CN115598024B - 细胞分级计数装置及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及光电探测技术领域，具体的提供一种细胞分级计数装置及其方法，装置包括依次沿光路设置的激光器、细胞通道、准直透镜、尺寸分级计数单元和光电探测单元。激光器发出激光光束入射至细胞通道内的待分级计数的细胞后散射，散射光束经准直透镜准直后，入射至尺寸分级计数单元进行分级计数，分级计数后的光束入射至光电探测单元，通过分析光电探测单元所接收的信息，获取待分级计数细胞的尺寸分级和数量。本发明所提供的技术方案解决了传统装置只能对细胞单一计数或进行尺寸分级，实现在对细胞无损伤的基础上，同时完成对细胞的种类划分与计数的统计工作。

Description

细胞分级计数装置及其方法
技术领域
本发明涉及光电探测技术领域，特别涉及一种细胞分级计数装置及其方法。
背景技术
流式细胞术（Flow CytoMetry，FCM）是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。微流控芯片技术(Microfluidics)是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上， 自动完成分析全过程。在流式细胞术、微流控等技术领域，一次检测工作往往会需要对上万数量的细胞进行检测。
目前，流式细胞术和微流控芯片技术中的细胞计数的方法主要有荧光细胞计数法、图像识别计数法和脉冲计数法。其中荧光细胞计数法需要对细胞进行染色，通过荧光法对不同的细胞进行计数统计。这种流程的弊端是染料可能会导致细胞凋亡，部分染料更是只能针对死亡细胞进行染色，同时即使可以保持细胞活性的染料，计数流程后也需要对细胞进行漂洗等流程，该流程进而增加了细胞的破坏概率，也增加了工作量。图像识别计数法通过图像分析实现对细胞的计数，但计数的准确性依赖于图像细胞的分割的准确性，不能准确地对细胞同时进行定性和定量的分析。脉冲计数法，通过一个脉冲感应模块对细胞的数量统计，当细胞活性差在样本内堆积，或者流速快时，均易造成对细胞数量统计不到位。
现有技术中的装置和方法，均不能够在区分细胞尺寸分级的同时进行准确计数。因此亟需开发一种准确、快速且经济成本和人力成本低的细胞分级计数的装置和方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提出了一种细胞分级计数装置及其方法。
为实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：
本发明提出的细胞分级计数装置，包括：依次沿光路设置的激光器、细胞通道、准直透镜、尺寸分级计数单元和光电探测单元；其中，
所述尺寸分级计数单元包括同心的菲涅尔透镜和菲涅尔透镜环组；其中，所述菲涅尔透镜环组中菲涅尔透镜环的数量为N，N≥1；
所述光电探测单元中光电探测器的数量为N+1，各个光电探测器与所述尺寸分级计数单元中透镜一一对应；
所述激光器发出激光光束，所述激光光束入射至所述细胞通道内的待分级计数的细胞，经所述待分级计数细胞后散射，散射光束经所述准直透镜准直为准直光束后，入射至所述尺寸分级计数单元进行分级计数，分级计数后的光束入射至所述光电探测单元，通过分析所述光电探测单元所接收的信息，获取待分级计数细胞的尺寸分级和数量。
进一步地，所述菲涅尔透镜和所述菲涅尔透镜环组均为正菲涅尔透镜；
所述菲涅尔透镜为圆形菲涅尔透镜；
所述菲涅尔透镜环组套设在所述菲涅尔透镜外，且各个菲涅尔透镜环的焦距与所述菲涅尔透镜的焦距相同。
进一步地，所述菲涅尔透镜和所述菲涅尔透镜环组之间的夹角为大于0°且小于90°的夹角。
进一步地，所述光电探测器的探测面设置在相应的透镜的焦点处，且与相应的透镜的焦面相切。
本发明提出的细胞分级计数方法，包括如下步骤：
S1、设置所述尺寸分级计数单元中所述菲涅尔透镜和各个菲涅尔透镜环之间的倾斜角度；
S2、所述激光器发出激光光束依次经所述细胞通道中待分级计数的细胞、所述准直透镜和所述尺寸分级计数单元后，入射至所述光电探测单元；
S3、通过对所述光电探测单元所接收的信息进行分析，识别所述光电探测单元中接收到信息的光电探测器的数量，进而实现所述待分级计数的细胞的尺寸分级和计数。
本发明能够取得以下技术效果：
本发明提供的细胞分级计数装置及其方法，通过细胞散射后的艾里斑尺寸的进行标识，实现在对细胞无损伤的基础上，同时完成对细胞的种类划分与计数的统计工作。本发明提供的细胞分级计数装置及其方法简单易操作，并且准确性高。避免了现有技术中通过染色荧光法对细胞进行计数统计，只能针对死亡细胞进行染色，即使可以保持细胞活性的染料，计数流程后也需要对细胞进行漂洗等流程。并且解决了图像识别计数法依赖图像分析实现对细胞的计数，不能准确地对细胞同时进行定性和定量的分析。也同时解决了脉冲计数法，当细胞活性差在样本内堆积，或者流速快时，易造成对细胞数量统计不到位的问题。
附图说明
图1是根据本发明实施例的细胞分级计数装置的第一示意图；
图2是根据本发明实施例的尺寸分级计数单元和光电探测单元的示意图；
图3是根据本发明实施例的尺寸分级计数单元的示意图；
图4是根据本发明实施例的细胞分级计数装置的第二示意图；
图5是根据本发明实施例的细胞分级计数装置的第三示意图；
图6是根据本发明实施例的细胞分级计数方法的流程图。
其中的附图标记包括：
激光器1、细胞通道2、准直透镜3、尺寸分级计数单元4、菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2、第二菲涅尔透镜环4-3、光电探测单元5、第一光电探测器5-1、第二光电探测器5-2、第三光电探测器5-3。
具体实施方式
在下文中，将参考附图描述本发明的实施例。在下面的描述中，相同的模块使用相同的附图标记表示。在相同的附图标记的情况下，它们的名称和功能也相同。因此，将不重复其详细描述。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
下面结合图1到图6对本发明的具体工作方式进行详细说明：
本发明提出一种细胞分级计数装置，如图1所示，包括：依次沿光路设置的激光器1、细胞通道2、准直透镜3、尺寸分级计数单元4和光电探测单元5。如图2和图3所示，本发明实施例中尺寸分级计数单元4包括同心设置的菲涅尔透镜4-1和菲涅尔透镜环组，菲涅尔透镜环的数量为2个，分别为同心设置的第一菲涅尔透镜环4-2、第二菲涅尔透镜环4-3。即以N=2为例进行详细说明。本发明实施例光电探测单元5中光电探测器的数量为3，各个光电探测器与尺寸分级计数单元4中透镜一一对应，也就是本发明实施例中光电探测器的数量也为3个，分别为第一光电探测器5-1、第二光电探测器5-2、第三光电探测器5-3。本发明实施例中第一光电探测器5-1、第二光电探测器5-2、第三光电探测器5-3分别与菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2、第二菲涅尔透镜环4-3一一对应。本发明实施例中的光电探测单元5采用高敏感型的光电探测器以保证尺寸分级计数的准确性和快速性，例如现有技术中的PMT光电倍增管、APD光电雪崩管均可，本发明对此不进行限定，可以根据具体情况进行选择。本发明实施例中的细胞通道2采用现有技术中的细胞通道即可，通常由石英、玻璃或高分子材料制成，其结构为一条直径为20-500μm、剖面为圆形或矩形的管道状结构，制作材料需要在紫外-可见光-近红外波段有良好的透过率。本发明实施例中的细胞通道2的透过率>50%。
本发明实施例中的技术方案，尺寸分级计数单元4中透镜的数量与所要分级区分的细胞尺寸分级的级数相关。若需要将细胞尺寸分级为4级，则N的取值为3，即需要将细胞尺寸分为M级，则N的取值则为M-1。在本发明实施例中N取值为2，在本发明实施例中尺寸分级计数单元4中透镜数量为3个。也就是尺寸分级计数单元4包括三个透镜，分别为：一个菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3。那么可以将需要尺寸分级的细胞按照尺寸分为三级，本发明实施例中以需要进行尺寸分级和计数的分别为3μm的血小板细胞、7μm的红细胞、11μm的白细胞，为例进行详细说明。可以根据实际情况设置菲涅尔透镜环的数量，进而根据需求对细胞进行尺寸分级和计数，本发明实施例对此不进行限定。
激光器1发出激光光束，激光光束入射至细胞通道2内的待分级计数的细胞，经待分级计数细胞后散射，散射光束经准直透镜3准直为准直光束后，入射至尺寸分级计数单元4进行分级计数。分级计数后的光束入射至光电探测单元5，通过分析光电探测单元5所接收的信息，获取待分级计数细胞的尺寸分级和数量。由于经待分级计数细胞散射的散射光束分散，会造成进入后续光路的尺寸分级计数单元4和光电探测单元5的光束较弱，因此本发明技术方案通过增加准直透镜3进行光束准直，提高散射光束的利用率的同时，还能够提高尺寸分级和计数的准确度。
本发明实施例中的技术方案的原理为：由于激光经过待尺寸分级和计数的细胞散射后形成的艾里斑直径与细胞尺寸成正比，那么艾里斑的直径就可以作为细胞尺寸的表征。待尺寸分级和计数的细胞的尺寸不同，那么入射至细胞后所散射的艾里斑尺寸就不相同。细胞尺寸越大，散射的艾里斑尺寸就越大。本发明实施例中尺寸分级单元包括菲涅尔透镜4-1和菲涅尔透镜环组，菲涅尔透镜4-1的中心与菲涅尔透镜环组的中心相重合，当散射的艾里斑直径越大，艾里斑可覆盖的菲涅尔透镜环越多，而菲涅尔透镜4-1和菲涅尔透镜环组都可以在空间中产生一个焦点，将高敏感型光电探测器放置在菲涅尔透镜4-1与菲涅尔透镜环组对应的焦点处，由于直径越大的艾里斑覆盖的菲涅尔透镜环越多，所以直径越大的艾里斑对应产生的光电信号越多，根据以上原理我们可得到细胞直径越大，可产生的光电信号就越多，通过计算单次采样的光电探测器的数量就可以得到对应的细胞尺寸等级。
本发明实施例中3μm的血小板细胞、7μm的红细胞、11μm的白细胞的散射角度依次增大。血小板细胞的散射光束入射至菲涅尔透镜4-1后被第一光电探测器5-1所接收；红细胞的散射光束入射至菲涅尔透镜4-1和第一菲涅尔透镜环4-2后被第一光电探测器5-1和第二光电探测器5-2所接收；白细胞的散射光束入射至菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3后被第一光电探测器5-1、第二光电探测器5-2和第三光电探测器5-3所接收。因此当光电探测器接收到信号则有一个细胞通过，此时进行计数；识别所接到信号的光电探测器具体为哪一个或哪几个光电探测器则能根据尺寸进行分级。最终同时获取待分级计数细胞的尺寸分级和数量。
本发明还提供一种优选实施方式，如图4和图5所示，菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3均为正菲涅尔透镜；菲涅尔透镜4-1为圆形的菲涅尔透镜；第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3套设在菲涅尔透镜4-1外，且菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3的焦距相同。光电探测器的探测面设置在相应的透镜的焦点处，且与相应的透镜的焦面相切。第一光电探测器5-1的探测面设置在菲涅尔透镜4-1的焦点处，第二光电探测器5-2的探测面设置在第一菲涅尔透镜环4-2的焦点处，第三光电探测器5-3在第二菲涅尔透镜环4-3的焦点处。采用此原理的技术方案的优点为，菲涅尔透镜4-1与菲涅尔透镜环组的焦点就会分布在尺寸分级单元光路后方的半个球面上，因此光电探测器的空间位置是可预知的，不再需要人工调试放置光电探测器的位置。
本发明还提供一种优选实施方式，菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3的焦距相等，菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3的中心重合，并形成一个大于0°且小于90°的空间夹角时，菲涅尔透镜4-1与菲涅尔透镜环的焦点就会分布在分级单元光路后方的半个球面上。如图5所示，F1为菲涅尔透镜4-1焦点；F2为第一菲涅尔透镜环4-2焦点；F3第二菲涅尔透镜环4-3焦点。在这样的三维空间中可放置更多的光电探测器，从而使细胞尺寸分级精度得以提高。
本发明实施例还提供一种细胞分级计数方法，如图6所示，包括如下步骤：
S1、设置菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3之间的倾斜角度，各个透镜间的倾斜角度为大于0°且小于90°的夹角。菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3的焦点就会分布在分级单元光路后方的半个球面上，在这样的三维空间中可放置更多的光电探测器，从而使细胞尺寸分级精度得以提高。
S2、激光器1发出激光光束依次经细胞通道2中待分级计数的细胞、准直透镜3和尺寸分级计数单元4后，入射至光电探测单元5。
激光器1发出一束经过准直的激光光束，经自由空间或光纤传导的方式照射在细胞通道2的中心。待分级计数的细胞在细胞通道2内以单细胞的形式向一个方向运动，流动时经过被激光器1发出的激光光束所照射，发出散射光束，其散射角度与细胞半径成正比。
细胞通道2到准直透镜3的垂直距离为准直透镜3的焦距，这样被细胞所散射后的光束通过准直透镜3就可以准直成平行光束向光路后向传播，并照射到尺寸分级计数单元4上。本发明实施例中尺寸分级计数单元4包括菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3，菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3具有相同的焦距，菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3的焦点分布在以该菲涅尔透镜4-1的中心为球心，焦距为半径的球面空间上，光电探测单元5的各个光电探测器的探测面置于对应菲涅尔透镜4-1与菲涅尔透镜环组的焦点处，并与相应的透镜的焦面相切，以保证经过相应的透镜的光束折射进入相应的光电探测器中。
S3、通过对光电探测单元5所接收的信息进行分析，识别光电探测单元5中接收到信息的光电探测器的数量，进而实现待分级计数的细胞的尺寸分级和计数。
本发明实施例中3μm的血小板细胞、7μm的红细胞、11μm的白细胞的散射角度依次增大。血小板细胞的散射光束入射至菲涅尔透镜4-1后被第一光电探测器5-1所接收；红细胞的散射光束入射至菲涅尔透镜4-1和第一菲涅尔透镜环4-2后被第一光电探测器5-1和第二光电探测器5-2所接收；白细胞的散射光束入射至菲涅尔透镜4-1、第一菲涅尔透镜环4-2和第二菲涅尔透镜环4-3后被第一光电探测器5-1、第二光电探测器5-2和第三光电探测器5-3所接收。因此当光电探测器接收到信号则有一个细胞通过，此时进行计数；识别所接到信号的光电探测器具体为哪一个或哪几个光电探测器则能根据尺寸进行分级。最终获取待分级计数细胞的尺寸分级和数量。例如，若光电探测器接收到信号，则进行一次计数，此时有一个细胞通过。进一步，对接收到信号的光电探测器进行识别，当只有第一光电探测器5-1接收到信号，则通过的细胞是3μm的血小板细胞。同理，第一光电探测器5-1和第二光电探测器5-2同时接收到信号，则通过的细胞是7μm的红细胞。第一光电探测器5-1、第二光电探测器5-2和第三光电探测器5-3同时接收到信号，则通过的细胞是11μm的白细胞。
由此可知，本发明实施例提供的细胞分级计数装置及其方法，通过细胞散射后的艾里斑尺寸的进行标识，实现在对细胞无损伤的基础上对细胞的类划分与计数的统计工作。避免了现有技术中通过染色荧光法对细胞进行计数统计，只能针对死亡细胞进行染色，即使可以保持细胞活性的染料，计数流程后也需要对细胞进行漂洗等流程，该流程进而增加了细胞的破坏概率，也增加了工作量。并且解决了图像识别计数法依赖图像分析实现对细胞的计数，不能准确地对细胞同时进行定性和定量的分析。也同时解决了脉冲计数法，当细胞活性差在样本内堆积，或者流速快时，易造成对细胞数量统计不到位的问题。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (3)

1.一种细胞分级计数装置，其特征在于，包括依次沿光路设置的激光器（1）、细胞通道（2）、准直透镜（3）、尺寸分级计数单元（4）和光电探测单元（5）；其中，
所述尺寸分级计数单元（4）包括同心的菲涅尔透镜（4-1）和菲涅尔透镜环组；其中，所述菲涅尔透镜环的数量为N，N≥1；
所述光电探测单元（5）中光电探测器的数量为N+1，各个光电探测器与所述尺寸分级计数单元（4）中透镜一一对应；
所述激光器（1）发出激光光束，所述激光光束入射至所述细胞通道（2）内的待分级计数的细胞，经所述待分级计数细胞后散射，散射光束经所述准直透镜（3）准直为准直光束后，入射至所述尺寸分级计数单元（4）进行分级计数，分级计数后的光束入射至所述光电探测单元（5），通过分析所述光电探测单元（5）所接收的信息，获取待分级计数细胞的尺寸分级和数量；
所述菲涅尔透镜（4-1）和所述菲涅尔透镜环组均为正菲涅尔透镜（4-1）；
所述菲涅尔透镜（4-1）为圆形菲涅尔透镜；
所述菲涅尔透镜环组套设在所述菲涅尔透镜（4-1）外，且各个菲涅尔透镜环的焦距与所述菲涅尔透镜（4-1）的焦距相同；
所述菲涅尔透镜（4-1）和所述菲涅尔透镜环组之间的夹角为大于0°且小于90°的夹角。
2.根据权利要求1所述的细胞分级计数装置，其特征在于，所述光电探测器的探测面设置在相应的透镜的焦点处，且与相应的透镜的焦面相切。
3.一种使用如权利要求1或2中任一项所述的细胞分级计数装置的细胞分级计数方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、设置所述尺寸分级计数单元（4）中所述菲涅尔透镜（4-1）和各个菲涅尔透镜环之间的倾斜角度；
S2、所述激光器（1）发出激光光束依次经所述细胞通道（2）中待分级计数的细胞、所述准直透镜（3）和所述尺寸分级计数单元（4）后，入射至所述光电探测单元（5）；
S3、通过对所述光电探测单元（5）所接收的信息进行分析，识别所述光电探测单元（5）中接收到信息的光电探测器的数量，进而实现所述待分级计数的细胞的尺寸分级和计数。
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