CN115317618B - 一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115317618B
CN115317618B CN202210816497.9A CN202210816497A CN115317618B CN 115317618 B CN115317618 B CN 115317618B CN 202210816497 A CN202210816497 A CN 202210816497A CN 115317618 B CN115317618 B CN 115317618B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gppm
gox
mpeg
dendrimer
cgamp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210816497.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115317618A (zh
Inventor
史向阳
高悦
欧阳智俊
沈思妍
贾兵洋
沈明武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Donghua University
Original Assignee
Donghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Donghua University filed Critical Donghua University
Priority to CN202210816497.9A priority Critical patent/CN115317618B/zh
Publication of CN115317618A publication Critical patent/CN115317618A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115317618B publication Critical patent/CN115317618B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/443—Oxidoreductases (1) acting on CH-OH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/12—Macromolecular compounds
    • A61K49/124—Macromolecular compounds dendrimers, dendrons, hyperbranched compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
    • A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles
    • A61K49/1821—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles
    • A61K49/1824—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised microparticles or nanoparticles coated or functionalised nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Inorganic Compounds Of Heavy Metals (AREA)
  • Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)
  • Oxygen, Ozone, And Oxides In General (AREA)

Abstract

本发明涉及一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用，所述为第五代聚酰胺‑胺PAMAM树状大分子G5表面修饰甲氧基聚乙二醇mPEG和苯硼酸PBA，内部包裹二氧化锰纳米颗粒。本发明操作工艺简单，反应条件温和，易于纯化，所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化的实施前景。

Description

一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用
技术领域
本发明属于功能性纳米材料领域，特别涉及一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用。
背景技术
肿瘤的预防、诊断和治疗一直是全球生物医学工作者的重点关注对象。免疫治疗可以通过靶向特定的肿瘤细胞进行精准的免疫杀伤，特异性高，毒性小，具有免疫记忆效应，能够有效防止肿瘤复发转移，因此成为当下研究的焦点，逐渐成为继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗手段。然而，免疫抑制性的肿瘤微环境(TME)严重限制免疫疗法的治疗效率。因此，深入挖掘肿瘤的发生发展机制，针对TME的特点，发展更为高效的联合免疫治疗方法十分重要。
值得关注的是，肿瘤细胞增殖迅速，对于能量的需求远高于正常细胞，因而在能量代谢模式上与正常细胞不同。其中最大的特点之一是，肿瘤细胞消耗葡萄糖的速度远远快于正常细胞，且即使在供养充足的情况下也高度依赖于糖酵解供能，这一现象也被称为“Warburg效应”。研究表明，这一现象限制了TME中免疫细胞的功能。
在众多的纳米载体材料中，聚酰胺-胺树状大分子(poly(amidoamine)，PAMAM)由于其独特的物化性质在纳米载体领域而受到广泛关注。它是一类高度支化的、合成性的、高度单分散的大分子，具有非常精确的核、内部空间和大量表面功能基团。PAMAM树状大分子通过其表面官能团功能化后具备良好的载体性能，能够靶向递送抗癌药物、基因等至肿瘤部位。
根据国内外文献检索结果，目前尚未发现关于树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒的制备及其在肿瘤药物递送和联合治疗应用的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用。
本发明的一种树状大分子复合材料，所述复合材料为第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5表面修饰甲氧基聚乙二醇mPEG和苯硼酸PBA，内部包裹二氧化锰纳米颗粒。
本发明的一种树状大分子复合材料的制备方法，包括：
(1)将具有马来酰亚胺端基的mPEG(Mal-mPEG)的水溶液、加入第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5的水溶液混合，水浴搅拌，经透析纯化、冷冻干燥，得到修饰有甲氧基聚乙二醇mPEG的第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5-mPEG；
(2)将G5-mPEG溶液、4-溴甲基苯硼酸溶液混合，水浴搅拌反应，经透析纯化、冷冻干燥，得到修饰有苯硼酸分子的第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5-mPEG-PBA，简称记为GPP；
(3)将G5-mPEG-PBA的水溶液中加入KMnO4水溶液，滴加完毕后，搅拌反应，透析
纯化、冷冻干燥，得到树状大分子复合材料G5-mPEG-PBA@MnO2，简称记为GPPM。上述制备方法的优选方式如下：
所述步骤(1)中第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5和Mal-mPEG的摩尔比为1:12～1:15；所述水浴搅拌为28-32℃条件下搅拌反应24-36h。
所述步骤(2)中溶液的溶剂为二甲基亚砜DMSO；所述G5-mPEG与4-溴甲基苯硼酸摩尔比为1:50～1:55；所述水浴搅拌反应为：68-72℃下搅拌反应24-36h。
所述步骤(3)中加入KMnO4水溶液具体为：通过微量注射泵匀速加入KMnO4水溶液，微量注射泵流速为0.8-1.0mL/分钟。
所述步骤(3)中G5-mPEG-PBA与KMnO4的摩尔比为1:30～55，KMnO4溶液浓度为0.25～0.30mg/mL；所述搅拌反应为室温搅拌反应1-1.5h。
进一步优选地，所述G5-mPEG-PBA与KMnO4的摩尔比为1:50～55。
所述步骤(1)-(3)中透析采用截留分子量为10000的纤维素透析膜在超纯水中透析1-3天。本发明提供一种所述方法制备的树状大分子复合材料。
进一步优选地，步骤(1)-(2)优选透析时间为2-3天；优选步骤(3)中透析时间为1天。本发明的一种载药树状大分子复合材料，所述树状大分子复合材料为载体复合葡萄糖氧化酶GOx和/或干扰素基因刺激因子STING激动剂cGAMP。
本发明的一种所述载药树状大分子复合材料在制备肿瘤的化学动力学/饥饿/免疫联合治疗药物中的应用。
本发明提供一种所述树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒作为载体系统在肿瘤纳米药物中的应用，其能够复合葡萄糖氧化酶(GOx)和干扰素基因刺激因子(STING)激动剂cGAMP用于肿瘤的化学动力学/饥饿/免疫联合治疗。
本发明方法包括：(1)功能化树状大分子G5-mPEG-PBA(简称GPP)的制备方法；(2)树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒G5-mPEG-PBA@MnO2(简称GPPM)的制备方法；(3)GPPM纳米颗粒复合GOx和STING激动剂cGAMP作为纳米药物在肿瘤联合治疗中的应用。
本发明基于第五代聚酰胺-胺树状大分子，表面修饰mPEG与PBA，内部包裹二氧化锰构建得到GPPM纳米颗粒。实验结果表明本发明的GPPM纳米颗粒具有优良的稳定性、化学动力学性能和载体性能，可作为载体复合GOx和cGAMP构建递送体系，在体外体内均能实现良好的肿瘤联合治疗效果，特别是在小鼠体内能同时有效抑制原发肿瘤和远端肿瘤的生长。
本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、动态光散射(DLS)测试、Zeta电势测试、透射电镜(TEM)、X射线光电子能谱(XPS)分析、弛豫率测试等方法表征了制备得到的GPPM纳米颗粒；通过亚甲基蓝(MB)降解实验体外评价了材料的化学动力学性能；采用CCK-8法在体外验证了GPPM负载GOx后的癌细胞杀伤效果；采用探针检测ROS和脂质过氧化物(LPO)的表达情况，并采用试剂盒测定胞内谷胱甘肽(GSH)的消耗情况，以此评价GPPM负载GOx后的化学动力学治疗效果；利用GPPM共负载GOx和cGAMP，评价了递送体系引起癌细胞凋亡的情况；通过试剂盒检测HMGB1和ATP的释放情况，评价递送体系引起肿瘤细胞免疫原性死亡的效果；通过Transwell实验评价了抗原递呈细胞树突细胞(DC)的成熟情况；最后在小鼠体内构建原发肿瘤和远端肿瘤，瘤内注射递送体系评价其体内联合治疗效果。具体测试结果如下：
(1)1H NMR表征结果
核磁氢谱分析结果如图2所示，图2a为G5-mPEG的谱图，其中2.2～3.4ppm处为G5中亚甲基质子的特征峰，3.6ppm处则为mPEG的特征峰，经积分可计算得出每个G5上连接有10.0个mPEG分子。图2b为GPP材料的核磁氢谱，7.0-8.0ppm处为PBA分子的特征峰归属，表明PBA分子的成功连接，经积分计算可得每个G5上连接的PBA为27.5个。
(2)二氧化锰包裹计量比的优化实验
设置GPP与KMnO4的摩尔比为1:30、1:50或1:80三个比例进行二氧化锰的包裹，得到的产物溶液如图3所示，其中选择1:30和1:50的摩尔比能够得到稳定的树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒，产物溶液澄清透明，而选择1:80的摩尔比则会产生颗粒沉淀，无法取得稳定的产物。本发明采用优化的1:50比例进行G5-mPEG-PBA@MnO2(即GPPM)的合成。
(3)水动力学直径及Zeta电势测试
将所合成的GPP与GPPM溶于超纯水中，进行Zeta电势和DLS测试，所得结果如表一所示。发现GPPM具有合适的纳米尺度，同时由于二氧化锰的包裹，GPPM电势相比于GPP有所下降，可能是由于树状大分子的表面氨基参与了KMnO4的还原反应，从而降低了其表面密度；水动力学直径有所降低，可能在于其分散性有所提升，从而进一步降低了其易于聚集的态势。
(4)TEM测试
取GPPM纳米颗粒进行TEM测试观测其内核MnO2颗粒形貌，结果如图4a-b所示，可以发现GPPM内核MnO2纳米颗粒的单分散性良好，其中包裹的二氧化锰纳米粒径较为均一。如图4c所示，通过粒径统计表明二氧化锰纳米颗粒平均尺寸在2.8nm。
(5)XPS分析
称取GPPM纳米颗粒进行XPS测试，测试结果如图5所示，谱图中出现Mn元素的Mn2p3/2和Mn2p1/2自旋轨道的峰，显示合成的GPPM中Mn元素的价态为正四价，说明二氧化锰的成功合成。
(6)T1弛豫性能表征
二氧化锰能够消耗TME中过量存在的GSH，产生具有良好T1成像性能的Mn2+，因此接下来研究了GPPM经GSH处理后的r1弛豫率。首先通过ICP-OES分析测定GPPM纳米颗粒中Mn元素的含量，随后配制两组不同Mn元素浓度(0.125、0.25、0.5、1.0和1.5mM)的GPPM溶液，其中一组溶液中添加10mM的GSH进行预处理。将两组溶液分别进行T1弛豫性能表征，对比发现经GSH处理后，由于产生了Mn2+，GPPM的弛豫率高达8.37mM-1s-1，而无GSH存在时GPPM中的MnO2则能够稳定存在，因此弛豫率仅为0.17mM-1s-1。该测试结果表明所合成的GPPM纳米颗粒在GSH处理后具有进行T1 MR成像的潜力。
(7)MB降解实验
Mn2+能够在生理环境中HCO3 -的存在下，与TME中的H2O2产生类芬顿反应，产生细胞杀伤性的羟基自由基，而GSH则会抑制羟基自由基的产生。因此以氧化环境下MB降解为基础，采用比色法检测GPPM在不同浓度GSH环境下产生羟基自由基的能力。分别配置含有不同浓度GSH(0、1、2、5或10mM)、GPPM纳米颗粒([Mn2+]＝0.25mM)、H2O2(10mM)和MB(10μg/mL)的NaHCO3/CO2缓冲液([NaHCO3/CO2]＝25mM)，将各组溶液静置于37℃环境中30分钟，反应结束后进行拍照并测定紫外吸收曲线。如图7所示，在无/较低浓度GSH环境下(0、1或2mM)，MB明显降解，其665nm处的特征吸收峰显著下降。这说明了合成的GPPM纳米颗粒可以引起类芬顿反应产生羟基自由基，同时有利于缓解GSH对羟基自由基产生的抑制作用。
(8)CCK-8细胞毒性实验
将GPPM和GOx溶于PBS溶液中，按一定比例混合共孵育30分钟，进行GPPM与GOx的复合(GPPM@GOx)。随后，以CT26小鼠结直肠癌细胞为模型，通过CCK-8细胞毒性实验初步研究了GOx、GPPM和GPPM@GOx的癌细胞杀伤效果。首先进行不同浓度GOx的细胞毒性测试(0、5、10、20、50和100ng/mL)，如图8a所示，GOx显示出良好的癌细胞杀伤效果，在100ng/mL时CT26细胞活力仅为26.5％。随后选择GOx＝50ng/mL的浓度与不同浓度的GPPM(0、2、5、10、20和50μg/mL)进行复合测试细胞毒性，如图8b所示，随着Mn浓度的提高，GPPM能够有效降低癌细胞活力，而在复合GOx后细胞毒性显著增强。这可能是由于GOx能够催化葡萄糖产生H2O2，进一步增强GPPM释放锰离子后介导的类芬顿反应。
(9)体外化学动力学治疗评价。
采用50ng/mL的GOx浓度和10μg/mL的Mn浓度，对GPPM及GPPM@GOx的化学动力学治疗效果进行一系列评价，包括材料使癌细胞产生ROS、LPO的效果以及消耗细胞内GSH的能力。实验过程中，为便于评价GOx复合物的效果，设置了同浓度下GPPM与无特殊功能的牛血清白蛋白(BSA)的复合物作为实验对照组。如图9a-b和图10所示，首先利用ROS探针(DCFH-DA)和LPO探针(C11-BODIPY)分别通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测了癌细胞经不同材料处理后产生ROS和LPO的效果。实验结果表明GPPM具有良好的细胞内化学动力学反应性能，而在复合GOx效果进一步增强，能高效介导细胞内ROS的产生和LPO的表达，复合BSA则无增强效果。如图11所示，进一步使用GSH试剂盒检测了不同实验组癌细胞的胞内GSH水平，得到的结果显示，GPPM和GPPM@GOx复合物都能非常有效地清除胞内GSH，GPPM@GOx复合物效果更佳，这进一步印证了GPPM和GPPM@GOx复合物的良好化学动力学治疗效果。
(10)细胞凋亡实验
将本发明制备的GPPM、GOx和cGAMP溶于PBS中，按比例混合后共孵育30分钟，同时复合GOx和cGAMP(Mn＝10μg/mL，GOx＝50ng/mL，cGAMP＝1μg/mL)后进行细胞凋亡实验评价；共设置PBS、GOx、GPPM、GPPM@GOx和GPPM@GOx+cGAMP五个实验组采用Annexin V-FITC/PI法进行检测。如图12a-b所示，相比于PBS组和GOx组，GPPM由于能有效引起化学动力学细胞杀伤，因此产生的较多的细胞凋亡和坏死；GPPM@GOx和GPPM@GOx+cGAMP实验组由于存在GPPM和GOx的共同作用，也均能有效引起癌细胞大量凋亡和坏死；值得注意的是，GPPM@GOx+cGAMP实验组中复合的cGAMP能够通过TBK1-IRF3信号通路的激活有利于肿瘤细胞的凋亡，因此取得了最佳的癌细胞凋亡和坏死效果。
(11)体外免疫原性死亡(ICD)效应评价
检测CT26癌细胞经不同实验组材料处理后(Mn＝10μg/mL，GOx＝50ng/mL，cGAMP＝1μg/mL)免疫原性死亡标志物HMGB1和ATP的释放情况，评价GPPM联合GOx和cGAMP后在体外引发癌细胞免疫原性死亡的效果。如图13和图14所示，相比于其他实验组，复合了GOx和cGAMP的GPPM@GOx+cGAMP由于存在载体本身的化学动力学杀伤作用、酶的饥饿治疗和cGAMP对TBK1-IRF3信号通路的激活作用，能够最为有效地引起肿瘤细胞产生ICD，有利于激活免疫反应。
(12)体外免疫效应评价
采用Transwell实验，上层培养CT26癌细胞并采用不同实验组材料(Mn＝10μg/mL，GOx＝50ng/mL，cGAMP＝1μg/mL)进行处理，下层共培养DC，24小时后通过流式细胞仪检测DC表面熟化标志物CD80和CD86的表达情况，评价材料体外激活免疫反应的能力。如图15a-b所示，相比于其他实验组，GPPM@GOx+cGAMP实验组由于能够最显著地引发癌细胞产生ICD，且复合的cGAMP能够直接激活DC中的STING，促进I型IFN和炎性细胞因子的产生，启动固有免疫应答，因此GPPM@GOx+cGAMP实验组DC具有最高的熟化程度，有利于抗肿瘤免疫反应的进行。
(13)体内抗肿瘤效果评价
如图16所示，将BALB/C小白鼠随机分组(n＝5)后在右腿皮下种植1×106个CT26细胞构建小鼠原发皮下肿瘤模型，待肿瘤体积约为50mm3(8天后)时，在第1、5和9天各进行一次治疗，即瘤内分别注射PBS、GOx、cGAMP、GPPM、GPPM@GOx或GPPM@GOx+cGAMP([cGAMP]＝5μg/只/次)，连续21天监测小鼠的肿瘤体积、体重等情况。与此同时，为了评价治疗组的体内抗肿瘤免疫激活情况，在第一次治疗时，将5×105个CT26细胞种植于小鼠左腿皮下构建远端肿瘤，同样连续21天监测远端肿瘤生长情况。
如图17所示，随着时间推移，各组小鼠体重缓慢增长，各组别之间无明显差异，表明各实验组的材料注射后均不存在明显的系统毒性。在原发肿瘤生长情况上，如图18所示，PBS组、GOx组和cGAMP组小鼠的原发肿瘤均生长迅速；GPPM实验组小鼠肿瘤生长受到一定抑制；GPPM@GOx和GPPM@GOx+cGAMP实验组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制；其中GPPM@GOx+cGAMP实验组的肿瘤抑制效果最好，实验组的小鼠肿瘤几乎完全消退，肿瘤抑制率高达到99.3％。在远端肿瘤生长情况上，如图19所示，PBS组的小鼠远端肿瘤生长同样迅速；GOx组和cGAMP组的远端肿瘤生长速度缓于PBS组；GPPM组由于存在Mn2+对先天免疫的刺激作用，也产生了较好的远端肿瘤抑制效果；GPPM@GOx组联合Mn2+与GOx，远端肿瘤抑制效果更佳；同时GPPM@GOx+cGAMP实验组通过实施化学动力学/饥饿/免疫联合治疗，小鼠远端肿瘤生长则受到完全抑制。更为直观地，如图20a-b所示，从实验最后一天小鼠肿瘤的代表性解刨图可以看出GPPM@GOx+cGAMP实验组具有最佳的肿瘤抑制效果，仅有一只小鼠残存小的原发肿瘤，同时无小鼠长出远端肿瘤。
进一步评价不同组材料激发体内免疫响应的效果。在实验结束后刨取小鼠脾脏，通过尼龙柱法分离得到T细胞，进行CD4和CD8+T细胞的流式分析，如图21所示，可以发现GPPM@GOx+cGAMP实验组小鼠脾脏中CD8+杀伤性T细胞的分化程度最高，表明具有最强的抗肿瘤免疫响应程度。与此同时，选取FOXP3、CD25、CD4为标志物，通过流式分析免疫抑制型调节性T细胞(Tregs，CD4+CD25+FOXP3+)的表达情况，如图22所示，GPPM@GOx+cGAMP实验组的小鼠拥有最少的Tregs细胞群体比例，因此更有利于机体对肿瘤的免疫杀伤，进一步佐证了GPPM@GOx+cGAMP实验组的小鼠具有最佳的抗肿瘤免疫响应效果。
有益效果
(1)本发明操作工艺简单，反应条件温和，易于纯化，所用的合成原料均为环境友好型材料，具有产业化的实施前景；
(2)本发明制备的树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒具有良好的稳定性、化学动力学性能和载体性能，能够用于复合GOx和cGAMP用于制备肿瘤纳米药物；
(3)本发明制备的树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒复合GOx和cGAMP后能够用于体外、体内的肿瘤细胞的高效联合治疗，其中在体内能够同时抑制原发肿瘤和远端肿瘤的生长，有效激发体内的抗肿瘤免疫反应；
(4)本发明制备的树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒在纳米医学、肿瘤联合治疗和诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒的合成过程示意图。
图2为本发明制备的G5-mPEG(a)和GPP(b)的1H NMR谱图。
图3为本发明制备的GPP按不同树状大分子/KMnO4摩尔比包裹二氧化锰后的产物溶液照片。
图4为本发明制备的GPPM纳米颗粒的高分辨TEM图片(a-b)以及对应的(c)二氧化锰粒径分布直方图。
图5为本发明制备GPPM纳米颗粒的Mn 2P XPS谱图。
图6为本发明制备的GPPM纳米颗粒在有无GSH预处理条件下的r1弛豫率结果图。
图7为本发明制备的GPPM纳米颗粒与MB、H2O2及不同浓度GSH在NaHCO3缓冲液混合后照片和紫外吸收曲线(混合液配置后均放置于37℃环境下30min，且[NaHCO3/CO2]＝25mM，[MB]＝10μg/mL，[H2O2]＝10mM，[Mn]＝0.25mM)。
图8为不同浓度GOx对CT26细胞的毒性(a)以及不同Mn浓度下的GPPM和GPPM@GOx复合物(GOx＝50ng/mL)对CT26细胞的毒性(b)。
图9为经不同材料处理4小时后CT26细胞产生ROS流式荧光分布图(a)和定量结果图(b)。图10为经不同材料处理4小时后CT26细胞LPO表达情况的激光共聚焦照片(细胞核使用DAPI进行染色)。
图11为经不同材料处理4小时后CT26细胞内GSH水平检测结果图。
图12为经不同材料处理24小时后CT26细胞的细胞凋亡流式检测散点图(a)和坏死/凋亡细胞比例定量结果图(b)。
图13为经不同材料处理24小时后CT26细胞HMGB1的释放量检测结果图。
图14为经不同材料处理24小时后CT26细胞ATP的释放量检测结果图。
图15为DC与经不同材料处理的CT26细胞共孵育24小时后，其表面熟化标志物CD80和CD86的流式检测分布图(a)和定量结果图(b)。
图16为本发明的小鼠体内抗肿瘤实验流程示意图。
图17为CT26荷瘤小鼠在接受PBS、GOx、cGAMP、GPPM、GPPM@GOx或GPPM@GOx+cGAMP处理后21天内的体重变化图。
图18为CT26荷瘤小鼠在接受PBS、GOx、cGAMP、GPPM、GPPM@GOx或GPPM@GOx+cGAMP处理后21天内原发肿瘤体积变化图。
图19为CT26荷瘤小鼠在接受PBS、GOx、cGAMP、GPPM、GPPM@GOx或GPPM@GOx+cGAMP处理后21天内远端肿瘤体积变化图。
图20为21天体内实验周期结束后不同还实验组小鼠原发肿瘤(a)和远端肿瘤(b)的照片(1:PBS；2:GOx；3:cGAMP；4:GPPM；5:GPPM@GOx；6:GPPM@GOx+cGAMP)。
图21为21天体内实验周期结束后不同还实验组小鼠脾脏中CD4+/CD8+T细胞的流式检测结果。
图22为21天体内实验周期结束后不同还实验组小鼠脾脏中Tregs的流式检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)称取46mg的Mal-mPEG(购自上海炎怡生物有限公司)和50mg第五代PAMAM树状大分子(G5)(购自美国Dendritech公司)分别溶解于超纯水中，将Mal-mPEG溶液加入G5溶液中，30℃下水浴搅拌反应24小时。反应结束后，使用截留分子量为10000的纤维素透析袋在纯水中透析3天后冷冻干燥，得到G5-mPEG粉末；
(2)称取50mg的G5-mPEG粉末溶解于DMSO溶液中，加入11.7mg的4-溴甲基苯硼酸的DMSO溶液(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，在70℃水浴搅拌反应24小时。反应结束后，使用截留分子量为10000的纤维素透析袋在纯水中透析3天后冷冻干燥，得到GPP材料。
(3)称取50mg的GPP溶于超纯水水中，按GPP与KMnO4的摩尔比为1:50通过微量注射泵匀速(流速为0.8-1.0mL/分钟)加入0.25mg/mL的KMnO4水溶液，滴加完毕后，搅拌反应1小时。反应结束后，使用截留分子量为10000的纤维素透析袋在纯水中透析1天，然后经冷冻干燥，得到树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒，即GPPM纳米颗粒。
实施例2
对实施例1中制备的GPPM纳米颗粒和制备过程中相关的中间产物进行表征：
(1)称取G5-mPEG溶于600μL氘代水用进行核磁氢谱分析，分析结果如图2a所示，其中2.2～3.4ppm处为G5中亚甲基质子的特征峰，3.6ppm处则为mPEG的特征峰，经积分可计算得出每个G5上连接有10.0个mPEG分子。同样称取GPP溶于600μL氘代水进行核磁氢谱分析，分析结果如图2b所示，7.0-8.0ppm处为PBA分子的特征峰归属，表明PBA的成功连接，经积分计算可得每个G5上连接的PBA为27.5个。
(2)设置GPP与KMnO4的摩尔比为1:30、1:50或1:80三个比例进行二氧化锰的包裹，得到的产物溶液如图3所示，其中选择1:30和1:50的摩尔比能得到稳定的树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒，产物溶液澄清透明，而选择1:80的摩尔比则会产生颗粒沉淀，无法取得稳定的产物。因而优化地采用1:50进行GPPM的合成。将所合成的GPP与GPPM溶于超纯水中，进行Zeta电势和DLS直径测试，可以发现GPPM纳米颗粒具有比GPP更小的纳米尺度，同时GPP的电势在19.2mV，而GPPM电势则由于包裹了二氧化锰下降为9.4mV。
为了对GPPM材料的形貌进行表征，取GPPM溶液滴于铜网上，充分干燥后进行TEM测试，所得结果如图4a-b所示，可以发现GPPM纳米颗粒的单分散性良好，其中包裹的二氧化锰纳米粒径较为均一。如图4c所示，通过粒径统计结果表明二氧化锰纳米颗粒平均尺寸在2.8nm。另称取GPPM纳米颗粒进行XPS测试分析锰元素的价态，测试结果如图5所示，谱图中出现Mn元素的Mn2p3/2和Mn2p1/2自旋轨道的峰，显示合成的GPPM中Mn元素的价态为正四价，说明二氧化锰的成功合成。
表1GPP和GPPM材料的电势粒径测试结果
样品名 粒径(nm) 电势(mV) PDI
GPP 180.1 19.2±3.45 0.338±0.064
GPPM 71.3 9.4±2.69 0.511±0.008
实施例3
对实施例1制备的GPPM进行材料T1成像弛豫性能测试。
二氧化锰能够消耗TME中过量存在的GSH，产生具有良好T1成像性能的Mn2+，因此随后研究了GPPM经GSH处理后的r1弛豫率。首先通过ICP-OES分析测定GPPM纳米颗粒中Mn元素的含量，随后配制两组不同Mn元素浓度(0.125、0.25、0.5、1.0和1.5mM)的GPPM溶液，其中一组溶液中添加10mM的GSH进行预处理。将两组溶液分别进行T1弛豫性能表征，对比发现经GSH处理后，由于产生了Mn2+，GPPM的弛豫率高达8.37mM-1s-1，而无GSH存在时GPPM中的MnO2则稳定存在，因此弛豫率仅为0.17mM-1s-1。该测试结果表明所合成的GPPM纳米颗粒在GSH处理后具有进行T1 MR成像的潜力。
实施例4
测试实施例1制备的GPPM在体外产生羟基自由基的能力。
Mn2+能够在生理环境中HCO3 -的存在下，与TME中的H2O2产生类芬顿反应，产生细胞杀伤性的羟基自由基，而GSH则会抑制羟基自由基的产生。因此以氧化环境下MB降解为基础，采用比色法检测GPPM在不同浓度GSH环境下产生羟基自由基的能力。分别配置含有不同浓度GSH(0、1、2、5或10mM)、GPPM纳米颗粒([Mn2+]＝0.25mM)、H2O2(10mM)和MB(10μg/mL)的NaHCO3/CO2缓冲液([NaHCO3/CO2]＝25mM)，将各组溶液静置于37℃环境中30分钟，反应结束后进行拍照并测定紫外吸收曲线。如图7所示，在无/较低浓度GSH环境下(0、1或2mM)，MB明显降解，其665nm处的特征吸收峰显著下降。这说明了合成的GPPM纳米颗粒可以引起类芬顿反应产生羟基自由基，同时有利于缓解GSH对羟基自由基产生的抑制作用。
实施例5
测试实施例1制备的GPPM复合GOx后的细胞毒性。将GPPM和GOx溶于PBS溶液中，按一定比例混合共孵育30分钟，进行GPPM与GOx的复合(GPPM@GOx)，以CT26小鼠结直肠癌细胞为模型进行CCK-8细胞毒性实验，初步研究了GOx、GPPM和GPPM@GOx的癌细胞杀伤效果。
首先研究单独GOx的细胞毒性，将CT26细胞按8000/孔的密度种于96孔板，培养12小时细胞贴壁后，将培养基更换为含不同浓度GOx(0、5、10、20、50和100ng/mL)的新鲜培养基。继续培养24小时后更换培养基为含10％CCK-8溶液(购自上海碧云天生物技术有限公司)的无血清培养基，37℃培养箱中培养2h后用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值，计算细胞活力。如图8a所示，GOx显示出良好的癌细胞杀伤效果，在100ng/mL时CT26细胞活力仅为26.5％。
同理，进行GPPM和GPPM@GOx的CCK-8细胞毒性测试。选择0、2、5、10、20和50μg/mL的Mn元素浓度和50ng/mL的GOx浓度进行实验，如图8b所示，随着Mn浓度的提高，GPPM能够有效降低癌细胞活力，而在复合GOx后细胞毒性显著增强。这可能是由于GOx能够催化葡萄糖产生H2O2，进一步增强GPPM释放锰离子后介导的类芬顿反应。
实施例6
测试实施例1制备的GPPM复合GOx后的体外化学动力学治疗效果。采用50ng/mL的GOx浓度和10μg/mL的Mn浓度，对GPPM及GPPM@GOx的化学动力学治疗效果进行一系列评价，包括材料使癌细胞产生ROS、LPO的效果以及消耗细胞内GSH的能力。实验过程中，为便于评价GOx复合物的效果，设置了同浓度下GPPM与无特殊功能的BSA的复合物作为实验对照组。
首先进行ROS的检测，以1×105/孔的密度将CT26细胞种植于12孔板中，待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，分别加入含PBS、GOx、GPPM、GPPM@BSA或GPPM@GOx的培养基孵育4小时，培养结束后用PBS清洗三次。随后，在避光条件下加入以无血清RPMI 1640培养基稀释500倍的DCFH-DA检测探针(购自上海碧云天生物技术有限公司)溶液(1mL)，孵育20分钟后，洗涤、消化和离心收集细胞进行流式细胞术检测。如图9a-b所示，实验结果表明GPPM具有良好的细胞内化学动力学反应性能，而在复合GOx后效果更佳，细胞的ROS荧光信号明显增强，而复合BSA后则无增强效果。
随后采用激光共聚焦显微镜进一步观察细胞内LPO表达水平。以1×105/孔的密度将CT26细胞种植于激光共聚焦显微镜皿中，在37℃、5％CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，分别加入含PBS、GOx、GPPM、GPPM@BSA或GPPM@GOx的培养基孵育4小时，培养结束后用PBS清洗三次。在避光条件下，每孔加1μL C11-BODIPY探针(购自上海碧云天生物技术有限公司)和1mL PBS，在孵育20分钟后，用PBS清洗三次，并用2.5％的戊二醛固定15分钟，固定后用DAPI染色10分钟，然后在激光共聚焦显微镜油镜下观察荧光信号。如图10所示，GPPM@GOx组细胞的氧化态荧光信号最强，非氧化态荧光信号最弱，表明该实验组细胞的LPO表达最多。
进一步使用GSH试剂盒检测了不同实验组癌细胞的胞内GSH水平。以1×105/孔的密度将CT26细胞种植于12孔板中，待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，分别加入含PBS、GOx、GPPM、GPPM@BSA或GPPM@GOx的培养基孵育4小时，培养结束后用PBS清洗三次，消化和离心收集细胞。随后将细胞超声破碎离心，提取细胞液，使用GSH检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)按操作步骤测试GSH含量。如图11所示，得到的结果显示，GPPM和GPPM@GOx复合物都能非常有效地清除胞内GSH，GPPM@GOx复合物效果更佳，这进一步印证了GPPM和GPPM@GOx复合物的良好化学动力学性能。
实施例7
测试实施例1制备的GPPM复合GOx和cGAMP后引发癌细胞细胞凋亡效果。将制备的GPPM、GOx和cGAMP溶于PBS中，按比例混合后共孵育30分钟进行复合，随后进行实验评价。
以2×105/孔的密度将CT26细胞种植于6孔板中，待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，分别加入含PBS、GOx、GPPM、GPPM@GOx或GPPM@GOx+cGAMP的培养基(Mn＝10μg/mL，GOx＝50ng/mL，cGAMP＝1μg/mL)孵育24小时，培养结束后用PBS清洗三次，消化和离心收集细胞，按顺序加入500μL的缓冲工作液、5μL Annexin V-FITC染色和5μL PI染液(试剂均购自江苏凯基生物技术股份有限公司)，随后用流式细胞仪进行检测。如图12a-b所示，相比于PBS组和GOx组，GPPM由于能有效引起化学动力学细胞杀伤，因此产生的较多的细胞凋亡和坏死；GPPM@GOx和GPPM@GOx+cGAMP实验组由于存在GPPM和GOx的共同作用，也均能有效引起癌细胞大量凋亡和坏死；值得注意的是，GPPM@GOx+cGAMP实验组中复合的cGAMP能够通过TBK1-IRF3信号通路的激活有利于肿瘤细胞的凋亡，因此取得了最佳的癌细胞凋亡和坏死效果。
实施例8
测试实施例1制备的GPPM复合GOx和cGAMP后的产生体外ICD效应的能力。
首先检测CT26癌细胞经不同实验组材料处理24小时后免疫原性死亡标志物HMGB1和ATP的释放情况。以2×105/孔的密度将CT26细胞种植于6孔板中，待细胞贴壁后，更换新鲜培养基，分别加入含PBS、GOx、GPPM、GPPM@GOx或GPPM@GOx+cGAMP的培养基(Mn＝10μg/mL，GOx＝50ng/mL，cGAMP＝1μg/mL)孵育24小时，培养结束后收集细胞培养上清，随后分别使用HMGB1检测试剂盒(购自武汉赛维尔生物有限公司)和ATP检测试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)进行测试。如图13和图14所示，相比于其他实验组，复合了GOx和cGAMP的GPPM@GOx+cGAMP由于存在载体本身的化学动力学杀伤作用、酶的饥饿治疗和cGAMP对TBK1-IRF3信号通路的激活作用，能够最为有效地引起癌细胞产生ICD，有利于激活免疫反应。
实施例9
测试实施例1制备GPPM复合GOx和cGAMP后的体外免疫效应。
首先在Transwell孔板(12孔板，小室孔径3μm)上层小室中按5×104/孔的密度种植CT26细胞，下层按1×105/孔的密度种植DC。待细胞贴壁后，将上层小室中的培养基更换为新鲜的含PBS、GOx、GPPM、GPPM@GOx或GPPM@GOx+cGAMP的培养基(Mn＝10μg/mL，GOx＝50ng/mL，cGAMP＝1μg/mL)，并将其转移到下层中，共培养24小时。随后消化和离心收集DC，使用荧光标记的CD80和CD86抗体进行染色，使用流式细胞仪检测DC熟化标志物的表达情况，评价材料体外激活免疫反应的能力。如图15所示，相比于其他实验组，GPPM@GOx+cGAMP实验组由于能够最显著地引发癌细胞产生ICD，且复合的cGAMP能够直接激活DC中的STING，促进I型IFN和炎性细胞因子的产生，启动固有免疫应答，因此GPPM@GOx+cGAMP实验组DC具有最高的熟化程度，有利于抗肿瘤免疫反应的进行。
实施例10
评价实施例1中的GPPM复合GOx和cGAMP后的体内抗肿瘤效果。
实验中使用的5周龄雌性BALB/C小白鼠购自上海斯莱克实验动物中心。如图16所示，将BALB/C小白鼠随机分组(n＝5)后在右腿皮下种植1×106个CT26细胞构建小鼠原发肿瘤，待肿瘤体积约为50mm3(8天后)在第1、5和9天各进行一次治疗，即瘤内注射PBS、GOx、cGAMP、GPPM、GPPM@GOx或GPPM@GOx+cGAMP([cGAMP]＝5μg/只/次)，连续21天监测小鼠的肿瘤体积、体重等情况。与此同时，为了评价治疗组的体内抗肿瘤免疫激活情况，在第一次治疗时，将5×105个CT26细胞种植于小鼠左腿皮下构建远端肿瘤，同样连续21天监测远端肿瘤生长情况。其中肿瘤体积测算公式如下：
肿瘤体积(V)＝a×b2/2 (1)
*a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
如图17所示，随着时间推移，各组小鼠体重缓慢增长，各组别之间无明显差异，表明各实验组的材料注射后均不存在明显的系统毒性。在原发肿瘤生长情况上，如图18所示，PBS组、GOx组和cGAMP组小鼠的原发肿瘤均生长迅速；GPPM实验组小鼠肿瘤生长受到一定抑制；GPPM@GOx和GPPM@GOx+cGAMP实验组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制；其中GPPM@GOx+cGAMP实验组的肿瘤抑制效果最好，实验组的小鼠肿瘤几乎完全消退，肿瘤抑制率高达到99.3％。在远端肿瘤生长情况上，如图19所示，PBS组的小鼠远端肿瘤生长同样迅速；GOx组和cGAMP组的远端肿瘤生长速度缓于PBS组；GPPM组由于存在Mn2+对先天免疫的刺激作用，也产生了较好的远端肿瘤抑制效果；GPPM@GOx组联合Mn2+与GOx，远端肿瘤抑制效果更佳；同时GPPM@GOx+cGAMP实验组通过实施化学动力学/饥饿/免疫联合治疗，小鼠远端肿瘤生长则受到完全抑制。更为直观地，如图20a-b所示，从实验最后一天小鼠肿瘤的代表性解刨图可以看出GPPM@GOx+cGAMP实验组具有最佳的肿瘤抑制效果，仅有一只小鼠仍残存体积较小的原发肿瘤，同时无小鼠长出远端肿瘤。
进一步评价不同组材料激发体内免疫响应的效果。在实验结束后刨取小鼠脾脏，通过尼龙柱法分离得到小鼠脾脏中的T细胞，采用携带FITC荧光的CD4抗体和携带PE荧光的CD8抗体标记T细胞，使用流式细胞仪进行检测，分析CD4和CD8+T细胞的分化情况，如图21所示，可以发现GPPM@GOx+cGAMP实验组小鼠脾脏中CD8+杀伤性T细胞的分化程度最高，表明具有最强的抗肿瘤免疫响应程度。与此同时，使用携带APC荧光的FOXP3抗体、携带FITC荧光的CD25抗体和携带PE荧光的CD4抗体标记T细胞，通过流式分析免疫抑制型Tregs(CD4+CD25+FOXP3+)的表达情况，如图22所示，GPPM@GOx+cGAMP实验组的小鼠拥有最少的Tregs细胞群体比例，因此更有利于机体对肿瘤的免疫杀伤，进一步佐证了GPPM@GOx+cGAMP实验组小鼠具有最佳的抗肿瘤免疫响应效果。

Claims (9)

1.一种树状大分子复合材料的制备方法，包括：
（1）将Mal-mPEG的水溶液与第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5的水溶液混合，水浴搅拌，经透析纯化、冷冻干燥，得到修饰有甲氧基聚乙二醇mPEG的第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5-mPEG；
（2）将G5-mPEG溶液、4-溴甲基苯硼酸溶液混合，水浴搅拌反应，经透析纯化、冷冻干燥，得到修饰有苯硼酸分子的第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5-mPEG-PBA；
（3）在G5-mPEG-PBA的水溶液中加入KMnO4水溶液，滴加完毕后，搅拌反应，透析纯化、冷冻干燥，得到树状大分子复合材料G5-mPEG-PBA@MnO2。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5和Mal-mPEG的摩尔比为1:12~1:15；所述水浴搅拌为28-32℃条件下搅拌反应24-36h。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中溶液的溶剂为二甲基亚砜DMSO；所述G5-mPEG与4-溴甲基苯硼酸摩尔比为1:50~1:55；所述水浴搅拌反应为：68-72℃下搅拌反应24-36h。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中加入KMnO4水溶液具体为：通过微量注射泵匀速加入KMnO4水溶液，微量注射泵流速为0.8-1.0 mL/分钟。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中G5-mPEG-PBA与
KMnO4的摩尔比为1:30~55，KMnO4溶液浓度为0.25~0.30 mg/mL；所述搅拌反应为室温搅拌反应1-1.5h。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤（1）-（3）中透析采用截留分子量为10000的纤维素透析膜在超纯水中透析1-3天。
7.一种权利要求1所述方法制备的树状大分子复合材料，其特征在于，所述复合材料为第五代聚酰胺-胺PAMAM树状大分子G5表面修饰甲氧基聚乙二醇mPEG和苯硼酸PBA，内部包裹二氧化锰纳米颗粒。
8.一种载药树状大分子复合材料，其特征在于，权利要求1所述方法制备的树状大分子复合材料为载体复合葡萄糖氧化酶GOx和干扰素基因刺激因子STING激动剂cGAMP。
9.一种权利要求8所述载药树状大分子复合材料在制备肿瘤的化学动力学/饥饿/免疫联合治疗药物中的应用。
CN202210816497.9A 2022-07-12 2022-07-12 一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用 Active CN115317618B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210816497.9A CN115317618B (zh) 2022-07-12 2022-07-12 一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210816497.9A CN115317618B (zh) 2022-07-12 2022-07-12 一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115317618A CN115317618A (zh) 2022-11-11
CN115317618B true CN115317618B (zh) 2024-12-27

Family

ID=83917959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210816497.9A Active CN115317618B (zh) 2022-07-12 2022-07-12 一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115317618B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110354282A (zh) * 2019-08-23 2019-10-22 东华大学 一种负载二氧化锰和阿霉素的纳米水凝胶及其制备和应用
CN113209106A (zh) * 2021-05-21 2021-08-06 东华大学 一种聚乙二醇-苯硼酸修饰的树状大分子包裹铜离子/替拉扎明复合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2499167A4 (en) * 2009-11-09 2013-07-10 Univ Drexel COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AN ILLNESS OR MALFUNCTION IN SOFT TISSUE
CN105504301B (zh) * 2015-12-07 2018-10-16 复旦大学 一种树枝大分子—共聚物细胞捕获材料及其制备方法和应用
CN106512028A (zh) * 2016-11-11 2017-03-22 东华大学 一种两性离子修饰的树状大分子包裹的金纳米颗粒ct造影剂及其制备和应用
WO2019164872A2 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Composition and method for targeting natural killer cells in immunotherapy to overcome tumor suppression with manganese dioxide nanoparticles
CN111973572A (zh) * 2020-06-11 2020-11-24 浙江大学 一种基于锰基的树枝状大分子复合纳米材料、制备方法及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110354282A (zh) * 2019-08-23 2019-10-22 东华大学 一种负载二氧化锰和阿霉素的纳米水凝胶及其制备和应用
CN113209106A (zh) * 2021-05-21 2021-08-06 东华大学 一种聚乙二醇-苯硼酸修饰的树状大分子包裹铜离子/替拉扎明复合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Manganese Dioxide-Entrapping Dendrimers Co-Deliver Protein and Nucleotide for Magnetic Resonance Imaging-Guided Chemodynamic/Starvation/Immune Therapy of Tumors;Yue Gao等;《ACS Nano》;20231125;第17卷;第23889-23902页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115317618A (zh) 2022-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Rational design of a minimalist nanoplatform to maximize immunotherapeutic efficacy: Four birds with one stone
An et al. ROS-augmented and tumor-microenvironment responsive biodegradable nanoplatform for enhancing chemo-sonodynamic therapy
Pan et al. Urinary exosomes-based engineered nanovectors for homologously targeted chemo-chemodynamic prostate cancer therapy via abrogating EGFR/AKT/NF-kB/IkB signaling
Peng et al. Sequential-targeting nanocarriers with pH-controlled charge reversal for enhanced mitochondria-located photodynamic-immunotherapy of cancer
Hu et al. pH-responsive and charge shielded cationic micelle of poly (L-histidine)-block-short branched PEI for acidic cancer treatment
Fu et al. A Versatile Nanoplatform Based on Metal‐Phenolic Networks Inhibiting Tumor Growth and Metastasis by Combined Starvation/Chemodynamic/Immunotherapy
Feng et al. Fe (III)-Shikonin supramolecular nanomedicines as immunogenic cell death stimulants and multifunctional immunoadjuvants for tumor vaccination
Liang et al. Au@ Pt nanoparticles as catalase mimics to attenuate tumor hypoxia and enhance immune cell-mediated cytotoxicity
Peng et al. Intracellular aggregation of peptide-reprogrammed small molecule nanoassemblies enhances cancer chemotherapy and combinatorial immunotherapy
Zheng et al. Arginine-assembly as NO nano-donor prevents the negative feedback of macrophage repolarization by mitochondrial dysfunction for cancer immunotherapy
CN110591075B (zh) 一种PEG-Peptide线性-树状给药系统及其制备方法和用途
Zhang et al. An intelligent vascular disrupting dendritic nanodevice incorporating copper sulfide nanoparticles for immune modulation‐mediated combination tumor therapy
Xu et al. Enhancing lipid peroxidation via radical chain transfer reaction for MRI guided and effective cancer therapy in mice
CN112023061B (zh) 一种功能化树状大分子包裹金纳米颗粒/PD-L1 siRNA复合物及其制备和应用
Ma et al. In vivo imaging of exosomes labeled with NIR-II polymer dots in liver-injured mice
CN113546087A (zh) 一种纤连蛋白包覆的单宁酸/铁配合物的载药纳米材料及其制备和应用
CN113230418A (zh) 一种超小核壳结构铁纳米颗粒的制备方法及应用
Wang et al. Hypoxia-stimulated tumor therapy associated with the inhibition of cancer cell stemness
Mo et al. A" lysosomal bomb" constructed based on amorphous calcium carbonate to induce tumor apoptosis by amplified sonodynamic therapy
Ye et al. Targeted pH-responsive biomimetic nanoparticle-mediated starvation-enhanced chemodynamic therapy combined with chemotherapy for ovarian cancer treatment
CN115192708B (zh) 负载抗肿瘤药物的纳米复合材料、纳米载药体系及制备与应用
CN116898829A (zh) 一种具有肿瘤细胞铁死亡诱导、指示及化疗增敏作用的纳米颗粒
CN115317618B (zh) 一种树状大分子包裹二氧化锰纳米颗粒及其制备和应用
CN113663086B (zh) 一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物及其制备和应用
Shi et al. Gelatin-coated glutathione depletion and oxygen generators in potentiated chemotherapy for pancreatic cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant