CN116448902A - 一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种未分级肝素或低分子肝素的物种来源鉴别方法，通过肝素中寡糖ΔⅠS和ΔⅡA‑ⅡSglu的含量和比例来鉴定物种来源的方法。肝素寡糖可以使用SAX‑HPLC、IPRP‑HPLC、IC、CE或2D‑NMR技术来分析，本方法优选一种肝素酶酶解‑SAX‑HPLC分析的技术，具体是先利用肝素酶将待检供试品样品彻底酶解，再SAX‑HPLC分析降解（或还原后）样品的寡糖，根据各寡糖特征信号，获得ΔⅠS）和ΔⅡA‑ⅡSglu（或还原后）的百分含量及二者比值，按照标准对照表，鉴别出肝素的物种来源。该分析方法，准确、实用，简单、易于操作，特别适合于经过纯化破坏掉DNA的未分级肝素或低分子肝素的种源鉴定。

Description

一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法
技术领域
0001.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法。
背景技术
0002.肝素(Heparin)和低分子肝素(Low Molecular Weight Heparin，LMWH)是临床上应用最广泛且最重要的抗凝剂，主要提取自猪、牛和羊的肠粘膜或肺。目前医用肝素的主要来源是猪的肠粘膜肝素，但牛、羊肝素在部分国家和地区(南美、东南亚与南亚)仍被广泛使用。未分级肝素(Unfractionated Heparin，UFH)指的是天然的大分子肝素，低分子肝素是以其解聚制备的小分子肝素，是临床主要的肝素制剂应用形式。
0003.众所周知，不同肝素物种来源的肝素在糖链组成和理化性质上存在差异，专利申请公布号为CN106243246B和CN105131153A的专利申请文献中，公布了多种来源未分级的肝素和相应制备的低分子肝素(依诺肝素(Enoxaparin))，它们在寡糖结构组成上，有着极为显著的差异。理化性质和生物学活性上，羊源(肠粘膜)的未分级肝素和低分子肝素(依诺肝素钠)与主流药典规定的猪肠粘膜肝素或低分子肝素(依诺肝素)相近，可以符合药典除种源外的其他指标要求，而牛源的肝素(牛肺肝素和牛肠粘膜肝素)却与猪源肝素相差巨大，尤其是因子(抗-Xa和抗-IIa)活性，无法符合药典对效价的要求。因此，猪、牛和羊源肝素及低分子肝素，应为“相似但不相同”的活性药物成分。
0004.医药工业上，控制肝素来源的方法有多种：一是从供应链角度，仅使用合法食用来源的猪肠粘膜生产肝素；二是从来料控制上，利用荧光定量PCR(QuantitativeReal-time PCR，Q-PCR)技术测定粗品肝素原料中的猪DNA和反刍DNA含量，要求反刍DNA占比在0.5％以下；三是控制肝素生产环节，防止混淆和污染；四是在成品阶段，使用核磁共振等精密分析技术，鉴别肝素物种的细微差异。
0005.以上，我们可以发现，关于肝素种源的鉴别控制，最有利的分析技术是在粗品肝素原料阶段，使用Q-PCR技术分析物料的物种DNA来源，其次是在成品阶段，使用复杂的精密分析设备鉴别二糖种类的细微差异。但是，Q-PCR的使用前提是物料中的DNA不能被破坏，有些肝素粗品物料在生产中，生产商会无意或有意地使用双氧水等化学试剂进行处理，其可以将物种的DNA破坏，从而不能被Q-PCR技术分析出来。而作为产品的医用未分级肝素和低分子肝素，均已经被氧化处理，因此Q-PCR方法不再适合用于这些肝素终端产品的肝素物种来源鉴定。而核磁共振技术，不仅是仪器设备贵重，而且肝素或低分子肝素作为大分子多糖组合物，其氢/碳信号主要堆积在一起，难以分辨，一方面要依赖于分析样品的纯度，另一方面在特征的氮-乙酰基的甲基氢信号和硫酸化区域氢信号上，本身各物种肝素的差异已较小，因此这些细微的差别，提供的信息有限，精度也低。
0006.综上，现有分析技术不适用于纯化后的未分级肝素或低分子肝素产品的肝素种源分析，因此，迫切需要准确、高效的分析技术用作肝素种源鉴别方法。
发明内容
0007.本发明所需解决的技术问题是：提供一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，该鉴别方法能够准确、高效的鉴别未分级肝素或低分子肝素物种来源。
0008.为解决上述问题，本发明采用的技术方案是：所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法是根据表1及样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比、ΔⅡA-ⅡSglu百分比、ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu二者比值，鉴别判定样品物种来源，所述的鉴别方法的步骤为：
表1.未分级肝素或低分子肝素的物种来源判断标准表
(1)将样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比与表1中ΔⅠS百分比条目下的各未分级肝素或低分子肝素物种来源类别进行对比：
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比在44.0％-86.0％范围以内的，找出样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种来源；
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比在44.0％-86.0％范围以外的，鉴别判定该样品不属于未分级肝素或低分子肝素物种；
(2)在找出的样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下，将样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比及ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值分别与表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比及ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值进行对比：
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围内、或者样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值范围内，鉴别判定步骤(1)中找出的样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种来源准确；
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围外，且样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值范围外，鉴别判定样品为非纯品物种来源的肝素。
0009.ΔⅠS(肝素分析中的标准二糖之一，为ΔUA2S-(1→4)α-GlcN(NS,6S))和ΔⅡA-ⅡSglu(为ΔUA-(1→4)α-GlcNAc(6S)-(1→4)β-GlcA-(1→4)α-GlcN(NS,6S))是肝素糖链中最为重要的寡糖之一，其非还原端的4,5不饱和糖醛酸结构，是因肝素糖链在样品分析时因酶解或降解作用形成。
0010.ΔⅠS的结构式为：
ΔUA2S-(1→4)α-GlcN(NS,6S)。
0011.ΔⅡA-ⅡSglu的结构式为：
ΔUA-(1→4)α-GlcNAc(6S)-(1→4)β-GlcA-(1→4)α-GlcN(NS,6S)。
0012.众所周知，肝素或低分子肝素的结构，主要由氨基葡萄糖(D-glucosamine，GlcN)和两种糖醛酸(艾杜糖醛酸(L-iduronic，IdoA)和葡萄糖醛酸(D-glucuronic，GlcA))中的一种组成二糖重复单元，且在糖单元的不同位置随机修饰有硫酸酯基。所有肝素的结构都可以用一个四糖单元来表示，如下所示的A和B，而C则显示与抗凝血酶结合的五糖结构，是维持抗凝活性所必需的核心结构。
0013.所有肝素的结构为：
0014.由上可知，这些结构会因糖单元数量、种类以及硫酸酯基的修饰数量、位置等不同而纷繁差异。肝素糖链中的主要部分为结构有序的“规则区”—结构规整的三硫酸化二糖重复单元—I2S-GlcNS6S(2-氧-硫酸基-艾杜糖醛酸-氮-硫酸基-6-氧硫酸基-葡萄糖胺，酶解寡糖分析时，形成ΔI2S结构)，如A所示；而B所示为低硫酸化区域，是结构无序的“不规则区”，主要是一些含IdoA和GlcA(其后连有N-乙酰基-GlcN或N-磺酰基-GlcN(GlcNAc，GlcNS))的单元[R.J.Linhardt,J.Med.Chem.46,(2003)2551-2564.]，B部分在肝素寡糖链中含量较小。另外，C显示了与抗凝血酶结合的五糖结构，它是肝素抗凝的核心位点，粗体表示的是维持抗凝活性所必需的，如除去则抗凝活性下降95％，斜体表示的也很重要，脱去后抗凝活性将下降25-50％；C的结构是GlcNS6S-GlcA-GlcNS3S6S-IdoA2S-GlcNS6S，为ΔⅡA-ⅡSglu的部分结构(后三个糖单元)和一个结构规整的三硫酸化二糖重复单元—I2S-GlcNS6S(酶解时形成ΔI2S结构)组成，ΔⅡA-ⅡSglu序列是C中最主要的组成部分，其含量多少可以反映抗凝活性大小。
0015.不同低分子肝素，因解聚方式不同，会在产生的低分子肝素糖链两端，形成特殊的链端结构，如依诺肝素在糖链的还原端有1,6-酐环结构、非还原端有4,5-不饱和糖醛酸结构这两种典型特征，其他的低分子肝素，如那曲肝素(Nadroparin)、达肝素(Dalteparin)、亭扎肝素(Tinzaparin)、帕肝素(Parnaparin)和贝米肝素(Bemiparin)等，也会在各糖链两端，形成特定的结构特征。但是，相比于糖链两端，上述ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu主要位于糖链内部，总的来说，ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu二者可以体现肝素样品来源于亲缘肝素的组成特征，从而通过对此二者的分析，可以进行肝素物种来源的鉴别。
0016.以上，ΔⅠS是肝素糖链的主要组成部分，位于结构有序的“规则区”，ΔⅡA-ⅡSglu是肝素抗凝活性作用位点的主要组成部分，位于核心五糖结构，属于结构无序的“不规则区”。它们主要位于肝素糖链的内部，在生产终端成品的未分级肝素或低分子肝素中，糖链内部结构均由亲缘肝素带来，也即不同种源的肝素产品，均会保留其原料肝素(亲缘肝素)的糖链组成特征。此外，肝素寡糖的种类繁多，不仅是此方法考察的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu，其他众多的寡糖单元也会反映出一些肝素亲缘的特征，但是，除了作为肝素结构有序“规则区”的ΔⅠS外，其他寡糖单元则主要位于结构无序的“不规则区”，只有其中的ΔⅡA-ⅡSglu能最为反映肝素的核心五糖结构含量多少。发明人经过对寡糖单元数据的汇总和比对分析，这两种寡糖对于种源鉴别最为准确和高效。
0017.此外，ΔⅠS与ΔⅡA-ⅡSglu在检验前还可以进行硼氢化钠还原处理，这种处理在美国药典附录<207>1,6-酐衍生物检查法中被公开记载，并表明，在还原处理的前后，所有二糖和/或四糖的百分含量占比是一致的，不会因为还原反应而变化。
0018.当前，ΔⅠS百分比、ΔⅡA-ⅡSglu百分比、ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu二者比值可以应用多种分析技术进行测定。一种方法是首先将肝素样品降解，再使用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱(SAX-HPLC)、酶解-离子色谱(IC)、酶解-反相离子对-高效液相色谱(IPRP-HPLC)和酶解-毛细管电泳(CE)等技术进行分析；另外一种方法是不把样品降解，直接利用二维核磁共振技术(2D-NMR)，利用糖单元连接与修饰方式的不同，计算得出。
0019.本方案优选采用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析方式。当采用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析方式时，以肝素酶将样品酶解，降解液使用硼氢化钠还原，再进行酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析，根据各肝素寡糖的特征峰信号，获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu，这里获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu为还原后的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu。
0020.进一步地，前述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其中，降解液使用硼氢化钠还原的步骤为：向降解产物溶液中加入硼氢化钠溶液，在室温下还原不少于1小时；所述硼氢化钠溶液的浓度为80-100mg/mL，现配现用。
0021.进一步地，前述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其中，采用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析方式时，还可以采用降解液不使用硼氢化钠还原的方式：以肝素酶将样品酶解，降解液不使用硼氢化钠还原，再进行酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析，根据各肝素寡糖的特征峰信号，获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu。
0022.进一步地，前述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其中，以肝素酶将样品酶解的步骤为：向浓度为5-50mg/mL的未分级肝素或低分子肝素样品供试品溶液中加入肝素酶，室温下酶解不少于24小时。
0023.进一步地，前述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其中，所述肝素酶包括肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ中的一种或多种组合。
0024.用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析方式时，色谱分析条件如表2所示，流动相梯度如表3所示。
0025.表2.色谱分析条件表
0026.表3.流动相梯度表
0027.进一步地，前述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其中，根据各肝素寡糖的特征峰信号获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu的方式为：根据对照品图谱，从肝素寡糖或衍生物中，辨别出ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu。
0028.本发明的有益效果是：本发明提供的基于未分级肝素或低分子肝素的寡糖单元保留有亲缘肝素特征，分析供试样品中ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu或者还原后的ΔⅠS和还原后的ΔⅡA-ⅡSglu的百分比和二者比值，归类鉴别出物种来源的技术，可用于准确鉴定肝素物种的来源，尤其是经过纯化破坏掉DNA的未分级肝素或低分子肝素的种源鉴定，填补了本领域内分析方法的空白。本方法准确、实用，简单、易于操作，适合于肝素生产企业、实验室和科研机构使用。
附图说明
0029.图1是寡糖对照品及肝素供试品分析的SAX-HPLC图谱比较示意图。
0030.图2是不同物种来源未分级肝素样品的寡糖SAX-HPLC图谱比较示意图。
0031.图3是不同物种来源未分级肝素的寡糖标准化聚类分析示意图。
具体实施方式
0032.下面结合附图及优选实施例对本发明所述的技术方案作进一步详细的说明。
0033.为了方便说明本发明，因肝素样品中寡糖单元(包括ΔⅠS与ΔⅡA-ⅡSglu)的百分比可以使用多种方法分析，尤其是酶解后使用SAX-HPLC、IC、IPRP-HPLC或CE技术分析，而这些均已有文献方法可参考，因此，本发明在以下实施例中，仅以SAX-HPLC分析技术来举例说明。应当提醒的是，本发明用于分析肝素样品中ΔⅠS与ΔⅡA-ⅡSglu的百分比和二者比值的分析方法，并不限于以下这些具体实施例，任何基于本发明的内容并据以实施，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
0034.【术语/定义/缩写】
ΔⅠS：为ΔUA2S-(1→4)α-GlcN(NS,6S))，肝素分析中的标准二糖之一；
ΔⅡA-ⅡSglu：为ΔUA-(1→4)α-GlcNAc(6S)-(1→4)β-GlcA-(1→4)α-GlcN(NS,6S))，一种肝素四糖；
Heparin：肝素；
LWMH：低分子肝素，Low Molecular Weight Heparin；
UFH：未分级肝素，Unfractionated Heparin；
GlcA：葡萄糖醛酸，D-glucuronic Acid；
GlcN：氨基葡萄糖，葡萄糖胺，D-glucosamine；
IdoA，L-iduronic Acid：艾杜糖醛酸；
ManN：甘露糖醛酸，Mannuronic Acid；
Q-PCR：定量聚合酶链式反应；
DNA：脱氧核糖核酸；
CE：毛细管电泳；
SAX-HPLC：强阴离子交换-高效液相色谱；
IPRP-HPLC：反相离子对-高效液相色谱；
2D-NMR：二维核磁共振技术。
0035.本实施例采用酶解-SAX-HPLC分析方法。
0036.酶解-SAX-HPLC分析方法具体如下：
0037.先以肝素酶将待检肝素样品水解，再将降解液经0.22微米过滤，以SAX-HPLC进行寡糖分析，从中确定特征的ΔⅠS百分比、ΔⅡA-ⅡSglu百分比、以及二者比值。
0038.(1)试剂配制：
溶液A：称取136mg的磷酸二氢钾，用约40mL的超纯水溶液后，以2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入20mg的小牛白蛋白，摇匀，并以超纯水定容至100mL，过滤得到10mM的磷酸二氢钾溶液；
溶液B：移取0.57mL的冰醋酸于烧杯中，加入约80mL的超纯水，加入32mg的醋酸钙，搅拌使之溶解。以2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入10mg小牛白蛋白，摇匀，并以超纯水定容至100mL，过滤得到100mM的醋酸钠溶液；
肝素酶溶液：根据肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ、肝素酶Ⅲ的包装规格，使用溶液A分别溶解和稀释；
流动相A：称取280mg的磷酸二氢钠，溶于约950mL的超纯水中，用磷酸调节pH为3.0，水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤；
流动相B：称取140g的一水合高氯酸钠，溶于950mL的流动相A中，用磷酸调节pH为3.0，再以流动相A定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤；
寡糖ΔⅠS对照品溶液：以超纯水溶解配制0.1mg/mL的ΔⅠS对照品溶液，分装后-20℃以下冻存；
寡糖ΔⅡA-ⅡSglu对照品溶液：以超纯水溶解配制0.1mg/mL的ΔⅡA-ⅡSglu对照品溶液，分装后-20℃以下冻存；
供试品溶液：称取～20mg的未分级肝素或低分子肝素供试样品，加入1mL的溶液B，振荡溶解。
0039.(2)肝素酶降解：
于离心管中加入20μL的供试品溶液、90μL的溶液B、90μL的肝素酶混合溶液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各0.4IU/ml，按1：1：1混合)，涡旋混匀，室温下酶解48小时。
(3)SAX-HPLC的色谱条件：色谱分析条件和流动相梯度表，见表4和表5。
0040.表4.HPLC色谱分析条件表
0041.表5.流动相梯度表
时间(min) 流动相A％ 流动相B％
0 97 3
20 65 35
40 20 80
60 0 100
70 97 3
0043.(4)分析：
分别将寡糖ΔⅠS对照品溶液、寡糖ΔⅡA-ⅡSglu对照品溶液和供试品溶液进样分析，获取供试品中ΔⅠS百分比、ΔⅡA-ⅡSglu百分比和二者比值数据。对照品及供试品分析的SAX-HPLC色谱图叠图，见图1。
实施例一
0043.不同物种来源未分级肝素的肝素酶酶解-SAX-HPLC分析，参照上述方法进行。
0044.试验样品：随机标记四份来自不同种源的未分级肝素，编为样品1至样品4，它们各来自牛肺肝素、牛肠粘膜肝素、羊肠粘膜肝素、猪肠粘膜肝素；交样品1至样品4于分析人员进行盲测。
0045.肝素酶酶解-SAX-HPLC分析中，以肝素酶将样品酶解，降解液不使用硼氢化钠还原，再进行酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析，根据各肝素寡糖的特征峰信号，获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu。以肝素酶将样品酶解的步骤为：向浓度为5-50mg/mL的未分级肝素或低分子肝素样品供试品溶液中加入肝素酶，室温下酶解不少于24小时。
0046.所述肝素酶包括肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ中的一种或多种组合。
0047.分析结果：
不同物种来源未分级肝素的二糖/寡糖图谱比较叠图，见图2。结果显示，在寡糖单元组成上各物种有较大的差异，表现在主要较大的几个寡糖峰的百分比差别。此外，样品1至样品4中得到的ΔⅠS百分比、ΔⅡA-ⅡSglu百分比、ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu二者比值数据如表6所示。
0048.表6.不同物种来源未分级肝素的特征糖单元比较结果表
0049.采用本发明所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法对表6中样品1-4进行鉴别判定样品物种来源，所述的鉴别方法的步骤为：
(1)将样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比与表1中ΔⅠS百分比条目下的各未分级肝素或低分子肝素物种来源类别进行对比：
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比在44.0％-86.0％范围以内的，找出样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种来源；
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比在44.0％-86.0％范围以外的，鉴别判定该样品不属于未分级肝素或低分子肝素物种。
0050.样品1的ΔⅠS百分比为78.69％，在表1中对应的范围为牛肺76.0％-86.0％。
0051.样品2的ΔⅠS百分比为52.43％，在表1中对应的范围为牛肠粘膜44.0％-54.0％。
0052.样品3的ΔⅠS百分比为66.26％，在表1中对应的范围为羊肠粘膜64.0％-76.0％。
0053.样品4的ΔⅠS百分比为63.31％，在表1中对应的范围为猪肠粘膜54.0％-64.0％。
0054.(2)在找出的样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下，将样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比及ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值分别与表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比及ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值进行对比：
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围内、或者样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值范围内，鉴别判定步骤(1)中找出的样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种来源准确；
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围外，且样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值范围外，鉴别判定样品为非纯品物种来源的肝素。
0055.样品1的ΔⅡA-ⅡSglu百分比为0.58％，与表1中牛肺的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围0.3％-0.8％进行对比，0.58％位于0.3％-0.8％内，判定样品1属于牛肺。
0056.样品2的ΔⅡA-ⅡSglu百分比为0.67％，与表1中牛肠粘膜的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围0.3％-1.0％进行对比，0.67％位于0.3％-1.0％内，判定样品1属于牛肠粘膜。
0057.样品3的ΔⅡA-ⅡSglu百分比为1.84％，与表1中羊肠粘膜的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围1.6％-2.2％进行对比，1.84％位于1.6％-2.2％内，判定样品1属于羊肠粘膜。
0058.样品4的ΔⅡA-ⅡSglu百分比为2.38％，与表1中猪肠粘膜的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围2.2％-2.6％进行对比，2.38％位于2.2％-2.6％内，判定样品1属于猪肠粘膜。
0059.此结果与盲标前的物料来源一致。
实施例二
0060.不同物种来源低分子肝素的肝素酶酶解-SAX-HPLC分析，与实施例一不同的是在供试品酶解后，使用硼氢化钠还原，同样地，对照品也使用还原后的寡糖，用于判定还原后的ΔⅠS和还原后的ΔⅡA-ⅡSglu位置，此外，还可以根据二者峰的相对保留时间，根据肝素图谱的特征(ΔⅠS为最大的主峰信号)来判定。
0061.试验样品：随机标记四份来自不同种源的低分子肝素，编为样品5至样品8，它们各来自羊肠粘膜依诺肝素、牛肺依诺肝素、牛肠粘膜依诺肝素、猪肠粘膜依诺肝素；交样品5至样品9于分析人员进行盲测。
0062.肝素酶酶解-SAX-HPLC分析中，以肝素酶将样品酶解，降解液使用硼氢化钠还原，再进行酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析，根据各肝素寡糖的特征峰信号，获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu。
0063.降解液使用硼氢化钠还原的步骤为：向降解产物溶液中加入硼氢化钠溶液，在室温下还原不少于1小时；所述硼氢化钠溶液的浓度为80-100mg/mL。
0064.以肝素酶将样品酶解的步骤为：向浓度为5-50mg/mL的未分级肝素或低分子肝素样品供试品溶液中加入肝素酶，室温下酶解不少于24小时。
0065.所述肝素酶包括肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ中的一种或多种组合。
0066.分析结果：
还原后测定的SAX-HPLC分析数据，数据参见表7所示。
0067.表7.不同来源低分子肝素(依诺肝素)的特征糖单元比较结果
0068.根据表1.未分级肝素或低分子肝素的物种来源判断标准，对表7中样品5-8进行鉴别判定样品物种来源，所述的鉴别方法的步骤为：
(1)将样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比与表1中ΔⅠS百分比条目下的各未分级肝素或低分子肝素物种来源类别进行对比：
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比在44.0％-86.0％范围以内的，找出样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种来源；
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比在44.0％-86.0％范围以外的，鉴别判定该样品不属于未分级肝素或低分子肝素物种。
0069.样品5的ΔⅠS百分比为71.26％，在表1中对应的范围为羊肠粘膜64.0％-76.0％。
0070.样品6的ΔⅠS百分比为81.42％，在表1中对应的范围为牛肺76.0％-86.0％。
0071.样品7的ΔⅠS百分比为47.45％，在表1中对应的范围为牛肠粘膜44.0％-54.0％。
0072.样品8的ΔⅠS百分比为58.45％，在表1中对应的范围为猪肠粘膜54.0％-64.0％。
0073.(2)在找出的样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下，将样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比及ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值分别与表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比及ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值进行对比：
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围内、或者样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值范围内，鉴别判定步骤(1)中找出的样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种来源准确；
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围外，且样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值在表1中样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值范围外，鉴别判定样品为非纯品物种来源的肝素。
0074.样品5的ΔⅡA-ⅡSglu百分比为1.78％，与表1中羊肠粘膜的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围1.6％-2.2％进行对比，1.78％位于1.6％-2.2％内，判定样品5属于羊肠粘膜。
0075.样品6的ΔⅡA-ⅡSglu百分比为0.61％，与表1中牛肺的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围0.3％-0.8％进行对比，0.61％位于0.3％-0.8％内，判定样品6属于牛肺。
0076.样品7的ΔⅡA-ⅡSglu百分比为0.71％，与表1中牛肠粘膜的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围0.3％-1.0％进行对比，0.71％位于0.3％-1.0％内，判定样品7属于牛肠粘膜。
0077.样品8的ΔⅡA-ⅡSglu百分比为2.28％，与表1中猪肠粘膜的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围2.2％-2.6％进行对比，2.28％位于2.2％-2.6％内，判定样品8属于猪肠粘膜。
0078.此结果与盲标前的物料来源一致。
0079.实施例中汇总了多批次未分级肝素或低分子肝素的特征寡糖数据，经标准化后聚类分析，见图3。
0080.结果显示，各物种的未分级肝素或低分子肝素，种内批次之间的差异较小，而它们与其他物种来源的未分级肝素或低分子肝素，种间有着极为显著的差别。因数据来源于特征寡糖ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu，这也间接反映了使用该二个特征寡糖的含量和比例数据，适用于未分级肝素或低分子肝素种源的鉴别。
0081.综上，本发明提供的基于未分级肝素或低分子肝素的寡糖单元保留有亲缘肝素特征，分析供试样品中ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu或者还原后的ΔⅠS和还原后的ΔⅡA-ⅡSglu的百分比和二者比值，归类鉴别出物种来源的技术，可用于准确鉴定肝素物种的来源，尤其是经过纯化破坏掉DNA的未分级肝素或低分子肝素的种源鉴定，填补了本领域内分析方法的空白。本方法准确、实用，简单、易于操作，适合于肝素生产企业、实验室和科研机构使用。
0082.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：根据下表未分级肝素或低分子肝素物种来源判断标准表、样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比、ΔⅡA-ⅡSglu百分比、ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu二者比值，鉴别判定样品物种来源，所述的鉴别方法的步骤为：
(1)将样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比与未分级肝素或低分子肝素物种来源判断标准表中ΔⅠS百分比条目下的各未分级肝素或低分子肝素物种来源类别进行对比：
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比在44.0％-86.0％范围以内的，找出样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种来源；
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比在44.0％-86.0％范围以外的，鉴别判定该样品不属于未分级肝素或低分子肝素物种；
(2)在找出的样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下，将样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比及ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值分别与样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比及ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值进行对比：
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比在样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围内、或者样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值在样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值范围内，鉴别判定步骤(1)中找出的样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种来源准确；
样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅡA-ⅡSglu百分比在样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅡA-ⅡSglu百分比范围外，且样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值在样品对应的未分级肝素或低分子肝素物种所在类别下的ΔⅠS/ΔⅡA-ⅡSglu比值范围外，鉴别判定样品为非纯品物种来源的肝素。
2.根据权利要求1所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：样品中保留有肝素亲缘特征的ΔⅠS百分比、ΔⅡA-ⅡSglu百分比、ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu二者比值这三种数据采用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析、酶解-反相离子对-高效液相色谱分析、酶解-毛细管电泳-高效液相色谱分析、酶解-离子色谱、二维核磁共振波谱中的任一种分析方式得到。
3.根据权利要求2所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：采用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析方式，以肝素酶将样品酶解，降解液使用硼氢化钠还原，再进行酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析，根据各肝素寡糖的特征峰信号，获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu。
4.根据权利要求3所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：降解液使用硼氢化钠还原的步骤为：向降解产物溶液中加入硼氢化钠溶液，在室温下还原不少于1小时；所述硼氢化钠溶液的浓度为80-–100mg/mL。
5.根据权利要求2所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：采用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析方式，以肝素酶将样品酶解，降解液不使用硼氢化钠还原，再进行酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析，根据各肝素寡糖的特征峰信号，获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu。
6.根据权利要求3或4或5所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：以肝素酶将样品酶解的步骤为：向浓度为5-50mg/mL的未分级肝素或低分子肝素样品供试品溶液中加入肝素酶，室温下酶解不少于24小时。
7.根据权利要求6所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：所述肝素酶包括肝素酶Ⅰ、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ中的一种或多种组合。
8.根据权利要求3或4或5所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：用酶解-强阴离子交换-高效液相色谱分析方式时，检测器为紫外检测器；波长为232nm；色谱柱为阴离子交换色谱柱，L14A，填料粒径5μm，4×250mm；预柱为强阴离子交换色谱柱，L14A，填料粒径5μm，4.6×10mm；柱温为15℃–35℃；流动相为流动相A和流动相B进行梯度洗脱；流速为0.4-1.0mL/min；进样量为5-25μL；其中流动相梯度如下表所示；
9.根据权利要求3或4或5所述的一种未分级肝素或低分子肝素物种来源的鉴别方法，其特征在于：根据各肝素寡糖的特征峰信号获得样品的ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu的方式为：根据对照品图谱，从肝素寡糖或衍生物中，辨别出ΔⅠS和ΔⅡA-ⅡSglu。
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