CN1155903A - T细胞抗原受体v区域蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及全长T细胞抗原受体V区域蛋白的生产。本发明提供了表达该蛋白的方法，以及增加该蛋白产量的表达载体。本发明还提供了Vβ5.3区域蛋白。本发明的蛋白在诊断和治疗免疫相关失调症方面有实用价值。

Description

T细胞抗原受体V区域蛋 白及其制备方法

本发明总的来说属于免疫学及医学领域，涉及全长度重组T细胞受体(TCR)V区域蛋白，涉及以工业规模量生产重组T细胞抗原受体V区域蛋白的表达载体，以及应用全长度重组T细胞受体V区域蛋白诊断和治疗免疫系统疾病和失调的方法。

1.T细胞抗原受体

对外来抗原的免疫反应，分为体液免疫(由B细胞介导)和细胞免疫(由T细胞介导)。B细胞用于识别抗原的受体分子是识别球形蛋白质构象表位的免疫球蛋白。T细胞上的抗原受体与免疫球蛋白相关，但结合与自身主要组织相容性复合物(MHC)分子相缔合的经处理抗原分子(Dembic等人，1986，Immunol.Today，7：308)。

TCR基因，如免疫球蛋白基因一样，由T细胞个体发育期间重排的编码区(或基因片段)组成(Chien等人，1984，Nature，312：31-35；Hedrick等人，1984，Nature，308：149-153；Yanagi等人，1984，Nature，308：145-149)。自从克隆过编码β-链的第一个cDNA以来，人T细胞受体β链基因座位得到广泛研究(Yanagi，Y.等人，1984，Nature 308：145-149；Hedrick等人，1984，Nature，308：149-152；Siu等人，1984，Cell，37：393-401)。该基因座位是含编码β链已知区域或结构域之区域的基因复合物，所述区域指：可变区(V)、多样性区(D)和连接区(J)。这些编码区同一个编码恒定区(C)的区域一起，参与体细胞重排(Chien等人，1984，Nature，309：322-326)。原位进行研究证实，TCRβ的座位位于7号染色体的7q35(Isobe等人，1985，Science，228：580)。目前估计，该复合物全长跨度超过600kb，并含有70-80个可变区片段(Cancannon等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：6598-6602；Tillinghast等人，1986，Science，233：879-883；Kimura等人，1987，Eur.J.Immunol.，17：375-383；Lai等人，1988，Nature，331：543-546)。这些V区域基因片段前后与两个串联组织的区域相邻，所述组织区每个均包括一个D和一个C基因片段，接着是一簇6或7个J区域基因片段(Tunnacliffe等人，1985，Nucleic Acids Res.，13：6651-6661；Toyonaga等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：8624-8628)。随着V、D、J编码区(基因片段)的成功DNA重排，翻译的β链多肽与TCRα链配对，并可在T细胞表面表达(由Kronenberg等人综述，见1986，Ann.Rev.Immunol.，4：529-591)。

TCRα和δ基因在人14号染色体上座位相邻。TCRδ编码区完全位于α基因座位中(Satyanarayana等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8166-8170；Chien等人，1987，Nature，330：722-727；Elliot等人，1988，Nature，331：627-631)。据估计至少存在45-50个Vα编码区(Becker等人，1985，Nature，317：430-434)，而仅仅只有约10个Vδ编码区(Chien等人，1987，前述文献)。外周血中，以二个Vδ编码区表达为主，即Vδ1和Vδ2。

γTCR基因首先在小鼠中(Saito等人，1984，Nature，309：757-762；Kranz等人，1985，Nature，313：762-755；Hayday等人，1985，Cell，40：259-269)，然后在人中(Lefranc等人，1985，Nature，316：464-466；Murre等人，1985，Nature，316：549-552)鉴定出来。人γTCR基因座位由5-10个V编码区，5个J编码区和2个C编码区组成(Dialynas等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：2619)。

TCR多样性及由此相应的T细胞特异性有几种来源(Barth等人，1985，Nature，316：517-523；Fink等人，1986，Nature，321：219-225)：种系基因片段多样性(Chien等人，1984，Nature，309：322-326；Malissen等人，1984，Cell，37：1101-1110；Gascoigne等人，1984，Nature，310：387-391；Kavaler等人，1984，Nature，310：421-423；Siu等人，1984，Nature，311：344-349；Patten等人，1984，Nature，312：40-46)；不同V、D和J编码区组装的组合多样性(Siu等人，1984，Cell，37：393-401；Goverman等人，1985，Cell，40：859-867)和连接的灵活性；N-区域多样性，以及或者使用多种D区域，或者使用Dβ片段三种翻译阅读框架任何一种。看来TCR多样性并不由在免疫球蛋白中观测到的体细胞超突变机理引起(Barth等人，前述文献)。根据这些机理产生的TCR，氨基末端区(N-末端区)结构域(即由V、D和J编码区组合构建的)不同，但其它均相似，包括其羧基未端区(C-末端区)结构域(它构成TCR恒定区)在内。从上述可知，能产生极大的TCR分子库。

对人TCRβ链可变编码区的结构和多样性研究，使人们将这些编码区分类成不同的V区域亚族(Tillinghast等人，1986，Science，233：879-883；Concannon等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：6598-6602；Borst等人，1987，J.Immunol.，139：1952-1959)。每个V区域亚族其特征在于有一个共有序列，并含其DNA序列表现出约75％以上相似性的相似编码区域。例如，采用人为的但简单的数字命名其Vβ基因片断，将16种小鼠Vβ序列归类入14种不同的亚族(见Barth等人，1985“The Murine T Cell ReceptorEmploys a Limited Repertoire of Expressed Vβ Gene Segments”Nature，316：517-523)。根据这一命名法，同一亚族的成员其第一个数字相同而第二个不同，因而Vβ8.1、Vβ8.2和Vβ8.3都属于Vβ8亚族。对人编码区也建议采用相似体系。就人来说，约60个功能性Vβ编码区分入至少24个族(Toyonaga和Mak，1988，Ann，Rev.Immunol.，5：585；Wilson等人，1988Immunol.Rev.，101：149；及Robinson，M.A.，1991，J.Immunol.，146：4392)。

2.自身免疫中的T细胞

免疫系统中，T细胞对于效应机制的分化和调节起关键作用(Paul等人，1987，Science，195：1293-1300)。通过T细胞进行的抗原和主要组织相容性分子的共识别必须是特异性的，且必须精确调节，因为不适当的调节将引起自身免疫。有几个实验室研究过看来是不适当免疫调节引起的疾病，例如自身免疫病，和某些形式的免疫缺损，并且其发病机理都与T细胞有关。

几种有害的免疫反应，以特定TCR组成的克隆或寡克隆增殖为特征，如引起T细胞白血病或淋巴瘤的恶性肿瘤疾病(例如参见Jack等人，1990，Am.J.Pathol.，136：17；Nitta等人，1990，Science，249：672；和Yoshino等人，1991，Int.J.Cancer，47：654)。T细胞白血病式淋巴瘤中，TCR起独特的肿瘤标志作用，因为它稳定地重排并存在于细胞表面。特定TCR组成也与器官移植受体相联系，该受体的T淋巴细胞的TCR与供体例如骨髓移植供体的MHC抗原反应。

几个研究组已报道过某些自身免疫情况下的选择性TCR V区域表达。例如，Grunwald等人注意到，若与患类肉瘤病人的外周血淋巴细胞比较，支气管肺泡灌洗中CD4+T细胞的Vα2.3基因产物优先表达(Grunwald，J.等人，1992，Eur.J.Immunol.，22：129)。川崎病中，注意到起病时便有Vβ2和Vβ8T细胞优先增殖(Abe，J.等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4066)。

有关这方面也对类风湿性关节炎(RA)进行过广泛研究。有些研究者注意到某些T细胞亚类优先增殖，例如DerSimonian等人，1993，J.Exp.Med.，177：1623(CD8+外周血T淋巴细胞中携带Vα12.1的T细胞优先增殖)；Stamenkovic等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：1179(IL-2中生长的透过滑膜的T细胞，通过Southern转膜杂交印迹分析为寡克隆)；Paliard等人，1991，Science，253：325(假设超抗原激活的Vβ14T细胞，包括自身反应T细胞克隆增殖，并迁移到RA患者的滑液中)；Howell等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10921(特别关注来自RA病人滑液的IL-2R+细胞中Vβ3、14、17T细胞V区基因的使用)；Vematsu等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8534(一个RA个体的滑液T细胞中寡克隆T细胞V区基因的使用)；国际专利申请WO90/06758(Vβ3，9，10与RA关系)。

也广泛研究过肠炎。有些研究组注意到增殖的T细胞群体，或特定TCRV区基因的优先利用，例如，Posnett等人，1990，J.Clin.Invest.，85：1770；Spencer等人，1991，J.Clin.Pathol.，44：915；Trejdosiewicz等人，1991，Clin.Exp.Immunol.，84：440；Van Kerckhove等人，1992，J.Exp.Med.，175：57。还有其他人报道通过分枝杆菌属麻疯菌(Mycobacterium leprae)中，TCR V基因的优先利用(Van Shooten等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：11244；Wang等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：188)。

多发性硬化病(MS)，是以中枢神经系统单核细胞浸润和脱髓鞘为特征的自身免疫疾病。虽然MS的病理是未知的，但遗传和环境因素与发病过程有关。遗传诱因的主要因素包括该病与特定第II类主要组织相容性复合物(MHC)单倍型相关(Terasaid等人，1976，Science，1933：1245-1247；Ho等人，1982，Immunogenetics，15：509-517；Spielman等人，1982，Epidemial.Rev.，4：45-65；Francis等人，1986，Lancet，1：211；Elian等人，1987，Disease Markers，5：89-99；Vrban等人，1988，Cell，54：577-592；Vandenbark等人，1989，Nature，341：541-544；Howell等人，1989，Science，246：668-670)。

业已证明，从患MS病人的脑髓液中分离出的T细胞利用了有限的一组TCR V区域基因。MS患者体内激活的髓鞘质碱性蛋白(MBP)特异性T细胞表明，MBP-反应性T细胞与该病致病机理有关(Wucherpfennig，K.W.等人，1990，Science，248：1016-1019)。使用TCR Vβ引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增cDNA表明，MBP反应性T细胞系只使用有限数量Vβ编码区(Wucherpfennig，K.W.等人，1990，前述文献，)Vβ17和较少Vβ12常常被用于识别人类自身抗原MBP的免疫决定区；Oksenberg，J.R.等人，1993，Nature，362：68-70(在有某些HLA表现型的患者脑中检测出重排Vβ5.2和/或Vβ5.3基因)；Kotzin，B.L.，1991，Proc.)Natl.Acad.Sci.USA，88：9161-9165(患MS病人的MBP特异性克隆中可见偏向使用β链可变区5.2/5.3，及较少Vβ6.1)。某些研究结果也暗示MS脑损伤中有限的TCR Vα基因表达(Oksenberg，J.R.等人，1990，Nature，345：344-346)。

3.T细胞介导治疗法

过去，选择性地改变个体的T细胞群体方面的努力集中于用完整活T淋巴细胞或减毒T淋巴细胞免疫接种(见Cohen，I.R.，1986，Immunol.Rev.，94：5-21所作综述)，或以选择TCR V区域特异性肽部分为基础的肽疫苗接种。这些方法基于现流行的观点，即潜在致病T细胞优先利用有限的一组V编码区。由Cohen开创的该方法利用活的、或减毒T细胞作疫苗，特别用于治疗或预防经验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。但该方法有局限性，因为它依赖于疾病特异的T细胞克隆的分离：必需利用病人自身增殖的细胞来治疗各病人，就是说，需要“量身订制”，或者说个体化治疗(见Zhang等人，1993，Science，261：1451)。

还有其它人提出过基于TCR V区参与的TCR肽的治疗应用，如Offner，H.，1991，Science，251：430(用基于TCR Vβ8氨基酸序列的肽治疗，缓解Lewis大鼠病情，并加速其康复)；还有Hashim，G.A.等人，1992，J.Immunol.，149：2803-2809；Offner，H.等人，1992，J.Immunol.，148：1706-1711；Offner，H.，等人，1991，J.Immunol.，146：4165-417；Sun，D.，1992，Cell，Immunol.，141：200-210等文均有报道。这些肽一般是短肽，长度在8-25个氨基酸之间，很少超过30个氨基酸。例如与EAE相关的TCR链上存在的21个氨基酸肽用于预防Lewis大鼠EAE病(Vandenback，A.A.等人，1989，Nature，341：541-544；Vandenbark，A.A.，国际专利公开WO91/01133；Janeway，C.A.，1989，Nature，341：482-483)。另有人报道过相应于β链VDJ区域或Jα区的只有8或11个氨基酸的更短肽，证明其用作疫苗，在大鼠模型中可有效预防或缓解EAE病情(Howell，M.D.等人，1989，Science，246：668-671；Howell，M.D.等人，国际专利公开WO92/12996)。

衍生自TCR蛋白的肽普遍用作治疗自身免疫病的候选药物，是因为其容易合成，还因为以前尚无能按有用量，并具明显生物活性之标准生产更长TCR V区域蛋白的方法可依。更重要的问题是，其所用合成小肽的主要缺点是要求对这个能有效调节免疫反应的特殊序列作出预测。必须预测要使用的肽的抗原性或免疫原特性，比如它们在V区域的超变区或互补决定区(CDR)的存在。此外，衍生自特定TCR的所设计肽之大小需经过计算，使之保持适当表位结构，以便抑制T细胞活性，或激活释放针对携载特定TCR(该肽与之相应)的T细胞亚群体之抗体。设计此种肽需很多时间和经验，在考虑用于治疗人的很多情况下，出于人道或道德原因，必需的实验无法进行。

另外，为获得由调节性T细胞引起的特异性抗原反应，该肽必须与个体的MHC分子结合。这些存在于靶细胞上的MHC抗原具多态区，其中特定等位基因存在于特定个体之中。绝大部分情况下，个体有二个单倍型，即存在来自同一基因座的特定MHC抗原的二个不同等位基因。并不是所有肽均有与MHC抗原结合的能力，也不是所有MHC抗原可结合某一单个肽，因为就每个单倍型而言有多种MHC抗原。因此此种T细胞介导的肽类治疗法的适用性需要针对每个个体的单倍型进行测定，即要求对患者个体订制不同的肽。

4.可溶性T细胞抗原受体的生产

借助重组技术生产大量可溶性TCR蛋白因为几个原因而未能如愿。生产可溶性T细胞抗原受体要克服的主要障碍是在不存在穿膜区域条件下的分泌作用(Traunecker，A.等人，1989，Immunol.Today，10：29-32)。某一研究者已证明鼠TCR(包括V、D、J区，接着是平截型Cβ区)的全长单体β链的分泌。该方法利用了免疫球蛋白轻链羧基末端与TCRβ链中Cys 241周围序列之间的同源性。该所得构建体利用编码来自MPC-11的k-链前导肽序列和重排的VDJ外显子的嵌合基因。该所得构建体在哺乳动物细胞中表达，且在该细胞上清液中可检测出。但该方法并未提出在不存在额外蛋白序列的条件下获得全长V区域蛋白的手段，因为该分泌作用取决于平截Cβ外显子的存在(Gasgoigne，N.，1990，J.Biol.Chem.，265(16)：9296-9301)。

另一研究组借助磷脂酰肌醇聚糖连接锚定的重组TCR异二聚体的表达，试图实现TCRβ链的可溶性形式以生化有意义量进行表达。该方法产生少量(每次收获0.5mg)全长TCR链，且需用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C从转染的细胞表面裂解下来(Lin，A.Y.等人，1990，Science，249：677-679)。

还有一些人通过将鼠TCR的可变区和恒定区与免疫球蛋白κ轻链恒定区组合，而生产出嵌合分子。这些研究者已能获得少量分泌的异二聚体αβTCR的可溶性形式(Gregoire，C.等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8077-8081)。Gregoire等人给出了由KB5-C2的Cα和Vα基因连接S105单克隆抗体κ轻链的C区组成的鼠嵌合体。也给出了VβCβCκ嵌合体。二者均被转染进不表达天然免疫球蛋白重链或轻链的哺乳动物B细胞骨髓瘤中(也见Weber，S.等人，1992，Nature，356：793-795)。

Novotny等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8646-8650介绍了一种生产具抗原结合特性的可溶性TCR的方法。将合成寡聚接头克隆进Vβ区C末端和Vα区N末端，得到单链VβVα。该所获表达载体编码框架中pelB前导序列之后紧接Vβ、接头和Vα片段。该构建体表达是在lacZ启动子控制之下，因此是IPTG可诱导的。

目前，有研究组已获得了与羧基末端多组氨酸“尾”融合的T细胞受体V区的少量分泌。该质粒含PelB前导序列，并在可化学诱导启动子的控制之下(Ward，E.S.，1991，Scand.J.Immunol.，34：215-220)。但此项研究并未描述如何在不存在融合部分的情况下获得T细胞抗原受体V区蛋白，或者怎样获得工业用量的受体V区域。

因此，非常需要针对自身免疫反应具特异性能，其选择具可预测性，且能方便和重复制备的药剂和药物组合物。

本发明首次提供了成功地生产治疗特定的T细胞介导疾病(涉及T细胞亚群)的通用药剂的方法，从而解决了上述问题。具体地说，本发现提供了可以进行自然加工的有效量的全长TCR V区域蛋白。体内加工后提供多种活性片段，并由每一个体的抗原呈现细胞呈现，从而不再需要进行“量体载衣”式的治疗药物。本发明也提供了在细菌中生产TCR V区域蛋白的一类重组表达载体。本发明重组TCR V区域蛋白，在治疗、预防或抑制与免疫相关之失调症方面有用。在另一实施方案中，TCR分子可以与药用相宜载体混合，作为治疗组合物使用。在又一实施方案中，所述TCR V区域蛋白可用于产生抗-TCR抗体。此外，该TCR V区域蛋白可用于诊断表征特定免疫相关失调症。根据其与自身抗体结合的能力，本发明TCR V区域蛋白可用作诊断探针。本发明优点之一是，该T细胞抗原受体V区域蛋白能在不存在融合蛋白或亲和尾(affinity tail)的条件下表达。本发明另一优点是，该TCR V区域蛋白能以工业规模之量生产，以便制备成对T细胞介导的自身免疫疾病有疗效之组合物。

本发明还提供了生产纯全长TCR V区域分子的表达载体。本发明表达载体包括编码T细胞抗原受体V区域的基本元件。本发明的TCR编码区是编码全长TCR V区域蛋白的任何核酸分子。在一优选实施例方案中，该TCR编码区包括Vβ5.3区域的结构性编码序列。

本文所述表达载体，提供了可诱导表达TCR V区域蛋白的工具。在优选实施方案中，T细胞抗原受体V区域编码序列处于可诱导细菌启动子的转录控制之下。根据本发明，该可诱导细菌启动子受化学或热调节。最优选该可诱导细菌启动子受热诱导。

在一实施例方案中，本发明的表达载体包括编码能与启动子结合的蛋白的调节基因，并由此抑制从可诱导启动子的转录作用。在一优选实施方案中，启动子来自E.coli lac操纵子，而调节基因含有E.coli lac I阻遏基因的功能性突变。该突变体lac I基因(lacIts)编码一个温度敏感性阻遏蛋白，利用该lacIts基因产生启动子热诱导作用。在一优选方案中，可诱导细菌启动子是trc启动子，而热诱导作用由lacIts调节基因提供。

在一实施方案中，调节基因位于一个共转化载体上。另一实施方案中，该调节基因位于细菌宿主细胞染色体中。在一优选实施方案中调节基因位于重组表达载体中。另一优选实施方案中，突变体lacI基因的转录方向与所表达之T细胞抗原受体结构基因取向相同。

本发明的重组表达载体包括前导肽或信号肽的编码序列亦为一有利方案。该前导序列，与欲表达的TCR V区编码区在同一读框内及5′端融合，指导有N-末端前导肽的TCR V区域蛋白的合成，而该N-末端前导肽随后指导重组蛋白穿过宿主细胞膜的分泌作用。本发明的其它实施方案不利用前导序列，而所需V区域产物可从细胞中分离，例如通过脲提取法分离。

在一优选实施方案中，本发明重组表达载体从5′到3′的方向依次包括：一个trc启动子，一个核糖体结合位点、一任选的前导序列、一个全长T细胞抗原受体V区域编码区、一个终止密码子、一个或多个转录终止子，一个其转录方向与T细胞抗原受体V区编码区相同的lacIts调节基因、一个细菌的复制起始点，和一个四环素抗性基因。

本发明也提供了以明显超过已有方法高水平生产TCR V区域蛋白的方法。

本发明提供治疗患免疫相关失调症病人的组合物和方法。该治疗包括给需此种治疗的患者施用根据本发明的组合物，其量及给药时间适宜于调节所述免疫失调症状。本发明的优点之一是，本发明组合物可治疗免疫相关失调症，而无需筛选特定肽片段，且无需针对特定待治疗个体调配特定组合物。

本发明也涉及全长T细胞抗原受体V区域蛋白在治疗自身免疫疾病和失调方面的应用。在一特定实施方案中，本发明涉及全长Vβ5.3蛋白的治疗应用。在另一实施方案中，本发明提供全长T细胞抗原受体V区域蛋白，在生产治疗自身免疫疾病或失调药物中的应用。因此在一个实施方案中，本发明能将全长Vβ5.3蛋白用于生产治疗MS之类与免疫相关的疾病和失调症的药物。

有关附图的简要说明：

图1：本发明全长Vβ5.3蛋白的全核苷核序列[SEQ ID No.25和SEQ IDNO.26]和氨基酸序列[SEQ ID NO.27]。

图2：pKTB-Vβ5.3质粒图谱。该质粒含Ptrc(trc启动子)、g10(来自噬菌体T7的g10前导基因片段)、SD1(核糖体结合位点1)、MC(编码核糖体结合位点2[SD2]AAG GAG[见微型顺反子核苷酸全序列SEQ ID NO.28]和肽Met Tyr Arg Leu Asn Lys Glu Glu[SEQ ID NO.29]的微型顺反子)、STII(STII前导序列)、Vβ5.3(Vβ5.3编码区)、T1T2(rrnB操纵子的转录终止子)、编码温度敏感性lac抑制基因的lacIts、Ori(复制起始点)、和Tet^r(四环素抗性基因)。

本发明描述了重组表达载体和大量生产T细胞抗原受体V区域蛋白的有效方法及其应用，包括诊断、治疗、预防或抑制免疫相关疾病及失调症。

已开发出一系列高水平生产全长TCR V区域蛋白的载体。此外，还提供了使用本发明表达载体以工业规模生产全长重组TCR V区域蛋白的方法。本发明的方法和载体是独特的，因为它们提供的生产全长T细胞抗原受体V区域蛋白不存在额外蛋白序列或融合对应体。正如前面有关本发明背景部份详细叙述过的，从前，T细胞抗原受体V区域只能作为更大蛋白的部分，以极低水平生产。这些额外蛋白在体内使用时可以引起不期望的免疫原性，常被管理当局划入不能允许的杂质之列。以前提纯的V区域蛋白还包括TCR的其它区域，如与V区域融合的C区。有些人曾构建过提供作为嵌合蛋白的TCR V区域(例如V区域与免疫球蛋白分子部分融合)的表达系统。

本发明的表达载体和方法，还提高了T细胞抗原受体V区域蛋白的表达水平。生产有商业应用价值(例如科研、诊断和治疗)的蛋白，其主要考虑便是要以工业规模生产该蛋白。因此本发明提供了TCR V区域蛋白之更高水平生产法。本发明使得V区域蛋白大量生产(例如每升细菌培养物产1-500mg或更多)成为可能。优选该蛋白生产水平至少可达100mg/l。在最优选实施方案中，本发明生产水平是每升细菌细胞培养物至少获300mgVβ蛋白。

本发明方法和表达载体生产的TCR V区域蛋白无额外的蛋白序列。因此本发明省去了现有方法中获得纯净TCR V区域蛋白所需要的其它几个步骤。在一个实施方案中，本发明还提供了通过热诱导提高V区域蛋白表达的方法，由此避免需清除化学诱导剂(例如IPTG)的步骤。

因为根据本发明的TCR V区域蛋白不存在额外蛋白，因此本发明提供了生产相对纯净产物的简单方法。本发明省去了附加加工步骤，例如向体系内引入酶或化学试剂，以便获得无任何融合的非TCR肽片段或亲和尾的蛋白。此种操作不仅往往会降低V区域产物的回收量，也引入了必需消除的成份，即需附加提纯步骤。

1.T细胞抗原受体V区域

本发明的T细胞抗原受体V区域蛋白是任何全长T细胞抗原受体V区域。全长TCR V区域蛋白是由T细胞抗原受体V区域的一个编码区编码的。该TCR V区域编码区是编码全长T细胞抗原受体V区域蛋白的核苷酸序列。本发明范围中，V区域包括T细胞抗原受体的可变区。从最为广泛的角度来说，本发明技术可以用来获得包括V区域，还包括D和/或J区域全部或部分区域的TCR蛋白之大量表达。

生产的TCR V区域蛋白不存在额外蛋白序列，例如恒定区、穿膜区或胞质区之类的其它TCR区。并且本发明的TCR V区域蛋白也不存在非TCR的融合对应体，例如亲和尾。此外，本发明TCR V区域蛋白，也不作为包括其它蛋白分子如免疫球蛋白在内的更大嵌合蛋白的一部分来生产。

已意识到，编码T细胞受体V区域的互补决定区(CDR)之一的DNA序列实际可以跨越V编码区和D编码区之间的已知的连接区(如在Vβ5.3的CDR3情况下)，这样本文所用之术语“全长”V区域编码区，既可包括此种横跨V-D连接区的CDR的全部编码序列，或此种CDR只位于已知V区域的部分序列，或者可以根本不包括此种CDR的编码序列。而且，本发明全长T细胞抗原受体V区域蛋白可以是任何T细胞抗原受体V区域，并不只限于Vβ区(即TCRβ-链V区域)。因此T细胞抗原受体V区域蛋白可以是α亚基、β亚基、δ亚基、或γ亚基的可变区。

在一优选实施方案中，本发明之TCR V区域蛋白是可得到全长编码序列的任何T细胞抗原受体V区域。获得本发明全长编码序列的方法是已知技术。人V区结构域DNA序列可按已知方法从多种人细胞(优选外周血T淋巴细胞)中分离获得。

本发明之DNA序列可用不同方法制备。优选该T细胞抗原受体V区域DNA序列通过用编码完整TCR的DNA序列作模板进行聚合酶链反应(PCR)而制备。例如，采用抗-CD3抗体刺激，从人外周血淋巴细胞制备cDNA，再通过扩增可制备人Vβ区域，此系遵循Chov等人，1989，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8941-8945一文所述方法进行的。

本发明一个方面，是从含该全长序列的任何克隆获得全长T细胞抗原受体V区域的编码区。例如，Concannon等人，1986，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：6598-6602一文中所述含全长编码区的几个TCR V区域序列和cDNA克隆。

本发明优选的TCR V区域蛋白是那些与免疫相关疾病或失调有关者，具体例如Vβ8.1(川崎病，见Abe等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4066)、Vβ6.1(麻疯病，见Wang等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90：188)。Vβ5.1(Lyme病，见Lahesma等人，1993，J.Immunol.，150：4125)、Vβ5.2、或Vβ5.3或Vβ6.1(多发性硬化症，见Kotzin等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9161)、Vβ2.1或Vβ3.1(类风湿性关节炎，见Uematsu等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：8534；也见Hfler，D.A.等人，1988，J.Exp.Med.，(67：1313；Mantgazza R.等人，1990，Autoimmunity，3：431)。

由自身免疫疾病中T细胞表达的，或由对特定自身抗原应答的T细胞克隆表达的TCR，可以使用TCR特异性抗体(例如对TCR可变区片段特异性的多克隆、单克隆或嵌合抗体)配合抗体标记法，包括萤光显微术、流式细胞计数、免疫细胞化学、或其它已知技术来加以鉴定。许多针对TCRα和/或β链V区的此类抗体已在文献中介绍过(例如见国际专利公开WO90/06758)。

此外，该T细胞克隆的DNA或mRNA可以使用已知杂交方法直接检测，也可经PCR扩增(Synha等人，1988，Science，239：1026；Saiki等人，1986，Nature，324：163)后，使其与各种TCR基因族的核酸探针特异性杂交来进行探测。然后该TCR序列或其部分可以直接从扩增的重排DNA或mRNA获得。

特定TCR的表达也可以通过检测编码至少部分TCR的核酸序列来鉴定，例如，可在克隆TCR V基因之后，或者可以通过测定至少部分TCR蛋白的氨基酸序列来鉴定。显然，上述任何方法，或本领域专业人员熟知的其它方法，结果均能鉴定在某T细胞  克隆或T细胞系上表达的TCR。

用于将TCR基因表达与疾病相关联的分子研究法的例子包括：

(1)产生和分析从一个或多个患病受试者获取的，与疾病相关T细胞所得到的cDNA库，确定是否存在频繁使用的或者“显性”的TCR基因；

(2)对疾病样本进行Southern分析，确定是否存在特异性遗传多态性(例如RFLP)或寡克隆TCR重排；

(3)采用cDNA合成PCR扩增、印迹(Slot blot)杂交法等对疾病样本进行分析；

(4)针对未预先培养之T细胞进行TCR探针的核酸原位杂交。

优选的TCR V区域蛋白包括Vβ8.1，Vβ5.2或Vβ5.3。编码Vβ5.3的双链cDNA和Vβ5.3的氨基酸序列示于图1(见SEQ ID NO.25，26和27)。

采用本领域专业人员熟知的方法，可将T细胞抗原受体V区域克隆导入本发明的表达载体上。例如，V区域被从cDNA克隆用PCR合成并在5′端加上起始ATG。可以合成任何适当的限制性酶切位点，用于整合进起始密码子并重建V区域的编码区。在优选实施方案中，限制性位点是NcoI位点。在V区域编码序列的3′端设计一个终止密码子和适当限制性位点，以便其可亚克隆进载体中。

应当认识到本发明的方法可用于制备从人以外的动物衍生的全长TCRV区域。

2.表达载体

本发明范围内的重组表达载体是含有编码待表达TCR V区域的核酸形式的外源DNA的质粒。将本发明之重组表达载体导入细菌宿主细胞，例如，通过转化，再分离和克隆表达所需V区域蛋白的转化子。

本发明涉及含编码全长TCR V区域蛋白的DNA序列的表达载体。优选该TCR V区域蛋白是本文详述的那些T细胞抗原受体蛋白。本发明范围的表达载体是含有在调节元件的转录和翻译控制下表达的TCR V区域基因的质粒。所述调节元件例如是启动子、核糖体结合位点以及转录终止子。此外还含细菌中稳定复制的复制起始点。它还优选包括编码抗生素抗性的基因，以便于含有质粒的转化细胞的筛选。当该表达载体导入适当宿主时，该所克隆序列便得到表达。

本发明所用表达载体通常是质粒形式。质粒是不整合入染色体的环形双链DNA序列。本发明表达载体也可以包括其它DNA序列，例如使表达产物定位或使其稳定的前导序列或信号序列，和/或使基因表达得到调整的调节序列，例如使该表达对温度变动或生长培养基组成变化能有所反应。

含一个或多个控制序列的表达载体，以可操纵方式连接到编码TCR V区域的DNA序列上。本发明范围内，所谓“以可操纵方式连接”表示，对基因表达有调节功能，或能编码某功能蛋白结构域的一种核酸序列，以其5′或3′末端共价连接到编码某蛋白的第二个核酸序列上，以便其调节功能对第二核酸序列施加影响，或者所述编码功能性的结构域在同一框架中与由第二个核酸编码的蛋白融合。所述对基因表达的调节功能，一般包括转录起始，转录终止、和对mRNA转录物处理。在基因表达中施加此种调节功能的核酸序列包括转录启动子、转录终止子、和mRNA处理信号。可以“按可操纵方式”连接到另一蛋白的功能性结构域包括例如可使蛋白透过细胞膜运输的前导肽或信号肽。

在一个实施方案中，启动子可以是任何可诱导启动子。在一优选方案中，所述启动子是可由存在或不存在某些培养基成分调节的启动子。本领域专业人员熟知受某些培养基成分的存在或不存在控制的几种细菌启动子，它们可以同本发明的表达载体相连使用。优选强细菌启动子，例如lac启动子、tac启动子、和trc启动子。因此，在一个实施方案中，本发明的一个载体中TCR V区域编码序列的一个启动子是受异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)(lac、tac、和trc启动子的安慰化学诱导物分子)的存在与否来调节。优选情况下，IPTG诱导启动子是lac启动子或tac启动子。在更为优选的实施方案中，IPTG诱导启动子是trc启动子(Brosius等人，1985，J.Biol.Chem.，260：3539-3541)，它相似于lac UV5启动子的-10区域与色氨酸操纵子的-35区域融合衍生的tac启动子(de Boer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25；Amann等人，1983，Gene，25：167-178)。除启动子中有单个碱基对改变外，trc启动子与tac启动子相同(Brosius等人，1985，前述文献)。

另一实施方案中将本发明表达载体加以改进，使之能通过温度改变来分泌表达本发明全长TCR V区域蛋白。根据该方案，在不存在化学诱导剂条件下，该表达载体可表达TCR V区域蛋白，即排除对IPTG和含LacI及lacI^q基因的细菌宿主菌株这样的因素之需要。本发明表达载体的优选方案包括能使蛋白表达受热诱导的调节基因。该调节基因序列最优选lacIts基因、该基因编码温度敏感lac阻遏物。

另一优选实施方案中，lacIts基因靠近转录终止子，并在其下游，其转录方向与V区域编码序列相同。

此外，本发明表达质粒优选含一个或多个筛选遗传标记。优选该筛选遗传标记赋于抗生素抗性，例如氨苄青霉素、卡那霉素或四环素抗性。最优选该选择性标志是四环素抗性基因。

另外，该载体包括一个细菌复制起始点。优选方案中，复制起始点来自pBR322。该表达载体还含有核糖体结合位点和E.coli的rrnB核糖体RNA操纵子的转录终止子(Brosius等人，1981，Plasmid，6：112-118)。

优选实施方案中，本发明表达载体从5′到 3′方向含有如下基本元件：一段含启动子和操纵基因的DNA序列、含能使宿主细胞中所需基因的mRNA结合到核糖体上的核糖体结合位点的DNA序列、ATG起始密码子或者一旦将所需基因插入载体中即能转换成ATG起始密码子的DNA序列、一个可插入所需基因并使之与ATG起始密码子处于同一阅读框架中的限制性位点，或一个含为插入适当基因或待表达编码区的几个限制性位点的多克隆位点，编码欲表达的T细胞抗原体V区域的核酸序列，和用于有效终止转录的转录终止子。该载体也含来自细菌质粒的能在宿主细胞中自主复制的复制起始点的DNA序列，以及含与载体存在于宿主时表现出的可筛选或可识别表型特性相关的基因之DNA序列。该表达载体还可任选包括以可操纵方式连接的信号编码序列或前导编码序列。即在同一阅读框架中，融合于编码TCR V区域的核酸序列的5′末端，以便该前导序列-TCR V区域序列的翻译得到前导肽-TCR V区域融合蛋白。其中，在该融合蛋白氨基末端的前导肽指导TCR V区域蛋白穿过宿主细胞膜的分泌作用。某些优选方案中，该表达载体含一个通过温度改变使该分泌蛋白表达的调节基因。

在一更为优选之方案中，从5′到3′方向，该表达载体含下述基本元件：由lac UV5启动子的-10区融合色氨酸操纵子的-35区组成的trc启动子(deBoer等人，前述文献；Amann等人，1983，前述文献)、一个强核糖体结合位点、欲表达的TCR V区域编码区、来自rrnB核糖体RNA操纵子的二个转录终止子、编码温度敏感性lac阻遏物的lacIts基因、pBR322的复制起点、和一个四环素抗性基因。该选方案之典型一例，表达载体pKBi-Vβ5.3，根据布达佩斯条约保藏于Aimerican Type Culture Collection(ATCC)保藏号69739(1995年1月6日)。

本发明表达载体可以含以可操纵方式连接于TCR V区域编码区5′末端编码信号肽的前导序列。一旦表达，氨基末端信号肽将指导TCR V区域蛋白穿过宿主细胞膜分泌，进入周质腔或培养基。本领域专业人员熟知，有许多前导序列可以与本发明表达载体连用。一种适宜的前导序列是来自胡萝卜欧文氏杆菌(E.carotovora)的pelB信号序列(Lei等人，1987，J.Bacteriology，169：4379-4383)。另一适宜前导序列是大肠杆菌(E.coli)热稳定性肠毒素II(STII)的信号序列(Morioka-Fujimoto等人，1991，J.Biol.Chem.，266：1728-1732)。

在一个实施方案中，表达体系含STII前导序列，而V区域编码区经PCR合成，3′末端含适当限制位点，且5′末端含组建的MluI位点，以使其能方便地与结合入STII前导肽3′末端的MluI位点连接。在另一更优选方案中，表达载体从5′到3′方向含：由lac UV5启动子-10区与色氨酸操纵子-35区融合的trc启动子、一个强核糖体结合位点、STII前导、欲表达的T细胞抗原受体V区域编码区、来自rrnB操纵子的转录终止子、编码温度敏感性lac阻遏物的lacIts基因、pBR322复制起始点，和一个四环素抗性基因。在一最优选方案中，表达载体是pKB-Vβ5.3。

本发明的表达载体可以使用本领域标准技术构建(见Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labratory，ColdSpring Harbor，NY(1982))。

本发明另外还涉及含表达载体的宿主细胞，而所述表达载体含编码全长TCR V区域的DNA序列。此外，优选宿主细胞含有带一个或多个调控DNA序列的表达载体，而所述调控DNA序列能指导编码全长T细胞抗原受体V区域蛋白之DNA序列的复制和/或表达。适宜的宿主细胞包括原核宿主细胞，优选的原核宿主细胞是细菌宿主细胞，最优选是E.coli(大肠杆菌)细胞。从本申请的说明，本领域专业人员可以明白，具体使用的表达载体将影响挑选用来生产全长TCR V区域蛋白之宿主株的选用。例如，对本发明范围内针对化学诱导的表达载体来说，具体采用带有lacI或lacI^q基因(它调节trc启动子)的细菌宿主菌株。而本发明范围内，对于含有lacIts基因(它提供温度敏感性阻遏物)之类的调节基因的表达载体来说，则优选不宿有野生型lacI或lacI^q基因的细菌宿主菌株。特别优选的宿主细胞是LJ24。

某些方案中，本发明表达载体不含前导序列，某些优选方案中细菌宿主菌株是E.coli BL21，或更优选蛋白酶缺陷E.coli菌株，例如SG21163，SG22094，或SG21173。

采用现有技术的各种方法，可将本发明表达载体导入宿主细胞中，所用方法由宿主细胞之类型而定。例如，氯化钙处理或电穿孔一般用于原核细胞(参见Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，cold spring Harbor，NY(1982))。

一旦表达载体被导入适当宿主细胞，可将该宿主细胞在能使大量TCR V区域得到表达的条件下培养。

采用任何适当手段可以鉴定该含表达载体的宿主细胞(其中所述表达载体含编码TCR V区域蛋白的DNA序列)。例如下面实施例中，使用免疫测定法免疫测定V区域蛋白的产生。另外，本发明含表达载体的宿主细胞，可以通过检测TCR V区域DNA转录水平来鉴定，而所述转录水平测定则由测定宿主细胞中TCR-V区域特异性mRNA转录物而得出(例如采用Northern印迹分析)。而在另一方法中，含本发明表达载体的宿主细胞，可通过用与该载体的TCR V区域编码序列互补的探针进行DNA-DNA杂交来鉴定。

本发明DNA序列，表达载体或DNA分子，可以用已知技术中的各种方法测定。例如由Sanger等人，在1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467中所述双脱氧链终止技术进行测定。

遵循本文提供的实施例，并利用上述一种或多种检测方法，本领域专业人员不用作过多实验，很容易选择出能提供最佳TCR V区域表达的表达载体和宿主细胞之组合。通过一特定宿主菌株与本发明的一特定表达载体相组合，能够获得相当高的全长T细胞受体蛋白的表达水平。优选该全长TCR V区域蛋白的表达水平是每升培养物至少300mg。这样的表达水平，比如可用E.Coli SG21173作细菌宿主菌株，pKBi-Vβ5.3作为表达载体(见下面实施例)的优选方案来达到。本发明的此种宿主和表达载体之组合，可以生产大量全长T细胞受体蛋白，而成本却低于已有方法。

表达之后，可以按标准方法来提纯本发明蛋白，包括硫酸铵沉淀法、亲和色谱法、柱色谱法、凝胶电泳法等等(参见Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，NY(1982))。

在一优选实施方案中，T细胞抗原受体V区域是可溶性的，这就是说，该T细胞抗原受体V区域在水相系统中可溶解。“可溶性”蛋白一般其特征在于，室温下经高离心力离心(100,000xg)不能使之从水相缓冲液中沉淀出来。溶解性对于简化TCR V区域蛋白从生产细胞中提纯来说特别重要。蛋白化学中一般使用的水相缓冲液含有维持特定pH值(一般在生理学范围pH5-9)的缓冲化合物，其提供特定离子强度(一般约10mM-约500mM)，并且通常包括一种蛋白酶抑制剂和温和去垢剂。标准缓冲液的例子是磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液或任何大量用于蛋白分离的缓冲液(见Methods in Enzymology；Mahler and Cordes Biological Chemistry(2d Ed.)，Harper and Row，New York(1966))。

3.T细胞抗原受体V区域蛋白的应用

本发明首次提供了有效地、经济地生产诊断、治疗和研究使用量的TCRV区域蛋白之手段，该蛋白是非融合蛋白，或不与额外序列(例如亲和尾)连接。

A.研究应用和诊断应用

本发明TCR V区域蛋白对于T细胞抗原受体(TCR)的结构和功能研究很有用。除了作为TCR特异形式的底物或结合结构域外，这些蛋白可以作为研究构象的工具，例如，研究T细胞受体各部分的天然构象。

该T细胞V区域蛋白也可用作诊断探针。在一特定方案中，本发明的TCR V区域蛋白可以用来测定一生物样本中某一特定TCR V区域亚族的存在或其量。一个此种检测在Rittershaus，C.W.的国际专利公开WO92/08981中有介绍，该专利题为“Therapeutic and Diagnostic Methods Using TotalLeukocyte Surface Antigens”。因此，本发明提供通过检测与疾病相关的特定T细胞亚类来诊断免疫相关疾病，例如多发性硬化症(MS)的方法。

另一方案中，本发明可用于生产抗体制备中所需的大量T细胞抗原受体V区域蛋白。该抗体可采用本领域很多已知技术之任何一种来制备。为生产单克隆抗体(MAb)，可使用借助培养物中连续细胞系来提供抗体分子生产的任何方法。这些方法包括(但不限于)最先由Kohler和Milstein(1995，Nature，256：495-497)介绍的杂交瘤技术；更近的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，1983，Immunology Today，4：72)；EBV技术(Cole等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp77-96(1985))；和损伤(trauma)技术。对于抗体生产方法的综述见：Hartlaw，E.等人，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，(1988)。

根据其与存在于生物样本中的自身抗体反应之能力，本发明TCR V区域蛋白可以作为诊断探针使用。

本发明也考虑到可以由适当检测器，例如闪烁计数器和Geiger计数器，或放射显影膜来检测的TCR V区域蛋白的标记衍生物。此类衍生物例如包括体外和体内诊断用的¹²⁵I、¹³¹I、¹³¹C、³⁵S、³H、¹¹²In、⁹⁹M、Tc等等。

B.治疗应用

如上所述，本发明在治疗免疫相关疾病方面很有用。此外，所谓“免疫相关疾病”指免疫系统参与了该病病理之疾病，或者，若对免疫系统加以适当刺激，便可预防的一类疾病。相关疾病包括(但不限于)自身免疫疾病、肿瘤、感染性疾病、过敏症、移植病、移植物对宿主病、和退化性神经系统疾病等。自身免疫疾病包括(但不限于)关节炎(例如类风湿性关节炎)、I型糖尿病、青少年糖尿病、多发性硬化症、自身免疫甲状腺炎(淋巴瘤性甲状腺炎)、重症肌无力、全身性红斑狼疮(SLE)、Sjogren综合征、突眼性甲状腺肿、Addison病、Goodpasture综合征、硬皮病、皮肤肌炎、粘液水肿、多肌炎、恶性贫血、包括Crohn病和自身免疫性萎缩性胃炎在内的肠胃炎症，以及自身免疫溶血性贫血。肿瘤病包括(但不限于)、白血病、淋巴瘤、非-何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏淋巴瘤之类的淋巴增生性疾病、以及乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、肾癌之类的癌症。感染性疾病包括(但不限于)由HIV、HSV、EBV、CMB、流感、A、B、C肝炎等病毒引起的病毒性感染；由酵母属念珠菌等引起的真菌感染；寄生虫感染，例如由血吸虫、丝虫、线虫、旋毛虫或原虫(如引起昏睡病的锥虫等)、引起疟疾的疟原虫、或引起利什曼病的利什曼虫等引起的感染；由分支杆菌、棒状杆菌或葡萄球菌等引起的细菌感染。过敏症包括(但不限于)I型过敏症例如与过敏原接触引起的过敏症；II型过敏症例如存在于Goodpasture综合征、和重症肌无力等中的过敏症。

本发明TCR V区域蛋白的治疗应用，其前提在于特定免疫相关疾病与特定T细胞抗原受体V区域的优先表达，或编码一TCR V区域蛋白特定序列的扩大使用相关。虽然本发明不局限于任何特定科学理论，但该TCR V区域有用，部份原因为其可用于调节个体内的免疫应答。具体说来，若特定V区域的异常高表达与特定免疫相关失调相关，那么可以通过中和载荷该特定V区域蛋白的T细胞来治疗个体。而引入TCR V区域蛋白，则通过刺激与载荷靶V区之T细胞特异性相互作用的调节性T细胞，来对免疫抑制功能施加影响。也很有可能是，TCR V区域蛋白可以激发与T细胞上靶V区能特异性相互作用的抗体应答，由此调节该免疫反应。

本发明全长T细胞抗原受体V区域蛋白在治疗免疫相关疾病方面具有独特优点。以前，涉及特异性T细胞的免疫相关疾病的治疗可选择性方法包括：(a)不经治疗可能自愈；(b)用相应于T细胞原受体V区域不同片段的肽治疗；(c)非特异性治疗，例如类固醇或非类固醇抗炎症药剂治疗。然而这些方法无一能提供本发明的特别优点。本发明的治疗方法具有超过现有技术治疗免疫相关疾病的突出优点，本发明方法的目标仅仅是表达特定TCR V区域的特定T细胞亚群，适用范围很广的患者，因为本发明已消除了需根据特定个体的MHC单倍型选择特定肽的要求。本发明的方法更为靠近只调整与疾病相关的T细胞，而不影响被治疗者的其它T细胞这一目的。因此本发明在更广泛的群体内取得了较大特异性治疗之成就。

在一优选实施方案中，全长T细胞抗原受体V区域蛋白可用于向下调节或消除显示带有相同V区域的TCR之T细胞亚群。T细胞抗原受体V区域蛋白可以通过调节载负靶V区域之T细胞的活性或对载负靶V区的反应活跃的T细胞群诱导出非反应性作用，而治疗病症。在这种情况下，该T细胞抗原受体作为治疗组合物用于受治疗者。

使用任何已知不同技术的可鉴定与给定疾病相关的特异性T细胞抗原受体V区域蛋白。由Oksenberg，J.R.等人，1989，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：988-992一文中介绍过用于已知患有重症肌无力或多发性硬化症的患者的遗传学方法。

本发明所谓“治疗”一词，意指对于疾病的“预防”、“抑制”或“治疗”诸情况。“预防”涉及诱发疾病之前施用保护性组合物。这样，例如在实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)的动物模型中，在注射诱发疾病的致脑炎病原以前，适当给其施用保护性组合物，结果可成功地“预防”该病。

“抑制”指诱发事件出现之后，而临床病症出现之前，施以该组合物。再次以EAF为例，在注射致脑炎病原之后，而神经学症状出现之前恰到好处地给以保护性组合物，结果可使该病受到“抑制”。

“治疗”指病症出现之后施以保护性组合物。以EAE为例，注射致脑炎病原并出现临床症状之后，恰当地施用保护性组合物，结果使该病得以“治疗”。

为测定本发明TCR V区域蛋白的预防，抑制，或治疗效果，可测量某些临床后果，尤其是测定体外淋巴细胞增殖反应的变化。测定该特定V区域蛋白的治疗效力为本领域已知技术。

为确定该蛋白在对抗疾病的保护作用或治疗疾病中有效性，可以采取动物模型系统。Knight等人，1978，在J.Exp.Med.，147：1653和Reinersten等人，1978，299：515二文中公开过对易感小鼠进行的全身性红斑狼疮(SLE)治疗。采用来自另一物种的可溶性AChR蛋白，对SJL/J雌性小鼠诱导重症肌无力(MG)后的治疗，如Lindstrom等人，1988，在Adv.Immunol.，42：233-284一文中所介绍。通过注射II型胶原蛋白使易感性小鼠诱导关节炎，如Stuart等人，1984，在Ann.Rev.Immunol.，42：233-284一文中所述。注射分支杆菌热休克蛋白使易感大鼠诱导付关节炎(adjuvant arthritis)，如Van Eden等人，1988，在Nature，331：171-173一文中所述。施用甲状腺球蛋白使小鼠诱导甲状腺炎，如Maron等人，1980，152：1115-1120一文中所述。胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)可自然出现，或可由某些系的小鼠(如Kanasawa等人，1984所述)诱导。小鼠和大鼠的EAE可以用作人类MS症的模型。该模型中，脱髓鞘症由施用髓鞘质碱性蛋白(MBP)而诱导，如Paterson，P.Y.的Textbook ofImmunopathology(Mischer等编，Grune和Stratton，New York，pp.179-213(1986)一书、McFarlin，D.E.等人，1973，Science，179：478-480、和Satoh，J.等人，1987，J.Immunol.，138：179-184诸文所述。

当然，同样的蛋白可能在人体中并不有效，因为该蛋白可能并不相应于与该病相关的人TCR的适当位点，但应明确，为治疗属于其它物种(包括人)的受治者，可能要求将特定动物模型中所述蛋白序列加以修改。

4.含T细胞抗原受体V区域的药用组合物

本发明的蛋白和组合物或其功能性衍生物非常适宜于制备药用组合物。本发明药用组合物，可以施用于能感受本发明组合物有益效果的任何动物。所述动物之首要者是人，当然本发明并不限于人。

本发明药用组合物可采用能达到其所求目的之任何手段施药。例如可经非肠道给药，如皮下、静脉内、真皮内、肌内、腹膜、透皮给药，或者经口腔含化给药。此外，同时还可口服给药。该蛋白和药用组合物可以经非肠道丸剂注射，或在一定时间内慢慢灌注的方式给药。

所用剂量取决于受治者年龄、性别、健康状况、和体重、以及可能存在的其它同时进行的治疗的方法，还应考虑治疗频率和所希望之效果。本发明组合物的给药剂量范围要大到足以产生所需效果，例如，通过延迟型过敏反应(DTH)或抗体产生测定看出，引起了对该蛋白的免疫反应，并且该免疫相关疾病明显得到预防、抑制或治疗。但该剂量也不应大到引起各种副作用的程度，例如不希望的交叉反应，普遍的免疫抑制、过敏性反应等等。

用于人类的优选剂量范围是约0.001-1mg/kg体重。

除了含本身具药物活性的本发明蛋白外，该药物组合物还可含适宜的药用可接受载体，包括将该活性化合物加工制成药用制剂的赋形剂和助剂。优选该组合物包括明矾之类的佐剂，或本领域已知其它佐剂(例如参见Warren等人，1986，Ann.Rev.Immunol.，4：369-388；Chedid，L.，1986，Feder.Proc.，45：2531-2560)。

为提高扩散效果或生物活性，可使用本领域已知方法和化合物将该蛋白掺入脂质体中。

可以口服的片剂和胶囊形式、可以直肠给药的制剂(例如栓剂)、和注射或口服用的溶液形式制剂，均可以约0.001-约99％，优选约0.01-约95％活性化合物(一种或多种)的量与赋形剂相组合。

具体说来，适宜的赋形剂是糖之类的填料，例如乳糖或蔗糖、甘露糖或山梨糖醇纤维素制剂，和/或磷酸钙之类的填料，例如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及淀粉浆之类的粘合剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯基吡咯烷酮。

其它可以口服的药物制剂包括明胶制扣封胶囊，以及软胶囊、明胶和甘油或山梨醇之类增塑剂制密封胶囊。扣封胶囊可含颗粒形活性化合物，使其与乳糖等填料、淀粉等粘合剂、和/或滑石粉或硬脂酸镁等润滑剂混合，还可任选地含有稳定剂。软胶囊中，优选该活性化合物溶于(或悬浮于)适当液体，例如脂肪油或液体石腊中。此外还可加入稳定剂。

可用于直肠的药物制剂，包括例如栓剂，它由一种或多种活性化合物与栓剂基质结合组成。适宜的栓剂基质是例如天然或合成甘油三酯或链烷烃。此外也可使用由活性化合物与基质结合组成的明胶直肠胶囊。可用的基质包括例如液体甘油三酯、聚乙二醇、或链烷烃。

适于非肠道给药的制剂包括在水溶性形式，例如水溶性盐中该蛋白的水溶液。此外，该蛋白悬浮液也可以适当油注射悬浮液给药。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油、或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。含能提高悬浮液粘度之物质的水注射悬浮液包括，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇、和/或葡聚糖，这些悬浮还可任选地含有稳定剂。

为注射给药，使用常规的药用相宜非肠道载体配制该蛋白。这些载体是非毒性及治疗性的，在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Martin E.W.编，Mack Publishing Co.Easton，PA(1990))一书中描述了许多配方。赋形剂的非限制性例子是水、盐水、Ringer氏溶液、右旋糖溶液，及Hank氏平衡盐溶液。根据本发明的制剂可以含少量添加剂，例如能维持等渗性，生理pH值和稳定性的物质。

本发明蛋白优选配制成基本上不含聚集物和其它蛋白物质的纯净形式，优选浓度为约1.0ng/ml-100mg/ml。

用于预防、抑制、或治疗免疫相关疾病的本发明蛋白有效剂量是约1ng-100mg/kg体重范围，优选剂量范围是约10ng-10mg/kg体重，更优选范围是约100ng-1mg/kg体重。

提高该蛋白效力的方法在现有技术中是已知的。这些技术适用于本发明的蛋白质。

下面实施例仅为了说明，并不限制其范围。实施例

下述一般技术用于下面所有实施例中。

1.一般材料和方法A.细菌、质粒、和一般方法

E.coli GM2929(甲基化酶阴性)和E.coli LJ24(lac缺失)(Rasmussen等人，1991，J.Bacteriology，173：6390-6397)由Dr.Martin Marinus赠与(University ofMassachusetts Medical School，Worcester，MA)。E.coli JM109(Yanisch-Perron等人，1985，Gene，33：103-119)购自Promega Corporation，Madison，WI(USA)。BL21(lon^-，ompT^-)(Wood，WB.，1996，J.Mol.Biol.，16：118-133；Studier和Moffatt，1986，J.Mol.Biol.，189：113-130)购自Novagen，Madison，WI(USA)。SG22094(lon^-，clp^-)、SG21163(lon^-，htpr^-)和SG21173(lon^-，htpr^-，clp^-)由Dr.Susan Gottesman(National Institute of Health，Bethesda，MD(USA))赠与。这些Gottesman菌株有lacI基因缺失。用于转染的感受态细菌按Morrison(1979，Meth.Enzymology，68：326-331)提供的方法制备，或从Gibco BRL，Gaithersburg，MD(USA)购买(DH5α)。

pKK233-2(Amann和Brosius，1985，Gene，40：183-190)购自Pharmacia，Piscataway，NJ(USA)。pBR322(Bolivar等人，1977，Gene，2：95-113)从New England Biolabs，Beverly，MA(USA)获得。pBluescript II KS+(Alting-Mees等人，1992，Meth.Enzymology，216：483-495)从Stratagene，La Jolla，CA(USA)获得。含arg U(dnaY)基因的pDC952(Lindsey等人，1989，J.Bacteriology，171：6197-6205)由Dr.James R.Walker(University of Texas，Austin，TX)赠与。pSE420(Brosius，1992，Meth.Enzymology，216：469-483)和pKK480-3(Brosius，1992，前述文献)由Dr.Jurgen Brosius(Mount SinaiSchool of Medicine，New York，NY)赠与。pUCts(Bukrinsky等人，1988，Gene，70：415-417)通过Jurgen Brosius从Michail I.Bukrinsky处获得。

用标准方法构建质粒(Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1989))。DNA限制酶和修饰酶除非专门说明外均购自NewEngland Biolabs，并均按厂商说明书使用。除非另外指明，合成寡核苷酸均购自Operon Technologies，Inc.，Alameda，CA(USA)。

将等摩尔浓度互补寡核苷酸，在10mM Tris pH8.0，0.5mM MgCl₂中混合，并于100℃放置5分钟，然后慢慢冷却至25℃，使其退火杂交在一起。使用GeneAmp试剂盒(The Perkin-Elmer Corporation，Norwalk，CT(USA))，在Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler仪中进行聚合酶链反应(PCR)(Saiki等人，1988，Science，239：487-491)。DNA测序使用Sequenase kit(USBiochemical，Cleveland，OH(USA))，采用双脱氧核苷酸链终止法(Sanger等人，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467)进行。所有化学试剂均选取最高纯度者。B.细胞培养物的生长和诱导

为进行化学诱导培养，将冷冻甘油贮存菌种用来接种含6μg/ml四环素的5-25ml 2 XYT培养基[每升水中含16g Bacto-Tryptone(Difco 0123)、10g Bacto-Yeast Extract(Difco 0127)、10g NaCl，pH7.2-7.4]，并使其在37℃，280rpm条件下生长过夜。一般，再用1/100体积该过夜培养物接种含25ml 2 XYT培养基加6μg/ml四环素的二个125ml烧瓶的每一个。培养物在37℃，280rpm条件下生长直到A₅₈₀为0.5-1.0吸收单位为止，然后用1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，并使其继续生长2小时。

为进行热诱导，将培养物在30℃，280rpm条件下生长直至A₅₈₀为0.5-1.0吸收单位为止。然后将一份培养物保持在30℃而其余的转移至42℃水浴进行诱导，并使其再生长2小时。或者，一培养物于30℃生长直到A₅₈₀为0.3-0.6吸收单位为止，然后再将其分为二等份，一份维持于30℃，而另一份于42℃生长进行诱导。

为检测诱导结果，将相当于A₅₈₀＝1.0吸收单位的1ml细胞的两份样品移出(例如假设A₅₈₀＝3.0，则应取出333μl培养物)。将该样品在Eppendorf微量离心机上，14000xg条件下离心1分钟，弃去上清液，并将沉淀之细胞于-20℃贮存。

C.稳定性研究

将细菌连续三次划线培养成单克隆，并将来自第三个平板的一个单克隆用来接种含6μg/ml四环素的200ml 2 XYT培养基。该培养物生长至A₅₈₀＝0.5-1.0吸收单位，取出60ml与40ml甘油混合，取1ml等分样分装于100个小瓶中，于-80℃贮存。将剩余培养物分成两等分；一份进行非诱导培养，另一份加入IPTG诱导培养或改变温度诱导培养。二者再生长2小时。诱导以前及诱导两小时之后，各取相当于A₅₈₀＝1.0吸收单位的1ml培养物之样品，检测A₅₈₀吸收，pH值，并通过EIA、丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析检测蛋白产生。

以冷冻库中取三只小瓶进行细菌生长和蛋白产生平行试验。各瓶(1ml)均用于接种200ml 2 XYT培养基加6μg/ml四环素，并培养至A₅₈₀＝0.5-1.0吸收单位。然后将各培养物均分成二等分，一分进行非诱导培养，另一份进行化学或热诱导。将相当于A₅₈₀＝1.0时1ml培养物之样品，分别在诱导前和诱导2小时之后从两份培养物中取出，并按前述方法检测。

为进行稳定性研究，诱导之前，从三份平行培养物之一取出1ml等分样，用2XYT培养基按1/1000比例稀释，并取20μl或200μl接种于200ml加四环素的2XYT培养基中，使其生长至A₅₈₀＝0.5-1.0吸收单位。然后将培养物分成二等分，其中一份诱导，二者均再生长2小时。诱导前及诱导二小时之后分别取出相当于A₅₈₀＝1.0时1ml培养物量之样品，并进行上述检测。D.细胞分级分离

在7000xg条件下，将细胞离心处理7分钟使之沉淀，并将上清液(培养基)以14000xg条件，在电泳之前再离心5分钟。该细胞沉淀物再悬浮于原始培养物1/5体积的20％(w/v)蔗糖、0.3M Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA中，于25℃保温15分钟，并于6000xg离心处理7分钟。弃去上清液，将沉淀再悬浮于1/5原始体积冷水中，于0℃放置10分钟，通过渗透休克法(Nossal和Heppel，1966，J.Biol.Chem.，241：3055-3062)将位于周质腔中之蛋白释放出来。接着在9000xg条件下离心处理10分钟后，保留上清液(周质级份)，该细胞沉淀再悬浮于1×TST(25 mM Tris-HCl pH8.0、200mMNaCl、1mM EDTA、10ml/l Tween 20)，超声处理，于12000xg离心15分钟、并保留上清液(可溶性细胞溶质级份)。E.聚丙烯酰胺凝胶电泳

通过剧烈振荡或采用超声处理，在0℃下，每次5秒，功率输出0.4，共三次，将冷冻E.coli细胞沉淀再悬浮于70μl水中(Sonic Dismembrator，Model 301，ARTEK Systems Corp.)。将该破裂细胞与70μl 2x上样缓冲液(125mM Tris-HCl、pH6.8、4％SDS、20％甘油、10％β-疏基乙醇、0.002％溴酚兰)混合(Laemmli，1970，Nature，227：680-685)。将样品于100℃保温5分钟，14000xg条件下离心30秒，然后将10-15μl等分样加入事先制好的16％或10-20％丙烯酰胺Tricine凝胶(acrylamide Tricine gels)上(Novex，San Diego，CA(USA))，置于同一厂商提供的缓冲液中电泳。电泳条件是每两块胶125V恒定电压，或45mA恒定电流，时间是2小时，直到溴酚兰染料泳出凝胶为止。标准物是每泳道使用1μl的预染色低分子量蛋白标准物(#SE 130024，Integrated Separation Systems，Natick，MA(USA))。将凝胶在10％乙酸、25％甲醇、0.025％考马斯亮蓝R中染色过液。F.Western印迹分析

经SDS-PAGE分离，使用Semi-Dry electroblotter(Integrated SeparationSystems)、通过电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Immobilon-P，Millipore，Bedford，MA(USA))，将蛋白进行免疫检测(Towbin等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：4350-4354)。蛋白转移条件是每cm²膜10mA进行1-3小时。然后将该膜在封闭缓冲液(1×PBS，2％奶粉、0.1％Tween-20)中过夜封闭处理。

将该膜洗三次、每次以1×PBS、0.1％Tween-20洗5分钟，接着再每次用1×PBS洗5分钟共三次，然后将其浸入辣根过氧化酶(HRP)-酶联的抗-Vβ5.3单克隆抗体(13A2-HRP，0.25mg/ml)以1∶3000之比在1×PBS、0.1％Tween-20中的稀释液中。接着轻柔晃动2小时，如上所述洗涤该膜，并以强化化学发光检测法使该蛋白显现(Amersham，ArlingtonHeights，IL(USA))，接厂商说明书进行。膜曝光时间为5秒至1分钟。G.酶免疫测定法

将冷冻细胞沉淀以剧烈振荡处理使之再悬浮于20μl 8M脲、50mMTris-HCl，pH8.5中(Marston和Hartley，1990，Meth.Enzymology，182：264-276)，并按如下所述进行酶免疫测定，对Vβ5.3定量分析：

将Nunc-Immuno Maxisorp板(VWR#62409-002)用每ml PBS中含4μg4C2 IgG，按每孔100μl之量包被处理，并于4℃贮存过夜。弃去包被液，按200μl/孔加入封闭缓冲液(PBS，0.05％Tween-20中1％酪蛋白水解物)。室温下，150rpm条件下，将这些板温育2小时，然后用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)洗三次。将封闭缓冲液中的样品(稀释1/2000至1/32000)和Vβ5.3标准物以100μl／孔量加入并于150rpm条件下室温中保温90分钟。将该板用洗涤缓冲液洗三次，将HRP酶联抗Vβ5.3单抗(13A2-HRP)以1/500稀释于加入5％胎牛血清的封闭缓冲液中，以100μl／孔(0.5μg/ml)量加入各孔。然后于150rpm条件下将该板再于室温保温90分钟，洗涤四次，并加入100μl/孔邻苯二胺(OPD)底物。30分钟后，加入50μl/2NH2SO4/孔使反应终止。测定490nm波长处的吸收率，减去650nm处本底吸收率。空白孔不含样品。

2.质粒构建

                            实施例1pK2D的构建

表达本发明T细胞抗原受体V区域蛋白的出发点是含有能对表达T细胞抗原受体V区域蛋白适当调节之元件的质粒的构建。这些元件包括启动子，二个转录终止子、及细菌中稳定复制的复制起始点。因为调节方面的考虑关系到该蛋白(该蛋白的一个特征是适合体内作治疗用)的制备，选用编码抗四环素的基因以便于质粒载负细胞的选择。最后，出发表达载体要有一多克隆位点，其设计应有利于本发明的优选编码区克隆进表达载体中。下面实施例描述了本发明的独特出发质粒。

构建优选表达载体的出发点是pKK233-2(4.6kb)，下面将要介绍。如下述，将NcoI限制位点转变成SpeI位点：用NcoI消化pKK233-2，所得5′突出末端通过以绿豆(mung bean)核酸酶于25℃保温30分钟而除去。用苯酚-氯仿抽提该质粒两次，在有2M乙酸铵存在下用乙醇沉淀，并重悬于水中。用细菌碱性磷酶(Gibco BRL)去磷酸化之后，将该载体与合成的SpeI接头(#1085，New England Biolabs)连接，将该连接物转化入DH 5α感受态细胞产生pKK233-2A载体。

接着，按下面步骤将四环素基因复原：用EcoRI和SalI消化pKK233-2A(4.6kb)，产生两个片段，分别为279bp和4321bp。用琼脂糖凝胶电泳将两片段分开，并使用Geneclean Kit(BIO 101，La Jolla，CA(USA))从琼脂糖中纯化该大片段，用EcoRI和SalI从pBR322上切下含四环素基因氨基末端编码区的651bp片段。并连接到来自pKK233-2A的4321bp片段上。所得质粒pK2B(4.97kb)为E.coli DH5α细胞提供四环素抗性，并被进一步修饰使其缺失β-内酰胺酶(β-lactamase)基因的的一部分，并将HindIII位点转变成SacII位点，详述如下：

使用pK2B作模板，将跨越SpeI独特位点到转录终止子3′端的DNA片段进行PCR合成。按5′→3′的方向，含SpeI、PstI和SacII限制酶识别序列(下划线者)的5′“有义”引物表示如下：

5′-TATAATGACTAGTCCCTCCAGCCAACCGCGGCTG-3′[SEQ ID NO 1]

含一个ScaI位点(下划线者)的3′“反义”引物表示如下：

5′-GTCCTAGAGTACTGAGCGGATAC-3′[SEQ ID NO 2]

将1ng pK2B DNA模板，与含10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl、1.5mM MgCl₂、100μg/ml明胶、脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)各200μM、两种引物各1μM、和2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶的各反应物混合在一起。最终反应体积是100μl，用100μl矿物油覆盖。该DNA95℃变性2分钟。按95℃变性1分钟、60℃退火1分钟、及72℃引物延伸1分钟的模式循环30次完成扩增反应。以1％琼脂糖凝胶于40mMTris-HCl pH7.8，5mM乙酸钠、1mM EDTA中电泳分析该扩增DNA。

以SpeI和ScaI消化所得485bp PCR合成片段，然后连接到用SpeI和ScaI消化pK2B后所得4129bp片段上，得到称之为pK2C的质粒。

质粒pK2C(4.6kb)被进一步修饰使含一多克隆位点。首先用SpeI和SacII消化pK2C，并连接到含15个限制位点的双链合成寡核苷酸上。使等摩尔浓度的两个互补的合成寡核苷酸(长度分别为91和97bp)退火形成多克隆位点(MCS)，所述两寡核苷酸序列如下：

5′-GGCTCGAGCCTAGGCTGCAGCCCGGGGCGCGCGCGGCCGCAGGCC

TTTAATTAAGAGCTCCGGACCGCACAATGTGGGCGCGCCCTTAAGA-3′

[SEQ ID NO 3]

5′-CTAGTCTTAAGGGCGCGCCCACATTGTGCGGTCCGGAGCTCTTAA

TTAAAGGCCTGCGGCCGCGCGCGCCCCGGGCTGCAGCCTAGGCTCGAG

CCGC-3′[SEQ ID NO 4]

该MCS编码下述限制酶位点：SpeI、AflII、AscI、DraIII、RsrII、SacI、PacI、StnI、NotI、BssHII、XmaI、PstI、AvrII、XhoI和SacII。将该连接混合物转化入甲基化酶阴性E.coli GM2929。所得质粒pK2D(4.67kb)被局部测序，以确保该体外合成区域的完整性。结果：

出发质粒是含有下述元件的pKK233-2：trc启动子(Brosius等人，1985，前述文献)，该启动子相似于lac UV5启动子-10区与色氨酸启动子-35区融合(de Boer等人，1983，前述文献；Aman等人，1983前述文献)衍生的tac启动子，还含有一个核糖体结合位点，接着是三个单限制酶(NcoI、PstI和HindIII)克隆位点、然后是E.coli rrnB核糖体RNA操纵子的转录终止子(Brosius等人，1981，Plasmid，6：112-118)，此外该pKK233-2还含有氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶(β-lactamase)基因、pBR322复制起始点，以及来自四环素抗性基因的无功能性羧基末端小片段。

对该pKK233-2进行修饰，以破坏NcoI位点，恢复四环素抗性基因，除去β-内酰胺酶编码区的一个片段(上此使该基因失活)，并插入一个由15个限制位点组成的多克隆位点，产生pK2D。

                            实施例2

将质粒pK2D进一步修饰，加入来自胡萝卜欧文氏杆菌(Erwiniacarotovora)的pelB信号序列(Lei等人，1987，J.Bacteriology，169：4379-4383)，或者E.coli的热稳定肠毒素II(STII)信号序列(Morioka-Fujimoto等人，1991，J.Biol.Chem.，266：1728-1732)。pK-pelB的构建

操作质粒pK2D(4.67kb)使之包括进一个核糖体结合位点(Shine和Dalgarno，1974，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71：1342-1346；Shine和Dalgarno，1995，Nature，254：34-38；Steitz和Jakes，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72：4734-4738)和来自胡萝卜欧文氏杆菌的pelB信号序列(Lei等人，1987，前述文献)，建立质粒pK-pelB(4.74kb)，详述如下：

用位于MCS的SpeI和SacI消化pK2D，并将该载体与二个互补的合成寡核苷酸(分别长103bp和95bp，见示于下面的序列)连接。将一个沉默突变(较小字母表示)引入pelB序列中，以产生NcoI限制位点(下面划线表示)，以便于随后的Vβ5.3基因序列的亚克隆。

5′-CTAGTAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAATACC

TATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCA

GCcATGGCCGAGCT-3′[SEQ ID NO 5]

5′-CGGCCATgGCTGGTTGGGCAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCT

GCCGTAGGCAATAGGTATTTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATAGA

ATTTA-3′[SEQ ID NO 6]pK-STII的构建

操作质粒pK2D，使之含有一个核糖体结合位点和E.coli热稳定肠毒素(STII)信号序列(Morioka-Fujimoto等人，1991，前述文献)，详述如下：

用位于MCS的SpeI和DraIII消化pK2D，将该载体与二个互补的合成寡核苷酸连接，该两寡核苷酸分别长105bp和98bp，如下面所示的序列。将两个沉默突变(较小字母)引入STII序列以产生MluI和DraIII限制位点(下面划线表示)，以便于随后Vβ5.3的亚克隆。

5′-CTAGTAAATTCTATTTCAAGGAGACAGTCATAATGAAAAAGAA

TATAGCATTCCTACTAGCTTCAATGTTCGTCTTCTCTATTGCAACTA

ACGCgTACGCaCATT-3′[SEQ ID NO 7]

5′-GtGCGTAcGCGTTAGTTGCAATAGAGAAGACGAACATTGAAGCT

AGTAGGAATGCTATATTCTTTTTCATTATGACTGTCTCCTTGAAATA

GAATTTA-3′[SEQ ID NO 8]

                      实施例3

将含来自实施例2(前述)信号序列的质粒进一步加以修饰，使之包括二个调节元件。pKT-pelB的构建

质粒pK-pelB被进一步修饰，使其在pelB前导序列的上游含二个调节元件，构建pKT-pelB(4.8kb)。该两元件是来自噬菌体T7基因10(g10)的翻译增强子、和一个编码8个氨基酸残基的微型顺反子ATG TAT CGA TTAAAT AAG GAG GAA TAA(GEQ ID NO.28)。采用SpeI和SacI消化pK2D，接着将该载体连接到编码g 10序列、核糖结合位点、微型顺反子和pelB前导序列(按5′-3′的方向)的合成寡核苷酸上来完成两个调节元件的插入。该寡核苷酸是以两组长为71-89聚体的互补链合成的，它们可通过9bp的互补突出区相连接。该两个寡核苷酸互补对称之为A对(Pair A)(寡J5A+J6A，分别89bp和76bp长)和B对(Pair B)(寡J5B+J6B，分别71bp和76bp长)，其序列如下：

J5A

5′-CTAGTCCGGAATTGCCCATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTAA

AGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAATA-3′[SEQ ID NO 9]

J6A

5′-CTCCTTATTTAATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTA

ATAATAAAGTTAATCGATGCCCAATTCCGGA-3′[SEQ ID NO 10]

J5B

5′-ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC

GCTGCCCAACCAGCCATGGK2CGAGCT-3′[SEQ ID NO 11]

J6B

5′-CGGCCATGGCTGGTTGGGCAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTG

CCGTAGGCAATAGGTATTTCATTATTTATTC-3′[SEQ ID NO 12]pKT-STII的构建

将质粒pK-STII进一步修饰，使之包含与pKT-pelB中相同的两个调节元件，由此建立pKT-STII(4.8kb)。用SepI和DraIII消化pK2D，将该载体连接到编码g10序列、核糖体结合位点、一个微型顺反子和STII前导序列(按5′-3′的方向)的合成寡核苷酸上。该寡核苷酸是以两组长73-89聚体的互补链合成的，它们可通过9bp的互补突出区相连接。该两互补寡核苷酸对被称为A对(Pair A)(寡J5A+J6A，分别89bp和76bp长)，和B对(Pair B)(寡J5C+J6C，分别73bp和79bp长)，其序列如下：

J5A

5′-CTAGTCCGGAATTGGGCATCGATTAACTTTATTATAAAAATTAA

AGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAATA-3′[SEQ ID NO 9]

J6A

5′-CTCCTTATTTAATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTA

ATAATAAAGTTAATCGATGCCCAATTCCGGA-3′[SEQ ID NO 10]

J5C

5′-ATGAAAAAGAATATAGCATTCCTACTAGCTTCAATGTTCGTCTT

CTCTATTGCAACTAACGCGTACGCACATT-3′[SEQ ID NO 13]

J6C

5′-GTGCGTACGCGTTAGTTGCAATAGAGAAGACGAACATTGAAGC

TAGTAGGAATGCTATATTCTTTTTCATTATTTATTC-3′[SEQ ID NO 14]

                        实施例4pK-pelB-Vβ5.3的构建：

有关T细胞抗原受体Vβ5.3蛋白的表达的下一步是将Vβ5.3序列加入含上述实施例2信号序列的质粒中。

该Vβ5.3的全部核苷酸序列产生如下：Vβ5.3克隆12A1的DNA序列最初由Leiden等人报道过(1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：4456-4460)，然后再部份地加以修正(Leiden等人，1986，Molec.Cell Biol.，6：3207-3214)。该克隆12A1缺失编码N-末端四个氨基酸残基的核苷酸；此外，所推测的克隆12A1 N末端氨基酸残基是不正确的。Vβ5.3(HPB-ALL)的N末端氨基酸序列由Jones等人报道过(1985，Science，227：311-314)，但未指明N末端第一氨基酸残基。经过后来测定，该残基是甘氨酸(Jebb Leiden，尚未发表过)。使用上述序列资料，采用重组DNA技术重建完整Vβ5.3。所得质粒(pBB-Vβ5.3)是下面实施例的Vβ5.3序列来源。有关编码Vβ5.3的全长核苷酸序列和预测的氨基酸序列，Plaza等人有更新的报道(1991，J.Immunol.，147：4360-4365)(也见本文图1；SEQ ID NO.25、26和27)。

使用pBB-Vβ5.3(6.2kb)作为模板以PCR法合成Vβ5.3。5′“有义”引物含有一个NcoI限制酶位点(下划线表示)：

5′-TAATTAGCCATGGCCGGCGTAACCCAATCTCCG-3′[SEQ ID NO 15]3′“反义”引物与载体中PstI位点下游的一段区域互补：

5′-CCAGTGCCAAGCTTGCATGCC-3′[SEQ ID NO 16]

使用DNA聚合酶I的Klenow片段，将所得Vβ5.3片段切成平齐末端，并连接到pBluescriptII KS+的去磷酸化的EcoRV位点，产生质粒pBL-pelB-Vβ5.3。用NcoI和PstI消化切割该Vβ5.3插入段，以琼脂糖纯化，并连接到pK-pelB的NcoI和PstI位点，产生质粒pK-pelB-Vβ5.3(5kb)。pK-STII-Vβ5.3的构建

使用pBB-Vβ5.3(6.2kb)作模板经PCR法合成Vβ5.3。5′“有义”引物含一个MluI限制酶位点(下划线表示)：

5′-GAAATTAACGCGTACGCAGGCGTAACCCAATCTC-3′[SEQ ID NO 17]3′“反义”引物与载体中PstI位点下游一段区域互补：

5′-CCAGTGCCAAGCTTGCATGCC-3′[SEQ ID NO 18]

使用DNA聚合酶I的Klenow片段，将所得Vβ5.3片段切成平齐末端，并连接到pBluescript II KS+的去磷酸化EcoRV位点，产生质粒pBL-STII-Vβ5.3。用MluI和PstI消化切割该Vβ5.3插入段，用琼脂糖凝胶纯化，并连接到pK-STII的MluI和PstI位点上、产生质粒pK-STII-Vβ5.3(5kb)。结果

与PelB或STII前导序列融合的Vβ5.3在E.coli JM109中表达(表1)。诱导作用进行2小时，并采用EIA测定Vβ5.3产量。

                         表1

                  Vβ5.3的表达和定位

    pK-pelB-Vβ5.3                pK-STII-Vβ 5.3定位    0mM IPTG   1mM IPTG           0mM IPTG    1mM IPTG上清液  0μg/ml    1.3μg/ml          0.5μg/ml   2.2μg/ml周质    0.9        4.6                没有检测    5.5胞液    9.9        范围以外[1∶40]    2.0         范围以外[1∶40]

虽然大部分表达蛋白位于胞内，但两前导序列都是有功能的。

                         实施例5

本例详述含前导序列和二个调节元件(g10和微型顺反子)以及Vβ5.3序列的质粒。pKT-pelB-Vβ5.3的构建

用NcoI和PstI从pK-pelB-Vβ5.3切割下Vβ5.3插入段，并连接到pKT-pelB的NcoI和PstI位点上，而构建质粒pKT-pelB-Vβ5.3。pKT-STII-Vβ5.3的构建

用相似方法，使用MluI和PstI，从pK-STII-Vβ5.3上切割下Vβ5.3插入段，并连接到pKT-STII的MluI和PstI位点上，从而构建pKT-STII-Vβ5.3。

所有随后的质粒构建体均利用STII信号序列。因此，假如未指明该信号序列，应理解为利用了该STII序列。结果pKT-Vβ5.3

将质粒pK-STII-Vβ5.3(实施例4)加以修饰，使其在STII前导序列的上游包括二个调节元件而建立pKT-Vβ5.3。所述元件是来自噬菌体T7基因10(g10)的翻译增强子、和编码8个氨基酸残基的微型顺反子。业已证明该两元件可提高几个基因的翻译效率(Schoner等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：5403-5407；Schoner等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：8506-8510；Olins等人，1988，Gene，73：227-235；Olins和Rangwala，1989，J.Biol.Chem.，264：16973-16976)。

在IPTG诱导条件下，于E.coli JM109中，pKT-Vβ5.3与pK-STII-Vβ5.3(实施例4)相比，可提高8倍以上蛋白产量。由于目前缺乏高纯′Vβ5.3标准样品，因此此处所记录之EIA值只是近似的。表明pKT-Vβ5.3在E.coli JM 109中是稳定的。

                       实施例6pKTB-Vβ5.3的构建

进一步修饰pKT-Vβ5.3(实施例5)，使之无需IPTG诱导可进行分泌表达。编码温度敏感lac阻遏蛋白(Bukrinsky等人，1988，Gene，70：415-417)的lacIts基因的存在，使其能够从30℃-42℃提高温度，而控制从trc启动子的基因表达。这就避免使用IPTG或使用带有lacI或lacIq基因的细菌菌株的必要。

通过EcoRI消化，从PUCts切下lacIts基因。用Klenow将由载体序列侧接的含完整lacIts编码区和其相联调节元件1.7kb片段切成平齐末端，并连接到位于pKT-Vβ5.3rrnB操纵子下游的脱磷酰ScaI位点，产生质粒pKTB-Vβ5.3(6.8kb)。该lacIts基因的取向由限制性酶切图确定。结果

该lacIts基因被以任意方向插入pKT-Vβ5.3中rrnB转录终止子的下游，建立质粒pKTB-Vβ5.3(图2)。该质粒在E.coli LJ24(lacI缺失)中表达，用丙烯酰胺凝胶上考马斯兰染色法(Laemmli，1970前述文献)，和用Western印迹法(Towbin等人，1979，上述文献)分析该蛋白。lacIts基因的一种取向(转录方向朝Ampr区)明显地比其相反取向获得更高Vβ5.3产量。

将从全部细胞沉淀提取物中获得的推定Vβ5.3带电转移到Immobilon-P膜上，并用考马斯兰染色。将该带切下，并进行氨基末端氨基酸测序(Matsudaira，1987，J.Biol.Chem.，262：10035-10038)，总共产生10个氨基酸残基。该结果加工后的Vβ5.3的N-末端10个氨基酸残基序列完全相符，即未测到前导序列。

该质粒也在三个不同的细菌菌株中通过热诱导表达，所述三菌株均含逐渐提高的内源lac阻遏物水平，即LJ24＜DH5α＜JM109。采用EIA法，从诱导培养物上清液中检测Vβ5.3表达(表2)

                      表2

         不同细菌菌株中的pKTB-Vβ5.3表达

诱导细胞2小时，测量培养上清液中的Vβ5.3产量(μg/ml)质粒            调节元件   E.coli宿主    诱导作用  未诱导  诱导

                                               (产率)  (产率)pKTB-Vβ5.3     lacIts     JM109(lacI^q) 42℃      未测    0.5pKTB-Vβ5.3     lacIts     DH5α(lacI)   42℃      未测    5.0pKTB-Vβ5.3     lacIts     LJ24(ΔlacI)  42℃      未测    5.2pKT-Vβ5.3      lacI^q     JM109         2mM IPTG  0       0.9pKT             lacI^q     JM109         42℃      未测    0

该数据与Western印迹观察和所预料结果相符，即最高表达水平是在LJ24(ΔlacI)中达到的，而最低表达是在JM109(lacI^q)中获得的。在培养上清液中测得的Vβ5.3量相当低，这与E.coli一般不分泌蛋白进入培养基这一事实相符。正如表1所示，表达的大部分Vβ5.3局限于周质中。lacIts基因的DNA序列

将温度诱导lacIts基因的完全编码序列加上包括启动子的上游80个核苷酸测序，并同已发表的IPTG可诱导lacI基因序列(Farabaugh，1978，Nature，274：765-769)加以比较。该启动子区域与lacI基因该区域相同，而与lacI^q基因该区域不同(Calos M.P.，1978，Nature，274：762-765)。lacIts基因序列显示一个编码360个氨基酸的1080个核苷酸的开放阅读框架，且与lacI基因#559核苷酸(从起始密码子的第一核苷酸数起)不同(从G变为A)，这样使得氨基酸残基#187从甘氨酸(GGC)变成丝氨酸(AGC)。此种只有一个氨基酸残基的变化，便给予了lac阻遏蛋白的热敏感性。

此外，lacI基因的已发表序列(Farabaugh，1978，前述文献)，以及在Genebank(基因座位ECOLAC)中出现的序列，在#857位置有一错误：#857核苷酸应是T而不是C，这样使得残基#286编码亮氨酸(TTA)，而不是丝氨酸(TCA)。该C-T转变，如前面由限制性酶切图(Brosius，1992，Meth.Enzymol.，216：469-483)表明的，在lacI基因的3′端引入了一个HpaI位点。应当注意到，前述Farabaugh(1978)文献中，同一密码子(TCA)被错误地报道为编码亮氨酸，而非编码丝氨酸。

                            实施例7pKTB的构建

用SalI和PstI消化质粒pKTB-Vβ5.3(6.7kb)，使用Geneclear Kit(BIO101)从琼脂糖凝胶中纯化5.42kb片段。用SalI和PstI消化质粒pKT-STII(4.8kb)，以相似方法纯化1.15kb片段，并连接到5.42kb片段上，产生质粒pKTB(6.56kb)。

                            实施例8pKB-Vβ5.3的构建

该质粒相同于减去二个调节元件的pKTB-Vβ5.3，即减去了g10翻译增强子和微型顺反子。用SalI和PstI消化质粒pKTB(6.56kb)，使用Geneclean Kit(BIO 101)从琼脂糖纯化大片段(5.4kb)。用SalI和PstI消化质粒pK-Vβ5.3，用相似方法纯化1.3kb片段，并连接到5.4kb片段上，得到质粒pKB-Vβ5.3(6.7kb)。结果pKB-Vβ5.3

正如上面所讨论的，加上两个调节元件，即g10基因片段和微型顺反子，看来可提高IPTG诱导条件下的Vβ5.3产量。我们打算除去pKTB-Vβ5.3载体中的该两元件，并于热诱导条件下再检测Vβ5.3的产量。通过丙烯酰胺电泳和Western印迹分析表明，pKTB-Vβ5.3和pKB-Vβ5.3比较，除去该两元件对Vβ5.3的产量无影响。全细胞脲提取物EIA测定表明，当在E.coli LJ24中表达时，pKB-Vβ5.3比pKTB-Vβ5.3产生更多的蛋白。

                         表3

            不同细菌菌株中的Vβ5.3表达质粒           LJ24       SG22094    SG21163    SG21173pKTB-Vβ5.3    90         80         20         30+前导+g 10/MCpKB-Vβ5.3     110        50         40         20+前导-g10/MCpKTBi-Vβ5.3   6          100        100        100-前导+g10/MCpKTBi-Vβ5.3   10         170        130        390-前导-g10/MC

诱导时间：42℃ 2小时

培养物体积：25ml

前导：STII

g10：T7基因10

MC：微型顺反子

样品：全细胞脲提取物

Vβ5.3产量(mg/l)、按EIA测量，根据单位/ml近似推算。1mg Vβ5.3近似等于1×10⁷单位。

质粒pKB-Vβ5.3被证明对于发酵来说是稳定的。

                     实施例9pKB的构建

用SalI和PstI消化质粒pKTB(6.56kb)，使用Geneclean Kit(BIO 101)从琼脂糖中纯化片段(5.4kb)。用SalI和PstI消化质粒pK-STII(4.75kb)，以相似方法纯化1.1kb片段，并连接到5.4kb片段上，产生质粒pKB(6.5kb)。

                     实施例10pKTBi的构建

该质粒与减去STII信号序列的pKTB相同。用SpeI和XmaI消化pKTB(6.56kb)，并连接于编码g10翻译增强子、一个核糖体结合位点、和一个含第二核糖体结合位点的微型顺反子双链合成寡核苷酸上。NcoI、DraIII、RsrII和XmaI的限制位点被设计在3′端。该两互补寡核苷酸序列如下：

5′-CTAGTCCGGAATTGGGCATCGATTAACTTTATTATTAAAAATTA

AAGAGGTATATATTAATGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC

ATGGCACATTGTGCGGTCCGC-3′[SEQ ID NO 19]

5′-CCGGGCGGACCGCACAATGTGCCATGGTTTATTCCTCCTTATTTA

ATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTAATAATAAAGTTA

ATCGATGCCCAATTCCGGA-3′[SEQ ID NO 20]

                     实施例11pKBi的构建

该质粒与减去STII信号序列的pKB相同。用SpeI和DraIII消化pKTB(6.56kb)，并连接于一个含一个核糖体结合位点，和含在3′端设计的NcoI和DraIII位点的双链合成寡核苷酸上。该两互补寡核苷酸序列如下：

5′-CTAGTAAATTATATTTAAAGGAGGAATAAACCATGGCACATT-3′[SEQ ID NO

21]

5′-GTGCCATGGTTTATTCCTCCTTTAAATATAATTTA-3′[SEQ ID NO 22]

                         实施例12pKTBi-Vβ5.3的构建

该质粒与减去STII信号序列的pKTB-Vβ5.3相同。用XmaI和NcoI消化pKTBi(6.4kb)，并连接到使用pKTB-Vβ5.3作模板经PCR合成的Vβ5.3上。含NcoI限制酶位点(下划线表示)的5′有义引物是：

5′-TATAGTCCATGGGCGTAACC-3′[SEQ ID NO 23]

含XmaI位点(下划线表示)的3′反义引物是：

5′-AACTTCCCGGGTTATCATTAGCTGC-3′[SEQ ID NO 24]结果pKTBi-Vβ5.3

作上述工作的同时，从表达质粒中除去STII前导序列。因为大部分表达的Vβ5.3局限于胞内(见下述)，可预料这些构建体的放大可能产生一个加上或去掉前导序列的Vβ5.3分子的异源群体，该前导肽将使加工后的Vβ5.3随后的提纯复杂化。因此将STII除去，建立用于胞内表达的pKTBi-Vβ5.3。预期该表达的Vβ5.3含N-末端蛋氨酸，尽管正如对pKBi-Vβ5.3(下面)的观察所知，该蛋氨酸可以由内源蛋氨酸氨基肽酶除去[Ben-Bassat等人，1978，J.Bacteriology，169：751-757；Baneyx和Georgiou，“Expression of Proteolytically SensitiVe Polypeptides in E.Coli”in Stability ofProtein Pharmaceuticals，PartA：Chemical and Physical Pathways of ProteinDegradation(Tim J.Ahrn and Mark C.Manning，eds.)，Plenum Press，New York，pp.69-108(1992)]。

pKTBi-Vβ5.3已构建完毕，但它在E.coli LJ24中不能表达出显著量的蛋白质(见前述表3)。经对完整Vβ5.3插入段测序，序列完全正确。诱导后分离的质粒DNA由限制性消化分析看出并无变化。对于含pKTBi-Vβ5.3的LJ24菌株明显地不能表达出有意义水平的蛋白这一问题，一个可能的解释是由于不存在前导肽，不能稳定胞内Vβ5.3蛋白，导至其很快降解的缘故。

因此，将该pKTBi-Vβ5.3转化入蛋白酶缺陷之菌株SG22094(lon^-，clp^-)和BL21(lon^-，ompT^-)，该两菌株给出的产量SG22904＞BL21。还检测了不同的诱导温度对产量的影响，发现两菌株均于42℃最佳。此外，在2-5小时之间，产量无明显增加。

pKTBi-Vβ5.3也在另外两个蛋白酶缺陷的菌株SG21163(lon^-，htpr^-)和SG21173(lon^-，htpr^-，clp^-)中表达。该结果归纳入表3中(前面)。

应当注意到菌株LJ24，SG22094，SG21163和SG21174不产生内源lac阻遏物，因为所有这些菌株中lacI基因均缺失。因此，野生型lac阻遏物不干扰trc启动子的热诱导作用。前面实施例表明无信号肽的Vβ5.3构建体可以很容易地在缺乏蛋白酶的宿主中表达，其结果产生大量Vβ5.3蛋白。

                   实施例13pKBi-Vβ5.3构建

该质粒与减去g10元件和微型顺反子(SEQ ID NO.28)的pKTBi-Vβ5.3相同。用NcoI和SalI消化pKBi(6.43kb)，并将970bp片段从琼脂糖中纯化。用NcoI和SalI消化pKTBi-Vβ5.3(6.75kb)，用相似方法纯化5.68kb片段，并将其连接到上述970bp片段上，产生质粒pKBi-Vβ5.3(6.64kb)。结果pKBi-Vβ5.3

该减去二个调节元件的无前导Vβ5.3构建体成功地在蛋白酶缺陷菌株中表达，我们的研究结果相似于pKTBi-Vβ 5.3的研究结果。该pKBi-Vβ5.3在另外两个蛋白酶缺陷的菌株中表达：SG21163(lon^-，htpr^-)和SG21173(lon^-，htpr^-，clp^-)。该结果归纳入表3中。所有的菌株试验中pKBi-Vβ5.3始终比pKTBi-Vβ5.3产生更多蛋白(表3)。该表达蛋白的N-末端测序表明，其开始的17个氨基酸残基与预期的Vβ5.3序列相符，末端蛋氨酸残基不存在。该质粒也是稳定的。

本文中对特定实施方案的叙述并不意味着对本发明范围加以限制。事实上，除了本文中这些详述内容外，本发明的各种修改，参照上述介绍和附图，对于本领域专业人员来说属显而易见。此种修改势必落入所附权利要求范围之内。本文所涉及的各种公开发表的文献，均以其全文列入本文作为参考。

 序列表(1)一般资料：

(i)申请人：T Cell Science，Inc.

(ii)发明题目：T细胞抗原受体V区域蛋白及其制备方法

(iii)序列数量：29

(iv)通信地址：

    (A)收件人：T Cell Sciences，Inc.

    (B)街道：115 Fourth Auenue

    (C)城市：Needham

    (D)州：Massachusetts

    (E)国家：USA

    (F)邮编：02194-2725

(v)计算机可读形式：

    (A)介质类型：Diskette，3.50英寸，1.44Mb贮存

    (B)计算机：IBM PC相容

    (C)操作系统：MS-DOS

    (D)软件：Wordperfect 6.0

(vi)现有申请资料：

    (A)申请号：

    (B)申请日期：

    (C)分类号：

(vii)优先申请资料：

    (A)申请号：08/181,492

    (B)申请日期：1994年1月13日

(viii)代理人资料

    (A)姓名：Yankwich，Leon R

    (B)登记号：30,237

    (C)案号：TCS-203-PCT(94，664-A)

(ix)通讯资料：

    (A)电话：617-345-9100(2)SEQ ID NO：1的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：34个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1

TATAATGACT AGTCGCTGCA GCCAACCGCG GCTG              34(2)SEQ ID NO：2的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：23个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

          GTCCTAGAGT ACTGAGCGGA TAC                   23(2)SEQ ID NO：3的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：91个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3

GGCTCGAGCC TAGGCTGCAG CCCGGGGCGC GCGCGGCCGC AGGCCTTTAA

TTAAGAGCTC CGGACCGCAC AATGTGGGCG CGCCCTTAAG A         91(2)SEQ ID NO：4的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：97个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

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    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

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    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4

CTAGTCTTAA GGGCGCGCCC ACATTGTGCG GTCCGGAGCT CTTAATTAAA    50

GGCCTGCGGC  CGCGCGCGCC CCGGGCTGCA GCCTAGGCTC GAGCCGC     97(2)SEQ ID NO：5的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：103个碱基对

    (B)类型：核酸

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    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

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    (A)名字：

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：5

CTAGTAAATT CTATTTCAAG GAGACAGTCA TAATGAAATA CCTATTGCCT     50

ACGGCAGCCG CTGGATTGTT ATTACTCGCT GCCCAACCAG CCATGGCCGA     100

GCT          103(2)SEQ ID NO：6的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：95个碱基对

    (B)类型：核酸

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    (A)描述：合成寡核苷酸

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(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6

CGGCCATGGC TGGTTGGGCA GCGAGTAATA ACAATCCAGC GGCTGCCGTA    50

GGCAATAGGT ATTTCATTAT GACTGTCTCC TTGAAATAGA ATTTA        95(2)SEQ ID NO：7的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：105个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7

CTAGTAAATT CTATTTCAAG GAGACAGTCA TAATGAAAAA GAATATAGCA    50

TTCCTACTAG CTTCAATGTT CGTCTTCTCT ATTGCAACTA ACGCGTACGC    100

ACATT          105(2)SEQ ID NO：8的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：98个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8

GTGCGTACGC GTTAGTTGCA ATAGAGAAGA CGAACATTGA AGCTAGTAGG    50

AATGCTATAT TCTTTTTCAT TATGACTGTC TCCTTGAAAT AGAATTTA      98(2)SEQ ID NO：9的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：89个碱基对

    (B)类型：核酸

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    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

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(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9

CTAGTCCGGA ATTGGGCATC GATTAACTTT ATTATTAAAA ATTAAAGAGG    50

TATATATTAA TGTATCGATT AAATAAGGAG GAATAAATA                89(2)SEQ ID NO：10的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：76个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10

CTCCTTATTT AATCGATACA TTAATATATA CCTCTTTAAT TTTTAATAAT    50

AAAGTTAATC GATGCCCAAT TCCGGA          76(2)SEQ ID NO：11的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：71个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11

ATGAAATACC TATTGCCTAC GGCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCTGC    50

CCAACCAGCC ATGGCCGAGC T          71(2)SEQ ID NO：12的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：76个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12

CGGCCATGGC TGGTTGGGCA GCGAGTAATA ACAATCCAGC GGCTGCCGTA    50

GGCAATAGGT ATTTCATTAT TTATTC          76(2)SEQ ID NO：13的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：73个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13

ATGAAAAAGA ATATAGCATT CCTACTAGCT TCAATGTTCG TCTTCTCTAT    50

TGCAACTAAC GCGTACGCAC ATT          73(2)SEQ ID NO：14的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：79个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14

GTGCGTACGC GTTAGTTGCA ATAGAGAAGA CGAACATTGA AGCTAGTAGG    50

AATGCTATAT TCTTTTTCAT TATTTATTC          79(2)SEQ ID NO：15的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：33个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15

TAATTAGCCA TGGCCGGCGT AACCCAATCT CCG             33(2)SEQ ID NO：16的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16

              CCAGTGCCAA GCTTGCATGC C    21(2)SEQ ID NO：17的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：34个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17

            GAAATTAACG CGTACGCAGG CGTAACCCAA TCTC    34(2)SEQ ID NO：18的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：21个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

  (A)名字：

  (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18

          CCAGTGCCAA GCTTGCATGC C    21(2)SEQ ID NO：19的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：110个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19

CTAGTCCGGA ATTGGGCATC GATTAACTTT ATTATTAAAA ATTAAAGAGG    50

TATATATTAA TGTATCGATT AAATAAGGAG GAATAAACCA TGGCACATTG    100

TGCGGTCCGC          110(2)SEQ ID NO：20的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：110个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20

CCGGGCGGAC CGCACAATGT GCCATGGTTT ATTCCTCCTT ATTTAATCGA    50

TACATTAATA TATACCTCTT TAATTTTTAA TAATAAAGTT AATCGATGCC    100

CAATTCCGGA          110(2)SEQ ID NO：21的资料

(i)序列特征：

  (A)长度：42个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓扑结构：线性

(xi)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21

CTAGTAAATT ATATTTAAAG GAGGAATAAA CCATGGCACA TT    42(2)SEQ ID NO：22的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：35个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22

GTGCCATGGT TTATTCCTCC TTTAAATATA ATTTA           35(2)SEQ ID NO：23的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：20个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23

            TATAGTCCAT GGGCGTAACC    20(2)SEQ ID NO：24的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：25个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

    (A)描述：合成寡核苷酸

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24

              AACTTCCCGG GTTATCATTA GCTGC    25(2)SEQ ID NO：25的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：276个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25GGC GTA ACC CAA TCT CCG ACT CAC CTG ATC AAA ACG AGA               39GGA CAG CAC GTG ACT CTG AGA TGC TCT CCT ATC TCT GGG               78CAC AAG AGT GTG TCC TGG TAC CAA CAG GTC CTG GGT CAG               117GGG CCC CAG TTT ATC TTT CAG TAT TAT GAG AAA GAA GAG               156AGA GGA AGA GGA AAC TTC CCT GAT CGA TTC TCA GCT CGC               195CAG TTC CCT AAC TAT AGC TCT GAG CTG AAT GTG AAC GCC               234TTG TTG CTG GGG GAC TCG GCC CTG TAT CTC TGT GCC AGC               273AGC          276(2)SEQ ID NO：26的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：276个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26CCG CAT TGG GTT AGA GGC TGA GTG GAC TAG TTT TGC TCT               39CCT GTC GTG CAC TGA GAC TCT ACG AGA GGA TAG AGA CCC               78GTG TTC TCA CAC AGG ACC ATG GTT GTC CAG GAC CCA GTC                                117CCC GGG GTC AAA TAG AAA GTC ATA ATA CTC TTT CTT CTC               156TCT CCT TCT CCT TTG AAG GGA CTA GCT AAG AGT CGA GCG               195GTC AAG GGA TTG ATA TCG AGA CTC GAC TTA CAC TTG CGG               234AAC AAC GAC CCC CTG AGC CGG GAC ATA GAG ACA CGG TCG               273TCG         276(2)SEQ ID NO：27的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：92个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys Thr Arg Gly Gln1               5                  10                  15His Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Lys Ser Val

            20                  25                  30Ser Trp Tyr Gln Gln Val Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe Ile Phe

            35                  40                  45Gln Tyr Tyr Glu Lys Glu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Phe Pro Asp

            50                  55                  60Arg Phe Ser Ala Arg Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

            65                  70                  75Val Ash Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala

            80                  85                  90Ser Ser

92(2)SEQ ID NO：28的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：27个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28

ATG TAT CGA TTA AAT AAG GAG GAA TAA                     27(2)SEQ ID NO：29的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：8个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

    (A)描述：

(iii)假定：

(iv)反义：

(ix)特征：

    (A)名字：

    (B)位置：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29Met Tyr Arg Leu Asn Lys Glu Glu1               5           8

Claims (33)

1、一种生产重组全长T细胞抗原受体V区域蛋白的方法，包括：

(a)用含编码全长T细胞抗原受体V区域蛋白的区域和可诱导性细菌启动子的重组表达载体转化感受态细菌宿主细胞；

(b)诱导a步骤中被转化细菌宿主细胞中的可诱导细菌启动子；和

(c)回收重组全长T细胞抗原受体V区域蛋白。

2、权利要求1的方法，其中，该可诱导性细菌启动子选自化学调节启动子和热调节启动子。

3、权利要求2的方法，其中该表达载体还含有选自lacI基因或lacI^q基因的调节基因序列。

4、权利要求2的方法，其中该表达载体包括lacIts基因。

5、权利要求4的方法，其中lacIts基因取向与T细胞抗原受体V区域蛋白编码区相同。

6、权利要求1的方法，其中该细菌启动子选自lac启动子、tac启动子和trc启动子。

7、权利要求6的方法，其中该重组表达载体还含有前导序列。

8、权利要求7的方法，其中该前导序列选自来自大肠杆菌的热稳定性肠毒素STII前导和来自胡萝卜欧文氏杆菌的pelB前导。

9、权利要求8的方法，其中该重组表达载体还含有衍生自大肠杆菌的STII前导序列的前导序列，该感受态细菌宿主细胞是不带有lacI或lacI^q基因的细胞。

10、权利要求9的方法，其中该细菌宿主菌株是一蛋白酶缺陷菌株。

11、根据权利要求10的方法，其中该蛋白酶缺陷菌株选自SG22094、SG21163和SG21173。

12、根据权利要求1的方法，其中，该表达载体还含有g10和微型顺反子序列(SEQ ID NO.28)调节元件。

13、权利要求1的方法，其中该重组表达载体还含有：

a)一个trc启动子，作为可诱导细菌启动子；

b)一个核糖体结合位点；

c)一个转录终止子；

d)一个lacIts调节基因序列；

e)一个pBR322复制起始点；和

f)一个四环素抗性基因。

14、权利要求13的方法，其中该重组表达载体选自pKTBi-Vβ5.3和pKBi-Vβ5.3。

15、权利要求13的方法，其中该重组表达载体还含有前导序列。

16、权利要求15的方法，其中该重组表达载体选自pK-Vβ5.3、pKT-Vβ5.3、pKTB-Vβ5.3和pKB-Vβ5.3。

17、一种表达载体，含一个在lacIts基因控制下可诱导细菌启动子，其中所述lacIts基因控制编码全长T细胞抗原受体V区域蛋白的区域的表达。

18、权利要求17的表达载体，其中该可诱导细菌启动子选自lac启动子、tac启动子和trc启动子。

19、权利要求17的表达载体，其中该可诱导细菌启动子是trc启动子。

20、权利要求19的表达载体，它还包括前导序列。

21、一种表达载体，它从5′至3′方向包括：

a)一个trc启动子；

b)一个核糖体结合位点；

c)一个编码全长T细胞抗原受体V区域蛋白的区域；

d)一个转录终止子；

e)一个lacIts调节基因序列；

f)一个pBR322复制起始点；和

g)一个四环素抗性基因。

22、用权处要求17的表达载体转化的细菌细胞。

23、权利要求1 7的表达载体，其中所述载体选自pK-STII-Vβ5.3，pKT-Vβ5.3，pKTB-Vβ5.3，pKTBi-Vβ5.3和pKBi-Vβ5.3。

24、由权利要求13的方法生产的全长T细胞抗原受体V区域蛋白。

25、含有全长T细胞抗原受体V区域蛋白的药物组合物。

26、权利要求25的药物组合物，其中该T细胞抗原受体V区域蛋白是Vβ5.3蛋白，其分子式为氨基酸序列SEQ ID NO.27的1-92氨基酸。

27、治疗免疫相关失调症的方法，包括给需要此种治疗的受治者施用含全长T细胞抗原受体V区域蛋白的药物组合物。

28、根据权利要求27的方法，其中免疫相关失调症是多发性硬化症。

29、权利要求28的方法，其中全长T细胞抗原受体V区域蛋白是Vβ5.3，其分子式是氨基酸序列SEQ ID NO 27的第1-92氨基酸。

30、基本纯化的T细胞抗原受体Vβ5.3蛋白，其分子式是氨基酸序列SEQ ID NO.27的第1-92氨基酸。

31、基本纯化的T细胞抗原受体V区域蛋白在制造治疗免疫相关疾病之药物中的应用。

32、每升细胞培养物至少产生300毫克全长重组T细胞抗原受体Vβ蛋白的转化细菌细胞。

33、诊断免疫相关失调症的方法，包括使用重组全长T细胞抗原受体V区域蛋白检测来自患者的生物学样本中与免疫失调症相关的特定T细胞亚群，或识别特定V区域蛋白的自身抗体的存在。

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