CN115078570B - Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸修饰在快速质谱法检测阿尔茨海默症中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疾病诊断和快速检测技术领域，具体涉及Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸修饰在快速质谱法检测阿尔茨海默症中的应用。本发明对于阿尔茨海默症的研究中发现，Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸修饰仅在阿尔茨海默症患者中出现，从而为阿尔茨海默症的诊断提供更为精准的检测方法，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明涉及疾病诊断和快速检测技术领域，具体涉及Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸修饰在快速质谱法检测阿尔茨海默症中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
阿尔茨海默病是老年期最为常见的一种痴呆类型，也是老年期最常见的慢性病之一，大约占到老年痴呆的50％～70％。2016年的一份调查显示，全球共有4000万人罹患阿尔茨海默病，而这个数字预计将每20年增长一倍。随着年龄的增加，阿尔茨海默病患病率逐渐上升，年龄平均增加6.1岁，其患病率升高1倍，至85岁会后，AD患病率可高达20％～30％。根据认知功能受损的程度，可将阿尔茨海默症分为轻度、中度、重度三类。根据发病形式，阿尔茨海默病可分为散发性和家族性。
阿尔茨海默病(AD)是一种隐匿发生和发展的神经系统退行性疾病。有研究显示在阿尔茨海默病出现临床症状之前约有20年左右的隐匿发展时间，即阿尔茨海默病患者在表现出临床症状前约20年，他们的脑神经细胞代谢已经出现异常。由于此病早期具有很强隐匿性，所以临床对与早期的病变基本无法诊断。临床上对于阿尔茨海默症的诊断以精神量表为主，以脑脊液中Aβ蛋白量和tau蛋白磷酸化程度以及血清学成分的检测为辅，另外还有CT和MRI等脑部影像学辅助诊断。缺乏更多更有效的生理学指标诊断。
阿尔茨海默病以脑神经细胞萎缩和死亡为直接病因，而神经细胞的微管系统异常是导致神经细胞萎缩和死亡的一个重要因素。微管系统是神经细胞骨架成分，能维持神经细胞树突和轴突的形态并保证其功能的正常运行。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是微管相关蛋白。正常脑神经细胞中Tau蛋白与微管蛋白结合促进微管蛋白聚合形成微管并与之相结合。tau蛋白能够维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离速度，并诱导微管成束。神经细胞通过调控微管的聚合与解离来调控神经之间的突触连接与突触的生理功能。在阿尔茨海默病发生的初期，由于异常原因导致神经细胞对于微管调控出现问题，致使神经细胞不能正常控制轴突的功能，进而导致神经细胞萎缩死亡。通常认为是微管相关蛋白tau的过渡磷酸化，导致微管蛋白不正常聚合，而过多游离于神经细胞中的tau蛋白进一步促使神经细胞死亡。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸修饰在快速质谱法检测阿尔茨海默症中的应用，为阿尔茨海默症患者提供更准确有效的分子生物学诊断方式与治疗参照。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，提供Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸作为阿尔茨海默症生物标志物的应用。
本发明研究发现，Tau蛋白分子中第639硫氰酸氨基酸修饰在阿尔茨海默症与非阿尔茨海默症患者之间具有极其显著的统计学差异，且本数据显示该硫氰酸氨基酸仅在阿尔茨海默症中出现。
具体的，本发明提供一种Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸作为生物标志物在制备阿尔茨海默症的诊断产品中的应用。
在阿尔茨海默症样本与非阿尔茨海默症样本中Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸修饰具有显著统计差异与诊断意义。
在一种具体的实施方式中，所述生物标志物包括：Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸；
在本发明的第二方面，提供一种用于阿尔茨海默症诊断的试剂盒，所述试剂盒中包含特异性检测Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸的试剂；
所述试剂盒能够用于检测Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸；
本发明还提供一种阿尔茨海默症的诊断方法，所述诊断方法为：检测待测样本的Tau 蛋白639位硫氰酸氨基酸，判断阿尔茨海默症发生或进展；
在本发明的第三方面，提供一种阿尔茨海默症的治疗靶点，所述治疗靶点为Tau蛋白 639位硫氰酸氨基酸；
本发明提供Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸作为阿尔茨海默症治疗靶点在制备阿尔茨海默症治疗药物中的应用，针对该靶点可制备的不同形式蛋白类或小分子类等药物；
本发明还提供一种治疗阿尔茨海默症的药物，所述药物中含有能够抑制Tau蛋白639 位硫氰酸氨基酸表达的组分。
本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
临床上对于阿尔茨海默症的诊断主要以精神量表为主，致使诊断过于主观化。而Tau 蛋白过渡磷酸化与Aβ蛋白学说虽然在一定程度上能够辅助确诊，但是临床上需要更多更有效的生物学检测标准。以患者自身生理状态作为最终的判定指标，对于患者后续诊断和治疗将更加有效。而本发明对于阿尔茨海默症的研究中发现，Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸修饰仅在阿尔茨海默症患者中出现，从而为阿尔茨海默症的诊断提供更为精准的检测方法，为后续治疗提供潜在治疗靶点，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为目标肽段二级谱图；
图2为样品中硫氰酸氨基酸检出信息；
图3为ROC曲线，注：ROC曲线的AUC＝0.833，临界值为0.67。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1技术方案1：阿尔茨海默症标本的质谱测定方法。
本实验过程共采用18例样本，9例为阿尔茨海默症，9例非阿尔茨海默对照。
将样本组织切成小于1mm2的组织块，加入RIPA裂解液(组织：裂解液＝1:100(1mg/100ul))并震荡混匀，冰上孵育30min。
将冰浴后的研磨珠加入样品管中。
将样品管放置于研磨仪中，并研磨3次，每次30秒。
取出研磨珠，冰浴超声，每次5秒，超声3次，涡旋30秒。
以4℃10000g10min条件离心。
取上清到一新EP管中，向样品管中加入5倍体积-40℃预冷的丙酮，涡旋10秒。
放置于-40℃冰箱中沉淀蛋白1小时。
以4℃、10000g、10分钟条件离心，弃上清。
向沉淀中加入同体积80％丙酮(水)，震荡洗涤蛋白沉淀。
向沉淀中加入100mM碳酸氢铵溶液溶解沉淀，可低温超声助溶。
BCA法测定样品蛋白浓度。
向样品管中加入Trypsin[KR|P](简写为Trypsin)，以样品蛋白总量：Trypsin＝50:1(μg：μg)的比例。
在37℃、700rpm孵育12小时,氮气保护。
补加第一次1/2量的Trypsin到样品中，37℃、700rpm孵育2小时，氮气保护。
采用(Waters Sep-Pak Vac 1cc(50mg)C18Cartridges)脱盐柱对完成消化的肽段脱盐。
采用BCA肽段浓度测定试剂盒测定脱盐后肽段的浓度。
取100μg肽段样品，采用Waterse2695(Separations Module)液相进行分级。①BufferA： 10ml 100×stock solution，970ml水，20ml CAN(乙腈)；BufferB：10ml 100×stock solution， 10ml水，980mlACN(乙腈)；100×stock solution(100ml)：浓氨水13.4ml，水86.6ml。②运行色谱仪，冲洗色谱仪管路。③取100ul样品至无残留样品瓶中，开始上样，设置液相设置流速0.1ml/min，色谱柱恒温箱温度50℃，Wavelength：214nm；bandwidth：12nm。④准备2ml平底EP管，依次标号并放置于样品收集器中，收集样本组分。⑤按时序将收集的组分分为三组，合并每个组的样本组分，真空离心干燥样品。
采用0.1％甲酸(水)溶解样本，以20000g 4℃10min条件离心。
用EASY-nLC 1200液相系统进行分离，使用在线Thermo QE-HFX质谱仪进行DDA模式检测。液相分离系统参数，预柱：150μm*3cm C18 1.9μm Reprosil-Pur 120；色谱柱：150μm *25cm C18 1.9μm Reprosil-Pur 120；流速：600nl/min；流动相A：0.1％甲酸(水)；流动相B：0.1％甲酸80％乙腈(水)；洗脱梯度：4％-7％B持续1min,7％-25％B持续94min， 25％-40％B持续16min，40％-100％B持续5min，100％持续4min；上样量：5μl。质谱检测参数，扫描范围：150-2000m/z；数据采集模式：DDA采集方式，top 20碎片图谱；MS1 分辨率(200m/z)：60,000；MS1 AGC target：3e6,maxIT:50ms；MS2分辨率(200m/z)： 15,000；MS2 AGCtarget：5e4,maxIT:45ms；标准化碰撞能量(NCE)：28％；隔离窗口： 1.6m/z。
实施例2 Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸的数据分析方法。
对质谱检测结果分析知tau蛋白有2％硫氰酸氨基酸。
第639位硫氰酸氨基酸的肽段C(+24.99)GSLGNIHHKPGGGQVEVK的二级谱图(图1)，二级谱图中包含了97％以上的离子碎片(除b1、y1以外的子离子)，说明结果具有十分的可信度。
本实施例的核心内容为：第639硫氰酸氨基酸。其P值为0.0081小于0.01，即该修饰在阿尔茨海默症与非阿尔茨海默症患者之间具有极其显著的统计学差异，且本数据显示该硫氰酸氨基酸仅在阿尔茨海默症中出现。(图2)
Deltamass相关信息。Deltamass所属蛋白：P10636(tau蛋白)；Deltamass位置：639； Deltamass所属肽段：CGSLGNIHHKPGGGQVEVK；Deltamass分子量：24.99；Deltamass 评分：0.924(deltamass评分是指：在质谱检测中，deltamass由于各种极其微小的作用，使得质谱测得的单个deltamass的结果在精确度与误差允许范围内呈正态分布形式，而得分就是对于正态曲线的拟合度，分值为0～1，分值越高说明检测结果越可靠。能够达到0.2的二级图谱就会被认可)。
AD组与对照组tau蛋白的ROC曲线如图3.
由以上信息可知：tau蛋白的第639位的硫氰酸氨基酸对于阿尔茨海默症患者的诊断具有重要。
本实施例上述内容中目标肽段采用Trypsin[KR|P]酶解样品蛋白后进行的后续实验。在质谱检测中亦可采用多种酶解样品的方案，如Trypsin(semi)[KR|P]；Trypsin/p[KR|-]； TrypsinK[K|P]；TrypsinR[R|P]；ChymoTrypsin[FWYL|P]；ArgC[R|P]；AspN[-|D]n-term；Clostripain[R|-]；CNBr[M|P]；Elastase[GVLIA|P]；Formic Acid[D|P]；GluC[DE |P]；GluC bicarb[E|P]；Iodosobenzoate[W|-]；LysC[K|P]；LysC/P[K|-]；LysN[-|K]n-term；LysN promisc[-|KASR]n-term；PepsinA[FL|P]；Protein endopeptidase[P|-]；Staph protease[E|-]；Trypsin-CNBr[KRM|P]；Trypsin-GluC[DEKR|P]等。通过这些酶解或采用超声等物理方案处理后的样品中也可检测到tau蛋白第639位硫氰酸氨基酸。另外，通过免疫学与蛋白相互作用等方案同样可以富集和检测本实施例所阐述的修饰。
实施例3对于tau蛋白第639位硫氰酸氨基酸的应用。
对tau蛋白第639位硫氰酸氨基酸的快速质谱检测方法。
采用skyline分析实施例2测得的质谱数据，得到目标肽段C(+24.99)GSLGNIHHKPGGGQVEVK色谱保留时间。将该保留时间与目标肽段2价与3价母离子和其相对应的子离子结合构建用于质谱检测时所采集的PRM的离子列表。(见表1.离子列表。每个母离子可对应多个1价、2价、3价子离子。为便于检测，本实施例仅列出相对丰度较高且氨基酸残基数不少于5的子离子碎片)
表1.目标肽段的2价和3价母离子及其对应的子离子
将采集的样本按照实施例1进行处理。
使用EASY-nLC 1200液相系统进行分离，使用在线Thermo QE-HFX质谱仪检测。液相分离系统参数为预柱：75μm*2cm PepMap C18 3μm Thermo；色谱柱：75μm*15cm PepMapC18 2μm Thermo；流速：500nl/min；流动相A：0.1％甲酸(水)；流动相B：0.1％甲酸 80％乙腈(水)；洗脱梯度：6％-25％B持续21min,25％-40％B持续4min，40％-100％B持续3min,100％B持续2min；样品加载量为：3μl。质谱检测参数，数据采集模式：PRM采集方式，top 20碎片图谱；MS2分辨率(200m/z)：30,000；MS2 AGC target：2e5,maxIT:70ms；标准化碰撞能量(NCE)：28％；隔离窗口：1.6m/z。
调整质谱参数，使其根据PRM离子列表对样品进行快速采集和检测。
采用skyline对质谱仪测得数据进行分析，采用内标或者外标的方式对目标离子碎片进行相对或者绝对定量，然后根据离子碎片的定量结果，对样品进行定性或者定量。
在样品定性或者定量的前体下判定患者是否患有阿尔茨海默症，或者作为其诊断的一个标准。
常规的免疫检测方案或者蛋白相互作用方案也能对目标修饰检测，本实施例仅以PRM 方案做了详细表述。
本实施例中所述的tau蛋白(Uniprot ID:P10636)第639位点的硫氰酸氨基酸亦可作为阿尔茨海默症的治疗靶点。针对该于靶点可制备的不同形式蛋白类或小分子药物类均是可行的。
检测验证：以3例健康样本、3例已临床确诊的阿尔茨海默症样本(不属于实施例1分析集中的样本)作为研究对象进行验证，分别检测上述样本的进行诊断时，3例健康样本和3 例已临床确诊的阿尔茨海默症患者样本的检测结果与已知结果一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.检测组织中Tau蛋白639位硫氰酸氨基酸修饰的物质在制备用于快速质谱法检测阿尔茨海默产品中的应用，所述Tau蛋白的Uniprot ID号为P10636。
2.一种用于阿尔茨海默症诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含特异性检测Tau蛋白硫氰酸氨基酸修饰的试剂；
所述试剂盒能够检测Tau蛋白的第639位的硫氰酸氨基酸修饰，所述Tau蛋白的UniprotID号为P10636。
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