CN116200331A - 悬挂式培养睾丸组织类器官的方法 - Google Patents

悬挂式培养睾丸组织类器官的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及悬挂式培养睾丸组织类器官的方法。本发明采用自主研发的悬挂式类器官培养装置和3层基质胶培养体系对睾丸组织细胞进行培养，本发明所述的悬挂式培养可以实现类器官的随意换液和转移培养，提高了睾丸类器官培养的灵活性，且悬挂式类器官培养装置和3层基质胶培养体系结合的方式能够实现人体睾丸类器官的高效培养，形成的睾丸类器官活力更强，可以传代培养。同时该方法还适用于其他种属来源的睾丸类器官，和肠道、泌尿生殖系统类器官的培养，能够提高类器官的成熟程度，缩短人类器官的构建周期。

Description

悬挂式培养睾丸组织类器官的方法
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及悬挂式培养睾丸组织类器官的方法。
背景技术
在过去十年中，干细胞研究领域取得的关键进展之一就是类器官体系的发展。类器官是由多能干细胞或成体干细胞分化而来的具有器官特异性的三维细胞培养物，它拥有与对应器官类似的空间组织，并能够重现器官的一部分生理功能。近年来，研究人员在体外成功制备出了包括肠道、胃、肝脏、胰岛和心脏等多种组织类器官。类器官已经成为再生医学、药物研究和基因治疗等领域的重要工具。
睾丸是生产精子的器官，睾丸的病变和外伤都会影响睾丸功能，从而影响男性的生育能力，因此建立体外睾丸类器官，是进行体外精子形成和不育症研究的最有潜力的工具。成熟睾丸组织和功能的非常复杂，支持细胞、曲精小管和基底膜等形成的三维空间结构，对睾丸的微环境形成非常重要，而目前对于人体组织来源睾丸类器官培养的报道还比较少。目前已经报道的方法有，包括从动物和人体中获取组织进行睾丸类器官培养。培养的策略包括二维原代生殖细胞培养、将原代细胞嵌入Matrigel胶滴的三维培养等。但是原有的培养方法中，基质胶滴会慢慢拉平，限制了类器官的生长空间，睾丸细胞失去重力的作用也会影响细胞的发育，导致睾丸类器官成熟缓慢，不易传代，消耗的培养基较多，也不宜进行大批量的培养。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供悬挂式培养睾丸组织类器官的方法。
本发明提供了悬挂式睾丸组织类器官的培养方法，其为将载有3层基质胶培养媒介的支架置于含有培养液的容器中培养后传代；
所述支架包括用于黏附3层基质胶培养媒介的主体和用于支撑所述主体的支撑部；所述支撑部将所述主体支撑于所述容器的底部。
本发明中，所述支架中的主体为圆形片状；所述主体的第一表面覆有组织培养处理的薄膜，所述薄膜用于黏附3层基质胶培养媒介。
本发明中，所述支架的支撑部包括：
第一端，位于所述主体的第一表面的一侧；
第二端，朝远离所述第一表面的反面方向延伸；
所述第二端朝远离所述第一表面的反面方向延伸形成支撑面；
所述支撑面，与所述第一表面之间的距离大于所述3层基质胶培养媒介在所述第一表面下方悬挂时的最大液滴高度。
进一步的，其特征在于，
所述支架的支撑部为多个，沿所述主体的圆周方向等距分布；
所述支撑部与所述主体为一体成型，所述多个支撑部与所述主体之间的夹角呈钝角。
本发明中，所述容器内的培养液的深度与所述支架的高度相等，使3层基质胶培养媒介没入培养液的液面。
本发明中，所述3层基质胶培养媒介包括：第一媒介、第二媒介和第三媒介；
所述第一媒介包括PBS和基质胶，所述PBS和基质胶的体积比为3：1；所述第一媒介黏附于支架第一表面；
所述第二媒介包括睾丸细胞悬液与基质胶，所述睾丸细胞悬液与基质胶的比例为1×104个活细胞/70μL基质胶；所述第二媒介叠加于第一媒介上；
所述第三媒介包括PBS和基质胶，所述PBS和基质胶的体积比为2：1；所述第三媒介包被于第二媒介上。
进一步的，
所述第一媒介黏附于支架第一表面的步骤为：将所述基质胶与PBS混合后置于第一表面上凝固，所述凝固的条件为37℃，30min；
所述第二媒介叠加于第一媒介上的步骤为：将预冷的睾丸细胞悬液与基质胶混合后置于第一媒介上凝固，所述凝固的条件为37℃，30min；
所述第三媒介包被于第二媒介上的步骤为：将基质胶与PBS混合后包裹于第二媒介上凝固，所述凝固的条件为37℃，30min。
更进一步的，本发明中，
所述第一媒介的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；
所述第二媒介的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；
所述第三媒介的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
本发明中，所述基质胶选择低酚红和低生长因子的基质胶；进一步的，在本发明的具体实施例中，选用不含有酚红和含有低生长因子基质胶对睾丸组织器官进行培养，睾丸器官组织能够正常生长；因为睾丸是特殊的性腺器官，需要的培养因子与其他类型类器官不同，加入其他生长因子会影响睾丸细胞的分化和生长。在本发明的另一些实施例中，使用含有酚红的基质胶(酚红有类似雌激素的作用)和含有细胞因子的基质胶后，睾丸类器官基本不生长，而且很快死亡。
本发明所述的培养方法中，
所述传代时间为第二媒介中的睾丸细胞体积大于500μm时传代；
所述传代时传代前和传代后第二媒介的体积比为1：2。
本发明所述的培养方法中，
所述传代前还需预处理的步骤，
所述预处理包括：融化支架上黏附的3层基质胶培养媒介后获取睾丸细胞，所述睾丸细胞经处理后进行接种传代。
成人睾丸组织与鼠类睾丸组织不同，成人睾丸组织细胞增殖缓慢，再生能力极低，进行传代困难。本发明中，所述3层基质胶培养媒介的培养体系给与类器官足够的生长空间，将3层基质胶培养媒介与支架结合，使睾丸细胞进行悬挂式培养，这样培养的方式使人体睾丸类器官的四周都可以接受培养基的滋养，且模拟了正常的重力环境，促进类器官的功能性成熟，可以实现成人睾丸类器官的传代培养。实验结果表明，本发明所述的培养方法用于人体睾丸细胞组织的传代培养，分离的原代睾丸细胞活率大于90％，在排除微生物污染的因素下，当细胞总数大于1×104个时，睾丸类器官培养的成功率可以达到95％，第一代生长到500μm仅需要约30天，传代培养的第二代睾丸类器官生长周期达到40天。且本发明所述的方法和其中涉及的装置可以与各种类型的常规细胞培养板及培养体系进行兼容，不受培养孔径大小限制，且此种设计，使得在换液过程中睾丸类器官可以直接转移到临近加有培养液的孔内，缩短了不接触培养液的乏养时间，减少了类器官的损伤。
进一步的，本发明所述的培养方法还适用于其他种属来源的睾丸类器官、肠道类器官、泌尿生殖系统类器官的培养，本发明对此不做限定。本发明所述的培养方法用于类器官的培养，可提高类器官的成熟程度，缩短类器官的构建周期。
本发明采用自主研发的悬挂式类器官培养装置和3层基质胶培养体系对睾丸组织细胞进行培养，本发明所述的悬挂式培养可以实现类器官的随意换液和转移培养，提高了睾丸类器官培养的灵活性，且悬挂式类器官培养装置和3层基质胶培养体系结合的方式能够实现人体睾丸类器官的高效培养，形成的睾丸类器官活力更强，可以传代培养。同时该方法还适用于其他种属来源的睾丸类器官，和肠道、泌尿生殖系统类器官的培养，能够提高类器官的成熟程度，缩短人类器官的构建周期。
附图说明
图1示睾丸类器官接种流程；
图2示人睾丸类器官P0代，第30天；
图3示人睾丸类器官P1代，第16天；
图4示支架结构。
具体实施方式
本发明提供了悬挂式培养睾丸组织类器官的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
所述支架结构请参阅图4，本实施例公开的一种类器官培养装置包括：支撑部201、主体202、第一表面203和第二表面204。
其中，所述支撑部201用于支撑所述主体202，所述主体202具有所述第一表面203和所述第二表面204，所述第一表面203用于3层基质胶培养媒介，3层基质胶培养媒介的主要作用是将类器官固定在一个空间里面进行培养，例如，胶状培养媒介可以是基质胶，其主要作用是将类器官固定在一个空间里进行培养。
本实施例所述装置中，作为一种可选的方案，所述主体202的材质可以为亚克力或聚酯材料，形状如图所示可以为圆形片状或其他形状，对于所述主体202的形态图1仅作示例，在此处不做具体限定，足以黏附所述胶状培养媒介即可。
本实施例所述装置中，所述第一表面203可以包覆有组织培养处理(简称：TC处理，Tissue culture treated)的薄膜，所述第二表面204可以不做处理。其中，所述TC处理能够增加所述胶状培养媒介在材料表面的黏附性，培养时，经TC处理的薄膜将会与胶状培养媒介接触，从而实现悬挂式培养。
本实施例所述装置中，作为一种可选的方案，所述支撑部201的材质可以为亚克力或聚酯材料，形状如图所示可以为棍状或其他形状，数量可以为两个或多个，与所述主体202之间的夹角可以为钝角或直角，可以均匀或不均匀地分布在所述主体202侧。对于所述支撑部201的形态图1仅作示例，在此处不做具体限定，能够支撑主体202即可。
所述支撑部201如图所示，具有与所述主体202相连的第一端和远离所述主体202的第二端，所述第一端位于第一表面203，所述第二端朝远离所述第二表面204方向延伸。
本实施例所述装置通过能够黏附胶状培养媒介的主体将包含类器官的胶状培养媒介悬挂在主体下方，且用于支撑主体的支撑部能够为类器官创造生长空间，防止类器官因重力下坠而贴壁生长以致失去3D结构，提升了类器官的培养效果。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1人源睾丸组织的收集和消化、接种和传代
1.组织收集和清洗
从手术室中切除的新鲜睾丸组织，立即放入含有三抗(青霉素+链霉素+两性霉素B)的原代组织保存液中。4℃低温运输至实验室。用75％酒精擦拭样本管外壁和盖子。在生物安全柜中，将组织从原代组织保存液中取出，放置入100mm无菌培养皿中，用含有三抗的PBS抽吸冲洗3次。
2.睾丸组织的机械分离
向上述100mm细胞培养皿上添加3ml含有三抗的MEM-α培养液，用一次性手术刀和镊子分离睾丸组织表面的白膜。用无菌手术刀将标本切割分离成为大小约为1mm3的细小碎片。
3.睾丸组织消化
将经过机械分离的组织碎片完全转移进入15ml无菌离心管中，根据组织量，加入适量原代组织消化液，用1ml枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有消化液的离心管放入37℃恒温空气浴摇床中，120rpm，10分钟，旋转消化。消化结束后，加入用无菌的PBS终止消化。
4.收集细胞
将消化后的细胞悬液在4℃，300g离心5分钟，去除上清液，加入2ml含三抗的MEM-α培养液，缓慢重悬细胞，进行细胞计数，在4℃，300g离心5分钟，去除大部分上清液，保留大约100μL液体。轻弹管底，使细胞重悬。将细胞悬液放置冰上预冷。
二、睾丸类器官接种
1.基质胶(其中包含60wt％层粘连蛋白、30wt％IV型胶原、8wt％巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖HSPG)提前6小时放置4℃自然融化，实验前取出插入冰上。所有与基质胶接触的枪头要提前预冷。将类器官悬挂培养支架按照如图1A所示的方法，倒置放置在无菌的100mm无菌细胞培养皿内。
2.用冷的无菌PBS和基质胶按照3：1充分混合，取混合后的冷基质胶20μL，如图1B滴加到类器官接种面，水平移动支架，使基质胶均匀涂布在接种面后，盖好细胞培养皿的盖子，水平放置在37℃细胞培养箱中，30分钟，等待基质胶凝固后取出。
注：根据需要培养类器官的数目准备支架数量。
3.用冷枪头吸取适量融化的基质胶，与上述收集预冷的细胞悬液按照1：1混合，缓慢重悬细胞(根据上述细胞计数结果，每1×104个活细胞种一滴胶)。将细胞与基质胶的混合液70μL滴加在上述铺底的第一层基质胶上面，盖好细胞培养皿的盖子，水平放置在37℃细胞培养箱中，30分钟，等待基质胶凝固后取出。
4.用冷的含三抗的预冷PBS和融化基质胶按照2：1充分混合，取混合后的基质胶30μL从上述含有细胞的基质胶上方缓慢滴加，使基质胶均匀的从上面流下，包裹第二层含有细胞的基质胶，如图1B所示。盖好细胞培养皿的盖子，水平放置在37℃细胞培养箱中，30分钟，等待基质胶凝固后取出。
5.用无菌镊子，将滴加有基质胶的支架取出，正置放入准备进行类器官培养的容器中(图1C)，向容器中缓慢添加睾丸类器官培养液，培养液的高度以刚没过基质胶为宜(图1E，F)。
6.3～4天换液，换液时只需要将悬挂支架转移进入另外的加有新鲜培养液的培养孔内即可。
本发明的基质胶建议使用低酚红，低生长因子的基质胶，如Corning货号为356231的基质胶，其不含酚红且只含有较低含量的生长因子，因为睾丸是特殊的性腺器官，需要的培养因子与其他类型类器官不同，加入其他生长因子会影响睾丸细胞的分化和生长。对比试验中，使用含有酚红(Corning,35230)的基质胶(酚红有类似雌激素的作用)和含有细胞因子的基质胶(Corning,356235)后，睾丸类器官基本不生长，而且很快死亡。
三、睾丸类器官的传代
1.当在镜下看到睾丸类器官的体积大于500μm时，需要进行传代。
2.传代时准备一个无菌的细胞培养皿，水平放置在冰上，将需要传代的类器官支架如图1B所示，倒置放在培养皿上，20分钟。待基质胶底部融化后，用预冷的枪头将基质胶转移进入无菌的1.5ml离心管中，用预冷的无菌PBS原位冲洗支架的接种面，将全部液体转移进入离心管中。
3.将含有类器官的离心管插入冰上，120rpm，水平孵育30分钟，充分使基质胶融化。在4℃，300g离心3分钟，弃上清。加入500μl预冷的含有三抗的MEM-α培养液，用200μL的枪头(提前用冰PBS润洗)缓慢吹打液体10次，将大块的类器官机械破碎成小片段。4℃，300g离心3分钟，弃大部分上清，保留适当体积液体，轻弹管底，使细胞重悬。将细胞悬液放置冰上预冷。
4.按照上述类器官接种的方法以1：2的比例对睾丸类器官进行传代，接种。
四、睾丸类器官培养液：
培养液主要成分包括：MEM-α、10％ KnockOutTM,促性腺激素FSH、人绒毛膜促性腺激素hCG、三抗(青霉素+链霉素+两性霉素B)和Primocin。在原代类器官接种和传代第一天的培养液中，添加适量Y27632。
结果表明，分离的原代睾丸细胞活率大于90％，在排除微生物污染的因素下，当细胞总数大于1×104个时，睾丸类器官培养的成功率可以达到95％，第一代生长到500μm仅需要约30天，传代培养的第二代睾丸类器官生长周期达到40天。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.悬挂式睾丸组织类器官的培养方法，其特征在于，
其为将载有3层基质胶培养媒介的支架置于含有培养液的容器中培养后传代；
所述支架包括用于黏附3层基质胶培养媒介的主体和用于支撑所述主体的支撑部；所述支撑部将所述主体支撑于所述容器的底部。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述支架中的主体为圆形片状；所述主体的第一表面覆有组织培养处理的薄膜，所述薄膜用于黏附3层基质胶培养媒介。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述支架的支撑部包括：
第一端，位于所述主体的第一表面的一侧；
第二端，朝远离所述第一表面的反面方向延伸；
所述第二端朝远离所述第一表面的反面方向延伸形成支撑面；
所述支撑面，与所述第一表面之间的距离大于所述3层基质胶培养媒介在所述第一表面下方悬挂时的最大液滴高度。
4.根据权利要求1～3所述的培养方法，其特征在于，
所述支架的支撑部为多个，沿所述主体的圆周方向等距分布；
所述支撑部与所述主体为一体成型，所述多个支撑部与所述主体之间的夹角呈钝角。
5.根据权利要求1～4所述的培养方法，其特征在于，所述容器内的培养液的深度与所述支架的高度相等，使3层基质胶培养媒介没入培养液的液面。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，
所述3层基质胶培养媒介包括：第一媒介、第二媒介和第三媒介；
所述第一媒介包括PBS和基质胶，所述PBS和基质胶的体积比为3：1；所述第一媒介黏附于支架第一表面；
所述第二媒介包括睾丸细胞悬液与基质胶，所述睾丸细胞悬液与基质胶的比例为1×104个活细胞/70μL基质胶；所述第二媒介叠加于第一媒介上；
所述第三媒介包括PBS和基质胶，所述PBS和基质胶的体积比为2：1；所述第三媒介包被于第二媒介上。
7.根据权利要求1～6任一项所述的培养方法，其特征在于，
所述第一媒介黏附于支架第一表面的步骤为：将所述基质胶与PBS混合后置于第一表面上凝固，所述凝固的条件为30℃～37℃，20min～30min；
所述第二媒介叠加于第一媒介上的步骤为：将预冷的睾丸细胞悬液与基质胶混合后置于第一媒介上凝固，所述凝固的条件为30℃～37℃，20min～30min；
所述第三媒介包被于第二媒介上的步骤为：将基质胶与PBS混合后包裹第二媒介上凝固，所述凝固的条件为30℃～37℃，20min～30min。
8.根据权利要求1或6或7所述的培养方法，其特征在于，
所述第一媒介的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；
所述第二媒介的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；
所述第三媒介的基质胶包括60wt％的层粘连蛋白、30wt％的IV型胶原、8wt％的巢蛋白和1.8wt％～2wt％的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，
所述传代时间为第二媒介中的睾丸细胞体积大于500μm时传代；
所述传代时传代前和传代后的第二媒介的体积比为1：2。
10.根据权利要求1或9所述的培养方法，其特征在于，
所述传代前还需预处理的步骤，
所述预处理包括：融化支架上黏附的3层基质胶培养媒介后获取睾丸细胞，所述睾丸细胞经处理后进行接种传代。
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