CN116802495A

CN116802495A - 可溶性gpc3的免疫分析中的含可溶性gpc3检体的处理方法

Info

Publication number: CN116802495A
Application number: CN202280010240.2A
Authority: CN
Inventors: 西井友教; 佐藤惠莉子; 饭田久美子; 八木慎太郎; 青柳克己
Original assignee: Fujirebio Inc
Current assignee: Fujirebio Inc
Priority date: 2021-01-18
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2023-09-22
Also published as: WO2022154119A1; EP4279504A4; EP4279504A1; US20240094210A1; JPWO2022154119A1; JP7843250B2

Abstract

本发明提供对可溶性GPC3的检查有用的方法及试剂。更具体而言，本发明提供下述(1)、(2)和(3)的发明。(1)一种可溶性GPC3的免疫分析中的检体的处理方法，其包含将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合。(2)一种可溶性GPC3的免疫分析方法，其包含下述(a)和(b)：(a)将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合；(b)使用针对可溶性GPC3的1种以上的抗体对(a)中得到的混合液中的可溶性GPC3量进行测定。(3)一种可溶性GPC3的免疫分析试剂，其包含下述(a)和(b)：(a)还原剂；(b)针对可溶性GPC3的1种以上的抗体。

Description

可溶性GPC3的免疫分析中的含可溶性GPC3检体的处理方法

技术领域

本发明涉及可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC3)的免疫分析中的含可溶性GPC3检体的处理方法等。

背景技术

GPC3是经由存在于其C末端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜结合的、属于具有硫酸乙酰肝素链的蛋白聚糖即磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族并且具有约65kDa的分子量的蛋白质。GPC3通过在高尔基体中被称为弗林(Furin)的酶在358位的精氨酸残基与359位的丝氨酸残基之间切断而生成N末端片段(约40kDa)和含GPI锚的C末端片段(约30kDa)。但是，确认了这样的2个片段通常通过二硫键连接。因此，认为GPC3在包含通过二硫键连接的2个片段的全长型蛋白质的形态下，经由GPI锚与细胞膜结合。

此外，由于GPC3是在肝癌等癌中确认到特异性表达的蛋白质，因此正在摸索开发对以GPC3为靶标的癌患者的检查有用的方法。例如，在专利文献1中，提出了基于可溶性GPC3的测定的癌患者的检查方法。此外，在专利文献2中，提出了使用与存在于GPC3的N末端区域的不同表位结合的不同的2个抗体的GPC3的测定方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2004/038420号

专利文献2：国际公开第2015/097928号

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的技术问题在于提供一种对可溶性GPC3的检查有用的方法及试剂。

解决技术问题的技术手段

本发明人等进行了深入研究，结果发现，在可溶性GPC3的免疫分析中，通过用还原剂处理检体，能够提高阳性检体与阴性检体的判别精度。本发明人等还发现，在可溶性GPC3的免疫分析中，通过用还原剂和表面活性剂这两者处理检体，能够提高阳性检体与阴性检体的判别精度，并且能够降低基质效应(matrix effect)，从而完成了本发明。

即，本发明如下所示。

〔1〕一种可溶性GPC3的免疫分析中的含可溶性GPC3检体的处理方法，其包含：将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合。

〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，还原剂以0.05～1000mM的终浓度使用。

〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其包含：进一步将含可溶性GPC3检体与表面活性剂进行混合。

〔4〕根据〔3〕所述的方法，其中，表面活性剂以0.005～10重量％的终浓度使用。

〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，免疫分析是使用针对可溶性GPC3中2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体的夹心免疫分析。

〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，含可溶性GPC3检体为血液检体。

〔7〕根据〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法，其中，含可溶性GPC3检体从患癌的被检体得到。

〔8〕根据〔7〕所述的方法，其中，癌为肝癌。

〔9〕一种可溶性GPC3的免疫分析方法，其包含下述(a)和(b)：

(a)将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合；

(b)使用针对可溶性GPC3的1种以上的抗体对(a)中得到的混合液中的可溶性GPC3量进行测定。

〔10〕根据〔9〕所述的方法，其包含：进一步将含可溶性GPC3检体与表面活性剂进行混合。

〔11〕根据〔9〕或〔10〕所述的方法，其中，通过使用针对可溶性GP C3中2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体的夹心免疫分析来进行测定。

〔12〕一种可溶性GPC3的免疫分析试剂，其包含下述(a)和(b)：

(a)还原剂；

(b)针对可溶性GPC3的1种以上的抗体。

〔13〕根据〔12〕所述的免疫分析试剂，其进一步包含：(c)表面活性剂。

〔14〕根据〔12〕或〔13〕所述的免疫分析试剂，其中，针对可溶性GP C3的1种以上的抗体为针对可溶性GPC3中2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体，并且所述免疫分析试剂用于夹心免疫分析。

〔15〕根据〔12〕～〔14〕中任一项所述的免疫分析试剂，其中，所述试剂用于癌的诊断。

发明效果

根据本发明，在可溶性GPC3的免疫分析中，能够提高阳性检体与阴性检体的判别精度。因此，本发明在可溶性GPC3的免疫分析中，对于实现针对特定状态(例如癌等疾病)的高诊断灵敏度是有用的。

附图说明

[图1]图1是表示基于蛋白质印迹(WB)的抗原蛋白质中的抗体A和抗体B的识别位点的解析的图。作为抗原蛋白质，使用包含人GPC3的第1～559位氨基酸残基的重组人GPC3(rhGPC3)和GPC3高表达的人肝癌细胞HepG2的培养上清液。泳道中添加的蛋白质的量分别为1.4ng/泳道和7.2ng/泳道。

具体实施方式

本发明提供可溶性GPC3的免疫分析中的检体的处理方法。

本发明中，可溶性GPC3是指由GPC3表达细胞分泌的可溶性GPC3。作为可溶性GPC3，可以利用源自任意的被检体的可溶性GPC3。作为这样的被检体，例如可举出哺乳动物(例如人、猴子等灵长类；小鼠、大鼠、兔子等啮齿类；牛、猪、山羊、马、绵羊等有蹄类；狗、猫等食肉类)、鸟类(例如鸡)。优选被检体为人等哺乳动物。GPC3在动物中广泛保守，特别是在哺乳动物间其氨基酸序列高度保守。从临床应用的观点出发，被检体优选为人。因此，可溶性GPC3优选为人可溶性GPC3。

优选的是，人可溶性GPC3为通过包含580个氨基酸残基的人GPC3蛋白(登录号：P51654.1)中的358位的精氨酸残基与359位的丝氨酸残基之间的切断而生成的N末端片段、或通过存在于人GPC3蛋白的C末端的GPI锚的切断而游离的可溶性全长型GPC3。作为可溶性全长型GPC3，例如可举出通过人GPC3蛋白中的358位的精氨酸残基与359位的丝氨酸残基之间的切断而生成的N末端片段与C末端片段经由二硫键彼此连接而成的GPC3片段。更具体而言，这样的人可溶性GPC3是：(a)包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列中的1～358位的氨基酸残基的N末端片段或其变体；(b)包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列中的1～358位的氨基酸残基的N末端片段或其变体与包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列中的359～560位的氨基酸残基的可溶性C末端片段或其变体通过二硫键连接而成的可溶性全长型GPC3；或者(c)在人种间和/或个人间可天然产生的它们的突变体。这样的突变体是针对(a)N末端片段或其变体、或(b)可溶性全长型GPC3或其变体导入了在人种间和/或个人间可天然产生的1个以上的氨基酸残基的突变(例如替换、插入、缺失)的突变体。这样的突变体中的氨基酸残基的突变的个数例如可以为1～30个，优选为1～20个，更优选为1～15个，更进一步优选为1～10个，特别优选为1个、2个、3个、4个或5个。

本发明中，免疫分析是指使用针对可溶性GPC3的1种以上的抗体的可溶性GPC3的免疫分析。作为抗体，例如可举出多克隆抗体和单克隆抗体。优选抗体为单克隆抗体。抗体还可以通过同种型(isotype)来确定。作为这样的同种型，例如可举出IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和IgY。优选抗体为IgG、I gM或IgA，更优选为IgG或IgM，更进一步优选为IgG。抗体还可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。此外，抗体也可以是包含分别包含可变区域和恒定区域的重链和轻链的全长抗体或其片段。作为抗体片段，例如可举出F(a b’)₂、Fab’、Fab和Fv。此外，抗体也可以是单链抗体(scFv)、VHH抗体。

本发明中使用的针对可溶性GPC3的抗体只要为1种以上就没有特别限定，可以为1种、2种、3种、4种或5种。在本发明中使用针对可溶性GPC 3的2种以上的抗体的情况下，这样的2种以上的抗体能够识别相同或不同的表位。优选这样的2种以上的抗体可以识别不同的表位。作为在可溶性GPC 3的免疫分析中可利用的表位(例如，在夹心分析中可利用的2种以上的不同表位)、以及针对该表位的抗体，已知有各种表位和抗体(例如，参照国际公开第2015/097928号、国际公开第2004/038420号、国际公开第2004/022739号)，因此，在本发明中，也可以使用这样的已知的表位以及针对该表位的抗体。此外，针对可溶性GPC3的抗体是市售的，因此在本发明中也可以使用市售抗体。从简便的免疫分析等观点出发，优选使用针对可溶性GPC3的1种或2种抗体。本发明中使用的针对可溶性GPC3的抗体优选为具有与GPC3的N末端片段中的区域结合的能力的抗体，更优选为具有与GPC3的N末端片段中的区域特异性结合的能力的抗体。

免疫分析可以通过使用针对可溶性GPC3的1种以上的抗体的任意的免疫分析来进行。作为这样的免疫分析，例如可举出化学发光免疫分析(CLIA)〔例如化学发光酶免疫测定法(CLEIA)〕、免疫比浊法(TIA)、酶免疫测定法(E IA)(例如直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA)、放射免疫分析(RIA)、胶乳凝集反应法、荧光免疫分析(FIA)和免疫层析法、蛋白质印迹、免疫染色。

免疫分析还可以通过使用包含针对可溶性GPC3的标记抗体和固相抗体的、针对可溶性GPC3的2种以上的抗体的任意的免疫分析来进行。标记抗体是用标记物质进行了标记的抗体或在免疫分析的步骤中用标记物质标记的抗体。作为标记物质，例如可举出荧光物质、发光物质、色素和酶。固相抗体是固定于固相的抗体或在免疫分析的步骤中固定于固相的抗体。作为固相，例如可举出粒子(例如，微粒、纳米粒子、微珠、纳米珠、微球、纳米球)、支撑体(例如，膜)和基板(例如，板)。固相也可以是具有磁性的固相(例如磁性粒子)。

免疫分析还可以以任意的方式进行。作为这样的方式，例如可举出直接法、间接法、竞争法和夹心法。优选的是，免疫分析可以通过使用针对可溶性GPC3的2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体的夹心免疫分析来进行。在这样的夹心免疫分析中，作为针对可溶性GPC3的2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体，使用包含针对可溶性GPC3的标记抗体和固相抗体的2种以上的抗体。从简便的免疫分析等观点出发，免疫分析可以通过使用针对可溶性GPC3中不同的2种表位的2种抗体(标记抗体和固相抗体)的夹心免疫分析来进行。针对可溶性GPC3的不同的2种表位的2种抗体(标记抗体和固相抗体)可以是针对N末端片段不同的表位的2种抗体，也可以是针对C末端片段不同的表位的2种抗体。或者，这样的2种抗体也可以是针对N末端片段的表位的1种抗体与针对C末端片段的表位的1种抗体的组合。优选这样的2种抗体是针对N末端片段不同的表位的2种抗体。

本发明的含可溶性GPC3检体的处理方法包含将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合。由此，生成含可溶性GPC3检体及还原剂的混合液。

含可溶性GPC3检体是含所述可溶性GPC3的任意的检体。作为含可溶性GPC3检体，例如可举出：从被检体得到的液体检体(例如血液、淋巴液、尿、乳汁、唾液、泪液)、从被检体得到的组织的提取液检体、能够从被检体回收的清洗液检体(例如清洗支气管等粘膜组织而得到的物质)、从源自被检体的细胞培养物得到的检体、以及包含重组可溶性GPC3的检体(例如可溶性G PC3标准品)、以及对这些检体进行处理(例如分级)而得到的液体检体。从简便地获得富含可溶性GPC3的检体等观点出发，含可溶性GPC3检体优选为血液检体(例如全血、血清、血浆)。

在特定的实施方式中，含可溶性GPC3检体也可以是从处于特定状态的被检体得到的检体。作为这样的被检体，例如可举出患有特定疾病的被检体、以及有可能患有特定疾病的被检体。作为特定疾病，例如可举出癌(例如肝癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤)、肝脏疾病(例如肝炎、肝硬化)(例如参照国际公开第2004/038420号；国际公开第2007/081790号；国际公开第2005/039380；D etection of glypican-3-specific CTLs in chronichepatitis and liver cirrhosis，Oncology Reports 22，p.149-54,2009)。

在将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合的情况下，可以使用任意的还原剂。作为这样的还原剂，例如可举出2-(二甲氨基)乙硫醇(DEAET)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、2-巯基乙胺、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、硫代甘油、亚硫酸钠、以及硼氢化物、以及它们的盐。作为盐，例如可举出金属盐(例如钠盐、钾盐等一价金属盐、以及钙盐、镁盐等二价金属盐)、无机盐(例如氟化物、氯化物、溴化物、碘化物等卤化物盐、以及铵盐)、有机盐(例如被烷基取代的铵盐)、以及酸加成盐(例如与硫酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐、以及与乙酸、草酸、乳酸、柠檬酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸等有机酸的盐)。从使用在溶液中高度稳定的还原剂等观点出发，优选DEAET或TCEP或它们的盐。

还原剂可以以能够降低源自阴性检体的检测信号强度(例如计数)的终浓度使用。终浓度是指混合时的浓度。因此，终浓度也可以表现为通过混合而生成的混合液中的浓度。这样的终浓度例如为0.05～1000mM，优选为0.5～500mM，更优选为1～300mM，更进一步优选为3～200mM。

在含可溶性GPC3检体及还原剂的混合中，也可以包含进一步将含可溶性GPC3检体与表面活性剂进行混合。在这样的情况下，生成含可溶性GPC3检体、还原剂以及表面活性剂的混合液。

作为表面活性剂，例如可举出非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂、以及它们的盐。盐与上述相同。作为非离子表面活性剂，例如可举出聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基苯基醚和聚氧乙烯烷基醚。作为聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如可举出聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween20)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单棕榈酸酯(Tween40)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯(Tween60)、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween80)，作为聚氧乙烯烷基苯基醚，例如可举出聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(Triton X-100)、聚氧乙烯(8)辛基苯基醚(Triton X-114)、聚氧乙烯(30)辛基苯基醚(Triton X-305)和聚氧乙烯(40)辛基苯基醚(Triton X-405)，作为聚氧乙烯烷基醚，可举出聚氧乙烯(23)月桂基醚(Brij35)、聚氧乙烯(20)鲸蜡基醚(Brij58)，作为非离子表面活性剂的优选例，可举出聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween20)及聚氧乙烯(10)辛基苯基醚(Triton X-100)，作为两性离子表面活性剂，例如可举出磺基甜菜碱型表面活性剂。作为磺基甜菜碱型表面活性剂，例如可举出3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[3-胆固醇氨丙基]二甲基氨基)-2-羟基丙磺酸(CHAPSO)、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐、N-十四烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐和N-十六烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐。作为阴离子表面活性剂，例如可举出十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸钠(NLS)十二烷基硫酸锂、十二烷基苯磺酸钠和脱氧胆酸盐。作为阳离子表面活性剂，例如可举出癸基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基溴化铵。优选表面活性剂为非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂或它们的盐。

表面活性剂可以以能够增强降低源自阴性检体的检测信号强度的还原剂的效果和/或能够降低检体的基质效应的终浓度使用。终浓度是指混合时的浓度。因此，终浓度也可以表现为通过混合而生成的混合液中的浓度。这样的终浓度例如为0.005～10重量％，优选为0.01～9重量％，更优选为0.02～7.5重量％，更进一步优选为0.05～6重量％，特别优选为0.05～5重量％。

优选的是，还原剂和表面活性剂可以以在源自阴性检体的检测信号强度的降低和/或检体的基质效应的降低中能够增强效果的比例使用。这样的比例可以通过每1mM还原剂的表面活性剂的浓度范围来给定。每1mM还原剂的表面活性剂的浓度范围例如为0.000025～3重量％，优选为0.00005～0.1重量％，更优选为0.0005～0.01重量％，更进一步优选为0.005～0.05重量％。

在含可溶性GPC3检体与还原剂及表面活性剂这两者混合的情况下，混合可以同时或分别进行。在同时进行混合的情况下，可以将含可溶性GPC3检体与还原剂及表面活性剂的混合液混合。在分别进行混合的情况下，可以将含可溶性GPC3检体先与还原剂、接着与表面活性剂混合，或者也可以先与表面活性剂、接着与还原剂混合。

还原剂和/或表面活性剂可以溶解在水溶液中使用。作为这样的水溶液，例如可举出水(例如蒸馏水、灭菌水、灭菌蒸馏水、纯水)和缓冲液。作为缓冲液，例如可举出磷酸缓冲液、MES缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、碳酸缓冲液、HPEPS缓冲液、MOPS缓冲液。缓冲液的pH根据还原剂的种类和浓度等因素而变动，从提高还原剂的效果等观点出发，可以为1.0～9.0(优选为4.0～6.0)。从在所期望的pH范围内稳定地发挥还原剂的效果等观点出发，水溶液优选为缓冲液。水溶液可以包含有机溶剂(例如醇)等其他成分。含可溶性GPC3检体与包含还原剂和/或表面活性剂的水溶液应混合的容量的比例(含可溶性GPC3检体:包含还原剂和/或表面活性剂的水溶液)例如为10:1～1:10，优选为5:1～1:5，更优选为2:1～1:2。

混合在单独的还原剂、或者在利用还原剂和表面活性剂这两者对检体的处理的充分的条件下进行。这样的温度条件例如为15～60℃，优选为20～50℃，更优选为25～45℃。混合时间例如为30秒以下。从迅速的处理等观点出发，混合时间优选为20秒以下，更优选为15秒以下。通过在这样的条件下进行混合，能够降低源自阴性检体的检测信号强度。

本发明的方法可以包含在混合后进一步孵育混合液。孵育时间根据还原剂的种类和浓度、有无组合使用表面活性剂、表面活性剂的种类和浓度、混合时间、以及检测信号强度中所期望的降低度、以及在进行使用抗体的测定(免疫分析)的情况下所需的时间等因素而变动，例如为120分钟以下，优选为60分钟以下，更优选为30分钟以下。从迅速的处理等观点出发，孵育时间可以进一步优选为20分钟以下，特别优选为10分钟以下或5分钟以下。孵育温度与所述混合中的温度条件相同。

本发明还提供一种可溶性GPC3的免疫分析方法，其包含下述(a)和(b)：

(a)将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合；

可溶性GPC3的免疫分析方法中的各种要素的定义、实例及优选例与本发明的含可溶性GPC3检体的处理方法中所述的定义、实例及优选例相同。

步骤(a)可以与本发明的含可溶性GPC3检体的处理方法同样地进行。步骤(b)可以通过所述免疫分析来进行。步骤(a)和(b)可以同时进行或分别进行。例如，在同时进行步骤(a)和(b)的情况下，通过将含可溶性GPC3检体、还原剂(和表面活性剂)、以及针对可溶性GPC3的1种以上的抗体同时混合，能够同时进行利用还原剂(和表面活性剂)的含可溶性GPC3检体的处理和抗原抗体反应。但是，为了充分降低源自阴性检体的检测信号强度(例如计数)，优选充分进行利用还原剂(和表面活性剂)的含可溶性GPC3检体的处理，接着，通过使用了针对可溶性GPC3的1种以上的抗体的抗原抗体反应对可溶性GPC3量进行测定。此外，在本发明中使用的抗体包含二硫键的情况下，若使抗体与还原剂长时间共存，则还原剂会通过抗体中的二硫键的切断而破坏抗体，因此会影响免疫分析的测定精度。因此，在本发明中使用的抗体包含二硫键的情况下，优选分别进行步骤(a)和(b)。当然，在本发明中使用的抗体不含二硫键的情况下(例如，单链抗体)，还优选同时进行步骤(a)和(b)。

本发明还提供一种可溶性GPC3的免疫分析试剂，其包含下述(a)和(b)：

(a)还原剂；

(b)针对可溶性GPC3的1种以上的抗体。

本发明的试剂还可以包含：(c)表面活性剂。

构成成分(a)～(c)的还原剂、抗体及表面活性剂的定义、实例及优选例与本发明的含可溶性GPC3检体的处理方法中所述的相同。

在特定的实施方式中，就本发明的试剂而言，也可以是针对可溶性GPC 3的1种以上的抗体为针对可溶性GPC3中2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体，并且所述试剂为用于夹心免疫分析的试剂。优选这样的试剂包含针对可溶性GPC3的标记抗体和/或固相抗体作为所述2种以上的抗体。或者，这样的试剂在不包含用标记物质进行了标记的标记抗体和/或固定于固相的固相抗体的情况下，也可以包含标记物质和/或固相。作为标记物质，例如可举出荧光物质、发光物质、色素和酶。在标记物质为酶的情况下，这样的试剂可以包含酶的底物(例如，产生检测信号的底物、或通过酶转化为产生检测信号的产物的底物、或能够与利用产生检测信号的底物或通过酶转化为产生检测信号的产物的底物的其他酶反应共轭的反应中的底物)。固相与所述相同。

本发明的试剂能够用于特定状态的判定(例如疾病的诊断)。特定状态(例如疾病)与上述相同。优选本发明的试剂可以用于肝癌、前列腺癌等癌的诊断。

实施例

下面，使用实施例对本发明进行更详细的说明，然而本发明并不限定于这些实施例。

参考例1：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)与抗体的反应性的确认

通过使用由GPC3的第1～559位氨基酸残基构成的重组人GPC3(rhGPC3)(R&DSystems)抗原、或GPC3高表达的人肝癌细胞HepG2的培养上清液的蛋白质印迹，进行抗GPC3抗体A和抗GPC3抗体B(均为单克隆IgG抗体)的识别位点的解析。

在rhGPC3和HepG2培养上清液中添加SDS-PAGE用样品缓冲液，以分别成为1.4ng蛋白质/泳道和7.2ng蛋白质/泳道的方式将rhGPC3和HepG2培养上清液施加于5-20％的聚丙烯酰胺凝胶(Supersep Ace 5-20％，WAKO)。电泳(30mA，60分钟)后，使用TRANS-BLOT(注册商标)SD半干电泳转印单元(B io-Rad)将蛋白质转印到印迹膜(IMMOBILON ISEQ，MERCKMILLIPORE)(15V，60分钟)。用TBS-T轻轻洗涤印迹膜后，在封闭液(0.5％ECL Block(GEHealthcare Life Sciences)，0.5％BSA，TBS-T)中在室温下振荡1小时。用TB S-T清洗2次后，在包含用反应液(将封闭液用TBS-T稀释2倍)分别稀释至1μg/mL的抗GPC3抗体A和抗GPC3抗体B的溶液中，在4℃下振荡一夜。用TBS-T清洗4次后，将印迹膜在包含用反应液稀释20000倍的POD标记抗小鼠F(ab’)₂(Jackson)的溶液中振荡1小时后，用TBS-T清洗。显色反应使用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo FisherScien tific)进行，使用化学成像系统(Chemiluminescence Imaging System)(FUSIONSYSTEM，Vilber Lourmat)进行显影。将蛋白质印迹的解析结果示于图1。

其结果，抗GPC3抗体A和抗GPC3抗体B均与相当于GPC3的N末端片段(比第358个氨基酸残基靠N末端侧的片段)的40kDa的条带反应(图1)。这表示抗GPC3抗体A和抗GPC3抗体B识别GPC3的N末端区域。因此，确认了抗GPC3抗体A和抗GPC3抗体B识别出可溶性GPC3。

参考例2：抗GPC3抗体固相化粒子的制备

在10mM MES缓冲液(pH5.0)中向磁性粒子添加抗GPC3抗体A，得到包含0.2mg/mL抗GPC3抗体A和0.01g/mL磁性粒子的悬浮液。边缓慢搅拌该悬浮液边在5℃下孵育1小时，使抗GPC3抗体A固相化于磁性粒子。然后，用磁铁将磁性粒子集磁，用清洗液(50mM Tris缓冲液，150mM NaCl，2.0％BSA，pH7.2)清洗磁性粒子，得到抗GPC3抗体A固相化粒子。在测定中，将抗GPC3抗体A固相化粒子悬浮于粒子稀释液(50mM Tris缓冲液，1mM EDTA2Na，0.1％NaN₃，2.0％BSA，pH7.2)中。

参考例3：碱性磷酸酶标记抗GPC3抗体的制备

将脱盐后的碱性磷酸酶(ALP)与N-(4-马来酰亚胺丁酰基)-琥珀酰亚胺(G MBS)(终浓度0.3mg/mL)混合，在30℃下静置1小时，将ALP马来酰亚胺化。接着，在偶联用反应液(100mM磷酸缓冲液，1mM EDTA2Na，pH6.3)中，将Fab’化的抗GPC3抗体B与马来酰亚胺化ALP以1:1的摩尔比混合，在25℃下反应1小时。使用Superdex200 10/300(GE Healthcare)的柱层析，用纯化用缓冲液(50mM MES缓冲液，150mM NaCl，0.1％NaN₃，pH8.0)以流速0.5m L/min分取主要峰进行纯化，得到ALP标记抗GPC3抗体B。测定中，将AL P标记抗GPC3抗体B悬浮于标记体稀释液(50mM MES缓冲液，150mM Na Cl，0.3mm ZnCl₂，1mM MgCl₂，0.1％NaN₃，2.0％BSA，pH6.8)中。

参考例4：可溶性GPC3的测定

将预处理液20μL分注到反应槽中，接着将检体20μL分注到反应槽中。将预处理液与检体的混合液在37℃下孵育6.5分钟后，向反应槽分注50μL的抗GPC3抗体A固相化粒子，搅拌混合液。将混合液在37℃下孵育8分钟，进行B/F分离·清洗。将ALP标记抗GPC3抗体B50μL分注到反应槽中后，搅拌混合液。将混合液在37℃下孵育8分钟，进行B/F分离·清洗。然后，将包含作为化学发光基质的3-(2'-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-膦酰氧基)苯基-1,2-二氧杂环丁烷·2钠盐(AMPPD)的LUMIPULSE基质液200μL分注到反应槽中，搅拌混合液。然后，将混合液在37℃下孵育4分钟，接着，用发光计测定发光量。实际的测定利用全自动化学发光酶免疫测定系统(LUMIPULSE L2400(FUJIREBIO公司制))进行。

实施例1：可溶性GPC3的测定中的利用还原剂DEAET进行的检体的预处理

将源自健康人的血清检体(阴性检体)和源自α-细胞蛋白(AFP)阳性的肝癌患者的血清检体(Trina公司)(阳性检体)用作可溶性GPC3评价用检体。作为预处理液，使用包含6.25mM～600mM的2-(二甲氨基)乙硫醇盐酸盐(DEAET)的磷酸缓冲液(10mM磷酸缓冲液，6.25～600mM DEAET，pH6.0)。作为对照液，使用了10mM磷酸缓冲液(pH6.0)。将阴性检体、阳性检体和缓冲液样品(10m M磷酸缓冲液)分别与预处理液以体积比1:1混合，在37℃下反应6.5分钟(有预处理)。同样地，将阴性检体、阳性检体和缓冲液样品分别与对照液混合，使其反应(无预处理)。

对于各检体，通过参考例4中记载的测定方法测定可溶性GPC3。各检体的计数如表1所示。此外，由计数通过下述计算式算出的(1)降低率(％)、(2)阳性与阴性的计数差(％)和(3)基质差(％)示于表1。

计算式

(1)降低率(％)＝100-(各DEAET浓度的“有预处理”的计数/“无预处理”的计数)×100

(2)阳性与阴性的计数差(％)＝(阳性检体的计数平均值)/(阴性检体的计数平均值)×100

(3)基质差(％)＝(缓冲液样品的计数)/(阴性检体的计数平均值)×100

降低率(％)是用于评价单个检体中的预处理的影响的指标。阴性检体的降低率越大并且阳性检体的降低率越小，阴性检体与阳性检体的测定值的差越大，能够进一步区分两者，因此能够实现较高的诊断灵敏度。因此，阴性检体的降低率越大并且阳性检体的降低率越小，作为可溶性GPC3的测定系统的预处理条件越有用。

阳性与阴性的计数差(％)是用于评价预处理的阳性检体与阴性检体的计数差的指标。阳性与阴性的计数差(％)越大，越能够实现高的诊断灵敏度，因此在可溶性GPC3的测定系统中有用。

基质差(％)是用于评价缓冲液样品与阴性检体的计数之差的指标。在使用了检体的免疫分析中，有时免疫反应会受到检体中所含的物质的影响(基质效应)。基质差(％)越接近100％，越能够实现基质效应的降低。降低的基质效应能够实现不依赖于检体种类的真值的输出，因此在可溶性GPC3的测定系统中有用。

[表1]

如表1所示，用DEAET对阴性检体进行预处理时，研究的所有浓度(6.25mM～600mM)下阴性检体的计数降低，其降低率非常大。另一方面，在用D EAET对阳性检体进行预处理的情况下，阳性检体的计数不降低，或者即使降低，其降低率也比阴性检体小。特别是在以50mM～400mM的浓度添加DEA ET的情况下，阳性与阴性的计数差(％)非常大。这表示利用还原剂DEAET进行的检体的预处理能够提高可溶性GPC3的测定中的阳性检体与阴性检体的判别精度。此外，用DEAET对阴性检体进行预处理时，基质差接近100％，基质效应降低。因此，确认了利用还原剂DEAET进行的检体的预处理对可溶性GPC3的测定有用。

实施例2：可溶性GPC3的测定中的利用还原剂2MEA进行的检体的预处理

作为预处理液，使用包含6.25mM～100mM的2-巯基乙胺盐酸盐(2MEA)的磷酸缓冲液(10mM磷酸缓冲液，6.25～100mM 2MEA，pH6.0)。作为对照液，使用了10mM磷酸缓冲液(pH6.0)。将阴性检体、阳性检体和缓冲液样品分别与预处理液以体积比1:1混合，在37℃下反应6.5分钟(有预处理)。同样地，将阴性检体、阳性检体和缓冲液样品分别与对照液混合，使其反应(无预处理)。

对于各检体，通过参考例4中记载的测定方法测定可溶性GPC3。各检体的计数如表2所示。此外，与实施例1同样地算出降低率(％)、阳性与阴性的计数差(％)及基质差(％)。

[表2]

如表2所示，将阴性检体用2MEA进行预处理时，研究的所有浓度(6.25mM～100mM)下阴性检体的计数降低，其降低率非常大。另一方面，在用2M EA对阳性检体进行预处理的情况下，阳性检体的计数不降低，或者即使降低，其降低率也比阴性检体小。这表示利用还原剂2MEA进行的检体的预处理能够提高可溶性GPC3的测定中的阳性检体与阴性检体的判别精度。此外，用2MEA对阴性检体进行预处理时，基质差接近100％，基质效应降低。因此，确认了利用还原剂2MEA进行的检体的预处理对可溶性GPC3的测定有用。

实施例3：可溶性GPC3的测定中的利用还原剂TCEP进行的检体的预处理

作为预处理液，使用包含6.25mM～100mM的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)的磷酸缓冲液(10mM磷酸缓冲液，6.25～100mM TCEP，pH6.0)。作为对照液，使用了10mM磷酸缓冲液(pH6.0)。将阴性检体、阳性检体和缓冲液样品分别与预处理液以体积比1:1混合，在37℃下反应6.5分钟(有预处理)。同样地，将阴性检体、阳性检体和缓冲液样品分别与对照液混合，使其反应(无预处理)。

对于各样品，通过参考例4中记载的测定方法测定可溶性GPC3。各样本的计数如表3所示。此外，与实施例1同样地算出降低率(％)、阳性与阴性的计数差(％)及基质差(％)。

[表3]

如表3所示，用TCEP对阴性检体进行预处理时，研究的所有浓度(6.25mM～100mM)下阴性检体的计数降低，其降低率非常大。另一方面，在用TC EP对阳性检体进行预处理的情况下，阳性检体的计数不降低，或者即使降低，其降低率也比阴性检体小。这表示利用还原剂TCEP进行的检体的预处理能够提高可溶性GPC3的测定中的阳性检体与阴性检体的判别精度。此外，用T CEP对阴性检体进行预处理时，基质差接近100％，基质效应降低。因此，确认了利用还原剂TCEP的检体的预处理对可溶性GPC3的测定有用。

(实施例1～3的总结)

若考虑实施例1～3的结果，则认为利用还原剂进行的检体的预处理与还原剂的种类及结构无关，能够提高可溶性GPC3的测定中的阳性检体与阴性检体的判别精度。此外，认为利用还原剂的阴性检体的预处理通过降低基质效应，能够实现不依赖于检体种类的真值的输出。因此，利用还原剂进行的检体的预处理对于可溶性GPC3的测定是有用的。

实施例4：可溶性GPC3的测定中的利用还原剂与表面活性剂的组合进行的检体的预处理

作为预处理液，使用表4A所示的试验例2～11的磷酸缓冲液(pH6.0)。试验例2～11的磷酸缓冲液包含DEAET作为还原剂、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)或聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween20)作为表面活性剂。作为对照液，使用表4A所示的试验例1的10mM磷酸缓冲液(p H6.0)。将阴性检体、阳性检体和缓冲液样品分别与预处理液以体积比1:1混合，在37℃下反应6.5分钟(有预处理)。同样地，将阴性检体、阳性检体和缓冲液样品分别与对照液混合，使其反应(无预处理)。

对于各检体，通过参考例4中记载的测定方法测定可溶性GPC3。各检体的计数如表4B所示。此外，与实施例1同样地算出降低率(％)、阳性与阴性的计数差(％)及基质差(％)。

[表4]

如表4所示，在以还原剂与表面活性剂的组合对阴性检体进行预处理的情况下，研究的全部表面活性剂浓度(各0.1～10重量％)下阴性检体的计数降低，其降低率非常大。另一方面，在以还原剂与表面活性剂的组合对阳性检体进行预处理的情况下，阳性检体的计数的降低率比阴性检体小。特别是在以给定的浓度添加表面活性剂的情况下(0.1～2.5重量％CHAPS和0.1～10重量％Tween20)，阳性与阴性的计数差(％)非常大。此外，用还原剂与表面活性剂的组合对阴性检体进行预处理时，基质差更接近100％，进一步降低基质效应。这表示利用还原剂与表面活性剂的组合的检体的预处理，能够提高可溶性GP C3的测定中的阳性检体与阴性检体的判别精度，以及能够降低检体的基质效应。因此，确认了利用还原剂与表面活性剂的组合的检体的预处理对可溶性GPC3的测定有用。

序列表

<110> 富士瑞必欧株式会社

<120> 可溶性GPC3的免疫分析中的含可溶性GPC3检体的处理方法

<130> RB-R033399

<150> JP2021-005934

<151> 2021-01-18

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 580

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp

20 25 30

Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly

35 40 45

Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val

50 55 60

Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys

65 70 75 80

Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala

85 90 95

Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln

100 105 110

Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala

115 120 125

Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe

130 135 140

Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro

165 170 175

Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu

180 185 190

Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe

195 200 205

Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln

210 215 220

Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile

225 230 235 240

Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu

245 250 255

Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys

260 265 270

Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly

275 280 285

Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu

290 295 300

Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu

305 310 315 320

Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys

325 330 335

Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser

340 345 350

Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile

355 360 365

Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu

370 375 380

Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser

385 390 395 400

Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala

405 410 415

Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr

420 425 430

Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His

435 440 445

Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp

450 455 460

Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys

465 470 475 480

Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly

485 490 495

Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly

500 505 510

Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr

515 520 525

Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro

530 535 540

Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser

545 550 555 560

Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe

565 570 575

Phe Leu Val His

580

Claims

1.一种可溶性GPC3的免疫分析中的含可溶性GPC3检体的处理方法，其包含：

将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

还原剂以0.05～1000mM的终浓度使用。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其包含：

进一步将含可溶性GPC3检体与表面活性剂进行混合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，

表面活性剂以0.005～10重量％的终浓度使用。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，

免疫分析是使用针对可溶性GPC3中2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体的夹心免疫分析。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，

含可溶性GPC3检体为血液检体。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，

含可溶性GPC3检体从患癌的被检体得到。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，

癌为肝癌。

9.一种可溶性GPC3的免疫分析方法，其包含下述(a)和(b)：

(a)将含可溶性GPC3检体与还原剂进行混合；

10.根据权利要求9所述的方法，其包含：

进一步将含可溶性GPC3检体与表面活性剂进行混合。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，

通过使用针对可溶性GPC3中2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体的夹心免疫分析进行测定。

12.一种可溶性GPC3的免疫分析试剂，其包含下述(a)和(b)：

(a)还原剂；

(b)针对可溶性GPC3的1种以上的抗体。

13.根据权利要求12所述的免疫分析试剂，其进一步包含：

(c)表面活性剂。

14.根据权利要求12或13所述的免疫分析试剂，其中，

针对可溶性GPC3的1种以上的抗体为针对可溶性GPC3中2种以上的不同表位的2种以上的不同抗体，并且，所述免疫分析试剂用于夹心免疫分析。

15.根据权利要求12～14中任一项所述的免疫分析试剂，其中，

所述试剂用于癌的诊断。