CN116621994A - 一种鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白及其应用。所述鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白经过纯化和鉴定后通过SPF雏鸡进行的免疫攻毒保护试验，初步显示出了良好的免疫保护效果。本研究为鸡滑液囊支原体基因工程疫苗的研发奠定基础。

Description

一种鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白及其制备和应用。
背景技术
滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)引起发病鸡关节肿大、滑液囊及肌腱发炎和实质器官的肿大，虽死亡率在10％以内，但鸡群感染后难以根除，可通过水平途径传播、垂直传播，并且常发生混合感染。由于MS感染具有长期性和容易在宿主体内的成功复制、存活，导致MS而常常难以被控制，给家禽业造成了巨大的经济损失。现在市场上，通过抗体检测的方法主要依赖于进口ELISA商品化试剂盒，但进口ELISA商品化试剂盒价格昂贵，不适用于养鸡场大批量检测来净化鸡群。因此，开发更为经济的MS抗体ELISA检测试剂盒来替代进口产品对我国MS感染情况的监测具有重要意义。
目前对于滑液囊支原体病的治疗主要是敏感的抗生素进行治疗，主要有泰乐菌素、大观霉素和螺旋霉素及其大环内酯类药物等。随着人们长期滥用药物，使得支原体对大环内脂类及其他抗生素药物的耐药性不断增加。而市面上常见的疫苗有弱毒苗MS-H株和MS灭活油乳剂苗，比较昂贵。开发更为经济的MS疫苗来替代进口产品对我国MS防控具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种编码上述鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
一种含有上述编码鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白的基因的重组表达载体，其出发载体为pET-32a(+)。
一种含有上述重组表达载体的重组表达菌，其出发菌株为大肠杆菌。
上述一种鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白在制备鸡滑液囊支原体基因工程疫苗中的应用。
本研究采用生物信息学软件及相关网站分析MS结构蛋白的优势线性表位，获得抗原表位序列，通过Protean软件分析抗原位点情况，并命名为MS-eLPD。再通过遗传密码子将多表位肽MS-eLPD的氨基酸序列推导为核苷酸序列，尽可能选择大肠杆菌优势密码子，抗原表位肽核苷酸序列送生物公司进行基因合成，并通过连接酶将目的基因和质粒进行连接。将MS-eLPD重组原核表达质粒转化DH5α感受态细胞，用质粒提取盒提取质粒。取重组质粒作模板，用EcoRΙ和Hind III对重组质粒进行双酶切和核酸电泳。将酶切鉴定鉴定为阳性的重组质粒送检测序。把构建正确的重组原核表达质粒命名为pET-32a(+)-MS-eLPD。将测pET-32a(+)-MS-eLPD重组质粒转化BL21，培养过夜后挑取单个分散的菌落在LB液体培养基继续培养，IPTG诱导蛋白的表达。
将MS-eLPD经大量诱导表达与纯化后，二次免疫SPF雏鸡，用分离鉴定的致病性MS攻菌，攻菌对照组试验鸡发病，而免疫组获得保护。
本发明的优点在于：
当前市面上常见的疫苗有弱毒苗MS-H株和MS灭活油乳剂苗两种，灭活苗虽然能够阻断MS的经蛋传播，可使体液抗体上升，暂时减轻感染时的症状，但是却不能彻底地清除鸡体内的野毒和阻止野毒入侵；MS-H株弱毒苗可使机体产生黏膜免疫。研究表明，支原体表面不含有脂多糖和肽多糖，但在其表面有大量的脂蛋白支原体脂蛋白可参与对宿主细胞的黏附作用，并且可以影响宿主的免疫系统。脂蛋白通过刺激细胞产生前炎性因子、细胞因子引发宿主细胞损伤。同时支原体脂蛋白能逃避宿主免疫系统的监视，使其能在宿主细胞中长期生存，能促进和辅助其他疾病的发病。随着生物信息学技术的不断发展，生物信息学被广泛地应用。目前，生物信息学分析技术被大量用来预测蛋白质的结构，对表位疫苗的研究起到了重要作用。
多表位疫苗是将多个表位核酸序列片段串联起来，利用重组DNA技术将其重组到载体中制备而成。多表位基因工程疫苗抗原可用于制备对单一病原体的多种血清型具有多重保护能力的多价疫苗，也可作为预防多种疾病的广谱疫苗。多表位疫苗是指同时携带多个目的抗原以及辅助性的表位的疫苗。它是基于目的抗原表位的氨基酸序列而制备的，是近年发展起来的一种新型的基因工程疫苗设计思路，代表了新一代疫苗的研究方向和发展趋势。多表位疫苗有很多传统基因工程疫苗所不具备的优点：多表位疫苗能被得到高效的抗原递呈；可以有效应对病原微生物抗原的突变和免疫反应中存在的许多不利因素；在细胞免疫方面具有独特的优势等。
随着人们长期滥用药物，使得支原体对大环内脂类及其他抗生素药物的耐药性增加，给后续的治疗加大困难。而市面上常见的疫苗又存在着诸多缺陷，在疫苗的研究方面，基因工程疫苗的研究在国内外并不常见，随着对多表位疫苗的研究深入，为支原体基因工程疫苗的研究提供了便利。
附图说明
图1A：蛋白质二级结构预测图。图1B：蛋白质三级结构预测图。
图2：重组质粒pET-32a(+)-MS-eLPD酶切电泳鉴定。
图3：重组蛋白pET-32a(+)-MS-eLPD的SDS-PAGE分析。
图4：Western blot分析。
图5：经MS-NP感染的雏鸡剖检变化。
图6：经MS-NP感染的雏鸡呼吸道病理切片。
图7：经MS-NP感染的雏鸡脾脏病理切片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
1材料与方法
1.1材料
1.1.1毒株、菌株、表达载体及实验动物
原核表达质粒pET-32a(+)由发明人实验室保存；大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)感受态细胞均购自北京全式金公司；SPF鸡胚购自福建圣农发展有限公司；滑液支原体MS-NP株由发明人实验室分离鉴定，测序发现，MS-NP株同在中国分离的滑液支原体HN01株、5-9株和JX01株均在同一分支，和澳大利亚减毒活疫苗MS-H株亲缘关系较远。
1.1.2主要试剂
Ni-NTA Resin、TMB ELISA用底物和T4DNA连接酶均购自全式金(北京)公司；去内毒素质粒中提试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶QuickCut EcoRΙ和QuickCut HindIII购自宝生物(大连)公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Amp)和咪唑均购自北京索莱宝公司；SDS-PAGE Gel Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；滑液囊支原体抗体检测试剂盒购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)购自上海翊圣生物科技有限公司；96孔ELISA板购自CORNING公司；兔抗鸡IgG-HRP购自Proteintech公司；CTB黏膜免疫佐剂购自爱必信(上海)生物科技有限公司；MS-H商品弱毒疫苗由福建圣农发展有限公司赠送。碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、吐温-20等其他常规试剂由本实验室保存。
1.2MS-eLPD原核表达质粒构建
1.2.1滑液囊支原体B/T细胞抗原表位的预测与筛选
使用ABCpred网站和SYFPEITHI网站进行抗原表位预测，结合DNAStar软件Protean程序分析预测滑液囊支原体DLD、LP78、VLHA、LDH、ENO等蛋白的B细胞表位(抗原性、亲水性，表面可能性、柔性等)相关参数。
登录IEBD网站(http://tools.immuneepitope.org/main/)、SYFPEITHI数据库网站(http://www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/)，分别输入通过上述分析后，预测得到的潜在优势表位氨基酸序列。评估各片段中相关性(相关性＞85％)较强的T细胞位点。
1.2.2MS-eLPD核苷酸序列的设计与合成
分别从筛选出的抗原表位通过4个甘氨酸(GGGG)将各抗原表位进行串联排列，得到预期的多表位肽序列，通过Protean软件分析多表位肽的抗原位点情况，并将该多表位肽命名为MS-eLPD。通过遗传密码子将多表位肽MS-eLPD的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)推导为核苷酸序列，尽可能选择大肠杆菌优势密码子，使用三肽囊素作为载体蛋白，同时在序列两端分别加上EcoRΙ和HindIII酶切位点，得到总计1113个碱基(SEQ ID NO.2)。将设计好的多表位肽核苷酸序列送生物公司进行基因合成。
1.2.3MS-eLPD原核表达质粒的构建和鉴定
通过T4 DNA连接酶将SEQ ID NO.2所示的目的基因和pET-32a(+)质粒进行连接，反应体系和条件如下表所示，得到重组质粒pET-32a(+)-MS-eLPD。将连接产物转化至大肠杆菌(E.coli)感受态细胞DH5α，在冰上反应30min；42℃热击90s，热击完毕冰上放2min，随后加入1mL无Amp的LB液体培养基，25℃培养45min；取100μL菌液均匀地涂布在含有Amp(1:1000)的固体LB培养基平板，倒置放在37℃培养箱中过夜培养。次日，随机挑选单菌落在含有Amp(1:1000)的LB液体培养基中培养，3h后，取菌液作为模板，采用T7通用引物(F:5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；R:5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')进行PCR反应，并进行琼脂糖凝胶电泳。
1.3 MS-eLPD的原核表达及SDS-PAGE分析
1.3.1多表位融合基因重组菌的诱导表达
将鉴定正确的重组质粒pET-32a(+)-MS-eLPD转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，次日挑取单个菌落37℃摇菌过夜，取200μL菌液接种于20ml含Amp(1:1000)抗性的液体LB培养基，培养至OD600nm达到0.6～0.8时，加20μL 1.0mmol/L IPTG于25℃诱导2h、4h、6h、8h、10h，各收1ml菌液，同时设置空载体和未加IPTG诱导的重组菌做阴性对照，12000r/min离心1min，取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，以确定MS-eLPD在E.coli中可溶性蛋白和包涵体的相对表达水平。
1.3.2多表位融合基因重组蛋白的纯化
按照ProteinIso Ni-NTA Resin试剂盒说明书，进行目的蛋白的纯化。分别以20mM、50mM、80mM、100mM和200mM浓度的咪唑进行洗脱，洗脱完毕，取洗脱流出液进行SDS-PAGE分析，以确定洗脱液的浓度。
1.3.3多表位融合基因重组蛋白透析与浓缩
因纯化时洗脱出的MS-eLPD溶液中含有高浓度的咪唑，会对后续的实验产生影响，所以此步骤目的是将纯化后的MS-eLPD重组蛋白进行透析将咪唑去除。进行梯度透析，依次在含有50mM、25mM、10mM、0mM咪唑中透析，每次透析3h。
透析结束后，使用PEG 20000进行浓缩：将PEG 20000粉末加到并覆盖透析袋表面，约1h后可将复性后的蛋白浓缩数倍。将纯化透析浓缩后的MS-eLPD重组蛋白进行SDS-PAGE检测，具体操作如下：
(1)安装垂直式电泳槽装置的玻璃板；
(2)聚丙烯酞胺凝胶分离胶的制备：参照碧云天试剂盒说明，制备10％的分离胶5mL；混匀后加入到玻璃板间，最上层用1mL的无水乙醇密封，注意使液面平整，室温下作用30-45min；
(3)聚丙烯酞胺凝胶浓缩胶的制备：制备2ml的5％积层胶混合液；将将分离胶上的水倒去并吸干加入上述混合液，将梳子插入玻璃板间，，室温下聚丙烯酞胺凝胶积层胶聚合需15-30min；
(4)样品处理与上样：将上述各试验中准备的样品溶液加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃水浴中裂解10mim，室温下12000r/min离心1-2min，取上清液10μL进行SDS电泳分析；
(5)电泳：加入TriS-甘氨酸电泳缓冲液，浓缩胶电压80v，分离胶电压，120v，4-8℃下电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止；
(6)染色与脱色：将电泳聚丙烯酞胺凝胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温下染色20-30min，然后放入脱色液中脱色至蛋白条带清晰；
(7)凝胶摄像和保存：用凝胶成像系统将脱色好的聚丙烯酸胺凝胶摄像保存。
1.3.4蛋白浓度的测定和Westernblot鉴定
根据Easy II Protein Quantitative Kit(BCA)试剂盒说明书，根据酶标仪读数，计算待测蛋白浓度。
以临床鸡MS阳性血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡IgG为二抗，进行Westernblot分析。参照朱立平等主编《免疫学常用实验方法》试验方法，具体操作如下：
(1)蛋白质样品制备综合上述表达结果，制备蛋白样品溶液作免疫印迹分析；
(2)SDS-PAGE电泳制备凝胶板。进行电泳；
(3)转移电泳：待电泳结束后取出凝胶，使用PBST将凝胶冲洗3次。预先将2张裁剪好的Bio-Rad Mini Trans-Blot Filter Paper及1张与凝胶大小相近的硝酸纤维膜(NC膜)一同浸入转膜缓冲液中作用10min，按照阴极板紧挨海绵垫、滤纸、分离胶、NC膜、滤纸、海绵垫的顺序装配。注满转移缓冲液，稳流100mA，电泳2-3h；
(4)封闭：电泳结束后拆开装置取出NC膜，使用PBST漂洗数次，加入适当体积5％脱脂乳室温封闭4-6h；
(5)一抗作用：倒掉封闭液，加入1×TBST漂洗液轻轻洗涤3次，每次5min，倒掉漂洗液，加入1:1000稀释后的MS阳性血清至完全覆盖，旋转摇动器轻轻摇动作用2-3h；
(6)二抗作用：洗涤NC膜并加入1:3000稀释后的HRP标记的羊抗鸡IgG，室温孵育2h。孵育结束后，洗涤NC膜。
(7)显色：使用现配制的ECL显色液显色
NC膜摄像和保存：用凝胶成像系统将显色好的的膜摄像保存
2动物实验
2.1制备感染菌液
对实验室分离鉴定冻存的MS-NP株进行复壮，采用液体培养基进行扩大培养，置于37℃培养箱培养，待其培养基pH值下降颜色由红变黄后，进行CCU测定，将其稀释至109CCU/mL后备用。
2.2雏鸡免疫程序
从圣农发展有限公司购入1日龄SPF雏鸡56只，饲养一周后随机抽取7只小鸡静脉血作为前期阴性对照。所有小鸡随机分为7个组，每组8只。设置空白对照组Ba、攻毒组Bb、商品化疫苗组Bc；根据免疫途径的差异设置为皮下注射组Aa、点眼滴鼻组Ab、肌肉注射组Ac、佐剂注射对照组Ad组。免疫方式为：在7日龄时将纯化的MS-eLPD重组蛋白溶液与弗氏完全佐剂按体积比1:1乳化(MS-eLPD重组蛋白终溶度1mg/mL)，按照下表免疫程序进行免疫。14日龄每组随机抽取3只小鸡的翅静脉血，并分离血清。21日龄时先对各组小鸡抽取静脉血后再以与一免相同的剂量加强免疫1次。28日龄每组随机抽取3只小鸡的翅静脉血，并分离血清。在31日龄进行攻毒，除Ba组外其余6个组的小鸡都采用滴鼻方式进行MS-NP菌液攻毒，用1ml无针头注射器每只小鸡的鼻腔滴注0.2×109CCU/mL的MS-NP菌液。攻毒后观察鸡群的发病、死亡情况，统计其死亡率，连续观察10d。38日龄每组随机抽取3只小鸡的翅静脉血，并分离血清。在41日龄将鸡只体重检测后进行安乐死，观察不同试验组鸡只的喉气管、肺和气囊等组织的病理变化情况，并做好记录最终参照文献进行病变等级评分。剖检采集气管、脾脏等样品进行进一步检测分析。
2.4临床症状观察
每日观察各组鸡只的临床症状，并对发病时间和临床症状特征进行详细记录。
2.5组织病理学检查
进行气管、脾脏组织病理变化观察，病理组织切片的制备过程如下：
采集试验动物的气管、脾脏置中性甲醛中(终浓度4％甲酸PBS溶液)，室温下固定24h后修块，将组织块修成0.5×0.5×0.5cm3大小，再置新鲜甲醛溶液中室温下固定24h。流水连续冲洗固定好的组织样品24h，洗去固定液；采用乙醇梯度升级脱水法进行脱水。梯度酒精脱水：75％，1.5h；85％，1h；95％，1h；100％，1h。二甲苯透明：二甲苯(Ⅰ)15min，二甲苯(Ⅱ)10min。将组织包埋蜡中，将透明好的组织放入融化好的蜡(Ⅰ)中浸蜡1h；再转入蜡(Ⅱ)中，再浸1h。待蜡块固定完成后修整到比组织块略大，然后切片，厚度一般为4～5μm。
切片染色：38～42℃的水温延展切片，后置于载玻片，标记，烘干。二甲苯脱蜡：二甲苯(Ⅰ)5-10min，二甲苯(Ⅱ)5-10min。梯度酒精复水：100％酒精5min；95％酒精3min；85％酒精3min；75％酒精2min；去离子水2min。染色：苏木精2min；1％的伊红乙醇1min。再重复一次梯度酒精脱水、二甲苯透明。中性树胶封片。显微镜下观察、拍照。
2.6血清抗体的ELISA检测
用原核表达的纯化抗原MS-eLPD(0.2μg/mL)包被ELISA板，100μL/孔；前期建立的间接ELISA方法检测抗体。其具体步骤如下：将采集的各时间点的鸡血清(7d，14d，21d，28d，38d)参照2.6的检测结果进行稀释。在同一块酶标板上将各组稀释好的血清样品加入酶标孔，每个样品重复3个孔，同时设立阴性血清对照和阳性血清对照。以各组相应的OD450nm值作为抗体水平参照值。
2.8实验动物MS重新分离鉴定
无菌采集实验动物的喉拭子进行鸡毒支原体的重新分离鉴定。
3结果
3.1蛋白质结构预测
采用Expasy在线预测网站进行分析，排除螺旋及折叠等不易形成表位的区域，二级结果预测结果如图1A所示，三级结构如图1B所示。
3.2重组质粒的双酶切鉴定结果
通过T4 DNA连接酶将目的基因和pET-32a(+)质粒进行连接后，将连接产物转化至DH5α克隆菌株。如图2，克隆菌株质粒经双酶切验证可见清晰的两条目的条带，证明重组质粒构建成功，将重组质粒命名为pET-32a(+)-MS-eLPD。双酶切验证正确的重组质粒送至福建生工有限公司进行测序，测序结果正确。
3.3原核表达及SDS-PAGE分析结果
结果显示重组质粒未诱导组(lane 1)未见明显的目的条带；重组质粒诱导组经超声后上清可见明显的约54KD(lane 2)大小的特异性条带，超声后上清(lane 3)可见明显条带；沉淀可见少量的蛋白(lane 4)。结果显示重组质粒pET-32a(+)-MS-eLPD经IPTG诱导后可表达约54KD大小的MS-eLPD融合蛋白，并且MS-eLPD融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在(图3)。将目的蛋白用镍亲和层析柱纯化后进行SDS-PAGE鉴定，结果显示100mM咪唑洗脱液可洗脱目的蛋白。纯化的目的蛋白浓缩，经测定OD562nm值为3.568，计算可知其浓度为49.14μg/ml。
3.4Western blot鉴定目的蛋白
纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，以临床鸡阳性血清作为一抗进行Westernblot检测。结果显示(图4)，目的蛋白在Western blot方法中与血清抗体具有良好的反应原性。
3.5免疫攻毒保护效果分析
3.5.1安全性评价
经MS-eLPD+佐剂免疫的雏鸡24h内均未见明显的应激反应和接种部位的不适反应，饮食饮水都表现正常，免疫两周后剖检在免疫接种部位以及全身都未发现有肿瘤等情况，说明本实验制备的重组蛋白MS-eLPD对鸡无明显的刺激性，接种部位和全身都无不适，安全性良好。
3.5.2雏鸡临床症状与病理变化整个试验期内，对照组鸡临床症状和生长发育表现没有异常变化。试验组鸡与对照组鸡相比较体积偏小。随着感染时间的推移，感染组鸡羽毛蓬乱无光泽，精神沉郁，采食量减少，部分鸡只出现轻微的呼吸道症状。剖检发现(图5)，空白对照组无异常变化。试验组少数鸡只轻度的胸骨囊肿现象，解剖后存在少量的液体；试验组不同组别存在不同数量的鸡出现了严重的气囊炎，出现滤泡增多。根据参考文献[90]以气囊炎严重程度对胸气囊或腹气囊进行评分：0为未发现肉眼可见气囊损伤；1为可见淋巴滤泡病变或气囊轻度浑浊；2为气囊轻度增厚，通常有小的干酪样渗出物聚集；3为气囊明显增厚，透明度下降，有单一气囊具有大量干酪样渗出物。各组评分如下表所示。
组别 病变数量 评分
Aa组 2/8 1
Ab组 1/8 1
Ac组 0/8 1
Ad组 4/8 2
Ba组 0/8 0
Bb组 5/8 1-2
Bc组 2/8 1
3.5.3病理切片分析
从三个组别中随机抽取切片观察(n＝3)，A组为PBS对照组(仅Ba组)，B组为免疫组(Aa组、Ab组、Ac组、Bc组)，C组为攻菌组(Ad组、Bb组)。
如图6所示，A组气管基本结构清晰、完整；B组气管黏膜上皮细胞逐渐变为柱状，少量淋巴细胞浸润部分脱落；C组气管上皮表面的纤毛排列紊乱，大量脱落；黏膜层有大量不规则黏液腺形成，以及大量淋巴细胞浸润、间隙增宽。
如图7所示，对照组(A组)雏鸡脾脏无明显的病理组织学变化，B组雏鸡脾脏淋巴细胞数量增加、少量淋巴细胞浸润，间隙增宽；C组雏鸡脾脏淋巴细胞有核碎裂、核溶解等坏死现象；细胞结构模糊，红髓与白髓界限不清，淋巴细胞中有部分细胞核消失，呈弥漫性坏死。
3.5.4 ELISA检测抗体水平
将采集的各时间点的鸡血清(7d，14d，21d，28d，38d)，用建立好的间接ELISA方法进行鸡血清的抗体滴度检测，观察不同免疫组鸡血清抗体水平的变化趋势。以纯化后的MS-eLPD蛋白为抗原，包被蛋白浓度0.5μg/mL，每孔100μL，包被96孔ELISA板。待测阳性血清和待测阴性血清稀释为1:100，经过孵育一抗(30min)、二抗(60min)，计算阳性血清与阴性血清读数3次测量的平均值，并计算阳性血清与阴性血清的比值(P/N值)。
结果如下表所示，空白组(Ba组)抗体水平一直很低，低于阴阳性临界值(阈值为0.2785)。商业灭活疫苗免疫组(Bc组)在第1次免疫后，抗体水平低于阴阳临界值，在第2次免疫后抗体滴度有了显著的改变(p＜0.001)，在攻菌后血清抗体水平迅速上升，远大于阴阳性临界值。免疫组(Aa组、Ab组)在第1次免疫后抗体水平逐步上升，并高于阴阳性临界值；第2次免疫后，抗体水平继续上升，在攻菌后抗体水平小幅度的上升后保持大致稳定，Aa组最终的抗体水平明显高于Bc组，Ab组最终的抗体水平与Bc组差异不显著。Ac组在初免后抗体水平保持较低的水平，在第二次免疫后有明显的上升并高于阴阳临界值，在攻菌后抗体水平又产生了小幅度的增长，但低于Bc组。同时，佐剂对照组(Ad组)与攻菌组(Bb组)在攻菌前的抗体水平一直很低，低于阴阳性临界值，在攻菌(31d)后抗体水平有了显著变化，并高于阴阳临界值。

Claims (7)

1.一种鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：其出发载体为pET-32a(+)。
5.含有权利要求2所述重组表达载体的重组表达菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达菌，其特征在于：其出发菌株为大肠杆菌。
7.权利要求1所述的鸡滑液囊支原体多抗原表位蛋白在制备鸡滑液囊支原体基因工程疫苗中的应用。
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