beaucage), 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona (ADTT), 5-fenil-3H-1,2,4-ditiazol-3-ona (POS), [(N,N-dimetilaminometilina)amino]-3H-1,2,4-ditiazolina-3-tiona (DDTT) y fenilacetildisulfuro (PADS). El agente de oxidación se puede usar diluyéndolo con un disolvente apropiado para ajustar de 0,001 a 2 M. Los disolventes que se van a usar no están particularmente limitados siempre que no impliquen la reacción e incluyen, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, piridina o cualquier disolvente mixto de estos disolventes. La etapa de oxidación puede llevarse a cabo después del procedimiento de taponado mencionado anteriormente, o viceversa, el procedimiento de taponado puede llevarse a cabo después de la etapa de oxidación, y el orden de los procedimientos no está limitado.

Entre la etapa (5), en la etapa de desproteger un grupo protector para un grupo fósforo, cuando se completa una síntesis de un ácido nucleico que tiene una secuencia deseable, se actúa un compuesto de amina para desproteger un grupo protector de una parte de fósforo. Los ejemplos del compuesto de amina incluyen, por ejemplo, dietilamina y los otros como se describe en JP 4705716 B2.

El grupo protector para el grupo hidroxilo 5' de un nucleósido introducido en la última etapa de un alargamiento puede usarse para una purificación en columna con el grupo protector 5' como una etiqueta después de los procedimientos mencionados a continuación de un corte de un soporte sólido y una desprotección de un grupo protector, o el grupo protector para el grupo hidroxilo 5' puede desprotegerse después de la purificación en columna. En la etapa (5), el corte de un oligómero de ácido nucleico que se alarga a una cadena deseable en un soporte sólido a partir de un soporte sólido se lleva a cabo normalmente usando un agua de amonio concentrada como agente de corte.

Además, usando amoníaco o compuesto de amina o los otros, por ejemplo, se recupera una cadena de oligonucleótidos cortándola de un soporte sólido. Los ejemplos del compuesto de amina incluyen metilamina, etilamina, isopropilamina, etilendiamina, dietilamina y los otros.

En la etapa (6), un grupo protector para el grupo hidroxi en la posición 2 o en la posición 3 de la ribosa del compuesto de ácido nucleico (6) que se corta de un soporte sólido en la etapa (5) puede eliminarse de acuerdo con un método descrito en WO 2006/022323 A1, WO 2013/027843 A1, o WO 2019/208571 A1 para obtener un oligómero de ácido nucleico desprotegido (7).

Los ejemplos del oligómero de ácido nucleico que se puede preparar de acuerdo con el proceso de la presente invención incluyen aquellos en donde un nucleósido contenido en el oligómero de ácido nucleico es ARN, ADN, así como ARN que tiene 2-O-MOE, 2'-O-Me, 2'-F y LNA, que no se limita a los mismos. Por ejemplo, están incluidos diversos nucleósidos descritos en Xiulong, Shen et al., Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46, n.° 46, 1584-1600, y Daniel O'Reilly et al., Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, n.° 2, 546-558.

Como ejemplos típicos de oligómero de ácido nucleico que se pueden usar en el proceso de la presente invención, se indican los siguientes ejemplos además de los ejemplos descritos en ejemplos de trabajo, que no se limitan a los mismos.

En lo sucesivo en el presente documento, en una descripción de una secuencia, u es uridina, c es citidina, A es adenosina o G es guanosina.

Se ejemplifica un oligómero de ácido nucleico que tiene las siguientes secuencias (B) y (C) como se describe en WO 2019/060442.

Secuencia (B): 5'-AUGGAAUmACUCUUGGUUmACdTdT-3' (Antisentido) (Secuencia n.° 3) 21 mer Secuencia (c ): 5'-GUmAACmCmAAGAGUmAUmUmCmCmAumdTdT-3' (Sentido) (Secuencia n.° 4) 21 mer En la secuencia (B) y la secuencia (C), Um es 2'-O-metiluridina, Cm es 2'-o-metilcitidina o dt es timidina.

Se ejemplifica un oligómero de ácido nucleico como se describe en Daniel O'Reilly et al., Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, n.° 2, 546-558. Los ejemplos típicos del mismo incluyen un oligómero de ácido nucleico que tiene la siguiente secuencia (D).

Secuencia (D): 5'-AGAGCCAGCCUUCUUAUUGUUUUAGAGCUAUGCUGU-3' (Secuencia n.° 5) 36 mer

Se ejemplifica un oligómero de ácido nucleico como se describe en JP 4965745 B2. Los ejemplos típicos del mismo incluyen un oligómero de ácido nucleico que tiene la siguiente secuencia (E). Secuencia (E):

5'-CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-P-GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGG UU-3' 49 mer. CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC (Secuencia N.° 6), GGCUGU-UGUCAUACUUCUCAUGGUU (Secuencia N.° 7).

En la Secuencia (E), "P" se representa mediante una estructura parcial separada por líneas onduladas en la siguiente fórmula (A5).

Un oligómero de ácido nucleico que tiene la siguiente secuencia (F) como se describe en Nucleic Acids Research, 2019, Vol. 47, n.° 2: Se ejemplifica 547.

Secuencia (F):

5'-ACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAA AGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3' (Secuencia n.° 8) 67 mer Se ejemplifica un oligómero de ácido nucleico que tiene la siguiente secuencia (G) como se describe en JP 2015-523856, 173.

Secuencia (E):

5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGC CCUCCCUUGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3'

(Secuencia n.° 9) 94 mer

Se ejemplifica un oligómero de ácido nucleico como se describe en JP 2017-537626. Los ejemplos típicos del mismo incluyen un oligómero de ácido nucleico que tiene las siguientes secuencias (F), (G), (H) y (J).

Secuencia (F):

5'-AGUCCUCAUCCCCCUCAAGCGUUUUAGAGCUAGUAAUAGCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC UUUU-3' (Secuencia n.° 10) 100 mer

Secuencia (G):

5'-GCAGAUGUAGUGUUUCCACAGUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAU AGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACC GAGUCGGUGCUUUUUUU-3' (Secuencia n.° 11) 113 mer

Secuencia (H):

5'-dAdGdTdCdCdTdCdAdTdCdTdCdCdCdTdCdAdAdGdCGUUUAAGAGCUAUG CUGGUAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUG AAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU-3' (Secuencia n.° 12) 113 mer En la secuencia (H), dt es timidina, dc es 2'-desoxicitidina, dA es 2'-desoxiadenosina o dG es 2'-desoxiquanosina.

Secuencia (J):

5'-AmsGmsUmsCCUCAUCUCCCUCAAGCGUUUAAGAGCUAUGCUGGUAACA GCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGG CACCGAGUCGGUGCUUUUmsUmsUmsU-3' (Secuencia 13) 113 mer

En la Secuencia (J), Um es 2-O-metiluridina, Cm es 2'-O-metilcitidina, Am es 2'-O-metiladenosina, Gm es 2'-O-metilcuanosina, o s es modificación de fosforotioato.

Ejemplos

En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se explica con más detalle mediante ejemplos de trabajo, y la presente invención no se limita a estos ejemplos.

<Método de medición>

En primer lugar, a continuación se muestran diversos métodos de medición usados en las siguientes pruebas.

Una pureza del oligonucleótido se midió por HPLC.

En la siguiente Tabla 1 se muestra una condición de medición de HPLC.

(Método de medición 1: Medición de la pureza del oligonucleótido)

[Tabla 11

Columna ACQUITY UPLC Oligonucleótido BEH C18, 2,1 mm * 100 mm, 1,7 pm * dos columnas

Caudal 0,2 ml/min

Longitud de onda de 260 nm

detección

Fase móvil A Acetato de hexilamina acuoso 100 mM (pH = 7,0)

Fase móvil B Acetato de hexilamina acuoso 500 mM: acetonitrilo = 1:4(v)

Condición del Bconc. 43 %(0 min)-56 %(30 min)-90 %(30,01 min)-90 %(35 min) -43 %(35,01 min)-43 %(50 min)

Temperatura d 80 °C

(Método de medición 2: Medición del rendimiento de oligonucleótidos)

Se midió la OD260 del producto bruto anterior. OD260 representa una absorbancia a UV260 nm por longitud de trayectoria óptica de 10 mm en una solución de 1 ml (pH = 7,5). Dado que se sabe en general que 1 OD = 40 |jg para ARN, el rendimiento se calculó basándose en el valor medido anterior de OD260.

<Síntesis en fase sólida de oligonucleótidos>

Secuencia (I):

5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUG CUUC-P-G-3' (Secuencia n.° 1,2) 3 mer

En la secuencia anterior (I), "A" se representa mediante una estructura parcial separada por líneas onduladas en la siguiente fórmula (A1). "C" se representa mediante una estructura parcial separada por líneas onduladas en la siguiente fórmula (A2). "G" se representa mediante una estructura parcial separada por líneas onduladas en la siguiente fórmula (A3). "U" se representa mediante una estructura parcial separada por líneas onduladas en la siguiente fórmula (A4). "P" se representa mediante una estructura parcial separada por líneas onduladas en la siguiente fórmula (A5). En este caso, "A" en un extremo 5' se representa mediante una estructura parcial separada por líneas onduladas en la siguiente fórmula (A6). También "G" en un extremo 3' se representa mediante una estructura parcial separada por líneas onduladas en la siguiente fórmula (A7).

AGCAGAGUAC ACACAGCAUA UACC (Secuencia N.° 1)

GGUAUAUGCU GUGUGUACUC UGCUUC (Secuencia N.° 2)

��

Usando un vidrio de poro controlado (CPG) como soporte sólido y un NTS M-4MX-E (fabricado por NIHON TECHNO SERVICE CO. LTD) como sintetizador de ácido nucleico, de acuerdo con un método de síntesis en fase sólida de fosforamidita, se sintetizó un oligonucleótido compuesto por la secuencia (I) anterior desde el lado 3' al lado 5'. La síntesis se llevó a cabo en una escala de aproximadamente 1 |jmol cuando se utilizó el NTS M-4MX-E (fabricado por NIHON TECHNO SERVICE CO. LTD). También en la síntesis, se usaron una amidita de EMM de uridina como se describe en el Ejemplo 2 de US 2012/0035246, se usaron una amidita de EMM de citidina como se describe en el Ejemplo 3 del mismo, una amidita de EMM de adenosina como se describe en el Ejemplo 4 del mismo, una amidita de EMM de guanosina como se describe en el Ejemplo 5 del mismo, y el compuesto (3) como se describe en WO 2017/188042, y se usó una solución de alta pureza de ácido tricloroacético en tolueno como solución de desbloqueo, y 5-bencilmercapto-1H-tetrazol como agente de condensación, y se usó solución de yodo como agente de oxidación, y se usó una solución de anhídrido fenoxiacético y una solución de N-metilimidazol como solución de taponado,

A continuación, se muestran ejemplos de preparación específicos de oligómero de ácido nucleico preparados por el proceso de la presente invención. En este caso, en los siguientes ejemplos, los oligonucleótidos preparados de acuerdo con el proceso de la presente invención son oligómeros de ácido nucleico que tienen las secuencias anteriores n.° 1 y 2.

Además, los derivados de guanosina como se describen en los siguientes ejemplos y ejemplos comparativos representan los compuestos representados por la siguiente fórmula estructural. Un círculo como se representa en la siguiente fórmula estructural representa CPG esquemáticamente.

(Ejemplo 1)

Usando vidrio de poro controlado (CPG) sobre el que se soportaron 1,07 |jmol de derivado de guanosina, y cada amidita representada por la fórmula (A8), fórmula (A9), fórmula (A10), fórmula (A11) o fórmula (A12) respectivamente, el oligómero de ácido nucleico representado por la secuencia (I) se sintetizó automáticamente por NTS M-4MX-E (fabricado por NIHON TECHNO SERVICE CO. LTD) desde el lado 3' hasta el lado 5'. Para los procedimientos de síntesis automática, en primer lugar, se transfirió en líquido a CPG ácido tricloroacético al 3 % en solución de tolueno en 1,4 ml cada vez, se desprotegió un grupo protector de tritilo en la posición 5' y, posteriormente, 0,3 ml de cada amidita y 0,4 ml de 5-bencilmercapto-1H-tetrazol como agente de condensación se transfirieron en líquido a CPG, y se procedió a una reacción de acoplamiento en un grupo hidroxilo en la posición 5'. Posteriormente, después de una solución de acetonitrilo: agua:piridina = 35,2:52,9:11,4 (% en peso) que contenía yodo 17 mM se almacenó a 60 °C durante 161 horas, y poco antes de la síntesis, se añadió acetonitrilo para hacer una solución de acetonitrilo: agua:piridina = 58,2:34,2:7,4 (% en peso) que contenía yodo 10 mM, y 0,7 ml de la solución resultante se transfirieron en líquido, de este modo un grupo fosfito se convirtió en un grupo fosfato. Sucesivamente, se usaron una solución de 0,5 ml de anhídrido fenoxiacético 0,1 M y una solución de 0,5 ml de N-metilimidazol al 10 % / 10 % 2,6-lutidina en acetonitrilo, de este modo se llevó a cabo una reacción de taponado en el punto de reacción en el que la reacción de acoplamiento no tuvo lugar. Además, estas etapas se repitieron 52 veces en total, de modo que se sintetizó un oligonucleótido de ácido nucleico de una secuencia representada por la secuencia (I) en un soporte de CPG, y se desprotegió un grupo protector de tritilo en la posición 5' con una solución de ácido tricloroacético al 3 % en tolueno. Después de eso, un soporte de CPG en el que se soportaban las cantidades totales de oligonucleótido se trató con 752 j l de agua amoniacal y 252 j l de etanol para dejar un oligómero de ácido nucleico del soporte sólido, y se eliminaron el agua amoniacal y el etanol mediante pulverización de nitrógeno. A continuación, el oligonucleótido liberado se solubilizó en 400 j l de dimetilsulfóxido y, después de que se añadieran al mismo 5,3 j l de nitrometano y una barra de agitación, y 530 j l (10,2 moles de TBAF por 1 mol de grupo protector) de solución de fluoruro de tetra-n-butil amonio 1 M (TBA<f>) en sulfóxido de dimetilo, que se sometió a un tratamiento de deshidratación con tamices moleculares de 4 A, se introdujo en el mismo a 30 °C con agitación con un agitador, y la mezcla resultante se mantuvo caliente durante 4 horas para desproteger un grupo protector de grupo protector 2'-EMM. El producto bruto se obtuvo mediante una operación de precipitación. El rendimiento fue de 8,6 mg y la pureza fue del 61 %. Para el producto bruto obtenido, se midió la pureza del oligonucleótido usando el método de la medición 1 anterior. Además, se midió un rendimiento de oligonucleótido usando el método de la medición 2 anterior.

(Ejemplo 2)

Usando vidrio de poro controlado (CPG) sobre el que se soportaron 1,02 jmol de derivado de guanosina, y cada amidita representada por la fórmula (A8), fórmula (A9), fórmula (A10), fórmula (A11) o fórmula (A12) respectivamente, el oligómero de ácido nucleico representado por la secuencia (I) se sintetizó automáticamente mediante NTS M-4MX-E (fabricado por NIHON TECHNO SERVICE CO. LTD) desde el lado 3' hasta el lado 5'. Para los procedimientos de síntesis automática, en primer lugar, se transfirió en líquido a CPG ácido tricloroacético al 3 % en solución de tolueno en 1,4 ml cada vez, se desprotegió un grupo protector tritilo en la posición 5' y, posteriormente, se transfirieron en líquido a CPG 0,3 ml de cada amidita y 0,4 ml de 5-bencilmercapto-1H-tetrazol como agente de condensación, y se procedió a una reacción de acoplamiento en un grupo hidroxilo en la posición 5'. Posteriormente, después de una solución de acetonitrilo: agua: piridina = 35,2:52,9:11,4 (% en peso) que contenía yodo 17 mM se almacenó a 60 °C durante 24 horas, y poco antes de la síntesis, se añadió acetonitrilo para hacer una solución de acetonitrilo: agua:piridina = 58,2:34,2:7,4 (% en peso) que contenía yodo 10 mM, y 0,7 ml de la solución resultante se transfirieron en líquido, de este modo un grupo fosfito se convirtió en un grupo fosfato. Sucesivamente, se usaron una solución de 0,5 ml de anhídrido fenoxiacético 0,1 M y una solución de 0,5 ml de N-metilimidazol al 10 % / 10 % 2,6-lutidina en acetonitrilo, de este modo se llevó a cabo una reacción de taponado en el punto de reacción en el que la reacción de acoplamiento no tuvo lugar. Además, estas etapas se repitieron 52 veces en total, de modo que se sintetizó un oligonucleótido de ácido nucleico de una secuencia representada por la secuencia (I) en un soporte de CPG, y se desprotegió un grupo protector de tritilo en la posición 5' con una solución de ácido tricloroacético al 3 % en tolueno. Después de eso, un soporte de CPG en el que se soportaban las cantidades totales de oligonucleótido se trató con 752 |jl de agua amoniacal y 252 |jl de etanol para dejar un oligómero de ácido nucleico del soporte sólido, y se eliminaron el agua amoniacal y el etanol mediante pulverización de nitrógeno. A continuación, el oligonucleótido liberado se solubilizó en 400 j l de dimetilsulfóxido y, después de que se añadieran al mismo 5,3 j l de nitrometano y una barra de agitación, y 530 j l (10,2 moles de TBAF por 1 mol de grupo protector) de solución de fluoruro de tetra-n-butil amonio 1 M (TBAf ) en sulfóxido de dimetilo, que se sometió a un tratamiento de deshidratación con tamices moleculares 4 A, se introdujo en el mismo a 30 °C con agitación con un agitador, y la mezcla resultante se mantuvo caliente durante 4 horas para desproteger un grupo protector de grupo protector 2'-EMM. El producto bruto se obtuvo mediante una operación de precipitación. El rendimiento fue de 7,3 mg y la pureza fue del 59 %. Para el producto bruto obtenido, se midió la pureza del oligonucleótido usando el método de la medición 1 anterior. Además, se midió un rendimiento de oligonucleótido usando el método de la medición 2 anterior.

(Ejemplo 3)

Usando vidrio de poro controlado (CPG) sobre el que se soportaron 1,03 jmol de derivado de guanosina, y cada amidita representada por la fórmula (A8), fórmula (A9), fórmula (A10), fórmula (A11) o fórmula (A12) respectivamente, el oligómero de ácido nucleico representado por la secuencia (I) se sintetizó automáticamente mediante NTS M-4MX-E (fabricado por NIHON TECHNO SERVICE CO. LTD) desde el lado 3' hasta el lado 5'. Para los procedimientos de síntesis automática, en primer lugar, se transfirió en líquido a CPG ácido tricloroacético al 3 % en solución de tolueno en 1,4 ml cada vez, se desprotegió un grupo protector de tritilo en la posición 5' y, posteriormente, 0,3 ml de cada amidita y 0,4 ml de 5-bencilmercapto-1H-tetrazol como agente de condensación se transfirieron en líquido a CPG, y se procedió a una reacción de acoplamiento en un grupo hidroxilo en la posición 5'. Posteriormente, después de una solución de acetonitrilo: agua:piridina = 35,2:52,9:11,4 (% en peso) que contenía yodo 17 mM se almacenó a 40 °C durante 24 horas, y poco antes de la síntesis, se añadió acetonitrilo para hacer una solución de acetonitrilo: agua:piridina = 58,2:34,2:7,4 (% en peso) que contenía yodo 10 mM, y 0,7 ml de la solución resultante se transfirieron en líquido, de este modo un grupo fosfito se convirtió en un grupo fosfato. Sucesivamente, se usaron una solución de 0,5 ml de anhídrido fenoxiacético 0,1 M y una solución de 0,5 ml de N-metilimidazol al 10 % / 10 % 2,6-lutidina en acetonitrilo, de este modo se llevó a cabo una reacción de taponado en el punto de reacción en el que la reacción de acoplamiento no tuvo lugar. Además, estas etapas se repitieron 52 veces en total, de modo que se sintetizó un oligonucleótido de ácido nucleico de una secuencia representada por la secuencia (I) en un soporte de CPG, y se desprotegió un grupo protector de tritilo en la posición 5' con una solución de ácido tricloroacético al 3 % en tolueno. Después de eso, un soporte de CPG en el que se soportaban las cantidades totales de oligonucleótido se trató con 752 j l de agua amoniacal y 252 j l de etanol para dejar un oligómero de ácido nucleico del soporte sólido, y se eliminaron el agua amoniacal y el etanol mediante pulverización de nitrógeno. A continuación, el oligonucleótido liberado se solubilizó en 400 j l de dimetilsulfóxido y, después de que se añadieran al mismo 5,3 j l de nitrometano y una barra de agitación, y 530 j l (10,2 moles de TBAF por 1 mol de grupo protector) de solución de fluoruro de tetra-n-butil amonio 1 M (TBA<f>) en sulfóxido de dimetilo, que se sometió a un tratamiento de deshidratación con tamices moleculares de 4 A, se introdujo en el mismo a 30 °C con agitación con un agitador, y la mezcla resultante se mantuvo caliente durante 4 horas para desproteger un grupo protector de grupo protector 2'-EMM. El producto bruto se obtuvo mediante una operación de precipitación. El rendimiento fue de 8,1 mg y la pureza fue del 57 %. Para el producto bruto obtenido, se midió la pureza del oligonucleótido usando el método de la medición 1 anterior. Además, se midió un rendimiento de oligonucleótido usando el método de la medición 2 anterior.

(Ejemplo de referencia 1)

Usando vidrio de poro controlado (CPG) sobre el que se soportaron 1,00 jmol de derivado de guanosina, y cada amidita representada por la fórmula (A8), fórmula (A9), fórmula (A10), fórmula (A11) o fórmula (A12) respectivamente, el oligómero de ácido nucleico representado por la secuencia (I) se sintetizó automáticamente mediante NTS M-4MX-E (fabricado por NIHON TECHNO SERVICE CO. LTD) desde el lado 3' hasta el lado 5'. Para los procedimientos de síntesis automática, en primer lugar, se transfirió en líquido a CPG ácido tricloroacético al 3 % en solución de tolueno en 1,4 ml cada vez, se desprotegió un grupo protector tritilo en la posición 5' y, posteriormente, se transfirieron en líquido a CPG 0,3 ml de cada amidita y 0,4 ml de 5-bencilmercapto-1H-tetrazol como agente de condensación, y se procedió a una reacción de acoplamiento en un grupo hidroxilo en la posición 5'. Posteriormente, una solución de piridina: agua = 88,7:10,0 (% en peso) que contenía yodo 50 mM se almacenó a 25 °C durante 24 horas, y 0,7 ml de la solución resultante se transfirieron en líquido, de modo que un grupo fosfito se convirtió en un grupo fosfato. Sucesivamente, se usaron una solución de 0,5 ml de anhídrido fenoxiacético 0,1 M y una solución de 0,5 ml de N-metilimidazol al 10 % / 10 % 2,6-lutidina en acetonitrilo, de este modo se llevó a cabo una reacción de taponado en el punto de reacción en el que la reacción de acoplamiento no tuvo lugar. Además, estas etapas se repitieron 52 veces en total, de modo que se sintetizó un oligonucleótido de ácido nucleico de una secuencia representada por la secuencia (I) en un soporte de CPG, y se desprotegió un grupo protector de tritilo en la posición 5' con una solución de ácido tricloroacético al 3 % en tolueno. Después de eso, un soporte de CPG en el que se soportaban las cantidades totales de oligonucleótido se trató con 752 j l de agua amoniacal y 252 j l de etanol para dejar un oligómero de ácido nucleico del soporte sólido, y se eliminaron el agua amoniacal y el etanol mediante pulverización de nitrógeno. A continuación, el oligonucleótido liberado se solubilizó en 400 j l de dimetilsulfóxido y, después de que se añadieran al mismo 5,3 j l de nitrometano y una barra de agitación, y 530 j l (10,2 moles de TBAF por 1 mol de grupo protector) de solución de fluoruro de tetra-n-butil amonio 1 M (TBAF) en sulfóxido de dimetilo, que se sometió a un tratamiento de deshidratación con tamices moleculares de 4 A, se introdujo en el mismo a 30 °C con agitación con un agitador, y la mezcla resultante se mantuvo caliente durante 4 horas para desproteger un grupo protector de grupo protector 2'-EMM. El producto bruto se obtuvo mediante una operación de precipitación. El rendimiento fue de 7,9 mg y la pureza fue del 42 %. Para el producto bruto obtenido, se midió la pureza del oligonucleótido usando el método de la medición 1 anterior. Además, se midió un rendimiento de oligonucleótido usando el método de la medición 2 anterior.

(Ejemplo de referencia 2)

Usando vidrio de poro controlado (CPG) sobre el que se soportaron 1,04 jmol de derivado de guanosina, y cada amidita representada por la fórmula (A8), fórmula (A9), fórmula (A10), fórmula (A11) o fórmula (A12) respectivamente, el oligómero de ácido nucleico representado por la secuencia (I) se sintetizó automáticamente mediante NTS M-4MX-E (fabricado por NIHON TECHNO SERVICE CO. LTD) desde el lado 3' hasta el lado 5'. Para los procedimientos de síntesis automática, en primer lugar, se transfirió en líquido a CPG ácido tricloroacético al 3 % en solución de tolueno en 1,4 ml cada vez, se desprotegió un grupo protector tritilo en la posición 5' y, posteriormente, se transfirieron en líquido a CPG 0,3 ml de cada amidita y 0,4 ml de 5-bencilmercapto-1H-tetrazol como agente de condensación, y se procedió a una reacción de acoplamiento en un grupo hidroxilo en la posición 5'. Posteriormente, una solución de acetonitrilo:agua:piridina = 58,2:34,4:7,2 (% en peso) que contenía yodo 10 mM se almacenó a 25 °C durante 24 horas, y 0,7 ml de la solución resultante se transfirieron en líquido, de modo que un grupo fosfito se convirtió en un grupo fosfato. Sucesivamente, se usaron una solución de 0,5 ml de anhídrido fenoxiacético 0,1 M y una solución de 0,5 ml de N-metilimidazol al 10 % / 10 % 2,6-lutidina en acetonitrilo, de este modo se llevó a cabo una reacción de taponado en el punto de reacción en el que la reacción de acoplamiento no tuvo lugar. Además, estas etapas se repitieron 52 veces en total, de modo que se sintetizó un oligonucleótido de ácido nucleico de una secuencia representada por la secuencia (I) en un soporte de CPG, y se desprotegió un grupo protector de tritilo en la posición 5' con una solución de ácido tricloroacético al 3 % en tolueno. Después de eso, un soporte de CPG en el que se soportaban las cantidades totales de oligonucleótido se trató con 752 j l de agua amoniacal y 252 j l de etanol para dejar un oligómero de ácido nucleico del soporte sólido, y se eliminaron el agua amoniacal y el etanol mediante pulverización de nitrógeno. A continuación, el oligonucleótido liberado se solubilizó en 400 j l de dimetilsulfóxido y, después de que se añadieran al mismo 5,3 j l de nitrometano y una barra de agitación, y 530 j l (10,2 moles de TBAF por 1 mol de grupo protector) de solución de fluoruro de tetra-n-butil amonio 1 M (TBAF) en sulfóxido de dimetilo, que se sometió a un tratamiento de deshidratación con tamices moleculares de 4 A, se introdujo en el mismo a 30 °C con agitación con un agitador, y la mezcla resultante se mantuvo caliente durante 4 horas para desproteger un grupo protector de grupo protector 2'-EMM. El producto bruto se obtuvo mediante una operación de precipitación. El rendimiento fue de 7,8 mg y la pureza fue del 35 %. Para el producto bruto obtenido, se midió la pureza del oligonucleótido usando el método de la medición 1 anterior. Además, se midió un rendimiento de oligonucleótido usando el método de la medición 2 anterior.

Los resultados de las pruebas de los Ejemplos 1 a 3 y los Ejemplos de referencia 1 a 2 se muestran en la Tabla 2.

A partir de los resultados anteriores de la Tabla, comparando el caso en el que se usó la solución de oxidación de la presente invención que se sometió a un tratamiento térmico a 40 °C o más con el caso de usar las soluciones de oxidación de los Ejemplos de referencia 1 y 2, se podría obtener un oligómero de ácido nucleico con alta pureza.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un proceso eficiente para preparar un oligómero de ácido nucleico. También, puede esperarse una mejora en la pureza de un oligómero de ácido nucleico que se prepara de acuerdo con un proceso para preparar oligómero de ácido nucleico.

Texto independiente del listado de secuencias

Las secuencias n.° 1 a 13 en un listado de secuencias representan una secuencia de nucleótidos de oligonucleótido que se prepara de acuerdo con un proceso de la presente invención.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso para preparar un compuesto de ácido nucleico que tiene en su extremo 5' un nucleótido representado por la fórmula (I):

   (en donde cada uno de G1 y G2 representa independientemente entre sí un grupo protector para el grupo hidroxi, y Ba representa una base de ácido nucleico que puede protegerse opcionalmente con un grupo protector, R representa un grupo hidroxi protegido, un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo metoxi, un grupo 2-metoxietilo o un grupo OQ', Q' representa un grupo metileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, un grupo etileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa o un grupo etilideno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, y un enlace marcado con el símbolo * representa un enlace que se dirige al lado extremo 3' de un ácido nucleico) mediante un método de fosforamidita, que comprende una etapa de hacer reaccionar un precursor que tiene un enlace triéster de fosfito representado por una fórmula (II):

   (en donde G1, G2, Ba, R y * son los mismos que se han definido anteriormente) con una solución de oxidación sometida a un tratamiento térmico a 40 °C o más que contiene yodo, piridina y agua.
2. 2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el precursor que tiene un enlace triéster de fosfito representa un compuesto de ácido nucleico representado por la fórmula (4):

   (en donde G1 representa un grupo protector para el grupo hidroxi, G2 es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo protector para el grupo hidroxi, Ba es igual o diferente y cada uno representa independientemente una base de ácido nucleico que puede protegerse con un grupo protector, R es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo hidroxi protegido, un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo metoxi, un grupo 2-metoxietilo o un grupo OQ', Q' es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo metileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, un grupo etileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa o un grupo etilideno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, Y es igual o diferente y cada uno representa independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, n es cualquier número entero de 1 o más a 200 o menos, cuando X representa OZ, W representa un grupo OV y V representa un grupo protector para el grupo hidroxi, cuando X representa un grupo R, W representa un grupo representado por OZ, Z representa un grupo que tiene una estructura que comprende un soporte sólido y un grupo de conexión, y cuando n es un número entero de 2 o más, el compuesto de ácido nucleico representado por la fórmula (4) puede incorporarse mediante un enlazador no nucleotídico en lugar de al menos un nucleótido entre nucleótidos en el extremo 5' y el extremo 3' del compuesto de ácido nucleico), el compuesto que contiene un enlace triéster de fosfato representa un compuesto representado por la fórmula (5):

   [en donde G1, G2, Ba, R, n, W, X e Y son los mismos que se han definido anteriormente, y como se define en la fórmula (4), se puede incorporar un enlazador no nucleotídico en lugar de un nucleótido).
3. 3. El proceso para preparar oligómero de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende una etapa de alargamiento de una resistencia de cadena de un compuesto de ácido nucleico representado por la fórmula (5) a cualquier longitud de cadena mediante un método de amidita para obtener un ácido nucleico representado por la fórmula (5'):

   (en donde G2, Ba, R, X y W son los mismos que los definidos en la fórmula (5), G5 representa un grupo protector para el grupo hidroxi, o un átomo de hidrógeno, m es un número entero que satisface m>n, Y es igual o diferente y cada uno representa independientemente un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, con la condición de que al menos uno de Y sea un átomo de oxígeno), una etapa de cortar el compuesto representado por la fórmula (6):

   (en donde G5, R y m son los mismos que se han definido anteriormente, Bc es igual o diferente y cada uno representa independientemente una base de ácido nucleico, G4 representa un átomo de hidrógeno, un ion de metal alcalino, un ion de amonio, un ion de alquil amonio o un ion de hidroxil alquil amonio, Y representa independientemente entre sí un átomo de oxígeno o un átomo de azufre, y al menos uno de los mismos es un átomo de oxígeno, y Xi representa un grupo hidroxi, y Wi representa un grupo OV en donde V representa un grupo protector para el grupo hidroxi, o Xi representa un grupo R y Wi representa un grupo hidroxi) del compuesto representado por la fórmula (5'), adicionalmente, una etapa de desprotección del compuesto representado por la fórmula (6) para preparar un oligómero de ácido nucleico desprotegido representado por la fórmula (7):

   (en donde m, Y, G4, y Bc son los mismos que se han definido anteriormente, R' es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo hidroxi, un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor, un grupo metoxi, un grupo 2-metoxietilo o un grupo OQ', Q' es igual o diferente y cada uno representa independientemente un grupo metileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, un grupo etileno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa o un grupo etilideno unido a un átomo de carbono en la posición 4' de la ribosa, cada uno de X<10>y W<10>representa independientemente entre sí un grupo hidroxi, o X<10>representa un grupo R', y W<10>representa un grupo hidroxi).
4. 4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde el enlazador no nucleotídico es un enlazador compuesto por una cadena principal de aminoácidos.
5. 5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el enlazador que comprende una cadena principal de aminoácidos es un enlazador que tiene una estructura seleccionada de las siguientes fórmulas (A14-1), (A14-2) y (A14-3).
6. 6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una concentración de yodo en una solución de oxidación es de 0,005 a 2 M.
7. 7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una concentración de yodo en una solución de oxidación es de 0,005 a 0,2 M.
8. 8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una concentración de yodo en una solución de oxidación es de 0,007 a 0,1 M.
9. 9. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una concentración de yodo en una solución de oxidación es de 0,008 a 0,07 M.
10. 10. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la solución de oxidación se prepara mezclando yodo, piridina y agua.
11. 11. El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la solución de oxidación es una solución de oxidación que contiene al menos un disolvente seleccionado de un grupo que consiste en acetonitrilo y tetrahidrofurano.
12. 12. El proceso de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde la solución de oxidación es una solución de oxidación que contiene además disolvente de acetonitrilo.
13. 13. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde un disolvente de la solución de oxidación es una mezcla de disolventes que se obtiene mezclando piridina, agua, acetonitrilo y tetrahidrofurano en una relación en volumen de 1 a 90:1 a 50:0 a 90:0 a 90.
14. 14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde un disolvente de la solución de oxidación es una mezcla de disolventes que se obtiene mezclando piridina, agua y acetonitrilo en una relación en volumen de 1 a 90:1 a 50:0 a 90.
15. 15. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la solución de oxidación preparada se deja envejecer en almacenamiento hasta su uso en la reacción de oxidación para la síntesis de ácido nucleico dentro de un intervalo de 40 °C o más a 60 °C o menos.
16. 16. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el compuesto de ácido nucleico es un compuesto de ácido nucleico que contiene un ribonucleósido (ARN).
17. 17. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 16, en donde el ácido nucleico es ribonucleósido (ARN), y su grupo protector 2' es un grupo protector representado por la fórmula (12):

    (en donde q es un número entero de 1 a 5, Ra y Rb son iguales o diferentes y cada uno representa independientemente un grupo metilo, un grupo etilo o un átomo de hidrógeno, un enlace marcado con el símbolo * representa un átomo de oxígeno del grupo OQ, y el grupo Ew representa un grupo atractor de electrones).
18. 18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde Ra y Rb son un átomo de hidrógeno al mismo tiempo, y Ew representa un grupo ciano.
19. 19. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde cuando R es un grupo hidroxi protegido, el grupo protector del grupo hidroxi protegido se selecciona del grupo que consiste en un grupo 2'-tercbutildimetilsililo (TBDMS), un grupo 2'-bis (2-acetoxi)metilo (ACE), un grupo 2'-(triisopropilsililoxi)metilo (TOM), un grupo 2'-(2-cianoetoxi)etilo (CEE), un grupo 2'-(2-cianoetoxi)metilo (CEM) y un grupo 2-para-toluilsulfoniletoximetilo (TEM).
20. 20. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el ácido nucleico es un ribonucleósido (ARN) que comprende 40 o más longitudes de cadena nucleotídica.
21. 21. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que comprende adicionalmente una etapa de preparación de una solución de oxidación descrita en la reivindicación 1.
22. 22. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en donde G1 representa el siguiente grupo:

    (en donde R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y cada uno representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alcoxi).
23. 23. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 22, en donde el soporte sólido comprende un soporte poroso inorgánico.