CN116754759B

CN116754759B - 一种用于检测抗染色质抗体的elisa试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN116754759B
Application number: CN202310049931.XA
Authority: CN
Inventors: 王楷文; 赵江峰; 曹励欧; 叶霜
Original assignee: Renji Hospital
Current assignee: Renji Hospital
Priority date: 2023-02-01
Filing date: 2023-02-01
Publication date: 2026-02-13
Anticipated expiration: 2043-02-01
Also published as: CN116754759A

Abstract

本发明公开了一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒。所述试剂盒内含有纯化后的天然结构的剥离H1组蛋白成分的染色质单体。本发明还公开了一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒的检测方法。本发明的有益效果在于：在真核生物细胞核中，染色质结构复杂，是由40％的DNA、40％的组蛋白、20％非组蛋白、少量RNA和其他大分子构成的天然复合物，纯化技术要求高，购买成品化的天然纯化染色质单体价格更是昂贵。本申请针对天然染色质的结构，纯化出剥离H1组蛋白成分的染色质单体，既保留了其有效的抗原成分，也大大的缩减了成本。本发明的试剂盒，能用于抗染色质抗体检测，弥补了国内抗染色质抗体检测方法的空白，具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简便的特点。

Description

一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于抗体检测领域，具体涉及一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒及其检测方法。

背景技术

系统性红斑狼疮是一种自身免疫机制介导，以血清中出现多种自身抗体、多器官，以及多系统受累为主要特征的一种弥漫性结缔组织病，临床表现复杂多样，病程迁延反复，大多数患者在起病的初期会出现发热、乏力之类的表现，同时蝶形红斑在系统性红斑狼疮的患者中也往往比较常见。肾脏、神经系统、血液系统、肺、消化系统在系统性红斑狼疮的患者中，也可以出现累及，对于系统性红斑狼疮的患者一旦确诊，要长期使用糖皮质激素的治疗，并且还需要根据患者的病情，来选择一些免疫抑制剂的治疗。

抗染色质抗体在系统性红斑狼疮发病机制中的发挥着关键的作用。抗染色质抗体协同抗ds-DNA抗体，为诊断SLE的标志性抗体。不仅该抗体水平与SLE的病情严重程度高度正相关，且与狼疮肾炎的发生率相关。动态观察血清中该抗体水平有助于预测病情演变、指导临床治疗。

传统的染色质提取方法为从小牛胸腺细胞核中分离染色质，这样所得到的抗原成分相对较杂，难以作为特异性较高的抗原来源。且目前国内市场上还未出现市场化的抗染色质抗体检测试剂盒。进口同类产品(美国伯乐公司ANA谱筛查试剂盒)的表现与系统性红斑狼疮的相关性较差。因此，鉴于检测抗染色质抗体的重要性，开发一种可以广泛应用，高效、灵敏及特异的抗染色质抗体检测试剂盒以及相应的检测方法，对于预测病情演变、指导临床治疗就显得尤为紧要。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供了一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒。

为了实现本发明的目的，所采用技术方案是：

一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒内含有纯化后的剥离H1组蛋白成分的染色质单体；

所述剥离H1组蛋白成分的染色质单体来自如下方法：

步骤一，制备细胞核；

采集外周静脉血，加入ACD进行抗凝；

后将抗凝后的血液进行红细胞裂解至红细胞完全溶解取白色沉淀物；

在所述白色沉淀物当中加入缓冲液后混匀后采用蛋白酶K100和20％SDS水浴提取得纯核产物；

步骤二，提取染色质：

将所述纯核产物悬浮于的pH7.6的Tris-HCl缓冲液中并采用匀浆器中匀浆，离心，弃上清，所得沉淀为粗染色质；

将所述粗染色质悬浮于pH7.6的脲素和PBS的混合溶液当中混匀，离心后弃上清，将沉淀洗涤后二次离心弃上清，保留沉淀；

在所述沉淀当中加入6.5％乙醇溶液洗涤后，离心后弃上清，所述洗涤为若干次以去除脲盐后得到染色质单体；

H1蛋白去除：

天然染色质用微球菌核酸酶消化后，悬浮于pH4.5的NH4Ac-HAc缓冲液中，进行分次提取；

将分次提取的产物分别离心沉淀后收集得到所述纯化后的剥离H1组蛋白成分的染色质单体。

在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒内设有抗染色质抗体检测板条，该检测板条为包被所述剥离H1组蛋白成分的染色质单体的96孔酶标板。

在本发明的一个优选实施例中，所述试剂盒内还设有阴性对照血清、阳性对照血清、血清稀释液、酶标二抗、洗涤液、底物显色液、终止液。

在本发明的一个优选实施例中，所述的阴性对照血清为SLE患者免疫法检测抗染色质抗体阴性血清，所述的阳性对照血清为SLE患者免疫沉淀法检测抗染色质抗体阳性血清，所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG；

所述洗涤液为PBST；

所述底物显色液为3,3'5,5'-四甲基联苯胺。

所述终止液为0.5％H₂SO₄溶液。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

1)剥离H1组蛋白成分的染色质单体包被96孔板，4度过夜；

包被结束后洗涤弃去包被液，用PBST进行洗涤，重复3-5次；

2)加入5％BSA，400ul/孔BSA常温温育2h后用PBST进行洗涤，重复3-5次；

3)加入标准品(已知阳性血清)和待测血清，每孔100ul，常温温育1h；

4)标准品稀释及空白对照：1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560，空白：100ul PBS，待测血清1：100稀释，分别加入100ul；

5)用PBST进行洗涤，重复3-5次；

6)加酶标二抗1：2000(羊抗人.HRP)，常温温育30分钟，用PBST进行洗涤，重复3-5次；

7)加底物液显色15min；

8)终止反应，450/630nm酶标仪读数。

在本发明的一个优选实施例中，步骤(1)中，所述剥离H1组蛋白成分的染色质单体浓度为0.5ug/ml，每个反应孔中加100ul。

本发明具有如下几点主要创新点：

天然结构的染色质结构复杂，技术要求高，购买纯化染色质价格更是昂贵。本发明则通过剥离H1组蛋白成分的染色质单体，不仅提升了其诊断的特异性，且大大的缩减了成本。

本发明的试剂盒，能用于抗染色质抗体检测，弥补了国内抗染色质抗体检测方法的空白，具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简便的特点，易于推广和应用。

附图说明

图1为天然染色质结构图；

图2为剥离H1组蛋白成分的染色质单体结构示意图；

图3为粗染色质单体与纯化后(去H1染色质单体)示意图；

图4为剥离H1组蛋白成分的染色质单体的诊断效能结构示意图；

图5为抗染色质抗体与系统性红斑狼疮疾病活动度的相关性结构示意图；

图6为抗染色质抗体与狼疮肾炎的相关性结构示意图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。

实施例1

1.染色质是细胞核内能被碱性染料染色的物质，它与染色体是在细胞周期不同阶段相互转变的形态结构。染色质指间期细胞内由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成的线性复合结构，是间期细胞遗传物质的存在形式。天然染色质结构非常复杂，包含成分多，在染色质的主要成分中，DNA和组蛋白是稳定存在的，DNA与组蛋白之比约为1：1。但与疾病相关，可作为ELISA平台检测的，具有抗原功能的染色质是H1剥离染色质单体。

2.通过提取分离真核细胞核内的染色质，进行纯化，包括如下步骤：

制备细胞核；

采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD(柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm2灭菌30min)抗凝；

将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内，加30ml红细胞裂解液，主要成分为0.32mol/L蔗糖、10mmol/lTris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl2、1％Triton–X 100，轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解；

冰浴10min，离心，3000rpm，10min。弃上清，红细胞裂解液重复处理1～3次；

弃上清，白色沉淀物加10ml缓冲液[0.1mol/L NaCl、10mmol/lTris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混匀，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20％SDS30μl，摇匀，置37℃水浴15～20h。

提取染色质

将纯核悬浮于4℃10mmol/L Tris-HCl pH7.6缓冲液中，玻璃匀浆器中匀浆，2h后于1,800g×15min，4℃，离心。弃上清，沉淀为粗染色质；

沉淀悬浮于10ml冷的8mol/L脲素10.05mol/L PBS pH7.6溶液中，混匀，18,000g×15min，4℃，离心。弃上清，沉淀洗涤，离心后弃上清，保留沉淀；

沉淀加入20ml冷的6.5％乙醇溶液，于1,500g×15min，4℃，离心。弃上清，沉淀按类似方法洗涤5次，以去除脲盐。这样可得到纯天然染色质单体。

H1蛋白去除：

天然染色质用微球菌核酸酶消化后，悬浮于0.005mol/L NH4Ac-HAc pH4.5缓冲液中，进行分次提取。每次提取时，用25ml NH4Ac/HAch缓冲液，在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆5-6次，移入100ml锥形瓶中，在4℃冷室内电磁搅拌提取4h，1,500g×15min，4℃，离心。沉淀再提取，最后收集。得到大量纯化后的去除H1的染色质单体。

3.以其作为抗原进行ELISA试验，包括如下步骤：

3.1抗原浓度为0.5ug/ml去除H1的染色质单体55ul包被96孔板，每个反应孔中加100ul，4度过夜；

3.2洗涤：包被结束后弃去包被液，用PBST进行洗涤，重复3-5次；

3.3封闭：5％BSA，400ul/孔，常温下温育2h后洗涤，同3.2；

3.4加入标准品和待测血清，每孔100ul，常温下温育1h；

3.5稀释标准品(已知阳性血清)：

标准品稀释：空白，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560；

空白：100ul PBS，待测血清1：100稀释，分别加入100ul；

3.6洗涤，同3.2；

3.7加二抗1：2000(羊抗人.HRP)，常温下温育30分钟，洗涤，同3.2；

3.8加底物液显色15min；

3.9终止反应，450/630nm酶标仪读数。

4.实验数据：

4.1抗染色质抗体检测在各组人群中的的表达，与进口试剂检测相比较，可看出本发明中的去除H1蛋白的染色质在SLE中的敏感性明显提升，且在其他结缔组织病中的阳性率显著降低。参见表1。

表1抗染色质抗体在各类结缔组织病的表达如下表1所示：

4.2本发明中抗染色质抗体检测数值与进口同类产品检测数值在SLE患者中的诊断效能。结果发现，141例非系统性红斑狼疮的结缔组织病患者及119例系统性红斑狼疮患者血清中抗染色质抗体检测数值对于系统性红斑狼疮患者的诊断效能，本发明(黑色)中的AUC面积为0.8197，而进口同类产品(绿色)检测数值仅为0.6718，本发明的检测特异性明显增高，具体参见图3。

4.3本发明中抗染色质抗体检测数值与进口同类产品检测数值与系统性红斑狼疮疾病活动度的相关性。119例系统性红斑狼疮患者做SLEDAI评分，分析其与抗染色质抗体表达量的相关性，进口产品检测数值显示两者无明显的相关关系，而本发明中的抗染色质检测数值与SLEDAI评分呈现正相关，具体参见图4。

4.4比较两种方法的抗染色质抗体检测数值在119例系统性红斑狼疮是否合并狼疮肾炎的比较，结果显示，本发明中的抗染色质抗体检测数值，在系统性红斑狼疮患者合并狼疮肾炎中的数值明显增高，具体参见图5。

Claims

1.一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内含有纯化后的剥离H1组蛋白成分的染色质单体；

所述剥离H1组蛋白成分的染色质单体来自如下方法：

步骤一，制备细胞核；

采集外周静脉血，加入ACD进行抗凝；

在所述白色沉淀物当中加入缓冲液后混匀后采用蛋白酶K100μl和20%SDS水浴提取得纯核产物；

步骤二，提取染色质：

将所述纯核产物悬浮于pH7.6的Tris-HCl缓冲液中并采用匀浆器匀浆，离心，弃上清，所得沉淀为粗染色质；

在所述沉淀当中加入6.5%乙醇溶液洗涤后，离心后弃上清，所述洗涤为若干次以去除脲盐后得到染色质单体；

步骤三，H1蛋白去除：

天然染色质用微球菌核酸酶消化后，悬浮于0.005mol/L NH4Ac-HAc pH4.5缓冲液中，进行分次提取；

2.如权利要求1所述的一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内设有抗染色质抗体检测板条，该检测板条为包被所述剥离H1组蛋白成分的染色质单体的96孔酶标板。

3.如权利要求1所述的一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内还设有阴性对照血清、阳性对照血清、血清稀释液、酶标二抗、洗涤液、底物显色液、终止液。

4.如权利要求3所述的一种用于检测抗染色质抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照血清为SLE患者免疫法检测抗染色质抗体阴性血清，所述的阳性对照血清为SLE患者免疫沉淀法检测抗染色质抗体阳性血清，所述的酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG；

所述洗涤液为PBST；

所述底物显色液为3,3'5,5'-四甲基联苯胺；

所述终止液为0.5%H₂SO₄溶液。