CN117062842A - 新型双环肽 - Google Patents

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Abstract

公开了共价结合分子支架的多肽，使得两个或更多个肽环在与支架的连接点之间对向。更特别地，本发明提供了PD‑L1的肽模拟物。还公开了与分子支架共价连接的多肽的多聚体结合复合物，使得两个或更多个肽环在与分子支架的连接点之间对向，所述分子支架是PD‑L1的模拟物。还公开了使用所述肽治疗由PD‑L1核定位介导的疾病或障碍的方法。

Description

新型双环肽
相关申请
本申请要求2021年1月19日提交的发明名称为“新型双环肽”的澳大利亚临时申请第2021900114号的优先权，其全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明一般涉及与分子支架共价结合的多肽，使得两个或更多个肽环在与支架的连接点之间对向。特别地，本发明描述了PD-L1的肽模拟物。本发明还涉及多肽的多聚体结合复合物，其与分子支架共价结合，使得两个或更多个肽环在与支架的连接点之间对向，所述支架是PD-L1的模拟物。本发明还包括包含与一个或多个效应物和/或官能团缀合的所述肽和复合物的药物缀合物，涉及包含所述肽配体、复合物和药物缀合物的药物组合物，以及涉及所述肽配体和药物缀合物在预防、抑制或治疗由PD-L1核定位介导的疾病或障碍中的用途。
背景技术
本说明书中对任何在先出版物(或从其导出的信息)或任何已知事项的引用不是也不应被视为了解或承认或以任何形式暗示该在先出版物(或从其导出的信息)或已知事项形成本说明书所涉及的努力领域中的公知常识的一部分。
程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)通过其调节T细胞激活和降低免疫反应的能力在免疫系统的调节中起着重要作用。PD-1在激活的T细胞(包括免疫抑制性CD4+T细胞(Treg)和耗竭性CD8+T细胞)、B细胞、髓样树突细胞(MDC)、单核细胞、胸腺细胞和自然杀伤(NK)细胞上表达(Gianchecchi等人(2013)Autoimmun.Rev.，12：1091-1100)。
PD-1信号传导途径有助于维持正常个体中的中枢和外周耐受性，从而避免破坏正常宿主组织。在胸腺中，PD-1与其配体的相互作用抑制阳性选择，从而抑制CD4-CD8-双阴性细胞向CD4+CD8+双阳性T细胞的转化(Keir等人(2005)J.Immunol.，175：7329-7379)。对逃避阴性选择以避免附带免疫介导的组织损伤的自身反应性和炎性效应T细胞的抑制依赖于PD-1信号传导途径(Keir等人(2006)J.Exp.Med，203：883-895)。
PD-1被两种配体结合：程序性细胞死亡配体-1(PD-L1；B7-H1；CD274)和程序性细胞死亡配体-2(PD-L2；B7-DC；CD273)。PD-L1在各种细胞类型上表达，包括T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞(Chen等人(2012)Clin Cancer Res，18(24)：6580-6587；Herzberg等人(2016)The Oncologist，21：1-8)。PD-L1表达也在局部肿瘤环境中的许多类型的肿瘤细胞和其他细胞中上调(Herzberg等人，同上)。PD-L2主要在抗原呈递细胞(如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)上表达，但取决于微环境刺激，也可以在多种其他免疫细胞和非免疫细胞上诱导表达(Herzberg等人，同上；Kinter等人(2008)J.Immunol.，181：6738-6746；Zhong等人(2007)Eur.J.Immunol.，37：2405-2410；Messal等人(2011)Mol.Immunol.，48：2214-2219；Lesterhuis等人(2011)Mol.Immunol.，49：1-3)。
局部肿瘤环境中的恶性细胞和其他细胞过表达PD-1、PD-L1和PD-L2。PD-1在来自许多不同肿瘤类型的大部分肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上高度表达，并抑制局部效应物免疫反应。PD-1的TIL表达与许多肿瘤类型中受损的效应物功能(细胞因子产生和针对肿瘤细胞的细胞毒性功效)和/或不良结果相关(Thompson等人(2007)Clin Cancer Res，13(6)：1757-1761；Shi等人(2011)Int.J.Cancer，128：887-896)。已发现PD-L1表达与许多肿瘤类型中的不良结果强烈相关，包括肾癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、尿路上皮癌、胃癌和胰腺癌(Keir等人(2008)Annu.Rev.Immunol.，26：677-704；Shi等人(2011)Int.J.Cancer，128：887-896)。已经显示PD-L2在肿瘤亚群中上调，并且也与不良结果相关。
有趣的是，核PD-L1表达已显示与几种肿瘤类型(包括前列腺癌、结肠直肠癌和乳腺癌)的短存活期和化学抗性相关(Satelli等人(2016)Scientific Reports，6：28 910；Ghebeh等人(2010)Breast Cancer Res.，12：R48)。
因此，PD-1信号传导途径的成员是治疗癌症的重要治疗靶标，并且需要靶向该途径、特别是PD-1信号传导途径成员的核定位的新治疗剂。
环肽能够以高亲和力和特异性结合蛋白质靶标，因此是有吸引力的开发治疗剂的分子类别。事实上，几种环肽已经成功地用于临床，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制药物环孢菌素或抗癌药物奥曲肽(Driggers等人，(2008)，Nat Rev Drug Discov 7(7)，608-24)。良好的结合性质来自于肽和靶标之间形成的相对大的相互作用表面以及降低的环状结构的构象柔性。通常，大环与几百平方埃的表面结合，例如环肽CXCR4拮抗剂CVX15(Wu等人，(2007)，Science 330，1066-71)、具有与整联蛋白a-Vβ3结合的Arg-Gly-Asp基序的环肽(Xiong等人，(2002)，Science 296(5565)，151-5)或与尿激酶型纤溶酶原激活剂结合的环肽抑制剂upain-1(Zhao等人，(2007)，J Struct Biol 160(1)，1-10)。
由于它们的环状构型，肽大环化合物(peptide macrocycles)的柔性低于线性肽，导致在与靶标结合时熵损失较小，并导致较高的结合亲和力。柔性降低还导致锁定目标特异性构象，与线性肽相比增加了结合特异性。这种作用已经通过基质金属蛋白酶8(MMP-8)的有效和选择性抑制剂举例说明，当MMP-8环打开时，其相对于其他MMP失去其选择性(Cherney等人，(1998)，J Med Chem 41(11)，1749-51)。在具有多于一个肽环的多环肽中，例如在万古霉素、乳链菌肽和放线菌素中，通过大环化实现的有利的结合性质甚至更为明显。
不同的研究小组之前已经将具有半胱氨酸残基的多肽连接到合成的分子结构上(Kemp和McNamara(1985)J.Org.Chem；Timmerman等人，(2005)，ChemBioChem)。Meloen及其同事使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速和定量环化到合成支架上，用于蛋白质表面的结构模拟(Timmerman等人，同上)。产生候选药物化合物的方法，其中所述化合物通过将含有半胱氨酸的多肽连接到分子支架上产生，例如1，1’，1”-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)(Heinis等人，(2014)Angewandte Chemie，国际版本53(6)1602-1606)。
已经开发了基于噬菌体展示的组合方法来产生和筛选针对目标靶标的双环肽的大文库(Heinis等人，(2009)，Nat Chem Biol5(7)，502-7和国际专利公开号WO9/098450)。简言之，在噬菌体上展示含有三个半胱氨酸残基和六个随机氨基酸(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)的两个区域的线性肽的组合文库，并通过将半胱氨酸侧链共价连接至小分子支架而环化。
发明内容
本发明部分基于以下发现：包含根据式I的氨基酸序列的双环PD-L1肽模拟物在抑制或减少PD-L1的核定位方面特别有效。因此，发明人设想了包含根据式I的氨基酸序列的PD-L1双环肽模拟物可用于抑制PD-L1的核定位。应理解，PD-L1双环肽模拟物通过阻止或抑制PD-L1和输入蛋白α(IMPα)的复合物来抑制核定位。
在一个方面，本发明提供了PD-L1双环肽模拟物或其修饰的衍生物或药学上可接受的盐，所述PD-L1双环肽模拟物包含多肽和分子支架，所述多肽包含由至少两个环序列分开的至少三个半胱氨酸残基，所述分子支架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在所述分子支架上形成至少两个多肽环，其中所述PD-L1双环肽模拟物包含以下氨基酸序列：
X1C1LX2X3IFC2X4LRKGX5C3X6X7X8X9KX10 (式I)
其中：
C1、C2和C3分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X1不存在或是丙氨酸；
X2选自任何小的氨基酸(任选地，苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸)
X3选自任何氨基酸；
X4选自任何氨基酸；
X5选自任何氨基酸；
X6选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X7选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X8选自任何氨基酸；
X9选自任何非极性/中性氨基酸(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和正亮氨酸)；以及
X10选自任何氨基酸。
通常，X2选自苏氨酸和丙氨酸。在一些优选的实施方案中，X2是苏氨酸。
通常，X3选自苯丙氨酸和丙氨酸。在一些优选的实施方案中，X3是苯丙氨酸。
通常，X4选自精氨酸和丙氨酸。在一些优选的实施方案中，X4是精氨酸。
通常，X5选自精氨酸和丙氨酸。在一些优选的实施方案中，X5是精氨酸。
通常，X6选自甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸。在一些优选的实施方案中，X6是甲硫氨酸。
通常，X7选自甲硫氨酸、丙氨酸和脯氨酸。在一些优选的实施方案中，X7是甲硫氨酸。在一些可选的实施方案中，X7是丙氨酸。
通常，X8选自天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸。在一些优选的实施方案中，X8是天冬氨酸。
通常，X9选自缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸。在一些优选的实施方案中，X8是缬氨酸。
通常，X10选自赖氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和甲硫氨酸。在一些优选的实施方案中，X10是赖氨酸。
在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物的氨基酸序列包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：ACLTFIFCRLRKGRCMMDVKK[SEQ ID NO：1]。
在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物结合IMPα并阻止IMPα和PD-L1的复合。通常，PD-L1双环肽模拟物不抑制或阻止IMPα对其他细胞蛋白(例如，PD-L2)的核转运。因此，PD-L1双环肽模拟物特异性地阻止PD-L1的核转运，但不抑制其他蛋白质的核转运。
合适地，分子支架包含(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。合适地，支架包含三取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分，例如三亚甲基取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。(杂)芳香族或(杂)脂环族部分合适地是六元环结构，优选三取代的，使得支架具有3重对称轴。在一些优选的实施方案中，分子支架1，3，5-(三溴甲基)苯(TBMB)。在其他优选的实施方案中，分子支架是1，3，5-三-(溴乙酰氨基)苯(TBAB)。
在优选的实施方案中，双环肽还包含N-末端细胞穿透肽(cell-penetratingpeptide)。优选地，细胞穿透肽是Myr。
在一些实施方案中，修饰的衍生物包括选自以下的一种或多种修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基(如用一个或多个电子等排或等电子氨基酸替换一个或多个极性氨基酸；用其他非天然电子等排或等电子氨基酸替换一个或多个疏水性氨基酸残基)；添加间隔基团；替换一个或多个抗氧化氨基酸残基；用丙氨酸替换一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体内的一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键替换一个或多个肽键；肽主链长度修饰；用另一种化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，以及用合适的胺、硫醇、羧酸和酚反应性试剂对氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和酪氨酸)的合成后双正交修饰。
在一些实施方案中，修饰的衍生物包含N-末端修饰，例如N-末端乙酰基团。
在一些实施方案中，修饰的衍生物包含C-末端修饰，例如C-末端酰胺基团。
在一些实施方案中，修饰的衍生物包含用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，药学上可接受的盐选自盐酸盐或乙酸盐。
在一些实施方案中，组合物被包封在纳米颗粒中或与纳米颗粒复合。通常，纳米颗粒是脂质纳米颗粒(例如，脂质体或脂质复合物)。
合适地，脂质纳米颗粒的直径为约50nm至500nm。通常，纳米颗粒的直径尺寸小于约250nm(例如，约100nm至250nm之间)。
通常，纳米颗粒包含阳离子脂质、PEG修饰的脂质、甾醇和/或非阳离子脂质。在这种类型的一些实施方案中，阳离子脂质是可电离的阳离子脂质。
在一些实施方案中，可电离的阳离子脂质选自包含以下或由以下组成的组：1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1，2-二油基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、5-羧基精酰甘氨酸双十八烷基酰胺(DOGS)、2，3-二油基氧-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵(DOSPA)、1，2-二油基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1，2-二硬脂基氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1，2-二油基氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1，2-二亚油基氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、三十七烷-6，9，28，31-四烯19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1，2-二亚油基氧-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)、N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧丁-4-氧基)-1-(顺，顺-9，12-十八碳二烯氧)丙烷(CLinDMA)、2-[5′-(胆甾-5-烯-3-β-氧)-3′-氧杂戊氧]-3-二甲基-1-(顺，顺-9′，1-2′-十八碳二烯氧)丙烷(CpLinDMA)、N，N-二甲基-3，4-二油基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N，N′-二油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、2，3-二亚油基氧-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1，2-N，N’-二亚油基氨基甲酰-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1，2-二亚油基氨基甲酰-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)和C12-200。在一些实施方案中，纳米颗粒包含二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)脂质。
药物组合物，其包含与一种或多种赋形剂组合的如上文和本文别处所述的PD-L1双环肽模拟物。
减少PD-L1过表达细胞中PD-L1核定位的方法，包括使细胞与上文和本文别处所述的PD-L1双环肽模拟物接触。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者癌症的方法，其中癌症包含至少一种PD-L1过表达细胞，所述方法包含向受试者施用如上文和本文别处所述的PD-L1双环肽模拟物。
优选地，PD-L1过表达细胞是癌干细胞、非癌干细胞肿瘤细胞。
在一些优选的实施方案中，PD-L1过表达细胞是癌干细胞肿瘤细胞。
在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌或脑癌，或黑色素瘤，或视网膜母细胞瘤。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用至少一种另外的癌症疗法。在一些实施方案中，另外的癌症疗法是化学治疗剂。
附图说明
图1是PD-L1双环肽模拟物结构和序列的图示。(A)序列描绘了为得到两种候选肽而进行的序列优化步骤。(B)双环肽候选物“DL-2”的图像表示。
图2是显示在免疫疗法抗性和反应性癌症中观察到的PD-L1 PTM的图示和照片表示。(A)免疫疗法抗性和反应性黑色素瘤和TNBC中PD-L1-PTM表达的代表性高分辨率免疫荧光图像。(B)对于免疫疗法抗性和反应性黑色素瘤和TNBC，PD-L1-PTM1或PTM2阳性的CTC群体百分比和PTM1的细胞核荧光强度(NFI)或PTM2的细胞质荧光强度(C FI)。(C)PD-L1-PTM1表达与免疫疗法治疗的IV期黑色素瘤患者的存活相关。虚线：PDL1-PTM1阴性；实线：PDL1-PTM1阳性。
图3是显示PD-L1的乙酰化形式是基于细胞核的变体的照片表示。(A)来自MDA-MB-231或MCF7乳腺癌细胞系的细胞核或细胞质提取物与丽春红上样对照的示例性免疫印迹。用我们定制的针对PD-L1-PTM1的抗体探测免疫印迹。(B)描绘了示例性高通量图像筛选，其展示了PD-L1-PTM1(Ac)的核定位或PD-L1-PTM2(Me3)的细胞质/全细胞染色。右下角的比例尺指示10μm。
图4是证实PD-L1-PTM1在癌细胞系中的核定位的照片表示。示例性超分辨率图像筛选展示了PD-L1-PTM1(Ac)的核定位和细胞角蛋白的细胞质定位。右下角的比例尺指示10μm。
图5是显示双重表观遗传免疫疗法重新训练和重新编程T细胞库的图示。(A)用CSV、PD-L1-PTM1(PDL1-Ac)、PDL1-PTM2(PDL1-Me3)或商业化PD-L1抗体(PDL1-28-8)的抗体染色的来自转移性TNBC患者的转移性脑病变的示例图像。(B)条形图显示了利用SEM的PD-L1-28-8、PD-L1-PTM1或PTM2的荧光强度以及对CSV和这些标志物中的任一种阳性的群体的百分比，显示了高通量图像筛选数据(n≥1000个细胞/组)。
图6是肿瘤内浸润性CD8+T细胞和PD-L1水平的图示和照片表示。用CD8和PD-L1-PTM1(PD-L1-AC)的抗体染色的来自转移性TNBC患者的转移性脑病变的示例图像。条形图显示了CD8和PD-L1-PTM1(PD-L1-Ac)阳性群体的百分比，显示了高通量图像筛选数据(n≥1000个细胞/组)。
图7是显示PD-L1双环肽模拟物对癌细胞增殖的影响的图示。MDA-MB-231-Br(MDA-BRM)或MDA-MB-231 TNBC细胞系的增殖测定以及用DL-1或DL-2抑制的影响。显示了每次测定的IC50值。
图8是显示PD-L2双环肽模拟物诱导显著更高的细胞质PD-L1-PTM2的图示。条形图显示了利用SEM的PD-L1-AC(PTM1)的细胞核荧光强度或PD-L1-Me3(PTM2)的细胞质荧光强度的荧光强度，显示了高通量图像筛选数据(n≥500个细胞/组)。用载剂对照或双环抑制剂DL-1或DL-2处理MDA-MB-231或MDA-MB-231-Br，并用高分辨率数字病理学对细胞核内的PD-L1-AC(PTM1)或细胞质内的PD-L1-Me3(PTM2)的表达进行评分。将显著差异计算为与载剂对照的成对比较。
图9是显示用PD-Ll双环肽模拟物处理后转移负荷的间充质调节剂的图示。条形图显示了利用SEM的CSV、ABCB5、EGFR或FOXQ1的细胞质或细胞核荧光强度，显示了高通量图像筛选数据(n≥500个细胞/组)。用载剂对照或双环抑制剂DL-1或DL-2处理MDA-MB-231或MDA-MB-231-Br，并用高分辨率数字病理学表征表达的变化。将显著差异计算为与载剂对照的成对比较。
图10提供了显示用PD-L1双环肽模拟物处理诱导上皮标志物表达的图示。条形图显示了利用SEM的E-钙粘蛋白的细胞质荧光强度，显示了高通量图像筛选数据(n≥500个细胞/组)。用载剂对照或双环肽抑制剂DL-1或DL-2处理(A)MDA-MB-23l或(B)MDA-MB-231-Br，并用高分辨率数字病理学表征表达的变化。将显著差异计算为与载剂对照的成对比较。
图11是显示PD-L1双环肽模拟物诱导细胞表面PD-L1-Me3上调的照片表示和图示。(A)用载剂对照、HDAC2i或双环肽抑制剂DL-2处理的非透化MDA-MB-231细胞的高通量图像筛选。将细胞用PD-L1-PTM2(Me3)染色。图像右下角的比例尺指示10μm。(B)图表绘制了PD-LL-Me3的平均FI，n≥100个细胞/组。通过Kruskal-Wallis非参数检验指示计算的显著差异。
图12提供了显示透化细胞中细胞核和细胞质PD-IL-Me3的表达水平的照片表示和图示。(A)用载剂对照、HDAC2i或双环肽抑制剂DL-2处理的透化MDA-MB-23l细胞的示例性高通量图像筛选。细胞用PDL1-PTM2(Me3)染色。图像右下角的比例尺指示10μm。(B)图表绘制了PD-LL-Me3的平均NFI(细胞核FI)或CFI(细胞质FI)，n≥100个细胞/组。通过Kruskal-Wallis非参数检验指示计算的显著差异。
图13提供了概述本发明的示例性PD-L1双环肽模拟物的合成的流程图。
图14提供了显示双环肽抑制剂DL-2抑制PDL1-PTM1和IMPα1的共定位而不抑制IMPα1，或PDL2和IMPα1的共定位的照片表示。(A)将MDA-MB-231细胞用DL-2处理4至96小时或用对照肽快速处理，将细胞透化并用小鼠抗-IMPα1、兔抗-PDL1进行探测，并用与Alexa Fluor647缀合的驴抗兔二抗或与Alexa Fluor 568缀合的驴抗小鼠二抗进行可视化。用ProLongnucblue玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析PDL1和IMPαl数字图像以确定平均荧光强度(平均FI)。图表表示IMPα1的平均FI。图表还使用ImageJ软件描绘了PDL1/IMPα1的PCC，所述软件具有自动阈值，并且手动选择对细胞核特异性的目标区域(ROI)以计算每对抗体的皮尔逊系数相关性(PCC)。PCC值的范围为：-1＝共定位的倒数。(B)用PDL1-Ac&IMPα1染色的DUOLINK细胞的高分辨率成像。
图15提供了显示双环肽DL-2抑制PDL1-PTM1和IMPα1复合物的照片表示。使用ASI数字病理学系统利用100x物镜对用PDL1-Ac&IMPα1染色的DUOLINK细胞进行高分辨率成像。
图16提供了显示双环肽DL-2而不是线性PDL1-L1肽抑制PDL1-PTM1和IMPα1的复合物的照片展示。使用ASI数字病理学系统利用100x物镜对用PDL1-Ac和IMPα1染色的DUOLINK细胞进行高分辨率成像。
图17提供了显示DL-2抑制PDL1(未修饰的)和IMPα1的复合物，但不抑制线性PDL1-L1肽抑制剂的照片展示。使用ASI数字病理学系统利用100x物镜对用PDL1(未修饰的)和IMPα1染色的DUOLINK细胞进行高分辨率成像。
图18提供了显示在免疫疗法反应性癌症系CT26中DL-2抑制PDL1(未修饰的)和IMPα1的复合物的照片展示。
图19提供了照片展示，其显示DL-2双环肽对NLS基序具有特异性，诱导PDL1-PTM2(PDL1-Me3)，而线性肽不能诱导。条形图显示了利用SEM的CSV、PDLl-PTM2的细胞质水平，显示了高通量图像筛选数据(N≥20个细胞/组)。
图20提供了显示DL-2不抑制PDL2和IMPα1复合物的图示。用PDL2和IMPα1染色的DUOLINK细胞的高分辨率成像。用DL-2或对照处理MDA-MB-231细胞，将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测。
图21提供了说明DL-2对PDL2的核表达没有影响的图示。DL-2肽特异性的高通量分析。
图22提供了说明DL-2对其他核蛋白表达没有影响并且对PDL1是特异性的图示。标志物PKCθ、LSD1、p65、C-Rel、SET、pSTAT3的核强度图。
图23提供了显示在两种不同的双环支架上维持DL-2效力的图示。(A)用DL-2或DL-2-TBAB(两种不同支架)双环抑制剂处理CT26、4T1或MDA-MB-231细胞72小时。抑制后，除去培养基并用WST-1细胞增殖试剂替换。1小时后在450nm下记录吸光度。数据代表一式三份进行的单个独立实验，结果绘制为平均值+/-标准误差(SE)。(B)使用ASI数字病理学系统利用100x物镜对用PDL1-Ac(PTM1)和IMPα1染色的DUOLINK细胞进行高分辨率成像。(C)使用ASI数字病理学系统利用100x物镜对用PDL1-未修饰和IMPα1染色的DUOLINK细胞进行高分辨率成像。
图24提供了展示DL-2和DL-2-D的生物稳定性的图示。(A)在大鼠血浆模型中进行DL-2和DL-2-D稳定性。该图表描绘了保留长达24小时(1440分钟)的测试化合物的百分比。(B)在大鼠血浆稳定性模型中测试DL-2、DL-2-D和线性肽对照。图表描绘了长达2小时的测试化合物的百分比。
图25显示了展示DL-2-D处理对癌细胞增殖的影响的图示。分析了三种癌细胞系(A)CT26、(B)4T1和(C)MDA-MB-231。
图26提供了显示DL-2和DL-2-D有效抑制输入蛋白：mPD-L1复合物的图示。
图27显示了显示包括DL-2-D的DL-2双环肽变体诱导细胞质PDL1-PTM2的表达并抑制CSV的图示。条形图显示了来自高通量图像筛选数据(N≥≥20个细胞/组)的利用SEM的CSV、PDL1-Me3的细胞质水平。
图28提供了显示环状PDL1肽抑制剂未能抑制间充质癌症标志物的图示。使用Leica Widefield系统利用100x物镜，通过对PDL1-PTM1、CSV和ALDH1A1染色的细胞进行高分辨率成像来比较。
图29提供了显示在转移性乳腺癌的4T1 TNBC模型中DL-2单一疗法减少原发肿瘤体积的图示。(A)在22天治疗期内的小鼠体重(g)。(B)在接种后第22天从载剂和DL-2(30mg/kg)处理的小鼠收集的肺、肝和脾的代表性图像。(C)接种后第22天的最终肺、肝和脾重量。无统计学差异，单向ANOVA，Tukey’s事后检验(Turkey’s post test)。(D)接种后第22天个体小鼠的肿瘤体积。在第22天相对于载剂，***p＜0.001，单向ANOVA，Tukey’s事后检验。(E)在接种后第22天收集的来自载剂和DL-2(30mg/kg)处理的小鼠的肿瘤的代表性图像。(E)接种后第22天的肿瘤重量。在第22天相对于载剂，*p＜0.05，**p＜0.01，单向ANOVA，Tukey’s事后检验。
图30提供了显示在转移性乳腺癌的4T1模型中DL-2和αPD1组合疗法减少原发肿瘤体积的图示。(A)10天治疗期内的小鼠体重(g)。(B)接种后第19天的最终肺、肝和脾重量。无统计学差异，单向ANOVA，Tukey’s事后检验。(C)用载剂(盐水)或DL-2(10mg/kg当量)联合αPD1或同型对照(10mg/kg)治疗的小鼠的肿瘤体积(n＝5/组)。(D)接种后第19天个体小鼠的肿瘤体积(数据也在C中表示)。在第19天相对于载剂+同型，*p＜0.05，**p＜0.01，单向ANOVA，Tukey’s事后检验。(E)在接种后第19天收集的肿瘤的代表性图像。
图31提供了显示DL-2-D和αPD1组合疗法减少转移性乳腺癌的4T1模型中原发性肿瘤负荷和肺转移的图示。(A)20天治疗期内的小鼠体重(g)。(B)接种后第20天的最终肺、肝和脾重量。(C)用载剂(盐水)或DL-2-D(20mg/kg)联合αPD1或同型对照(10mg/kg)治疗的小鼠的肿瘤体积(n＝5/组)。(D)在接种后第20天的个体小鼠肿瘤体积(数据也显示在C中)，在第20天，DL-2-D+αPD1相对于载剂+αPD1，*p＜0.05，且相对于载剂+同型，**p＜0.01，Mann-Whitney事后检验。(E)接种后第20天收集的肿瘤的代表性图像。(F)接种后第20天用载剂(盐水)或DL-2-D(20mg/kg)联合αPD1或同型对照(10mg/kg)治疗的小鼠的肺结节计数(n＝5/组)。将肺在Bouin’s溶液中固定并检查表面转移的存在。第20天，DL-2-D+αPD1相对于载剂+同型，*p＜0.05，且相对于DL-2-D+同型，**p＜0.01，Mann-Whitney事后检验。
图32提供了显示DL-2和DL-2-D之间的比较的图示。(A)根据上面的图24和25。(B)用PBS洗涤固定的细胞，并重悬于含有1％BSA的PBS中，然后进行抗体染色。使用靶向CD8、TIM3和PD1抗体的一抗。将适当的抗体对照用于所有流式细胞术染色和采集。在LSRFortessa细胞计数器(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)上获取所有样品，并使用FlowJo v10软件分析数据。
图33提供了在来自转移性免疫疗法抗性癌症的MIC的临床前治疗中DL-2抑制抗性标签(signature)的图示。图表表示使用ASI数字病理学自动化系统测量的CSV的CFI值、PDL1-PTM1、ALDH1A1的NFI和ABCB5的FI，以选择细胞核减去背景(n≥40个细胞/样品/5名患者/组)。Mann-Whitney非参数t检验用于成对比较，并且Kruskal-Wallis用于比较组，其中****p＜0.0001、***p＜0.001、**p＜0.01和*p＜0.05。
图34提供了DL-2-N纯化的图示。(A)对照制剂(即，中空纳米颗粒)的尺寸分布图。(B)DL-2纳米颗粒(DL-2-NP)制剂的尺寸分布图。通过将脂质纳米颗粒与DL-2以3∶1的比例以12mL/min至18mL/min的流速组合形成纳米颗粒，或者仅使用脂质纳米颗粒用于中空对照。使用DLS测定纳米颗粒尺寸的强度，所述DLS是光子相关光谱-使用光散射来测量颗粒的布朗运动。(C)DL-2、DL-2-NP和DL-2-D稳定性在大鼠血浆模型中进行。该图显示了24小时(1440分钟)后保留的测试化合物的百分比。蓝色图：DL-2；橙色图：DL2-D；和灰色图：DL-2-NP。
图35提供了DL-2-NP处理对使用MDA-MB-23l癌细胞系的细胞增殖的影响的图示和照片表示。(A)数据代表一式三份进行的单个独立实验；结果绘制为平均值+/-标准误差(SE)。浓度表示从1＝0.001nM至10＝10nM的10个浓度读数。(B)用DL-2或载剂对照处理MDA-MB-231细胞24小时，浓度范围为10nM至0.3nM。用PDL1-PTM1(PDL1-AC)、CSV或DLL4染色的MDA-MB-231细胞的高分辨率成像。比例尺指示10μm。(B)图表表示细胞核(NFI)、细胞质(CFI)区室中的平均荧光强度或细胞核与荧光染色的比率(Fn/c)，其中比率大于1意指细胞核偏差，小于1意指细胞质偏差，并且0意指相等分布。根据Kruskal-Wallis单向ANOVA计算显著差异。
图36提供了展示DL-2-NP有效抑制PDL1和Impα1的靶复合物的图示。(A、B)使用ASI数字病理学系统利用100x物镜，通过对PDL1未修饰的&IMPα1染色的DUOLINK细胞进行高分辨率成像来比较。(A)使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1(未修饰的)和IMPα1 DUOLINK数字图像。(B)图表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，显著差异根据单向ANOVA比较计算。红色截止值表示DL-2-NP用于消除PDL1-(未修饰的)和IMPα1复合物的表达的IC50。(C、D)用载剂对照(中空纳米颗粒)或DL-2-NP以10nM至0.3nM的浓度处理MDA-MB-231细胞。(C)使用ASI数字病理学系统利用100x物镜，通过对PDL1-PTM1和IMPα1染色的DUOLINK细胞进行高分辨率成像来比较。将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测，并使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析PDL1-PTM1和IMPα1DUOLINK数字图像。(B)图表表示根据单向ANOVA比较计算的具有显著差异的细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度。红色截止值表示DL-2-NP消除PDL1-PTM1和IMPα1表达的IC50。
具体实施方式
1.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语定义如下。
冠词“一个(a和an)”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文中提及“约”值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
本文所用的术语“乙酰化位点”是指可以被乙酰化的任何氨基酸序列，例如，通过乙酰转移酶；特别是组蛋白乙酰转移酶，其非限制性实例包括GCN5、Hatl、ATF-2、Tip60、MOZ、MORF、HBO1、p300、CBP、SRC-1、ACTR、TIF-2、SRC-3、TAF1、TFIIIC和/或CLOCK，最特别是p300。术语“乙酰化位点”是指包含乙酰化底物(例如，赖氨酸残基)和可参与酶(例如，乙酰转移酶)的底物识别的周围和/或近端氨基酸残基的序列。乙酰化位点可以是任何合适长度的氨基酸序列，如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或大于22个残基，优选长度为14、15、16、17、18、19、20或21个残基。
术语“药剂(agent)”包括诱导所需药理学和/或生理学作用的化合物。该术语还包括本文具体提及的那些化合物的药学上可接受的和药理学上活性的成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。使用上述术语时，则应当理解，这包括活性药剂本身以及药学上可接受的、药理学上活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“药剂”不被狭窄地限制，而是延伸至小分子、PD-L1双环肽模拟物(如肽、多肽和蛋白质)以及包含它们的组合物和遗传分子(如RNA、DNA及其模拟物和化学类似物)以及细胞试剂。
如本文所用，“和/或”是指并包括一个或多个相关所列项的任何和所有可能的组合，以及当以替代物(或)解释时缺少组合。
术语“癌干细胞”(CSC)是指具有肿瘤起始和肿瘤维持能力的细胞，包括广泛增殖、形成新肿瘤和维持癌症发展的能力，即具有驱动肿瘤形成和生长的无限增殖潜力的细胞。CSC在生物学上不同于大量肿瘤细胞，并且具有与干细胞相关的特征，特别是自我更新和繁殖并产生在特定癌症样品中发现的所有细胞类型的能力。术语“癌干细胞”包括干细胞(SC)中的基因改变和成为CSC的细胞中的基因改变。在具体的实施方案中，CSC是乳腺CSC，其合适地是CD24+CD44+，其说明性实例包括CD44高CD24低(CD44highCD24low)。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述受试者中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括但不限于鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric或stomach cancer)(包括胃肠癌和胃肠间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney或renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、结节性黑色素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小非裂解细胞NHL；巨大肿块NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)，以及与母斑病(phakomatoses)相关的异常血管增殖、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)、Meigs综合征、脑以及头颈癌和相关转移。在某些实施方案中，适于通过本发明的抗体治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤、类癌、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自：小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)和肝细胞癌。然而，在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌，包括那些癌症的转移形式。在具体的实施方案中，癌症是黑色素瘤或肺癌，合适地是转移性黑色素瘤或转移性肺癌。
“化学治疗剂”包括用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括厄洛替尼(Genentech/OSI Pharm.)、硼替佐米(Millennium Pharm.)、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯、盐孢菌酰胺A(salinosporamide A)、卡非佐米、17-AAG(格尔德霉素)、根赤壳菌素、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、氟维司群(AstraZeneca)、sunitib(Pfizer/Sugen)、来曲唑(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(Novartis)、菲那舒那(finasunate)(Novartis)、奥沙利铂(Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素(Sirolimus，Wyeth)、拉帕替尼(GSK572016，Glaxo SmithKline)、洛那法尼(SCH 66336)、索拉菲尼(Bayer Labs)、吉非替尼(AstraZeneca)、AG1478、烷化剂如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶如苯佐多巴(benzodopa)、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(methylomelamine)；多聚乙酰(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括拓扑替康和伊立替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；肾上腺皮质类固醇(包括泼尼松和泼尼松龙)；醋酸环丙孕酮；5α-还原酶，包括非那雄胺和杜他雄胺；伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、丙戊酸、莫西他司、多司他丁；阿地白介素、滑石多卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，如苯丁酸氮芥、chlomaphazine、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、双氯乙基甲胺(chlorophosphamide)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.1994 33：183-186)；达内霉素，包括达内霉素A；双膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉霉素(carabicin)、caminomycin、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、(多柔比星)、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链霉黑素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如frolinic酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登木素生物碱，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidamnol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐呋喃sizofuran；锗螺胺；sizofuran；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫衫烷类(例如，TAXOL(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、(无克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，III.)和(多西他赛、多西紫杉醇；Sanofi-Aventis))；苯丁酸氮芥；(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；(长春瑞滨)；novantrone；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
化学治疗剂还包括(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括柠檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮和(柠檬酸托瑞米芬)；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素产生，如，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦；Pfizer)、formestanie、法倔唑、(伏氯唑)、(来曲唑；Novartis)和(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；布舍瑞林、曲普瑞林、醋酸甲羟孕酮、己烯雌酚、倍美力、氟甲睾酮、全反式视黄酸、芬维A胺以及曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，如，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；(vii)核酶，如VEGF表达抑制剂(例如，)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，如基因治疗疫苗，例如和 rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，如 rmRH；和(ix)上述任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
化学治疗剂还包括抗体，如阿仑单抗(Campath)、贝伐珠单抗(Genentech)；西妥昔单抗(Imclone)；帕尼单抗(Amgen)、利妥昔单抗(Genentech/Biogen Idec)、帕妥珠单抗(2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(Genentech)、托西莫单抗(Bexxar，Corixia)和抗体药物缀合物、吉妥珠单抗奥佐米星(Wyeth)。具有作为与本发明化合物组合的药剂的治疗潜力的其他人源化单克隆抗体包括：阿泊珠单抗(apolizumab)、阿塞珠单抗、atlizumab、巴匹组单抗(bapineuzumab)、莫比伐珠单抗(bivatuzumab mertansine)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、西利珠单抗(cedelizumab)、培塞利珠单抗(certolizumab pego1)、cidfusituzumab、cidtuzumab、达克珠单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗(erlizumab)、非维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉妥珠单抗奥佐米星、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗、拉贝珠单抗、林妥珠单抗、马妥珠单抗、美泊利珠单抗、莫维珠单抗、motovizumab、那他珠单抗、尼妥珠单抗、诺洛珠单抗(nolovizumab)、努马维珠单抗(numavizumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕考珠单抗(pascolizumab)、pecfusituzumab、帕妥珠单抗(pectuzumab)、培克珠单抗、ralivizumab、雷珠单抗、reslivizumab、瑞利珠单抗、热西维珠单抗(resyvizumab)、罗维珠单抗、卢利珠单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗、索土珠单抗、他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗、他利珠单抗、替替非组单抗(tefibazumab)、托珠单抗、托拉珠单抗(toralizumab)、西莫白介素单抗、tucusituzumab、mavizumab、乌珠单抗、乌司奴单抗、维西珠单抗和抗白介素-12(ABT-874/J695，Wyeth Research and Abbott Laboratories)，其是重组的唯一的人序列全长IgG1λ抗体，经遗传修饰以识别白介素-12p40蛋白。
化学治疗剂还包括“EGFR抑制剂”，其是指与EGFR结合或以其他方式直接相互作用并阻止或降低其信号传导活性的化合物，并且也可称为“EGFR拮抗剂”。此类试剂的实例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与EGFR结合的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见，美国专利号4,943,533，Mendelsohn等人)及其变体，如嵌合225(C225或西妥昔单抗；)和重塑的人225(H225)(参见，WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，一种全人EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变EGFR的抗体(美国专利号5,212,290)；如美国专利号5,891,996中所述的结合EGFR的人源化和嵌合抗体；和结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF或帕尼单抗(参见，WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto等人，Eur.J.Cancer 32A：636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗)，一种与EGF和TGF-α竞争EGFR结合的针对EGFR的人源化EGFR抗体(EMD/Merck)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；称为El.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3的全人抗体，并描述于美国专利号6,235,883中；MDX-447(Medarex Inc)；和mAb 806或人源化mAb 806(Johns等人，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可以与细胞毒性剂缀合，从而产生免疫缀合物(参见，例如，EP659439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，如美国专利号5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008和5,747,498以及以下的PCT公开：WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037中所述的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774、厄洛替尼、Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI 1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸盐，Pfizer Inc.)；ZD 1839，吉非替尼4-(3′-氯-4′-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8-二胺，Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)-；(R)-6-(4-羟苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(-二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼(GSK572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2-甲基磺酰基]乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化学治疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，包括前段所述的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，如可获自Takeda的TAK165；CP-724，714，一种ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；双重HER抑制剂，如EKB-569(可获自Wyeth)，其优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR过表达细胞；拉帕替尼(GSK572016；可获自Glaxo-SmithKline)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可获自Novartis)；泛HER抑制剂，如卡奈替尼(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，如可从ISIS Pharmaceuticals获得的反义制剂ISIS-5132，其抑制Raf-1信号传导；非HER靶向TK抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(可获自Glaxo SmithKline)；多靶点酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼(可获自Pfizer)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，如瓦他拉尼(PTK787/ZK222584，可获自Novartis/Schering AG)；MAPK胞外调节激酶I抑制剂CI-1040(可获自Pharmacia)；喹唑啉，如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶，4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4，5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的tyrphostine；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如，与HER编码核酸结合的那些)；喹喔啉(美国专利号5,804,396)；tryphostin(美国专利号5,804,396)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制剂，如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Pfizer)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imelone)，雷帕霉素(西罗莫司，)；或如任何以下专利公开中所述的：美国专利号5,804,396；WO 1999/09016(American Cyanamid)；WO 1998/43960(American Cyanamid)；WO 1997/38983(Warner Lambert)；WO 1999/06378(Warner Lambert)；WO 1999/06396(Warner Lambert)；WO 1996/30347(Pfizer，Inc)；WO 1996/33978(Zeneca)；WO 1996/3397(Zeneca)和WO1996/33980(Zeneca)。
化学治疗剂还包括地塞米松、干扰素、秋水仙碱、氯苯氨啶(metoprine)、环孢菌素、两性霉素、甲硝唑、阿仑单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、氨磷汀、三氧化二砷、天冬酰胺酶、活卡介苗、bevacuzimab、贝沙罗汀、克拉屈滨、氯法拉滨、达贝泊汀α、地尼白介素、右雷佐生、依泊汀α、elotinib、非格司亭(filgrastim)、醋酸组氨瑞林、替伊莫单抗、干扰素α-2a、干扰素α-2b、来那度胺、左旋咪唑、美司钠、甲氧沙林、诺龙、奈拉滨、诺非妥单抗nofetumomab、奥普瑞白介素(oprelvekin)、帕利弗明、帕米膦酸盐(pamidronate)、培加酶、培门冬酶、聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim)、培美曲塞二钠、普利卡霉素、卟吩姆钠(porfimer sodium)、喹那西林(quinacrine)、拉布立酶(rasburicase)、沙格司亭、替莫唑胺、VM-26、6-TG、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星、唑来膦酸盐和唑来膦酸，及其药学上可接受的盐。
化学治疗剂还包括氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松、新戊酸替可托、曲安奈德、曲安西龙醇、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松(fluocinonide)、醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、二丙酸阿氯米松、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、泼尼卡酯、氯倍他松-17-丁酸酯、氯倍他索-17-丙酸酯、氟可龙己酸酯、氟可龙新戊酸酯和醋酸氟泼尼定；免疫选择性抗炎肽(ImSAID)，如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构体形式(feG)(IMULAN Biotherapeutics，LLC)；抗风湿药物，如硫唑嘌呤、环孢菌素(环孢菌素A)、D-青霉胺、金盐、羟氯喹hydroxychloroquine、来氟米特米诺环素(leflunomideminocycline)、柳氮磺胺吡啶、肿瘤坏死因子α(TNF-α)阻断剂，如依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、赛妥珠单抗(Cimzia)、戈利木单抗(Simponi)、白介素1(IL-1)阻断剂，如阿那白滞素(Kineret)、T细胞共刺激阻断剂，如阿巴西普(Orencia)、白介素6(IL-6)阻断剂，如托珠单抗白介素13(IL-13)阻断剂，如lebrikizumab；干扰素α(IFN)阻断剂，如隆利组单抗Rontalizumab；β7整联蛋白阻断剂，如rhuMAb Beta7；IgE途径阻断剂，如抗M1 prime；分泌的同源三聚体LTa3和膜结合的异源三聚体LTa1/β2阻断剂，如抗淋巴毒素α(LTa)；放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；混杂研究性药剂，如thioplatin、PS-341、丁酸苯酯、ET-18-OCH3或法尼基转移酶抑制剂(L-739749、L-744832)；多酚，如槲皮素、白藜芦醇、白皮杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、黄烷醇、原花青素、桦木酸及其衍生物；自噬抑制剂，如氯喹；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；乙酰喜树碱、scopolectin和9-氨基喜树碱)；podophyllotoxin；tegafurbexarotene双膦酸盐，如氯膦酸盐(例如，或)、依替膦酸盐NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿仑膦酸盐帕米膦酸盐替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如疫苗；哌立福辛，COX-2抑制剂(例如，塞来昔布或依托昔布)、蛋白酶体抑制剂(例如，PS341)；CCI-779；替吡法尼(R11577)；奥拉非尼(orafenib)，ABT510；Bcl-2抑制剂，如奥利默森钠匹杉琼；法尼基转移酶抑制剂，如洛那法尼(SCH6636，SARASARTM)；和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写)；和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和甲酰四氢叶酸组合的治疗方案的缩写)。
化学治疗剂还包括具有止痛、退热和抗炎作用的非甾体抗炎药。NSAID包括环加氧酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体实例包括阿司匹林；丙酸衍生物，如布洛芬、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦和萘普生；乙酸衍生物，如吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、双氯芬酸；烯醇酸衍生物，如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈噁昔康、氯诺昔康和伊索昔康；芬那酸衍生物，如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸；和COX-2抑制剂，如塞来昔布、依托昔布、罗美昔布、帕瑞昔布、罗非昔布、罗非昔布和伐地昔布。NSAID可适用于病症的症状缓解，所述病症如类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性关节病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、莱特尔氏综合征、急性痛风、痛经、转移性骨痛、头痛和偏头痛、术后疼痛、由于炎症和组织损伤引起的轻度至中度疼痛、发热、肠梗阻和肾绞痛。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(以及其各种词性)”将被理解为暗示包括所述步骤或要素或者步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的组。因此，术语“包含”等的使用指示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在。“由……组成”意指包括并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，并且不存在其他要素。“基本上由……组成”意指包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于本公开中针对所列要素指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是其他要素是任选的，并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
“对应于(以及其各种词性)”是指显示出与参考氨基酸序列实质性的序列相似性或同一性的氨基酸序列。通常，氨基酸序列将显示出与参考氨基酸序列的至少一部分至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、97％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至高达100％的序列相似性或同一性。
“衍生物”是指通过修饰，例如通过与其他化学部分缀合或复合，或通过本领域已知的翻译后修饰技术，从基础分子衍生的分子，如多肽。术语“衍生物”在其范围内还包括对亲本序列进行的改变，包括提供功能等同分子的添加或缺失。
如本文所用，术语“剂量单位形式(dosage unit form)”是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性物质以及所需的药学上可接受的载剂。
“有效量”至少是实现特定障碍的可测量的改善或预防所需的最小量。本文中的有效量可以根据诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何毒性或有害效果的量。对于预防用途，有益或期望的结果包括诸如消除或降低风险、减轻严重程度或延迟疾病发作的结果，包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病发展期间呈现的中间病理表型。对于治疗用途，有益或期望的结果包括临床结果，如减少由疾病引起的一种或多种症状，提高患有疾病的患者的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，如通过靶向增强另一种药物的治疗效果，延迟疾病进展和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可以具有减少癌细胞数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓或期望停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在一定程度上减缓并期望停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症或肿瘤相关的一种或多种症状的作用。有效量可以在一次或多次施用中施用。出于本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床背景中所理解的，药物、化合物或药物组合物的有效量可以或可以不与另一种药物、化合物或药物组合物联合实现。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的背景下考虑“有效量”，并且如果与一种或多种其他药剂联合，可以实现或实现期望的结果，则可以认为单一药剂以有效量给予。
患者对药物治疗的“有效反应”或患者的“反应性”和类似措辞是指赋予处于疾病或障碍(例如，癌症)风险中或患有疾病或障碍(例如，癌症)的患者的临床或治疗益处。在一个实施方案中，此类益处包括以下任何一种或多种：延长存活(包括总体存活和无进展存活)；导致客观反应(包括完全反应或部分反应)；或改善癌症的体征或症状。对治疗“不具有有效反应”的患者是指不具有以下任一项的患者：延长存活(包括总体存活和无进展存活)；导致客观反应(包括完全反应或部分反应)；或改善癌症的体征或症状。
本文所用的术语“消除半衰期”是指从受试者血浆中消除肽的终末对数线性速率。本领域技术人员将理解，半衰期是作为清除率和分布体积的函数而变化的衍生参数。在消除半衰期的上下文中使用的术语“延长的”、“更长的”或“增加的”在本文中可互换使用，并且旨在意指如在相当条件下测定的，相对于参考分子(例如，线性L-氨基酸肽)的半衰期，肽(例如，双环肽)的半衰期存在统计学上显著的增加。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在编码序列的情况下，表达涉及将编码序列转录成mRNA并将mRNA翻译成一种或多种多肽。相反，非编码序列的表达仅涉及非编码序列转录成转录物。术语“表达”在本文中也用于指蛋白质或分子在特定位置的存在，因此可以与“定位”互换使用。
关于基因序列的术语“表达”是指基因转录以产生RNA转录物(例如，mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等)，并且视情况将所得mRNA转录物翻译成蛋白质。因此，如从上下文将清楚的，编码序列的表达由编码序列的转录和翻译产生。相反，非编码序列的表达由非编码序列的转录产生。
如本文所用，术语“高”是指大于正常、大于标准(如预定量度或亚组量度)或相对大于另一亚组量度的量度。例如CD44hlgh指大于正常CD44量度的CD44量度。因此，“CD44hlflh”总是至少对应于受试者身体的相关部分或来自受试者身体的相关样品中可检测的CD44。可以根据本领域技术人员可用的任何方法确定正常量度。术语“高”还可以指等于或大于预定量度(如预定截止值)的量度。如果受试者对于特定标志物不是“高”，则其对于该标志物是“低”的。通常，应当选择用于确定受试者是“高”还是“低”的截止值，使得划分变得在临床上相关。
术语“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，其可以是或已经是本发明的任何重组载体(vector)或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、意外的或有意的突变和/或变化，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态上或在总DNA补体上)。宿主细胞包括用本发明的重组载体或多核苷酸在体内或体外转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。
“杂交”在本文中用于表示互补核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂合体或DNA-RNA杂合体。互补碱基序列是通过碱基配对规则相关的那些序列。在DNA中，A与T配对，而C与G配对。在RNA中，U与A，而C与G配对。在这点上，本文所用的术语“匹配”和“错配”是指互补核酸链中配对核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸有效杂交，如上述经典的A-T和G-C碱基对。错配是不能有效杂交的核苷酸的其他组合。在本发明中，优选的配对机制涉及寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键配对的互补核碱基。杂交可以在本领域技术人员已知的不同情况下发生。
本文所用的术语“抑制剂”是指降低或抑制靶分子的至少一种功能或生物活性的试剂。
如本文所用，术语“分离的”是指基本上或本质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的物质。例如，“分离的肽”是指PD-L1双环肽模拟物从其天然细胞环境中和从与细胞的其他组分的缔合中体外分离和/或纯化。“基本上不含”意指肽制剂为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯。在优选的实施方案中，肽制剂具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(按干重计)的不是本发明主题的分子(也称为“杂质分子”)。重组产生肽时，还希望其基本上不含培养基，即培养基占小于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的制剂体积。本发明包括干重为至少0.01mg、0.1mg、1.0mg和10mg的分离或纯化的制剂。
如本文所用，“说明材料”包括出版物、记录、图表或可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的任何其他表达介质。本发明的试剂盒的说明材料可以例如固定在含有本发明的治疗剂或诊断剂的容器上，或者与含有本发明的治疗剂或诊断剂的容器一起运输。
术语“脂质体”是指人工制备的由脂双层组成的囊泡。脂质体可用于递送治疗剂，因为它们具有将水溶液的一部分包封在亲脂性双层膜内的独特性质。亲脂性化合物可以溶解在脂质双层中，并且以这种方式，脂质体可以携带亲脂性和亲水性化合物两者。为了将分子递送至作用位点，脂质双层可以与其他双层(如细胞膜)融合，从而递送脂质体内容物。
术语“间充质表型”在本领域中是理解的，并且可以通过形态学、分子和/或功能特征来鉴定。例如，与上皮细胞相比，间充质细胞通常具有细长或纺锤形外观，表达间充质标志物波形蛋白、纤连蛋白和N-钙粘蛋白，分裂缓慢或不分裂和/或具有相对高水平的运动性、侵袭性和/或锚定非依赖性生长。
如本文所用，术语“间充质-上皮转化”(MET)是一种可逆的生物学过程，其涉及从运动的、多极或纺锤形间充质细胞向称为上皮细胞的极化细胞的平面阵列的转化。MET是EMT的逆过程。MET发生在正常发育、癌症转移和诱导的多能干细胞重编程中。在具体的实施方案中，MET是指已经经历EMT的细胞的重编程以重新获得一种或多种上皮特征(例如，如上所述)。例如，此类细胞通常表现出降低的运动性和/或侵袭性和/或快速分裂，从而可以恢复对免疫治疗剂和/或细胞毒性剂的敏感性。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。这些术语不排除修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。主题肽的可溶形式是特别有用的。该定义内包括例如含有一种或多种氨基酸类似物的肽，所述氨基酸类似物包括例如非天然氨基酸或具有取代键的多肽。
术语“药物组合物”或“药物制剂”是指这样的制剂，其处于允许活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对将施用组合物或制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(载剂、添加剂)是可以合理地施用于受试哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些。
如本文所用，术语“PD-L1过表达细胞”是指脊椎动物细胞，特别是哺乳动物或禽类(鸟)细胞，特别是哺乳动物细胞，其以可检测的高于正常细胞的水平表达PD-L1。细胞可以是脊椎动物细胞，如灵长类动物细胞；禽类(鸟)细胞；家畜动物细胞(如绵羊细胞、牛细胞、马细胞、鹿细胞、驴细胞和猪细胞)；实验室测试动物细胞(如兔细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞和仓鼠细胞)；伴侣动物细胞(如猫细胞和狗细胞)；和捕获的野生动物细胞(如狐狸细胞、鹿细胞和野狗细胞)。在具体的实施方案中，PD-L1过表达细胞是人细胞。在具体的实施方案中，PD-L1过表达细胞是癌干细胞或非癌干细胞肿瘤细胞；优选癌干细胞肿瘤细胞。与正常细胞或比较细胞(例如，乳腺细胞)相比，过表达可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
“药学上可接受的载体(carrier)”是指由不是生物学上或其他方面不需要的材料组成的药物载剂，即该材料可以与所选的活性剂一起施用于受试者而不引起任何或实质性的不良反应。载体可以包括赋形剂和其他添加剂，如稀释剂、洗涤剂、着色剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂、转染剂等。
类似地，本文提供的化合物的“药理学上可接受的”盐、酯、酰胺、前药或衍生物是在生物学上或其他方面不是不合需要的盐、酯、酰胺、前药或衍生物。
如本文所用，术语“预防(以及其各种词性)”是指预防性治疗，其增加受试者对发展疾病或病症的抗性，或者换句话说，降低受试者将发展疾病或病症的可能性，以及在疾病或病症开始后的治疗，以减少或完全消除疾病或病症或防止疾病或病症变得更糟。这些术语在其范围内还包括预防疾病或病症在可能易患该疾病或病症但尚未被诊断为患有该疾病或病症的受试者中发生。
“放射疗法”是指使用定向γ射线或β射线诱导对细胞的足够损伤，从而限制其正常发挥功能的能力或完全破坏细胞。应当理解，本领域已知有许多方法来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用给予，并且典型的剂量范围为每天10至200个单位(戈瑞)。
术语“减少”、“抑制”、“遏制”、“降低”和语法上的等同物，用于指第一样品中物质和/或现象相对于第二样品的水平时，是指第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中物质和/或现象的量低任何量，该量使用任何本领域公认的统计分析方法是统计学上显著的。在一个实施方案中，可以主观地确定减少，例如患者提及其对疾病症状(例如，疼痛、疲劳等)的主观感知时。在另一个实施方案中，可以客观地确定减少，例如来自患者的样品中的CSC和/或非CSC肿瘤细胞的数量低于来自患者的早期样品中的CSC和/或非CSC肿瘤细胞的数量时。在另一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少10％。在另一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少25％。在又一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少50％。在另一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少75％。在又一个实施方案中，第一样品中物质和/或现象的量比第二样品中相同物质和/或现象的量低至少90％。可选地，差异可以表示为差“n倍”。
如本文所用，术语“盐”和“前药”包括任何药学上可接受的盐、酯、水合物或任何其他化合物，其在施用于接受者后能够(直接或间接地)提供本发明的PD-L1双环肽模拟物或其活性代谢物或残余物。合适的药学上可接受的盐包括药学上可接受的无机酸的盐，如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸，或药学上可接受的有机酸的盐，如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸和戊酸。碱盐包括但不限于与药学上可接受的阳离子，如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵形成的那些。此外，碱性含氮基团可以用以下试剂季铵化：低级烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸酯，如硫酸二甲酯和硫酸二乙酯；以及其他。然而，应当理解，非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内，因为它们可用于制备药学上可接受的盐。盐和前药的制备可以通过本领域已知的方法进行。例如，金属盐可以通过本发明的化合物与金属氢氧化物的反应来制备。可以通过使适当的酸与本发明的PD-L1双环肽模拟物反应来制备酸式盐。
本文所用的术语“样品”包括可以从受试者中提取、未处理、处理、稀释或浓缩的任何生物样品。样品可以包括但不限于生物流体，如全血、血清、红细胞、白细胞、血浆、唾液、尿液、大便(即粪便)、泪液、汗液、皮脂、乳头抽吸物、导管灌洗液、肿瘤渗出物、滑液、腹水、腹膜液、羊水、脑脊液、淋巴液、细针抽吸物、羊水、任何其他体液、细胞裂解物、细胞分泌产物、炎症液、精液和阴道分泌物。样品可以包括组织样品和活组织检查、组织匀浆等。有利的样品可以包括包含可检测量的如本文教导的任何一种或多种生物标志物的样品。合适地，样品可通过微创方法容易地获得，允许去除或分离来自受试者的样品。在某些实施方案中，样品含有血液，特别是外周血，或其级分或提取物。通常，样品包含血细胞，例如成熟、未成熟或发育中的白细胞，包括淋巴细胞、多形核白细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、网织红细胞、嗜碱性粒细胞、体腔细胞、血细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞或此类细胞的级分(例如，核酸或蛋白质级分)。在具体的实施方案中，样品包含白细胞，包括外周血单核细胞(PBMC)。
本文所用的术语“支架”或“分子支架”是指在本发明的组合物中在烷基氨基键和硫醚键(存在半胱氨酸时)处与肽键合的化学部分。如本文所用的术语“支架分子”或“分子支架分子”是指能够与肽或肽配体反应以形成具有烷基氨基并且在某些实施方案中还具有硫醚键的本发明衍生物的分子。因此，支架分子具有与支架部分相同的结构，除了分子的相应反应性基团(如离去基团)被与支架部分中的肽的烷基氨基和硫醚键取代。
本文中可互换使用的术语“受试者”、“患者”、“宿主”或“个体”是指需要治疗或预防的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如，人、猴和猿，并且包括来自猕猴属(例如，食蟹猴，如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)和/或恒河猴(Macaca mulatta)和豚尾狒狒(Papio ursinus))的猴物种，以及狨猴(来自狨属(Callithrix)的物种)、松鼠猴(来自松鼠猴属(Saimiri)的物种)和绢毛猴(来自柽柳猴属(Saguinus)的物种)，以及猿的物种，如黑猩猩(Pan troglodytes))；啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)；兔形动物(例如，兔、野兔)；牛科动物(例如，牛)；绵羊类(例如，绵羊)；山羊类(例如，山羊)；猪科动物(例如，猪)；马科动物(例如，马)；犬科动物(例如，狗)；猫科动物(例如，猫)；鸟类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟，如金丝雀、鹦鹉等)；海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸鱼)；爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼类。优选的受试者是需要引发免疫反应的人，包括具有增强的T细胞激活的免疫反应。然而，应当理解，上述术语并不意味着存在症状。
如本文所用，术语“治疗(以及其各种词性)”是指设计用于在临床病理学过程中改变所治疗个体或细胞的自然过程的临床干预。期望的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。例如，如果减轻或消除与T细胞功能障碍性病症相关的一种或多种症状，包括但不限于减少(或破坏)癌细胞的增殖，减少病原体感染，减少由疾病引起的症状，提高患有疾病的那些的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，和/或延长个体的存活，则个体被成功地“治疗”。
如本文所用，术语“肿瘤”是指任何赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语癌症和癌性是指或描述哺乳动物中通常部分以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。如本文所用，术语“癌症”是指非转移性和转移性癌症，包括早期和晚期癌症。术语“癌前”是指通常在癌症之前或发展成癌症的病症或生长。术语“非转移性”是指良性的或保留在原发部位并且尚未穿透到淋巴或血管系统或原发部位以外的组织的癌症。通常，非转移性癌症是0期、I期或II期癌症的任何癌症。“早期癌症”是指非侵袭性或转移性的癌症，或分类为0、I或II期癌症。术语“晚期癌症”通常是指III期或IV期癌症，但也可以指II期癌症或II期癌症的亚阶段。本领域技术人员将理解，将II期癌症分类为早期癌症或晚期癌症取决于癌症的特定类型。癌症的说明性实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、甲状腺癌、肾癌(肾脏癌)、癌、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤、直肠癌和食道癌。在一个示例性实施方案中，癌症是乳腺癌或黑色素瘤。
除非另有特别说明，本文所述的每个实施方案经必要的修改后适用于每个实施方案。
2.双环肽
本发明部分基于PD-L1双环肽模拟物有效刺激间充质抗性标签癌细胞向上皮反应性癌细胞的转变的确定。经鉴定，这种活性是由于PD-L1核定位的抑制或减少引起的。在一个或多个实施方案中，此类双环肽抑制或减少癌干细胞和非癌干细胞肿瘤细胞的形成、维持和/或活力，和/或抑制EMT和/或诱导MET或癌干细胞肿瘤细胞。因此，发明人设想本发明的双环肽可用于治疗或预防癌症。
2.1 PD-L2双环肽模拟物
因此，在本发明的一个方面，提供了分离的或纯化的PD-L1双环肽模拟物或经修饰的衍生物或药学上可接受的盐，所述PD-L1双环肽模拟物包含多肽和分子支架，所述多肽包含由至少两个环序列分开的至少三个半胱氨酸残基，所述分子支架与多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在所述分子支架上形成至少两个多肽环，其中所述PD-L1双环肽模拟物包含以下氨基酸序列：
Z1X1C1LX2X3IFC2X4LRKGX5C3MX6MDX8KX9
其中：
C1、C2和C3分别表示第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X1不存在或是丙氨酸；
X2选自任何小的氨基酸(任选地，苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸)
X3选自任何氨基酸；
X4选自任何氨基酸；
X5选自任何氨基酸；
X6选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X7选自任何非极性/中性氨基酸(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和正亮氨酸)；
X8选自任何非极性/中性氨基酸(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和正亮氨酸)；
X9选自任何氨基酸；以及
Z1不存在或是1-十四烷酸。
在一些实施方案中，式I的PD-L1双环肽模拟物包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成：
ACLTFIFCRLRKGRCMMDVKK[SEQ ID NO：1]。
在这方面，在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物包含以下分子结构、由以下分子结构组成或基本上由以下分子结构组成：
在优选的实施方案中，式I的PD-L1双环肽模拟物具有选自以下的任何一种或多种活性：(i)增加细胞死亡；(ii)增加MET；(iii)减少或抑制EMT；(iv)抑制或减少维持；(v)抑制或减少增殖；(vi)增加分化；(vii)抑制或减少形成；或(viii)降低PD-L1过表达细胞的活力。在一些实施方案中，PD-L1过表达细胞是癌干细胞或非癌干细胞肿瘤细胞；特别是癌干细胞肿瘤细胞。
在一些实施方案中，式I的PD-L1双环肽模拟物与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相似性。在一些实施方案中，式I的PD-L1双环肽模拟物与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
本发明还涉及作为SEQ ID NO：1的变体的PD-L1双环肽模拟物。此类“变体”PD-L1双环肽模拟物包括通过在PD-L1双环肽模拟物的N-末端和/或C-末端缺失或添加一个或多个氨基酸，在PD-L1双环肽模拟物中的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸，或在PD-L1双环肽模拟物中的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO：1的PD-L1双环肽模拟物。
本发明包括的变体PD-L1双环肽模拟物是生物活性的，即它们继续具有天然PD-L1双环肽模拟物的所需生物活性。
SEQ ID NO：l的PD-L1双环肽模拟物可以以各种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，SEQ ID NO：1的氨基酸序列变体可以通过诱变编码SEQ ID NO：l中任一个的氨基酸序列的核酸来制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如Kunkel(1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：488-492)、Kunkel等人(1987，Methods In Enzymol，154：367-382)、美国专利号4,873,192、Watson，J.D.等人(“Molecular Biology ofthe Gene”，第四版，Benjamir V.Cummings，加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park，Calif.)，1987)和其中引用的参考文献。关于不影响目的PD-L1双环肽模拟物的生物活性的适当氨基酸取代的指导可见于Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(华盛顿美国国家生物医药研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))。用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物以及用于筛选cDNA文库中具有所选性质的基因产物的方法是本领域已知的。此类方法适用于快速筛选通过SEQ ID NO：1的PD-L1双环肽模拟物的组合诱变产生的基因文库。递归集合诱变(REM)是一种提高文库中功能突变体频率的技术，其可与筛选测定组合使用以鉴定活性变体(Arkin和Yourvan(1992)Pnoc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：7811-7815；Delgrave等人，(1993)Protein Engineering，6：327-331)。保守取代，如将一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸交换，可能是期望的，如下文更详细讨论的。
与亲本(例如，参考)氨基酸序列(如SEQ ID NO：1)相比，本发明的变体PD-L1双环肽模拟物可在沿其序列的各个位置处含有保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义，如下文详细讨论的。
酸性：由于在生理pH下质子的损失，残基具有负电荷，并且残基被水溶液吸引以便肽在生理pH下的水性介质中时寻找其中含有它的肽构象中的表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
碱性：残基由于在生理pH下或在其一个或两个pH单位内与质子缔合而具有正电荷(例如，组氨酸)，并且残基被水溶液吸引以便肽在生理pH下的水性介质中时寻找其中包含它的肽构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
带电荷的：残基在生理pH下带电荷，且因此包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
疏水性：残基在生理pH下不带电，并且残基被水溶液排斥，以便肽在生理pH下的水性介质中时寻找其中包含它的肽构象中的内部位置。具有疏水性侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
中性/极性：残基在生理pH下不带电荷，但残基不被水溶液充分排斥，使得肽在生理pH下的水性介质中时，它将寻找其中包含它的肽构象中的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
该说明书还将某些氨基酸表征为“小的(small)”，因为即使缺少极性基团，它们的侧链也不足以赋予疏水性。除脯氨酸外，“小的”氨基酸是至少一个极性基团在侧链上时具有四个或更少碳并且不在侧链上时具有三个或更少碳的那些氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。由于其对肽链的二级构象的已知影响，基因编码的二级氨基酸脯氨酸是一种特殊情况。脯氨酸的结构与所有其他天然存在的氨基酸的不同之处在于其侧链与α-氨基的氮以及α-碳键合。然而，几种氨基酸相似性矩阵(例如，Dayhoff等人(1978)，A model of evolutionary change in proteins.matrix for determiningdistance relationships，见M.Dayhofr，(编辑)，Atlas of protein sequence andstructure，第5卷，第345-358页，华盛顿美国国家生物医药研究基金会(NationalBiomedical Research Foundation,Washington DC)和Gonnet等人(1992)，Science，256(5062)：1443-1445中公开的PAM 120矩阵和PAM 250矩阵)包括与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸同一组的脯氨酸。因此，出于本发明的目的，脯氨酸被分类为“小的”氨基酸。
分类为极性或非极性所需的吸引或排斥程度是任意的，并且因此本发明特别考虑的氨基酸已被分类为一种或另一种。大多数未具体命名的氨基酸可以基于已知行为进行分类。
氨基酸残基可以进一步细分为环状或非环状、芳香族或非芳香族残基，这些与残基侧链取代基有关的分类不言自明，还可细分为小的或大的残基。如果残基含有总共四个或更少的碳原子，包括羧基碳，条件是存在另外的极性取代基；如果不是，为三个或更少的碳原子，则认为残基是小的。当然，小的氨基酸残基总是非芳香族的。取决于它们的结构特性，氨基酸残基可以落入两个或更多个类别中。对于天然存在的蛋白质氨基酸，根据该方案的亚级分类示于表1中。
表1
氨基酸亚级分类
保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和正亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸，用谷氨酸替换天冬氨酸，用丝氨酸替换苏氨酸，或用结构相关的氨基酸类似地替换氨基酸将不会对所得的本发明变体肽的性质产生重大影响。氨基酸变化是否导致抑制或降低可核定位多肽(如PD-1、PD-L1和/或PD-L2)的核定位的PD-L1双环肽模拟物可以通过测定其活性来容易地确定。保守取代在表2中在示例性和优选取代的标题下示出。落入本发明范围内的氨基酸取代通常通过选择在其对维持(a)取代区域中肽骨架的结构、(b)分子在靶位点的电荷或疏水性或(c)侧链的主体的影响方面没有显著差异的取代来实现。在引入取代后，筛选变体的生物活性。
表2
示例性和优选的氨基酸取代
可选地，用于进行保守取代的相似氨基酸可以基于侧链的特性分为三类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸，它们都具有带电荷的侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和正亮氨酸，如Zubay，Biochemistry，第三版，Wm.C.Brown Publishers(1993)中所述的。
本发明的PD-L1双环肽模拟物中的Thusn必需氨基酸残基通常被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。可选地，可以沿着本发明的PD-L1双环肽模拟物的全部或部分编码序列随机引入突变，如通过饱和诱变，并且可以针对亲本多肽的活性筛选所得突变体，如例如本文所述，以鉴定保留该活性的突变体。在编码序列诱变后，可以重组表达所编码的PD-L1双环肽模拟物并测定其活性。“非必需”氨基酸残基是可以从本发明的实施方案PD-L1双环肽模拟物的参考序列改变而不消除或基本上改变其一种或多种活性的残基。合适地，改变基本上不改变这些活性之一，例如，活性是野生型活性的至少20％、40％、60％、70％或80％。相比之下，“必需”氨基酸残基是从本发明的实施方案PD-L1双环肽模拟物的野生型序列改变时，导致亲本分子的活性消除，使得存在小于20％的野生型活性的残基。
因此，本发明还考虑了SEQ ID NO：1的PD-L1双环肽模拟物的变体，其中变体与亲本序列的区别在于一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代。通常，变体将显示与参考PD-L1双环肽模拟物序列至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性，例如，如SEQ IDNO：1所示，如通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数所确定的。理想地，变体将与亲本或参考PD-L1双环肽模拟物序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，例如，如SEQ ID NO：1所示，如通过本文所述的序列比对程序使用默认参数所确定的。落入本发明的变体PD-L1双环肽模拟物范围内的SEQ ID NO：1的变体通常可以与亲本分子相差至少1个，但少于5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的变体PD-L1双环肽模拟物与SEQ ID NO：1中的相应序列相差至少1个，但少于5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，本发明的变体PD-L1双环肽模拟物的氨基酸序列包含式I的PD-L1双环肽模拟物。在具体的实施方案中，本发明的变体PD-L1双环肽模拟物抑制或减少PD-L1的核定位。
如果序列比较需要比对，则通常对序列进行比对以获得最大相似性或同一性。来自缺失或插入或错配的“环”出序列(“looped”our sequence)通常被认为是差异。合适地，差异是非必需残基处的差异或变化或保守取代。
在一些实施方案中，序列之间的序列相似性或序列同一性的计算如下进行：
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较的目的对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位，并且为了比较的目的，可以忽略非同源序列)。在一些实施方案中，出于比较目的比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少40％，更通常至少50％或60％，甚至更通常至少70％、80％、90％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是相同的。对于氨基酸序列比较，当第一序列中的位置被第二序列中相应位置处的相同或相似氨基酸残基占据(即保守取代)时，则分子在该位置处是相似的。
两个序列之间的同一性百分比是所述序列在各个位置共有的相同氨基酸残基数的函数，其中考虑了为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位数目和每个空位的长度。相比之下，两个序列之间的相似性百分比是在单个序列处由序列共有的相同和相似氨基酸残基的数目的函数。考虑到空位的数量和每个空位的长度，需要引入空位的数量和每个空位的长度以实现两个序列的最佳比对。
序列的比较和序列之间百分比同一性或百分比相似性的确定可以使用数学算法来完成。在某些实施方案中，使用Needleman和WQnsch，(1970，J.Mol.Biol.，48：444-453)算法、使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定氨基酸序列之间的同一性或相似性百分比，所述算法已并入GCG软件包(Devereaux等人(1984)Nucleic Adds Research，12：387-395)中的GAP程序中。在一些实施方案中，氨基酸序列之间的同一性或相似性百分比可以使用Meyers和Miller(1989，Cablos，4：11-17)的算法、使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定，所述算法已经并入ALIGN程序(2.0版)中。
本发明还涉及分离或纯化的PD-L1双环肽模拟物，其由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列在本文定义的严格条件下，特别是在中等、高或极高严格条件下，优选在高或极高严格条件下，与编码SEQ ID NO：1的PD-L1双环肽模拟物的多核苷酸序列或其非编码链杂交。本发明还考虑了包含多核苷酸序列的分离的核酸分子，所述多核苷酸序列在本文定义的严格条件下，特别是在中等、高或极高严格条件下，优选在高或极高严格条件下，与编码SEQ ID NO：1的PD-L1双环肽模拟物的多核苷酸序列或其非编码链杂交。
如本文所用，术语“在严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件，并且可以包括低严格性、中等严格性、高严格性和极高严格条件。
进行杂交反应的指导可以在Ausubel等人(1998)Current Protocols inMolecular Biology(约翰威利父子出版公司)，特别是6.3.1-6.3.6节中找到。可以使用水性和非水性方法。本文提及的低严格条件包括并涵盖用于在42℃下杂交的至少约1％v/v至至少约15％v/v甲酰胺和至少约1M至至少约2M盐，以及用于在42℃洗涤的至少约1M至至少约2M盐。低严格条件还可以包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％十二烷基硫酸钠(SDS)，用于在65℃下杂交，和(i)2c氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.1％SDS；或(II)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS，用于在室温下洗涤。低严格条件的一个实施方案包括在约45℃下在6cSSC中杂交，接着在至少50℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格条件，洗涤温度可增加至55℃)。中等严格条件包括并涵盖至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5M至至少约0.9M盐，用于在42℃下杂交，以及至少约0.1M至至少约0.2M盐，用于在55℃下洗涤。中等严格条件还可以包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)，7％SDS，用于在65℃下杂交，和(i)2×SSC、0.1％SDS；或(II)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS，用于在60-65℃下洗涤。中等严格条件的一个实施方案包括在约45℃下在6×SSC中杂交，然后在60℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。高严格条件包括并涵盖至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和约0.01M至约0.15M盐，用于在42℃下杂交，和约0.01M至约0.02M盐，用于在55℃下洗涤。高严格条件还可以包括1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS，用于在65℃下杂交，和(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(II)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS，用于在超过65℃的温度下洗涤。高严格条件的一个实施方案包括在约45℃下在6×SSC中杂交，然后在65℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。
在本发明的一些方面，提供了本发明的分离或纯化的PD-L1双环肽模拟物，其由在高严格条件下与编码SEQ ID NO：1的PD-L1双环肽模拟物的多核苷酸序列或其非编码链杂交的多核苷酸序列编码。在某些实施方案中，本发明的分离或纯化的PD-L1双环肽模拟物由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列在极高严格条件下与编码SEQ ID NO：l的PD-L1双环肽模拟物的多核苷酸序列或其非编码链杂交。极高严格条件的一个实施方案包括在65℃下用0.5M磷酸钠、7％SDS杂交，然后在65℃下用0.2×SSC、1％SDS洗涤一次或多次。在一些实施方案中，本发明的变体PD-L1双环肽模拟物的氨基酸序列包含式I的氨基酸序列。在具体的实施方案中，本发明的变体PD-L1双环肽模拟物抑制或降低核定位PD-L1。
其他严格条件是本领域熟知的，并且本领域技术人员将认识到可以操纵各种因素以优化杂交的特异性。最终洗涤的严格性的优化可用于确保高度杂交。详细的实例参见Ausubel等人(1998)Current Protocols in Molecular Biology(约翰威利父子出版公司)，特别是第2.10.1-2.10.16页和Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，特别是1.101至1.104节。
尽管严格洗涤通常在约42℃至68℃的温度下进行，但本领域技术人员将理解其他温度可适用于严格条件。最大杂交速率通常发生在低于形成DNA-DNA杂交体的Tm约20℃至25℃下。本领域公知Tm是解链温度，或两个互补多核苷酸序列解离的温度。用于估计Tm的方法是本领域熟知的(参见，Ausubel等人(1998)Current Protocols in Molecular Biology(约翰威利父子出版公司)，第2.10.8页)。通常，DNA的完全匹配的双链体的Tm可以通过以下公式预测为近似值：
Tm＝81.5+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)
其中：M是Na+的浓度，优选在0.01M至0.4M的范围内；％G+C是鸟苷和胞嘧啶碱基的总和占碱基总数的百分比，在30％至75％G+C的范围内；％甲酰胺是甲酰胺浓度的体积百分比；长度是DNA双链体中碱基对的数目。随着随机错配碱基对的数目每增加1％，双链体DNA的Tm降低约1℃。对于高严格性，洗涤通常在Tm-15℃下进行，或对于中等严格性，通常在Tm-30℃下进行。
在杂交程序的一个实例中，将含有固定化DNA的膜(例如，硝酸纤维素膜或尼龙膜)在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺，5c SSC，5c Denhardt溶液(0.1％ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％BSA)，0.1％SDS和200mg/ml变性鲑鱼精子DNA)中于42℃杂交过夜。然后对膜进行两次连续的中等严格性洗涤(即，2×SSC、0.1％SDS，在45℃下洗涤15分钟，随后2×SSC、0.1％SDS，在50℃下洗涤15分钟)，随后进行两次连续的较高严格性洗涤(即，0.2×SSC、0.1％SDS，在55℃下洗涤12min，随后0.2×SSC和0.1％SDS溶液，在65-68℃下洗涤12min)。
本发明的PD-L1双环肽模拟物还包括PD-L1双环肽模拟物，其包含具有修饰的侧链的氨基酸，在肽合成期间掺入非天然氨基酸残基和/或其衍生物，以及使用交联剂和其他对本发明的PD-L1双环肽模拟物施加构象限制的方法。侧链修饰的实例包括氨基的修饰，如通过用乙酸酐酰化；氨基与琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐的酰化；用甲基乙酰亚氨酸酰胺化；氨基与氰酸酯的氨甲酰化；用吡哆醛-5-磷酸对赖氨酸进行吡哆醛化，然后用硼氢化钠还原；通过与醛反应然后用硼氢化钠还原的还原烷基化；和用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基进行三硝基苄基化。
羧基可以通过形成O-酰基异脲进行碳化二亚胺激活，随后衍生为例如相应的酰胺来修饰。
精氨酸残基的胍基可以通过与试剂如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。
在肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、/Ve-乙酰基-L-鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸、L/e-乙酰基-L-赖氨酸、L/e-甲基-L-赖氨酸、L/e-二甲基-L-赖氨酸、L/e-甲酰基-L-赖氨酸和/或氨基酸的D-异构体。本发明考虑的非天然氨基酸的列表示于表3中。
表3
非常规氨基酸
在一些实施方案中，本发明的PD-L1双环肽模拟物包含至少一个非天然氨基酸。
2.2 D-氨基酸肽
在一些实施方案中，上文和/或本文别处所述的PD-L1双环肽模拟物的至少一个氨基酸是D-氨基酸。优选地，D-氨基酸对应于天然L-氨基酸。这种类型的实施方案的优点是掺入至少一个D-氨基酸的肽通常比仅包含L-氨基酸的肽具有更高的稳定性、更长的生物利用度和/或更慢的消除半衰期。
在一些实施方案中，本发明的PDLl双环肽模拟物仅由D-氨基酸残基(除了甘氨酸，其不具有立体异构体)组成。在其他实施方案中，PD-L1双环肽模拟物的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的氨基酸是D-氨基酸。
在一些实施方案中，对应于已知或预测为蛋白水解切割位点和/或另外易于降解的残基的残基被相应的D-氨基酸亚型取代。作为说明性实例，PD-L1双环肽模拟物可包含对应于PD-L1的NLS基序的氨基酸序列，并且对应于野生型PD-L1氨基酸序列261位的亮氨酸(如SEQ ID NO：75所示)、野生型PD-L1氨基酸序列262位的精氨酸(如SEQ ID NO：75所示)和/或野生型PD-L1氨基酸序列(如SEQ ID NO：75所示)263位的赖氨酸的任何一个关键NLS残基被相应的D-氨基酸取代。
在一些实施方案中，式I的PD-L1双环肽模拟物在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1序列261位的位置包含D-亮氨酸。在一些相同的实施方案和一些可选的实施方案中，式I的PD-L1双环肽模拟物在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1序列262位的位置包含D-精氨酸。在一些相同的实施方案和一些可选的实施方案，式I的PD-L1双环肽模拟物在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1氨基酸序列263位的位置包含D-赖氨酸。在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物包含在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1序列261位的位置处的D-亮氨酸、在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1序列262位的位置处的D-精氨酸和在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1氨基酸序列263位的位置处的D-赖氨酸中的两个。在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物包含在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1序列261位的位置处的D-亮氨酸、在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1序列262位的位置处的D-精氨酸和在对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1氨基酸序列263位的位置处的D-赖氨酸。
在一些相同的实施方案和一些其他实施方案中，式(I)的PD-L1双环肽模拟物可以包含逆反构型的D-氨基酸链。在这种类型的实施方案中，整个肽可以是逆反形式，或者肽的一部分可以是逆反形式。举例来说，在式(I)的PD-L1双环肽模拟物中，“LRK”残基(即，对应于SEQ ID NO：75所示天然PD-L1氨基酸序列的残基261-263)可以是D-氨基酸，并且呈逆反形式。在此类实施方案中，这些残基呈以下形式(即，D-Lys-D-Arg-D-Leu)。
2.3末端肽修饰
如果存在，可以将另外的氨基酸或其他取代基添加到本发明的PD-L1双环肽模拟物的N-末端或C-末端。例如，本发明的PD-L1双环肽模拟物可以形成更长序列的一部分，其中另外的氨基酸添加到N-末端和C-末端中的任一端或两端。
对于本发明的特定用途和方法，可能需要具有高水平稳定性的PD-L1双环肽模拟物，例如，以增加PD-L1双环肽模拟物在受试者中的消除半衰期。因此，在一些实施方案中，本发明的PD-L1双环肽模拟物包含稳定部分或保护部分。稳定部分或保护部分可以偶联于肽上的任意点。合适的稳定或保护部分包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚糖或封端部分，包括乙酰基、焦谷氨酸或氨基。在优选的实施方案中，乙酰基和/或焦谷氨酸与PD-L1双环肽模拟物的N-末端氨基酸残基偶联。在具体的实施方案中，PD-L1双环肽模拟物的N-末端是乙酰胺。在优选的实施方案中，氨基与PD-L1双环肽模拟物的C-末端氨基酸残基偶联。在具体的实施方案中，PD-L1双环肽模拟物在C-末端具有伯、仲或叔酰胺、酰肼或羟酰胺；特别是C-末端的伯酰胺。在优选的实施方案中，PEG与PD-L1双环肽模拟物的N-末端或C-末端氨基酸残基偶联，或通过赖氨酸侧链或其他适当修饰的侧链的氨基偶联，特别是通过N-末端氨基酸残基，如通过残基的氨基偶联，或通过赖氨酸侧链的氨基偶联。
在一些优选的实施方案中，本发明的PD-L1双环肽模拟物在C-末端具有伯酰胺或游离羧基(酸)，在N-末端具有伯胺或乙酰胺。
2.4膜穿透部分
尽管本发明的PD-L1双环肽模拟物可以固有地穿透膜，但是通过膜穿透部分与PD-L1双环肽模拟物的缀合可以进一步增加膜穿透。因此，在一些实施方案中，本发明的PD-L1双环肽模拟物包含膜穿透部分。膜穿透部分可以偶联于PD-L1双环肽模拟物上的任意点。
合适的膜穿透部分包括脂质部分、胆固醇和蛋白质，如细胞穿透肽和聚阳离子肽；特别是脂质部分。
合适的细胞穿透肽可以包括例如US 2009/0047272、US 2015/0266935和US 2013/0136742中描述的肽。因此，合适的细胞穿透肽可以包括但不限于碱性聚(Arg)和聚(Lys)肽以及含有Arg和Lys残基的非天然类似物的碱性聚(Arg)和聚(Lys)肽，例如YGRKKRPQRRR(HIV TAT47-57；SEQ ID NO：22)、RRWRRWWRRWWRRWRRR(W/R：SEQ ID NO：23)、CWK18(AlkCWK18；SEQ ID NO：24)、K18WCCWK18(Di-CWK18；SEQ ID NO：25)、WTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(TransDortan；SEQ ID NO：26)、GLFEALEELWEAK(DipaLytic；SEQ ID NO：27)、K16GGCRGDMFGCAK16RGD(K16RGD；SEQ ID NO：28)、K16GGCMFGCGG(PI；SEQ ID NO：29)、K16ICRRARGDNPDDRCT(P2：SEQ ID NO：30)、KKWKMRRNQFWVKVQRbAK(B)bA(P3：SEQ ID NO：31)、VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYN KRA(P3a；SEQ ID NO：32)、IGRIDPANGKTKYAPKFQDKATRSNYYGNSPS(P9.3；SEQ ID NO：33)、KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(Pep-1；SEQ ID NO：34)、PLAEIDGIELTY(Plae；SEQ ID NO：35)、K16GGPLAEIDGIELGA(Kplae；SEQ ID NO：36)、K16GGPLAEIDGIELCA(cKplae；SEQ ID NO：37)、GALFLGFLGGAAGSTMGAWSQPKSKRKV(MGP；SEQ IDNO：38)、WEAK(LAKA)2-LAKH(LAKA)2LKAC(HA2；SEQ ID NO：39)、(LARL)6NHCH3(LARL46；SEQID NO：40)、KLLKLLLKLWLLKLLL(Hel-11-7；SEQ ID NO：41)、(KKKK)2GGC(KK；SEQ ID NO：42)、(KWKK)2GCC(KWK；SEQ ID NO：43)、(RWRR)zGGC(RWR；SEQ ID NO：44)、PKKKRKV(SV40NLS7；SEQ ID NO：45)、PEVKKKRKPEYP(NLS12；SEQ ID NO：46)、TPPKKKRKVEDP(NLS12a；SEQID NO：47)、GGGGPKKKRKVGG(SV40 NLS13；SEQ ID NO：48)、GGGFSTSLRARKA(AV NLS13；SEQID NO：49)、CKKKKKKSEDEYPYVPN(AV RME NLS17；SEQ ID NO：50)、CKKKKKKKSEDEYPYVPNFSTSLRARKA(AV FP NLS28；SEQ ID NO：51)、LVRKKRKTEEESPLKDKDAKKSKQE(SV40 Nl NLS24；SEQ IDNO∶52)和KgKzKgKgGGKg(Loligomer；SEQ ID NO：53)；HSV-1被膜(tegument)蛋白VP22；与核输出信号(NES)融合的HSV-1被膜蛋白；大肠杆菌肠毒素EtxB的突变B-亚基(H57S)；解毒的内毒素A(ETA)；HIV-1 Tat蛋白的蛋白转导结构域，GRKKRRQRRRPPQ(SEQ IDNO：54)；黑腹果蝇触角足突变结构域Antp(氨基酸43-58)、RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：55)；Buforin II，TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(SEQ ID NO：56)；hClock-(氨基酸35-47)(人Clock蛋白DNA-结合肽)、KRVSRNKSEKKRR(SEQ ID NO：57)；MAP(模型两亲性肽)、KIALKIALKALKAALKIA(SEQ ID NO：58)；K-FGF，AAVALLPAVLIALIAP(SEQ ID NO：59)；Ku70-衍生的肽，包含选自以下的肽：VPMLKE(SEQ ID NO：60)、VPMLK(SEQ ID NO：61)、PMLKE(SEQ IDNO：62)或PMLK(SEQ ID NO：63)；小鼠阮病毒Prpe(氨基酸1-28)、MANLGYWLIALFVTMWTDVGLCKKRPKP(SEQ ID NO：64)；pVEC，LLIILRRRIRKQAHAHSK(SEQ ID NO：65)；Pep-I，KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO：66)；SynBI，RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ IDNO：67)；转运子(Transportan)，GWTLNSAGYLLGKINLKAIAAIAKKIL(SEQ ID NO：68)；转运子-10，AGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：69)；CADY，Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-巯基乙胺化(cysteamide)(SEQ ID NO：70)；Pep-7，SDLWEMMMVSIACQY(SEQ ID NO：71)；HN-1，TSPLNIHNGQKL(SEQ ID NO：72)；VT5，DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD(SEQ ID NO：73)；或pISL，RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQ ID NO：74)
在优选的实施方案中，膜穿透部分是脂质部分，例如C10-C20脂肪酰基，特别是硬脂酰基(十八烷酰基；C18)、棕榈酰基(十六烷酰基；C16)或肉豆蔻酰基(十四烷酰基；C14)；最特别是肉豆蔻酰基。在优选的实施方案中，膜穿透部分与N-末端或C-末端氨基酸残基偶联、或通过PD-L1双环肽模拟物的赖氨酸侧链或其他适当修饰的侧链的氨基，特别是PD-L1双环肽模拟物的N-末端氨基酸残基、或通过赖氨酸侧链的氨基偶联。在具体的实施方案中，膜穿透部分通过N-末端氨基酸残基的氨基偶联。
在一些具体的实施方案中，膜穿透部分是与N-末端氨基酸残基偶联的肉豆蔻酰基。
2.5靶向肽
在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物还包含能够增强分子穿过血脑屏障(“BBB”)或进入特定细胞类型中的转运的靶向肽。在某些实施方案中，靶向肽具有序列Angiopep-1(SEQ ID NO：100)；Angiopep-2(SEQ ID NO：101)；Angiopep-3(SEQ ID NO：104)；Angiopep-4a(SEQ ID NO：105)；Angiopep4b(SEQ ID NO：106)；Angiopep-5(SEQ IDNO：107)；Angiopep-6(SEQ ID NO：108)；或Angiopep-7(SEQ ID NO：109)(参见表4)。在与靶向肽缀合时，PD-L1双环肽模拟物可以有效地转运到特定细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任何一种、两种、三种、四种或五种)中，或者可以有效地穿过哺乳动物BBB(例如，Angiopep-1、-2、-3、-4a、-4b、-5和-6)。在一些可选的实施方案中，在与靶向肽缀合时，PD-L1双环肽模拟物可以有效地转运到特定细胞类型(例如，肝、肺、肾、脾和肌肉中的任何一种、两种、三种、四种或五种)中，但不能有效地穿过哺乳动物BBB(例如，Angiopep-7)。靶向肽可以具有任何长度，例如，至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、70或100个氨基酸，或这些数字之间的任何范围。在某些实施方案中，肽载体的长度为10至50个氨基酸。
表4
示例性靶向肽序列
肽 氨基酸序列 SEQ ID NO：
Angiopep-1 TFFYGGCRGKRNNFKTEEY 100
Angiopep-2 TFFYGGSRGKRNNFKTEEY 101
Angiopep-3 TFFYGGSRGKRNNFKTEEY 104
Angiopep-4a RFFYGGSRGKRNNFKTEEY 105
Angiopep-4b RFFYGGSRGKRNNFKTEEY 106
Angiopep-5 RFFYGGSRGKRNNFRTEEY 107
Angiopep-6 TFFYGGSRGKRNNFRTEEY 108
Angiopep-7 TFFYGGSRGRRNNFRTEEY 109
Cys-Angiopep-2 CTFFYGGSRGKRNNFKTEEY 110
Angiopep-2-Cys TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC 111
在PD-L1双环肽模拟物用于治疗或预防其必须穿过BBB的适应症(例如，脑癌或受BBB保护的其他癌症)的情况下，靶向肽可包含选自Angiopep-2(SEQ ID NO：101)、Angiopep-1(SEQ ID NO：100)、Cys-Angiopep-2(SEQ ID NO：110)和Angiopep-2-Cys(SEQID NO：111)的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在优选的实施方案中，靶向肽是Angiopep-2(SEQ ID NO：101)。
在一些实施方案中，靶向肽可以偶联于PD-L1双环肽模拟物上的任意点，特别是与N-末端或C-末端氨基酸残基偶联。在可选的实施方案中，靶向肽可以与PD-L1双环肽模拟物的Cys接头区缀合。
因此，在本发明的另一个方面，提供了由式II表示的分离或纯化的PD-L1双环肽模拟物：
M-P(式II)
其中：
M是膜穿透部分；和
P是由式I表示的分离或纯化的PD-L1双环肽模拟物。
在一些实施方案中，M偶联于PD-L1双环肽模拟物上的任意点；特别是偶联至N-末端或C-末端氨基酸残基或通过PD-L1双环肽模拟物的赖氨酸侧链或其他适当修饰的侧链氨基偶联，更特别是偶联至PD-L1双环肽模拟物的N-末端氨基酸残基或通过赖氨酸侧链的氨基偶联；最特别是通过N-末端氨基酸残基的氨基偶联。
式I表示的PD-L1双环肽模拟物的合适的膜穿透部分和实施方案如本文所述。
本发明的PD-L1双环肽模拟物可以是盐或前药的形式。本发明的PD-L1双环肽模拟物的盐优选是药学上可接受的，但应当理解，非药学上可接受的盐也落入本发明的范围内。
本发明的PD-L1双环肽模拟物可以是结晶形式和/或溶剂化物形式，例如水合物。溶剂化可以使用本领域已知的方法进行。
本发明的肽可以使用重组DNA技术或通过化学合成制备。
2.6核酸分子
在一些实施方案中，使用重组DNA技术制备本发明的PD-L1双环肽模拟物。例如，本发明的PD-L1双环肽模拟物可以通过包括以下步骤的程序来制备：(a)制备包含编码本发明的PD-L1双环肽模拟物并且与调控元件可操作地连接的多核苷酸序列的构建体；(b)将构建体导入宿主细胞中；(c)培养宿主细胞以表达多核苷酸序列，从而产生编码的本发明的PD-L1双环肽模拟物；和(d)从宿主细胞中分离本发明的PD-L1双环肽模拟物。本发明的PD-L1双环肽模拟物可以使用标准方案重组制备，例如，如Klint等人(2013)PLOS One，8(5)：e63865；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：ALaboratoryManual(冷泉港出版社)，特别是第16和17节；Ausubel等人(1998)Current Protocols in Molecular Biology(约翰威利父子出版公司)，特别是第10和16章；Coligan等人(1997)Current Protocols inProtein Science(约翰威利父子出版公司)，特别是第1、5和6章；和US 5,976,567，其全部内容通过引用并入本文。
因此，本发明还涉及编码本发明PD-L1双环肽模拟物的核酸分子。因此，在本发明的另一个方面，提供了分离的核酸分子，其包含编码本发明的PD-L1双环肽模拟物的多核苷酸序列或与编码本发明的PD-L1双环肽模拟物(例如，式I的PD-L1双环肽模拟物(SEQ IDNO：1)，或如本文所述的变体PD-L1双环肽模拟物)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
本发明的分离的核酸分子可以是DNA或RNA。核酸分子是DNA形式时，它可以是基因组DNA或cDNA。本发明的核酸分子的RNA形式通常是mRNA。
尽管核酸分子通常是分离的，但在一些实施方案中，核酸分子可以整合到或连接到或以其他方式融合或缔合到其他遗传分子中，如表达载体。通常，表达载体包括与多核苷酸序列可操作地连接的转录和翻译调控核酸。因此，在本发明的另一个方面，提供了一种表达载体，其包含编码本发明的PD-L1双环肽模拟物(如式I的PD-L1双环肽模拟物(SEQ IDNO：1)，或如本文所述的变体PD-L1双环肽模拟物)的多核苷酸序列。
典型的载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调控核酸表达的启动子。载体任选地包含通用表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列，允许盒在真核生物、原核生物或两者(例如，穿梭载体)中复制的序列和用于原核和真核系统的选择标志物。载体可适用于原核生物、真核生物或两者中的复制和整合。参见，Giliman和Smith(1979)，Gene，8：81-97；Roberts等人(1987)Nature，328：731-734；Berger和Kimmel，Guideto Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，美国学术出版社，San Diego，Calif.(Berger)；Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning-A LaboratoryManual(第2版)第1-3卷，冷泉港实验室出版社，冷泉港出版社，N.Y.；和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，编辑，Current Protocols，格林出版合伙公司和约翰威利父子出版公司之间的合资企业(增刊)，其全部内容通过引用并入本文。
含有来自真核病毒(如逆转录病毒)的调控元件的表达载体通常用于在真核细胞中表达核酸序列。SV40载体包括pSVT7和pMT2。衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-IMTHA，衍生自EB病毒的载体包括pHEBO和p205。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及允许在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示在真核细胞中有效表达的其他启动子的指导下表达蛋白质的任何其他载体。
虽然可以使用多种载体，但应当注意，病毒表达载体可用于修饰真核细胞，因为病毒载体转染靶细胞并整合到靶细胞基因组中的效率高。这种类型的说明性表达载体可以衍生自病毒DNA序列，包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒如B、C和D逆转录病毒以及泡沫病毒和修饰的慢病毒。用于转染动物细胞的合适的表达载体描述于例如Wu和Ataai(2000)Curr.Opln.Biotechnol.，11(2)：205-208，Vigna和Naldini(2000)J.Gene Med.，2(5)：308-316；Kay等人(2001)Nat.Med.，7(1)：33-40；Athanasopoulos等人(2000)Int.J.Mol.Med.，6(4)：363-375；和Walther和Stein(2000)Drugs，60(2)：249-271，其全部内容通过引用并入本文。
表达载体的多肽或肽编码部分可以包含天然存在的序列或其变体，其已经使用重组技术工程化。在变体的一个实例中，使用在特定哺乳动物细胞或组织类型中利用密码子使用偏好或密码子翻译效率的方法，修饰编码本发明的PD-L1双环肽模拟物的多核苷酸的密码子组成，以允许增强本发明的PD-L1双环肽模拟物在哺乳动物宿主中的表达，如例如国际公开WO 99/02694和WO 00/42215中所述。简言之，后一种方法是基于以下观察结果：不同细胞或组织之间不同密码子的翻译效率不同，并且这些差异可以与基因的密码子组成一起用于调节蛋白质在特定细胞或组织类型中的表达。因此，为了构建密码子优化的多核苷酸，亲本多核苷酸的至少一个现有密码子被在靶细胞或组织中具有比其替换的现有密码子更高的翻译效率的同义密码子替换。尽管优选用具有更高翻译效率的同义密码子替换亲本核酸分子的所有现有密码子，但这不是必需的，因为即使部分替换也可以实现增加的表达。合适地，替换步骤影响亲本多核苷酸的5％、10％、15％、20％、25％、30％，更优选35％、40％、50％、60％、70％或更多的现有密码子。
表达载体与其导入的细胞相容，使得本发明的PD-L1双环肽模拟物可由细胞表达。通过任何合适的方式将表达载体导入细胞中，所述方式将取决于所用表达载体和细胞的特定选择。这种导入方式是本领域技术人员公知的。例如，可以通过使用接触(例如，在病毒载体的情况下)、电穿孔、转化、转导、缀合或三亲本交配、转染、用阳离子脂质感染膜融合、用DNA包被的微粒高速轰击、用磷酸钙-DNA沉淀物孵育、直接显微注射到单细胞中等来实现导入。其他方法也是可用的并且是本领域技术人员已知的。可选地，通过阳离子脂质(例如，脂质体)来导入载体。此类脂质体是可商购的(例如，由马里兰州盖瑟斯堡的LifeTechnologies，Gibco BRL提供的LIPOFECTAMINETM等)。
分子支架
本发明的PD-L1双环肽模拟物包含与分子支架共价结合的多肽、基本上由与分子支架共价结合的多肽组成或由与分子支架共价结合的多肽组成。分子支架描述于例如国际PCT专利公开号WO 2009/098450和其中引用的参考文献，特别是WO 2004/077062和WO2006/078161中。如前述文献中所述，分子支架可以是小分子，如小的有机分子。
在一些实施方案中，分子支架可以是或可以基于天然单体，如核苷、糖或类固醇。例如，分子支架可以包含此类实体的短聚合物，如二聚体或三聚体。
在一个实施方案中，分子支架是已知毒性(例如，低毒性)的化合物。合适的化合物的实例包括胆固醇、核苷酸、类固醇或现有药物，如替马西泮。
在一些实施方案中，分子支架可以是大分子。在一些实施方案中，分子支架是由氨基酸、核苷酸或碳水化合物组成的大分子。
在一些实施方案中，分子支架包含能够与多肽的官能团反应形成共价键的反应性基团。
分子支架可包含化学基团，如胺、硫醇、醇、酮、醛、腈、羧酸、酯、烯烃、炔烃、叠氮化物、酸酐、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、烷基卤和酰基卤。
在一些实施方案中，支架是芳香族分子支架(即，包含(杂)芳基的支架)。这些芳香族环可以任选地含有一个或多个杂原子(例如，N、O、S和P中的一个或多个)，如噻吩基环、吡啶基环和呋喃基环。芳香环可以任选被取代。芳基环也可以任选被取代。合适的取代基包括烷基(其可以任选被取代)、其他芳基(其本身可以被取代)、杂环(饱和或不饱和)、烷氧基(其意在包括芳氧基(例如，苯氧基))、羟基、醛基、硝基、胺基(例如，未取代的或被芳基或烷基单取代或二取代的)、羧酸基、羧酸衍生物(例如，羧酸酯、酰胺等)、卤素原子(例如，Cl、Br和I)等。
合适地，支架包含三取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分，例如，三亚甲基取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。(杂)芳香族或(杂)脂环族部分合适地是六元环结构，优选三取代的，使得支架具有3重对称轴。
在一些实施方案中，支架是三亚甲基(杂)芳基部分，例如1，3，5-三亚甲基苯部分。在这些实施方案中，相应的支架分子合适地在亚甲基碳上具有离去基团。然后亚甲基形成如本文所定义的烷基氨基连接的R1部分。在这些亚甲基取代的(杂)芳香族化合物中，芳香环的电子可以在亲核取代期间稳定过渡态。因此，例如，与未连接至(杂)芳香族基团的烷基卤化物相比，苄基卤化物对亲核取代的反应性高100-1000倍。
在这种类型的实施方案中，支架和支架分子具有以下通式：
其中LG代表如下进一步描述的支架分子的离去基团，或LG(包括形成烷基氨基的R1部分的相邻亚甲基)代表与本发明缀合物中的肽的烷基氨基连接。
在一些实施方案中，上述基团LG可以是卤素，如但不限于溴原子，在这种情况下支架分子是1，3，5-三(溴甲基)苯(TBMB)。另一种合适的分子支架分子是2，4，6-三(溴甲基)均三甲苯。它类似于1，3，5-三(溴甲基)苯，但另外含有与苯环连接的三个甲基。在这种支架的情况下，额外的甲基可以与肽形成进一步的接触，因此增加额外的结构约束。因此，实现了与使用1，3，5-三(溴甲基)苯不同的多样性范围。
用于形成通过亲核取代与肽反应的支架的另一种优选分子是1，3，5-三(溴乙酰氨基)苯(TBAB)：
在一些可选的实施方案中，支架是非芳香族分子支架(例如，包含(杂)脂环族基团的支架)。如本文所用，“(杂)脂环基”是指碳环或杂环饱和环。该环可以是未取代的，或者它可以被一个或多个取代基取代。取代基可以是饱和或不饱和的、芳香族或非芳香族的，并且合适的取代基的实例包括上文关于烷基和芳基上的取代基的讨论中所述的那些。此外，两个或更多个环取代基可以组合形成另一个环，因此如本文所用的“环(ring)”意指包括稠环系统。在这些实施方案中，脂环族支架优选为1，1’，1”-(1，3，5-三嗪烷-1，3，5-三基)三丙-2-烯-1-酮(TATA)。
在一些可选的实施方案中，分子支架可以具有四面体几何形状，使得编码肽的四个官能团与分子支架的反应产生不超过两种产物异构体。其他几何形状也是可能的；实际上，几乎无限数量的支架几何形状是可能的，导致肽配体多样化的更大可能性。
用于形成本发明的双环肽的肽包含用于与支架形成硫醚键的半胱氨酸，其中半胱氨酸的末端-SH基团被-NH2替换。
本发明的双环肽具有许多有利的性质，这些性质使得它们能够被认为是用于注射、吸入、鼻、眼、口服或局部施用的有益的药物样分子。这些有利的性质包括：
-物种交叉反应性，这是临床前药效学和药代动力学评价的典型要求；
-蛋白酶稳定性，因为双环肽配体理想地表现出对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定的”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、胞内蛋白酶等的稳定性。应当在不同物种之间保持蛋白酶稳定性，使得双环肽候选物可以在动物模型中开发以及有信心地施用于人类；
-所需的溶解度曲线，其是带电和亲水与疏水残基的比例以及分子内/分子间H-键的函数，这对于配制和吸收目的是重要的；和
-最佳消除半衰期。根据临床适应症和治疗方案，可能需要开发用于在急性疾病管理环境中短时间暴露的双环肽，或开发具有增强的保留的双环肽。因此，它对于管理更慢性的疾病状态和癌症是最佳的。相对于由于药剂的持续暴露而伴随的毒理学，驱动期望的消除半衰期的其他因素是为了最大治疗效率而需要持续暴露。
在一个实施方案中，分子支架可包含三(溴甲基)苯，特别是1，3，5-三(溴甲基)苯(“TBMB”)或其衍生物或由其组成。
在一些特别优选的实施方案中，分子支架是1，3，5-(三溴甲基)苯。
在一些其他实施方案中，分子支架是2，4,6-三(溴甲基)均三甲苯。该分子类似于1，3，5-三(溴甲基)苯，但含有与苯环连接的三个另外的甲基。这具有以下优点：额外的甲基可以与多肽形成进一步的接触，且因此增加额外的结构约束。
可用于分子支架上以与半胱氨酸的硫醇基团反应的支架反应性基团是烷基卤化物(或也称为卤代烷烃或卤代烷)。实例包括溴甲基苯(支架反应性基团，例如TBMB)或碘乙酰胺。用于将化合物选择性偶联至蛋白质中的半胱氨酸的其他支架反应性基团是马来酰亚胺。可用作本发明中的分子支架的马来酰亚胺的实例包括：三-(2-马来酰亚胺基乙基)胺、三-(2-马来酰亚胺基乙基)苯、三-(马来酰亚胺基)苯。硒代半胱氨酸也是天然氨基酸，其具有与半胱氨酸相似的反应性，并且可用于相同的反应。因此，无论在何处提及半胱氨酸，除非上下文另有说明，否则通常可接受取代硒代半胱氨酸。
2.7合成
本发明的肽可以通过标准技术合成制备，然后在体外与分子支架反应。进行此操作时，可以使用标准化学方法。这使得能够快速大规模制备可溶性材料以用于进一步的下游实验或验证。这些方法可以使用常规化学方法完成，如Timmerman等人(同上)所公开的化学方法。
因此，本发明还涉及如本文所述选择的多肽或缀合物的制备，其中所述制备包括如下所述的任选的进一步步骤。在一个实施方案中，这些步骤在通过化学合成制备的终产物多肽/缀合物上进行。
任选地，制备缀合物或复合物时，目的多肽中的氨基酸残基可以被取代。
肽也可以延伸，以掺入例如另一个环，且因此引入多种特异性。为了延伸肽，可以使用标准固相或溶液相化学，使用正交保护的赖氨酸(和类似物)在其N-末端或C-末端或环内简单地进行化学延伸。标准蛋白质化学可用于引入可激活的N-末端或C-末端。可选地，可以通过片段缩合或天然化学连接进行添加，例如如(Dawson等人，1994.Synthesis ofproteins by native chemical ligation.Science 266：776-779)中所述，或通过酶进行添加，例如使用枯草杆菌连接酶，如(Chang等人，Proc Natl Acad Sci USA.1994年12月20日；91(26)：12544-8或Hikari等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters第18卷，第22期，2008年11月15日，第6000-6003页)中所述的。
可选地，可以通过二硫键进一步缀合来延伸或修饰肽。这具有允许第一肽和第二肽一旦在细胞的还原环境内就彼此解离的额外优点。在这种情况下，可以在化学合成第一肽期间添加分子支架(例如，TBMB)，以便与三个半胱氨酸基团反应；然后可以将另外的半胱氨酸附加到第一肽的N-末端，使得该半胱氨酸仅与第二肽的游离半胱氨酸反应。
类似的技术同样适用于合成/偶联两个双环和双特异性大环，潜在地产生四特异性分子。此外，其他官能团或效应物基团的添加可以以相同的方式，使用合适的化学方法，在N-末端或C-末端或通过侧链偶联来完成。在一个实施方案中，偶联以不阻断任一实体的活性的方式进行。
在一些实施方案中，可以通过导入一种或多种表达构建体(如表达载体)在细胞内产生本发明的PD-L1双环肽模拟物，所述表达构建体包含编码本发明的PD-L1双环肽模拟物的多核苷酸序列。
本发明考虑在宿主细胞内重组产生本发明的PD-L1双环肽模拟物，所述宿主细胞如哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠骨髓瘤(NSO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞或人胚肾(HEK293)细胞、酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorls)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)细胞、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)细胞、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞或Arxula adeninivorans细胞)或细菌细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)细胞、谷氨酸棒状杆菌(Coryynebacterium glutamicum)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)细胞)。
对于治疗应用，本发明还考虑在受试者的细胞内体内产生本发明的PD-L1双环肽模拟物，所述细胞例如PD-L1过表达细胞，如脊椎动物细胞，特别是哺乳动物或禽类细胞，特别是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，本发明的PD-L1双环肽模拟物使用标准肽合成方法(如溶液合成或固相合成)制备。本发明的PD-L1双环肽模拟物的化学合成可以手动或使用自动合成仪进行。例如，线性肽可以使用Boc或Fmoc化学方法利用固相肽合成来合成，如Merrifield(1963)J Am Chem Soc.，85(14)：2149-2154；Schnolzer等人(1992)Int J Pept ProteinRes，40：180-193和Cardoso等人(2015)Mol Pharmacol，88(2)：291-303中所述，其全部内容通过引用并入本文。在脱保护和从固体支持物切割后，使用合适的方法如制备型色谱法纯化线性肽。
3.药物组合物
根据本发明，PD-L1双环肽模拟物可用于治疗或预防涉及PD-L1核定位的病症(例如，癌症)的组合物和方法中。
因此，在一些实施方案中，本发明的PD-L1双环肽模拟物可以是药物组合物的形式，其中药物组合物包含本发明的PD-L1双环肽模拟物和药学上可接受的载体或稀释剂。
可以将本发明的PD-L1双环肽模拟物配制成中性或盐形式的药物组合物。
如本领域技术人员所理解的，药学上可接受的载体或稀释剂的选择将取决于施用途径和病症的性质以及待治疗的受试者。本领域技术人员可以容易地确定特定的载体或递送系统和施用途径。载体或递送系统和施用途径应仔细选择以确保PD-L1双环肽模拟物的活性在制剂制备期间不被耗尽，并且PD-L1双环肽模拟物能够完整地到达作用位点。本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，包括但不限于口服、直肠、局部、鼻内、眼内、经粘膜、肠道、肠内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、脑内、阴道内、膀胱内、静脉内或腹膜内施用。
适于注射使用的药物形式包括无菌可注射溶液或分散体和用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末。这样的形式在制造和储存条件下应该是稳定的，并且可以防止还原、氧化和微生物污染。
本领域技术人员将能够使用常规方法容易地确定本发明的PD-L1双环肽模拟物的适当制剂。用于配制和施用的技术可见于例如Remington(1980)Remington′sPharmaceutical Sciences，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton，Pa.)，最新版；和Niazi(2009)Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations，纽约InformaHealthcare出版社(Informa Healthcare，New York)，第二版，其全部内容通过引用并入本文。
优选的pH范围和合适的赋形剂(如抗氧化剂)的鉴定是本领域常规的，例如，如Katdare和Chaubel(2006)Excipient Development for Pharmaceutical，Biotechnologyand Drug Delivery Systems(CRC出版社)中所述。缓冲系统通常用于提供所需范围的pH值，并且可以包括但不限于羧酸缓冲液，如乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐和琥珀酸盐；甘氨酸；组氨酸；磷酸盐；三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)；精氨酸；氢氧化钠；谷氨酸；和碳酸盐缓冲剂。合适的抗氧化剂可包括但不限于酚类化合物，如丁基化羟基甲苯(BHT)和丁基化羟基苯甲醚；维生素E；抗坏血酸；还原剂如甲硫氨酸或亚硫酸盐；金属螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；半胱氨酸盐酸盐；亚硫酸氢钠；偏亚硫酸氢钠；亚硫酸钠；抗坏血酸棕榈酸酯；卵磷脂；没食子酸丙酯；和α-生育酚。
对于注射，本发明的PD-L1双环肽模拟物可以配制在水溶液中，合适地在生理上相容的缓冲液中，如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于待穿透的屏障的穿透剂。此类穿透剂通常是本领域已知的。
本发明的组合物可以配制成用于以含有可接受的稀释剂(如盐水和无菌水)的液体形式施用，或者可以配制成含有可接受的稀释剂或载体的洗剂、霜剂或凝胶的形式，以赋予所需的质地、稠度、粘度和外观。可接受的稀释剂和载体是本领域技术人员熟悉的，并且包括但不限于乙氧基化和非乙氧基化表面活性剂、脂肪醇、脂肪酸、烃油(如棕榈油、椰子油和矿物油)、可可脂蜡、硅油、pH平衡剂、纤维素衍生物、乳化剂(如非离子有机和无机碱)、防腐剂、蜡酯、类固醇醇、甘油三酯、磷脂(如卵磷脂和脑磷脂)、多元醇酯、脂肪醇酯、亲水性羊毛脂衍生物和亲水性蜂蜡衍生物。
可选地，本发明的PD-L1双环肽模拟物可以使用本领域熟知的药学上可接受的载体容易地配制成适于口服施用的剂量，这也被考虑用于本发明的实践。这样的载体使得本发明的生物活性剂能够配制成剂型，如片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，用于待治疗的患者口服摄取。这些载体可选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和无热原水。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的本发明PD-L1双环肽模拟物的水溶液。另外，本发明的PD-L1双环肽模拟物的悬浮液可以制成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载剂包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
无菌溶液可以通过将所需量的活性化合物在合适的溶剂中与其他所需的上述赋形剂混合，然后灭菌，如过滤来制备。通常，通过将各种灭菌的活性化合物掺入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌介质含有基础分散介质和如上所述的所需赋形剂。无菌干粉可以通过真空干燥或冷冻干燥包含活性化合物和如上所述的其他所需赋形剂的无菌溶液来制备。
用于口服使用的药物制剂可以通过将本发明的PD-L1双环肽模拟物与固体赋形剂混合并加工颗粒混合物来获得，如果需要，在加入合适的助剂后，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂特别是填充剂，如糖类，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠。这样的组合物可以通过任何药学方法制备，但是所有方法都包括使如上所述的一种或多种治疗剂与构成一种或多种必需成分的载体结合的步骤。通常，本发明的药物组合物可以以本身已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。
糖衣丸芯具有合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，用于识别或表征颗粒剂的不同组合。
可以口服使用的药物包括由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fit capsule)，以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。推入配合式胶囊可以含有与填充剂(如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。
可以将本发明的PD-L1双环肽模拟物掺入调释制剂(modified-releasepreparation)和制剂(formulation)中，例如聚合物微球制剂和基于油或凝胶的制剂。
在具体的实施方案中，本发明的PD-L1双环肽模拟物可以以局部而不是全身的方式施用，如通常以储库(depot)或缓释放制剂(sustained releaseformulation)的形式将PD-L1双环肽模拟物直接注射到组织中，所述组织优选为皮下或网膜组织。在局部施用或选择性摄取的情况下，药剂的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
3.1药物递送系统
此外，本发明的PD-L1双环肽模拟物可以在靶向药物递送系统中施用，如在适当靶向细胞或组织并被细胞或组织选择性摄取的颗粒中施用。在一些实施方案中，本发明的PD-L1双环肽模拟物包含在选自脂质体、胶束、树枝状聚合物、生物可降解颗粒、人工DNA纳米结构、基于脂质的纳米颗粒和碳或金纳米颗粒的载剂中或以其他方式与其缔合。在这种类型的说明性实例中，载剂选自聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(乙二醇)(PEG)、PLA-PEG共聚物及其组合。
3.1.1脂质纳米颗粒
在一些优选的实施方案中，PD-L1双环肽模拟物与一种或多种脂质(例如，阳离子脂质和/或可电离脂质和/或中性脂质)复合、包封、部分包封或缔合，从而形成基于脂质的载体，如脂质体、脂质纳米颗粒、脂质复合物和/或纳米脂质体。PD-L1双环肽模拟物可以完全或部分地位于基于脂质的载体的内部空间中。将治疗剂(例如，肽、核酸和小分子)掺入脂质载体中在本文中也称为“包封(encapsulation)”，其中治疗剂(例如，PD-L1双环肽模拟物)完全包含在脂质载体的内部空间内。将PD-L1双环肽模拟物掺入脂质载体中的一个优点是保护PD-L1双环肽模拟物免受可能含有酶或化学物质的环境或降解核酸的条件和/或导致肽快速排泄的系统或受体的影响。此外，将PD-L1双环肽模拟物掺入基于脂质的载体可以促进PD-L1双环肽模拟物的摄取，且因此可以增强肽的治疗效果。因此，将PD-L1双环肽模拟物掺入脂质体、脂质纳米颗粒、脂质复合物和/或纳米脂质体中可能特别适合于本发明的组合物(例如，用于肌内、静脉内和/或皮内施用)。
在本文中，术语“复合的”或“缔合的”是指核酸与一种或多种脂质基本上稳定地组合成较大的复合物或组装体而没有共价结合。
脂质纳米颗粒被合适地表征为具有通过膜或一个或多个双层与外部介质隔离的内部水空间的微观囊泡。脂质纳米颗粒的双层膜通常由两亲性分子形成，如合成或天然来源的脂质，其包含空间上分离的亲水和疏水结构域。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合物囊泡、类脂质体等)形成。在本发明的上下文中，脂质纳米颗粒通常用于将PD-L1双环肽模拟物转运至靶组织(例如，肿瘤)。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒可包含可电离脂质。如本文所用，术语“可电离脂质”具有其在本领域中的普通含义，并且可以指包含一个或多个带电部分的脂质。在一些实施方案中，可电离脂质可以带正电荷或带负电荷。可电离脂质可以是带正电荷的，在这种情况下，它可以被称为“阳离子脂质”。在某些实施方案中，可电离脂质分子可包含胺基，并且可称为可电离氨基脂质。如本文所用，“带电部分”是携带形式电荷的化学部分，例如单价(+1或-1)、二价(+2或-2)、三价(+3或-3)等。带电部分可以是阴离子的(即带负电荷)或阳离子的(即带正电荷)。带正电荷的部分的实例包括胺基(例如，伯胺、仲胺和叔胺)、铵基、吡啶鎓基、胍基和咪唑鎓基。在一些实施方案中，带电部分包含胺基。带负电荷的基团或其前体的实例包括羧酸根基团、磺酸根基团、硫酸根基团、膦酸根基团、磷酸根基团、羟基等。在一些情况下，带电部分的电荷可以随环境条件而变化，例如，pH的变化可以改变部分的电荷，和/或使部分带电或不带电。通常，可以根据需要选择分子的电荷密度。可电离脂质也可以是国际公开号WO2017/075531、WO2015/199952、WO2013/086354或WO2013/116126中公开的化合物，或选自美国专利号7,404,969的式CLI-CLXXXXII(出于此目的，将其各自全部内容通过引用并入本文)。
应当理解，术语“带电的”或“带电部分”不是指分子上的“部分负电荷”或“部分正电荷”。术语“部分负电荷”和“部分正电荷”具有其在本领域中的普通含义。官能团包含变为极化的键时，可能产生“部分负电荷”，使得电子密度被拉向键的一个原子，在原子上产生部分负电荷。通常，本领域普通技术人员将认识到可以以这种方式使键极化。
在一些实施方案中，可电离脂质是可电离氨基脂质，在本领域中有时称为“可电离阳离子脂质”。在一个实施方案中，可电离氨基脂质可以具有通过接头结构连接的带正电荷的亲水头部和疏水尾部。除此之外，可电离脂质也可以是包含环胺基团的脂质。
在一些实施方案中，本公开的PD-L1双环肽模拟物可以配制成脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒可包含至少一种可电离的氨基脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种固醇和/或至少一种聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为20-60％的可电离氨基脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含摩尔比为20-50％、20-40％、20-30％、30-60％、30-50％、30-40％、40-60％、40-50％或50-60％的可电离氨基脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为20％、30％、40％、50％或60％的可电离氨基脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为5-25％的非阳离子脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含摩尔比为5-20％、5-15％、5-10％、10-25％、10-20％、10-25％、15-25％、15-20％或20-25％的非阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为5％、10％、15％、20％或25％的非阳离子脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为25-55％的甾醇。例如，脂质纳米颗粒可包含摩尔比为25-50％、25-45％、25-40％、25-35％、25-30％、30-55％、30-50％、30-45％、30-40％、30-35％、35-55％、35-50％、35-45％、35-40％、40-55％、40-50％、40-45％、45-55％、45-50％或50-55％的甾醇。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％的甾醇。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为0.5-15％的PEG修饰的脂质。例如，脂质纳米颗粒可以包含0.5-10％、0.5-5％、1-15％、1-10％、1-5％、2-15％、2-10％、2-5％、5-15％、5-10％或10-15％的摩尔比。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含摩尔比为20-60％的可电离氨基脂质、5-25％的非阳离子脂质、25-55％的甾醇和0.5-15％的PEG修饰的脂质。
在一些具体的实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种脂质POPC、胆固醇和/或DSPE-PEG。更具体地，脂质纳米颗粒可包含POPC、胆固醇和DSPE-PEG中的每一种。
3.2剂量
将组合物配制成剂量单位形式是有利的，以便于施用和剂量均匀性。本发明的新型剂量单位形式的确定由活性物质的独特特征、待实现的特定治疗效果和混合活性材料的领域中固有的限制决定并直接取决于这些因素，所述活性材料用于治疗患有其中身体健康受损的患病状况的活体受试者的疾病，如本文详细公开的。
虽然本发明的PD-L1双环肽模拟物可以是施用于受试者的唯一活性成分，但另外的癌症疗法与所述PD-L1双环肽模拟物同时施用也在本发明的范围内。例如，式I的PD-L1双环肽模拟物(SEQ ID NO：1)或本文所述的变体可以与一种或多种癌症疗法同时施用，所述癌症疗法的非限制性实例包括放射疗法、手术、化学疗法、激素消除疗法、促凋亡疗法和免疫疗法。本发明的PD-L1双环肽模拟物可以在用癌症疗法治疗之前治疗性地使用，可以在癌症疗法之后治疗性地使用，或者可以与癌症疗法一起治疗性地使用。
合适的放射疗法包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如γ-照射、X-射线、UV照射、微波、电子发射和放射性同位素。通常，可以通过用上述形式的辐射照射局部肿瘤部位来实现治疗。最有可能的是，所有这些因素都对DNA、DNA前体、DNA复制和修复以及染色体组装和维持造成广泛的损伤。
X-射线的剂量范围从50-200伦琴的日剂量持续延长的时间段(例如，3-4周)到2000-6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。合适的放射疗法可包括但不限于适形外束放射疗法(在4-8周内分次给予50-100戈瑞)、单次或分次高剂量近距离放射疗法、永久性间质近距离放射疗法和全身放射性同位素，如锶89。在一些实施方案中，放射疗法可以与放射增敏剂一起施用。合适的放射增敏剂可包括但不限于乙丙昔罗、依他硝唑、氟路索(fluosol)、米索硝唑、尼莫唑、替莫泊芬和替拉扎明。
3.3组合
合适的化学治疗剂可包括但不限于抗增殖/抗肿瘤药物及其组合，包括烷化剂(例如，顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安和亚硝基脲)；抗代谢物(例如，抗叶酸剂，如氟吡啶，如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类，如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、放线菌素D和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如，长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨，以及紫衫烷类，如紫杉醇和多西他赛)；和拓扑异构酶抑制剂(例如，表鬼臼毒素类，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康和喜树碱)；细胞抑制剂，如抗雌激素(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和艾多昔芬)；雌激素受体下调调节剂(例如，氟维司群)；抗雄激素(例如，比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和醋酸环丙孕酮)；UH拮抗剂或LHRH激动剂(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)；孕激素(例如，醋酸甲地孕酮)；芳香酶抑制剂(例如，阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂，如非那雄胺；抑制癌细胞侵袭的药剂(例如，金属蛋白酶抑制剂，如马立马司他和尿激酶纤溶酶原激活物受体功能抑制剂)；生长因子功能抑制剂，例如此类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如，抗-erbb2抗体曲妥珠单抗[HERCEPTINTM]和抗-erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法尼基转移酶抑制剂、MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的其他抑制剂(例如，其他EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板衍生生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；抗血管生成剂，如抑制血管内皮生长因子作用的那些(例如，抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AVASTINTM]，如国际专利公开号WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些化合物)和通过其他机制起作用的化合物(例如，利诺胺、整联蛋白anb3功能抑制剂和血管抑素)；细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，如palbocidib、abemacidib、riboddib和alvoddib；血管损伤剂，如考布他汀A4和国际专利公开号WO 99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中公开的化合物；反义疗法，例如针对上文列出的靶标的那些，如抗ras反义分子ISIS2503；和基因治疗方法，包括例如替换异常基因(如异常p53或异常GDEPT)的方法(基因定向酶前药治疗)方法，如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些方法，以及增加患者对化学疗法或放射疗法的耐受性的方法，如多药抗性基因治疗。
合适的免疫治疗方法可以包括但不限于增加患者肿瘤细胞免疫原性的离体和体内方法，如用细胞因子转染，所述细胞因子包括白介素2、白介素4或粒细胞集落刺激因子；降低T细胞无反应性的途径；使用转染的免疫细胞(如细胞因子转染的树突细胞)的方法；使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法；和使用抗独特型抗体的方法。这些方法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对恶性细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。单独的抗体可以用作治疗的效应物，或者它可以募集其他细胞以实际促进细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且仅用作靶向剂。可选地，效应物可以是携带与恶性细胞靶标直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在一些实施方案中，免疫效应物是靶向PD-L1的分子，包括但不限于抗PD-L1抗体，其非限制性实例包括阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、BMS-936559、BMS-935559、国际专利公开号WO 2013/173223、WO 2013/079174、WO 2010/077634、WO 201 1/066389、WO 2010/036959、WO 2007/005874、WO 2004/004771、WO 2006/133396、WO 2013/181634、WO 2012/145493和中国专利公开号CN101104640中所述的抗体、克隆EH12和克隆29E.2A3；CA-170；CA-327；BMS-202(N-[2-[[[2-甲氧基-6-[(2-甲基[1，1’-联苯]-3-基)甲氧基]-3-吡啶基]甲基]氨基]乙基]-乙酰胺)；BMS-8(1-[[3-溴-4-[(2-甲基[1，1，-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶羧酸)；Chang等人(2015)Angew Chem Im Ed Engl,54(40)：11760-11764中描述的肽，特别是(D)PPA-1；AUNP-12；以及WO 2014/151634中描述的肽，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，免疫效应物是靶向PD-1的分子，包括但不限于抗PD-1抗体，其非限制性实例包括纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗(BGB-A317)、WO2016/106159、WO 2009/114335、WO 2004/004771、WO 2013/173223、WO 2015/112900、WO2008/156712、WO 2011/159877、WO 2010/036959、WO 2010/089411、WO 2006/133396、WO2012/145493、WO 2002/078731、抗小鼠PD-1抗体克隆J43、抗小鼠抗体克隆RMP1-14、ANB011(TSR-042)、AMP-514(MEDI0680)、WO 2006/121168、WO 2001/014557、WO 2011/110604、WO2011/110621、WO 2004/072286、WO 2004/056875、WO 2010/036959、WO 2010/029434和WO2013/02209中描述的抗体；AMP-224；WO 2011/082400中描述的化合物；美国专利号6,808,710中描述的分子和抗体；WO 2013/019906中描述的分子和抗体；WO 2003/011911中描述的分子；以及WO 2013/132317中描述的化合物，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，免疫效应物是靶向PD-L2的分子，包括但不限于抗PD-L2抗体，其非限制性实例包括国际专利公开号WO 2010/036959中描述的抗体，其全部内容通过引用并入本文；和rHigM12B7。
在一些实施方案中，免疫效应物是靶向CTLA-4的分子，包括但不限于抗CTLA-4抗体，如伊匹单抗、曲美木单抗、WO 00/37504、WO 01/14424和US2003/0086930中描述的抗体；以及WO 2006/056464中描述的化合物，其全部内容通过引用并入本文。
其他癌症疗法的实例包括植物疗法、冷冻疗法、毒素疗法或促凋亡疗法。本领域技术人员将理解，该列表并非穷举可用于癌症和其他增生性病变的治疗方式的类型。
众所周知，化学疗法和放射疗法靶向快速分裂的细胞和/或破坏细胞周期或细胞分裂。这些治疗作为治疗几种形式的癌症的一部分提供，旨在通过治愈性治疗减缓其进展或逆转疾病症状。然而，这些癌症治疗可能导致免疫受损状态和随后的致病性感染，且因此本发明还延伸至组合疗法，其使用本文所述的式I的PD-L1双环肽模拟物(SEQ ID NO：1)或变体、癌症疗法和抗感染剂，所述抗感染剂有效对抗感染，所述感染由癌症疗法引起的免疫受损病症发展而成或具有发展由癌症疗法引起的免疫受损病症的增加的风险。抗感染药物合适地选自抗微生物剂，其可以包括但不限于杀死或抑制微生物(如病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物等)生长的化合物，并且因此包括抗生素、抗阿米巴药、抗真菌剂、抗原生动物剂、抗疟疾剂、抗结核剂和抗病毒剂。抗感染药物在其范围内还包括驱肠虫剂和杀线虫剂。说明性抗生素包括喹诺酮类(例如，氨氟沙星、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、噁喹酸、培氟沙星、罗索沙星、替马沙星、托氟沙星、司帕沙星、地那沙星、加替沙星、莫西沙星、吉米沙星和加雷沙星)、四环素、甘氨酰环素和噁唑烷酮类(例如，chlortetracydine、demedocydine、多西环素、赖甲环素、甲烯土霉素、米诺环素、土霉素、四环素、tigecydine、利奈唑胺、依哌唑胺)、糖肽、氨基糖苷(例如，阿米卡星、arbekadn、丁苷菌素、dibekadn、福提霉素、庆大霉素、kanamydn、menomydn、奈替米星、ribostamydn、西索米星、pectinomydn、链霉素、妥布霉素)、β-内酰胺(例如，亚胺培南、美罗培南、比阿培南、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢曲嗪、头孢西酮、头孢唑啉、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、cefonidd、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替安、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢泊肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑南、头孢乙腈、头孢氨苄、cephaloglydn、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、cefinetazole、头孢西丁、头孢替坦、氨噻单菌胺(azthreonam)、卡芦莫南、氟氧头孢、拉氧头孢、amdinocilin、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、苄青霉素、carfecilin、doxacillin、didoxacillin、methidllin、美洛西林、nacillin、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林、磺苄西林、替莫西林、ticardllin、头孢托仑、SC004、KY-020、头孢地尼、头孢布烯、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、头孢唑兰、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-20000、LY206763)、利福霉素、大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、竹桃霉素、罗他霉素、蔷薇霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素)、酮内酯类(例如，泰利霉素、赛红霉素)、香豆霉素、林可酰胺类(例如，克林霉素、林可霉素)和氯霉素。
说明性抗病毒剂包括硫酸阿巴卡韦、阿昔洛韦钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、西多福韦、甲磺酸地拉夫定、去羟肌苷、依法韦仑、泛昔洛韦、福米韦生钠、膦甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米夫定拉米夫定/齐多夫定、甲磺酸奈非那韦、奈韦拉平、磷酸奥司他韦、利巴韦林、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、司他夫定、盐酸valacydovir、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。
合适的抗阿米巴药或抗原生动物剂包括但不限于阿托伐醌、盐酸氯喹、磷酸氯喹、甲硝唑、盐酸甲硝哒唑和羟乙磺酸喷他脒。驱虫药可以是选自甲苯咪唑、双羟萘酸噻嘧啶、阿苯达唑、伊维菌素和噻苯达唑中的至少一种。说明性抗真菌剂可选自两性霉素B、两性霉素B胆固醇硫酸盐复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、灰黄霉素微粉、灰黄霉素超微粉、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素和盐酸特比萘芬。合适的抗疟药包括但不限于盐酸氯喹、磷酸氯喹、多西环素、硫酸羟氯喹、盐酸甲氟喹、磷酸伯氨喹、乙胺嘧啶和乙胺嘧啶与磺胺多辛。抗结核药包括但不限于氯法齐明、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福喷汀和硫酸链霉素。
如前所述，可以将PD-L1双环肽模拟物与合适的药学上可接受的载体以剂量单位形式以有效量混合以方便且有效地施用。在一些实施方案中，单位剂型可以包含量在约0.25pg至约2000mg范围内的本发明的活性肽。本发明的活性肽可以以约0.25pg至约2000mg/mL载体的量存在。在药物组合物包含一种或多种另外的活性成分的实施方案中，剂量通过参考所述成分的通常剂量和施用方式来确定。
4.方法
本发明人已经确定了包含对应于式I的氨基酸序列的PD-L1双环肽模拟物抑制或减少PD-L1的核定位。先前已知PD-L1的乙酰化位点的乙酰化增加了其在细胞中的核定位。然而，特别地，本发明人已经发现了对应于PD-L1中的乙酰化位点的PD-L1双环肽模拟物减少或抑制PD-L1的核定位。本发明人已经设想了本发明的PD-L1双环肽模拟物可用于改变PD-L1过表达细胞的形成、增殖、维持、EMT、MET或活力中的至少一种的方法，并且可用于治疗或预防受试者中涉及PD-L1核定位的病症，如癌症。
不希望受理论束缚，发明人已经确定了PD-L1的乙酰化增加了多肽的核定位，因此，提出了抑制PD-L1的乙酰化也将抑制或减少PD-L1的核定位。此外，提出了对应于乙酰化位点的PD-L1双环肽模拟物将竞争性地抑制可核定位多肽的乙酰化，并因此降低PD-L1的核定位。
更具体地，本发明人鉴定了本发明的PD-L1双环肽模拟物抑制或以其他方式破坏PD-L1多肽和输入蛋白之间的相互作用。输入蛋白是与PD-L1结合以将复合物转运到细胞核中的核转运分子。本发明的PD-L1双环肽模拟物是PD-L1-输入蛋白复合物的特异性抑制剂。在一些特别优选的实施方案中，PD-L1双环肽模拟物不显著抑制或破坏输入蛋白与任何其他多肽之间的相互作用。在一些实施方案中，输入蛋白是输入蛋白α(例如，输入蛋白α1)。
因此，在本发明的另一个方面，提供了一种抑制或减少PD-L1核定位的方法，所述方法包含使细胞与PD-L1双环肽模拟物接触，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于式I的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)、由对应于式I的氨基酸序列(例如，SEQID NO：1所示的氨基酸序列)组成或基本上由对应于式I的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)组成。
PD-L1双环肽模拟物包括对应于天然野生型PD-L1氨基酸序列的乙酰化位点的氨基酸。PD-L1的乙酰化通常通过乙酰转移酶进行；特别是组蛋白乙酰转移酶，包括但不限于GCN5、Hatl、ATF-2、Tip60、MOZ、MORF、HB01、p300、CBP、SRC-1、ACTR、TIF-2、SRC-3、TAF1、TFIIIC和/或CLOCK；特别是p300。
在具体的实施方案中，PD-L1双环肽模拟物的氨基酸序列对应于赖氨酸乙酰化位点(即，其中赖氨酸残基被乙酰化的赖氨酸乙酰化位点)；特别是PD-Ll赖氨酸乙酰化位点；最特别是PD-L1的残基255至271。
PD-L1的氨基酸序列(UniProt登录号Q9NZQ7)示于SEQ ID NO：75。对应于PD-L1的残基255至271的氨基酸序列包含潜在的乙酰化位点，其中赖氨酸263上的ε-氨基被乙酰化。残基255至271在以下序列中加下划线。
在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物是分离或纯化的由式I表示的PD-L1双环肽模拟物；特别是SEQ ID NO：1的PD-L1双环肽模拟物，或本文所述的变体PD-L1双环肽模拟物。
在本发明的另一个方面，提供了本发明的分离或纯化的PD-L1双环肽模拟物，特别是式I的PD-L1双环肽模拟物(SEQ ID NO：1)或本文所述的变体PD-L1双环肽模拟物，用于治疗或在制备用于治疗的药物中的用途。本发明还提供了本发明的分离或纯化的PD-L1双环肽模拟物，特别是式I的PD-L1双环肽模拟物(SEQ ID NO：1)或本文所述的变体PD-L1双环肽模拟物，其用于疗法。
本发明还提供了一种抑制或减少PD-L1在过表达PD-L1的细胞中的核定位的方法，所述方法包含使细胞与PD-L1双环肽模拟物接触，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还考虑了PD-L1双环肽模拟物用于抑制或减少PD-L1在PD-L1过表达细胞中的核定位的用途，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成；PD-L1双环肽模拟物，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，用于抑制或减少PD-L1在PD-L1过表达细胞中的核定位；以及用于制备用于这种用途的药物。
在本发明的再另一个方面，提供了一种改变以下至少一种的方法：PD-L1过表达细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)EMT；(v)MET；或(vi)活力，所述方法包含使所述细胞与形成、增殖、维持、EMT、MET或活力调节量的PD-L1双环肽模拟物接触，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还考虑了包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成的PD-L1双环肽模拟物用于改变以下至少一种的用途：PD-L1过表达细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)EMT；(v)MET；或(vi)活力。本发明还延伸至PD-L1双环肽模拟物，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，用于改变以下中的至少一种：PD-L1过表达细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维持；(iv)EMT；(v)MET；或(vi)活力；以及用于制备用于该用途的药物。
在上述任一方面的一些实施方案中，PD-L1过表达细胞是癌干细胞或非癌干细胞肿瘤细胞，特别是癌干细胞肿瘤细胞。
在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物导致PD-L1过表达细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)维护；(iv)EMT或(vi)活力；和/或增强PD-L1过表达细胞的(v)MET。
PD-L1双环肽模拟物的合适实施方案如本文所述。
包含对应于本文所述乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于本文所述乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于本文所述乙酰化位点的氨基酸序列组成的PD-L1双环肽模拟物，特别是式I的PD-L1双环肽模拟物(SEQ ID NO：1)或变体PD-L1双环肽模拟物，可用于抑制PD-L1的核定位。因此，本发明人设想了PD-L1双环肽模拟物可用于治疗或预防受试者的癌症。因此，在另一个方面，提供了一种用于治疗或预防受试者的癌症的方法，其中癌症包含至少一种PD-L1过表达细胞，所述方法包含向受试者施用PD-L1双环肽模拟物，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还延伸至包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成的PD-L1双环肽模拟物用于治疗或预防受试者的癌症的中的用途，其中癌症包含至少一种PD-L1过表达细胞；以及在制备用于此目的的药物中的用途。还考虑了PD-L1双环肽模拟物，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列，由包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，用于治疗或预防受试者的癌症，其中癌症包含至少一种PD-L1过表达细胞。
癌症可以是涉及PD-L1过表达的任何癌症。合适的癌症可包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌或脑癌，或黑色素瘤或视网膜母细胞瘤；特别是乳腺癌、肺癌或黑色素瘤；最特别是乳腺癌或黑色素瘤；更特别是乳腺癌。
在一些实施方案中，包含对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列组成的PD-L1双环肽模拟物可用于治疗、预防和/或缓解恶性肿瘤，特别是转移性癌症的症状。在优选的实施方案中，PD-L1双环肽模拟物用于治疗、预防和/或缓解转移性癌症的症状。转移性癌症的合适类型包括但不限于转移性乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肾癌或脑癌，或黑色素瘤或视网膜母细胞瘤。在一些实施方案中，脑癌是神经胶质瘤。在优选的实施方案中，转移性癌症是转移性乳腺癌、肺癌或黑色素瘤；特别是转移性乳腺癌或黑色素瘤；最特别是转移性乳腺癌。
PD-L1双环肽模拟物可用于涉及过表达PD-Ll的细胞的方法中。在具体的实施方案中，PD-L1过表达细胞选自乳腺、前列腺、睾丸、肺、膀胱、胰腺、结肠、黑色素瘤、白血病、视网膜母细胞瘤、肝、卵巢、肾或脑细胞；特别是乳腺、肺或黑色素瘤细胞；最特别是乳腺或黑色素瘤细胞；更特别是乳腺细胞。在优选的实施方案中，PD-L1过表达细胞是乳腺上皮细胞，特别是乳腺导管上皮细胞。
在一些实施方案中，PD-L1过表达细胞是癌干细胞或非癌干细胞肿瘤细胞；特别是癌干细胞肿瘤细胞；最特别是乳腺癌干细胞肿瘤细胞。在一些实施方案中，癌干细胞肿瘤细胞表达CD24和CD44，特别是CD44高CD24低。
在一些实施方案中，所述方法还包括在向受试者施用PD-L1双环肽模拟物之前，检测从受试者获得的肿瘤样本中PDL1基因的过表达，其中所述肿瘤样本包含癌干细胞肿瘤细胞和任选的非癌干细胞肿瘤细胞。
包含对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列组成的PD-L1双环肽模拟物适用于治疗已被诊断患有癌症、怀疑患有癌症、已知易感且被认为可能发展癌症或被认为发展先前治疗的癌症的复发的个体。癌症可以是激素受体阴性的。在一些实施方案中，癌症是激素受体阴性的，因此对激素或内分泌疗法具有抗性。在癌症是乳腺癌的一些实施方案中，乳腺癌是激素受体阴性的。在一些实施方案中，乳腺癌是雌激素受体阴性和/或孕酮受体阴性的。
存在许多涉及PD-L1过表达的条件，其中包含对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于如本文所述的乙酰化位点的氨基酸序列组成的PD-L1双环肽模拟物可能是有用的。因此，在本发明的另一个方面，提供了一种治疗或预防受试者的病症的方法，关于所述病症，PD-L1的核定位的抑制或减少与有效治疗相关，所述方法包含向受试者施用PD-L1双环肽模拟物，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成。本发明还提供了包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成的PD-L1双环肽模拟物用于治疗或预防受试者的病症的用途，关于所述病症，PD-L1的核定位的抑制或减少与有效治疗相关；PD-L1双环肽模拟物，其包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，用于治疗或预防受试者的病症，关于所述病症，PD-L1的核定位的抑制或减少与有效治疗相关；以及包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成的PD-L1双环肽模拟物在制备用于此目的的药物中的用途。
涉及PD-L1过表达的病症的非限制性实例包括癌症、感染、自身免疫疾病和呼吸系统障碍。
在一些实施方案中，感染是病原性感染。感染可以选自但不限于病毒、细菌、酵母、真菌、蠕虫或原生动物感染。本发明考虑的病毒感染包括但不限于由HIV、肝炎、流感病毒、日本脑炎病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒、丝状病毒、人乳头瘤病毒、人T细胞嗜淋巴细胞病毒、人逆转录病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、肠道病毒、鼻病毒、埃博拉病毒、西尼罗河病毒和呼吸道合胞病毒引起的感染；特别是由HIV、肝炎、流感病毒、日本脑炎病毒、EB病毒和呼吸道合胞病毒引起的感染。细菌感染包括但不限于由奈瑟氏球菌属(Neisseria)物种、脑膜炎球菌属(Meningococcal)物种、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、链球菌属(Streptococcal)物种、军团菌属(Legionella)物种、支原体属(Mycoplasma)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、衣原体属(Chlamydia)物种、放线菌属(Actinomyces)物种、鱼腥藻属(Anabaena)物种、拟杆菌属(Bacteroides)物种、蛭弧菌属(Bdellovibrio)物种、博德特氏菌属(Bordetella)物种、Borrella物种、弯曲杆菌属(Campylobacter)物种、柄杆菌属(Caulobacter)物种、氯菌属(Chlrorbium)物种、染色菌属(Chromatium)物种、梭菌属(Chlostridium)物种、棒状杆菌属(Corynebacterlum)物种、噬纤维菌属(Cytophaga)物种、异常球菌属(Deinococcus)物种、埃希氏菌属(Escherichia)物种、弗朗西斯氏菌属(Francisella)物种、螺杆菌属(Helicobacter)物种、嗜血杆菌属(Haemophilus)物种、丝微菌属(Hyphomicrobium)物种、钩端螺旋体属(Leptospira)物种、细辛菌属(Usteria)物种、微球菌属(Micrococcus)物种、分枝球菌属(Mycococcus)物种、硝化细菌属(Nitrobacter)物种、颤藻属(Oscillatoila)物种、原绿藻属(Prochloron)物种、变形杆菌属(Proteus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、红螺菌属(Rhodospirillum)物种、立克次体属(Rickettsia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、螺旋菌属(Spirillum)物种、螺旋体属(Spirochaeta)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、硫杆菌属(Thiobacillus)物种、密螺旋体属(Treponema)物种、弧菌属(Vibrio)物种、耶尔森氏菌属(Yersinia)物种、诺卡氏菌属(Legionella)物种和分枝杆菌属(Mycobacterium)物种；特别是由奈瑟氏球菌属物种、脑膜炎球菌属物种、嗜血杆菌属物种、沙门氏菌属物种、链球菌属物种、军团菌属物种和分枝杆菌属物种引起的感染。本发明涵盖的原生动物感染包括但不限于由疟原虫属(Plasmodium)物种、利什曼原虫属(Leishmania)物种、锥虫属(Trypanosoma)物种、弓形虫属(Toxoplasma)物种、内阿米巴属(Entamoeba)物种和贾第虫属(Giardia)物种引起的那些。蠕虫(Helminth)感染可以包括但不限于由血吸虫属(Schistosoma)物种引起的感染。本发明考虑的真菌感染包括但不限于由组织胞浆菌属(Histoplasma)物种和念珠菌属(Candida)物种引起的感染。
合适的自身免疫性疾病包括但不限于自身免疫性风湿性疾病(如，例如类风湿性关节炎、干燥综合征、硬皮病、狼疮如系统性红斑狼疮(SLE)和狼疮性肾炎、多肌炎-皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和牛皮癣性关节炎)、自身免疫性胃肠道和肝脏疾病(如，例如炎性肠病，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、血管炎(如，例如抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)阴性血管炎和ANCA相关血管炎，包括Churg-Strauss血管炎、韦格纳氏肉芽肿病和显微镜下多血管炎)、自身免疫性神经障碍(如，例如多发性硬化、眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和自身免疫性多发性神经病)、肾病变(如，例如肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征和贝格尔氏病)、自身免疫性皮肤病(如，例如银屑病、荨麻疹(urticaria)、荨麻疹(hives)、寻常性天疱疮、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液系统障碍(如，例如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力障碍疾病(如，例如内耳疾病和听力损失)、贝赫切特氏病、雷诺氏综合征、器官移植和自身免疫性内分泌病症(如，例如糖尿病相关的自身免疫性疾病，如I型糖尿病、艾迪生氏病和自身免疫性甲状腺疾病(例如，格雷夫斯病和甲状腺炎))。
合适的呼吸系统障碍包括但不限于慢性阻塞性肺病(CORD)或哮喘，特别是过敏性哮喘。
在一些实施方案中，所述方法还包括在向受试者施用本发明的PD-L1双环肽模拟物之前，检测从受试者获得的肿瘤样本中PD-L1基因的过表达，其中所述肿瘤样本包含癌干细胞肿瘤细胞和任选的非癌干细胞肿瘤细胞。
在具体的实施方案中，上述任一种方法包含施用一种或多种如上文3.3节所述的其他活性剂，例如另外的癌症疗法和/或抗感染剂，特别是另外的癌症疗法。
本发明的PD-L1双环肽模拟物，特别是式1的PD-L1双环肽模拟物(SEQ ID NO：1)，或本文所述的变体PD-L1双环肽模拟物，可用于抑制或减少PD-L1的乙酰化。在一些实施方案中，乙酰化由乙酰转移酶催化；特别是组蛋白乙酰转移酶。在一些实施方案中，组蛋白乙酰转移酶是GCN5、Hatl、ATF-2、Tip60、MOZ、MORF、HBO1、p300、CBP、SRC-1、ACTR、TIF-2、SRC-3、TAF1、TFIIIC和/或CLOCK；特别是P300。
因此，在本发明的再一个方面，提供了一种抑制受试者中乙酰转移酶的催化活性的方法，包括施用PD-L1双环肽模拟物，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成，其实施方案在本文中描述。本发明还延伸至本文所述的PD-L1双环肽模拟物用于抑制受试者中乙酰基转移酶的催化活性的用途，以及本文所述的PD-L1双环肽模拟物，其用于抑制受试者中乙酰基转移酶的催化活性。在优选的实施方案中，乙酰转移酶是组蛋白乙酰转移酶，其实施方案如上所述。
本发明还考虑了一种产生抑制或减少PD-L1核定位的PD-L1双环肽模拟物的方法，其中PD-L1乙酰化位点的乙酰化增加了其在细胞中的核定位，所述方法包含：
a)使细胞与PD-L1双环肽模拟物接触，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于乙酰化位点的氨基酸序列、由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成或基本上由对应于乙酰化位点的氨基酸序列组成；和b)相对于在不存在PD-L1双环肽模拟物的情况下核定位的正常或参考水平，检测细胞中可核定位多肽的核定位的降低或抑制。
本发明还考虑了一种产生抑制或减少PD-L1核定位的PD-L1双环肽模拟物的方法，其中PD-L1与输入蛋白(例如，输入蛋白α)的结合增加了其在细胞中的核定位，所述方法包含：
a)使细胞与PD-L1双环肽模拟物接触，所述PD-L1双环肽模拟物包含对应于PD-L1氨基酸序列的氨基酸序列、由对应于PD-L1氨基酸序列的氨基酸序列组成或基本上由对应于PD-L1氨基酸序列的氨基酸序列组成；和
b)相对于在不存在PD-L1双环肽模拟物的情况下PD-L1与输入蛋白(例如，输入蛋白α)的结合的正常或参考水平，检测细胞中PD-L1与输入蛋白(例如，输入蛋白α)的结合的减少或抑制。
在另一个方面，本发明提供了一种产生抑制或减少PD-L1核定位的PD-L1双环肽模拟物的方法，其中PD-L1乙酰化位点的乙酰化增加了其在细胞中的核定位，所述方法包含：
a)使细胞与PD-L1双环肽模拟物接触，所述PD-L1双环肽模拟物包含式I所示的氨基酸序列、由式I所示的氨基酸序列组成或基本上由式I所示的氨基酸序列组成；和
b)相对于在不存在PD-L1双环肽模拟物的情况下核定位的正常或参照水平，检测细胞中可核定位多肽的核定位的降低或抑制。
本发明还考虑了一种产生抑制或减少PD-L1核定位的PD-L1双环肽模拟物的方法，其中PD-L1与输入蛋白(例如，输入蛋白α)的结合增加了其在细胞中的核定位，所述方法包含：
a)使细胞与PD-L1双环肽模拟物接触，所述PD-L1双环肽模拟物包含根据式I的氨基酸序列、由根据式I的氨基酸序列组成或基本上由根据式I的氨基酸序列组成；和
b)相对于在不存在PD-L1双环肽模拟物的情况下PD-L1与输入蛋白(例如，输入蛋白α)的结合的正常或参照水平，检测细胞中PD-L1与输入蛋白(例如，输入蛋白α)的结合的降低或抑制。
在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物与天然野生型PD-L1序列(例如，天然PD-L1 NLS)的区别至少在于添加了三个半胱氨酸残基。
PD-L1核定位的减少或抑制可以使用本领域的标准技术来确定，所述技术的非限制性实例包括免疫荧光、免疫组织化学染色、染色质免疫沉淀(ChIP)、ChIP-seq、染色质可及性测定，如DNase-seq、FAIRE-seq和ATAC-seq测定，如Satelli等人(2016)Sci Rep，6：28910；Bajetto等人(2000)Brain Research Protocols，5(3)：273-281；和Sung等人(2014)BMC Cancer，14：951中所述的，其全部内容按引用并入本文。
在另一个方面，提供了一种产生PD-L1双环肽模拟物的方法，所述PD-L1双环肽模拟物抑制或减少癌细胞(例如，癌干细胞)的形成、增殖、活力或EMT中的至少一种，所述方法包含：
a)使癌干细胞与PD-L1双环肽模拟物接触，所述PD-L1双环肽模拟物包含式I所示的氨基酸序列、由式I所示的氨基酸序列组成或基本上由式I所示的氨基酸序列组成；和
b)相对于在不存在所述PD-L1双环肽模拟物的情况下所述细胞的形成、增殖、活力或EMT的正常或参考水平，检测所述癌干细胞的形成、增殖或EMT的降低或抑制。
在一些实施方案中，PD-L1双环肽模拟物与PD-L1(例如，PD-L1 NLS)的区别至少在于添加了三个半胱氨酸残基。
PD-L1双环肽模拟物的氨基酸序列可以对应于天然的、设计的或合成的乙酰化位点。在一些实施方案中，乙酰化位点是PD-L1的位点。合适的乙酰化位点如本文先前所述。在其他实施方案中，对应于乙酰化位点的氨基酸序列不同于PD-L1的氨基酸序列。
具有对应于设计的乙酰化位点的氨基酸序列的PD-L1双环肽模拟物可以使用本领域的药物化学技术标准来鉴定。
多肽的乙酰化位点可以使用计算方法来鉴定，如Hake和Janzen(2013)P roteinAcetylation：Methods and Protocols，Methods in Molecular Biology，第981卷；Li等人(2014)Srf Rep，4：57 65；Hou等人(2014)PLoS One，9(2)：e89575；和Wuyun等人(2016)PLoSOne，11(5)：e0155370(其全部内容通过引用并入)中所述；或者可以使用例如预测残基的诱变与使用例如针对乙酰化氨基酸残基(如乙酰化赖氨酸)的抗体检测乙酰化水平的组合通过实验来确定。可以使用本领域的药物化学技术标准来确定周围和/或近端残基的参与。
本领域技术人员将充分意识到用于评价多肽(如PD-L1)的核定位和鉴定抑制或减少多肽核定位的PD-L1双环肽模拟物的合适测定法。根据本发明的活性剂的筛选可以通过任何合适的方法来实现。例如，该方法可包括使表达对应于编码目的多肽(如PD-L1)的基因的多核苷酸的细胞与疑似具有抑制活性的药剂接触，并筛选细胞核中目的多肽水平的抑制或降低。
可选地，可以筛选目的多肽的功能活性的抑制或由多核苷酸编码的转录物的水平的降低，或多肽或转录物的下游细胞靶标的活性或表达的抑制，其中活性与PD-L1的核定位相关。检测此类抑制可利用包括但不限于以下的技术来实现：ELISA、免疫荧光、Western印迹、免疫沉淀、免疫染色、狭缝或斑点印迹测定、闪烁邻近测定(scintillation proximityassay)、使用抗原结合分子缀合物或荧光物质(如荧光素或罗丹明)的抗原缀合物的荧光免疫测定、RIA、Ouchterlony双扩散分析、采用抗生物素蛋白-生物素或链霉亲和素-生物素检测系统的免疫测定、核酸检测测定(包括逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR))、细胞增殖测定(如WST-1增殖测定)和用PD-L1半通道ChIP处理的细胞的免疫印迹分析。多肽的乙酰化可以使用针对乙酰化多肽的抗体，如针对乙酰化赖氨酸残基的抗体来确定。
将理解从其调节或表达PD-L1的多核苷酸可以天然存在于作为测试对象的细胞中，或者可以为了测试的目的将其导入宿主细胞中。
乙酰酶催化活性的抑制可以使用本领域的标准技术测定。例如，乙酰转移酶的抑制可以使用以下来评估：荧光测定，如来自Abcam的乙酰转移酶活性测定试剂盒(货号ab204536)、来自BPS Bioscience的p300荧光测定试剂盒(货号50092)、或来自Abcam的p300抑制剂筛选测定试剂盒(荧光测定)(货号ab196996)；比色测定，如来自Abcam的组蛋白乙酰转移酶活性测定试剂盒(货号ab65352)；或化学发光测定，如来自BPS Bioscience的p300化学发光测定试剂盒(货号50077)。
这些方法提供了进行高通量筛选推定的调节剂(如蛋白质药剂)的机制，所述调节剂包括合成的、组合的、化学的和天然的文库。
可以在动物模型中进一步测试活性分子，以鉴定具有最有效的体内作用的那些分子。这些分子可以用作药物进一步开发的先导分子，例如通过使化合物经受序列修饰、分子建模和在合理药物设计中采用的其他常规程序。
5.试剂盒
在本发明的其他实施方案中，提供了包含PD-L1双环肽模拟物和抗癌喷雾剂的治疗试剂盒。在一些实施方案中，治疗试剂盒还包含包装插页，所述包装插页包含用于同时施用PD-L1双环肽模拟物和抗癌剂以治疗T细胞功能失调性障碍、或增强患有癌症的个体的免疫功能(例如，免疫效应物功能、T细胞功能等)、或治疗或延迟癌症进展、或治疗个体中的感染的说明材料。在一些实施方案中，抗癌剂包含化学治疗剂(例如，靶向快速分裂细胞和/或破坏细胞周期或细胞分裂的药剂，其代表性实例包括细胞毒性化合物，如紫杉烷)。
在一些实施方案中，LSD抑制剂、PD-l结合拮抗剂和任选的化学治疗剂位于同一容器或分开的容器中。合适的容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。容器可以由各种材料形成，如玻璃、塑料(如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，容器容纳制剂，并且容器上或与容器相关联的标记可以指示使用说明。试剂盒还可以包括从商业和用户观点来看期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明材料的包装插页。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种其他药剂(例如，化学治疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种药剂的合适容器包括例如瓶、小瓶、袋和注射器。
在本发明的其他实施方案中，提供了用于测定生物标志物(包括本文公开的T细胞功能生物标志物)的表达的诊断试剂盒，其包括允许检测和/或定量生物标志物的试剂。此类试剂包括例如允许定量生物标志物的化合物或材料，或化合物或材料组。在具体的实施方案中，化合物、材料或化合物或材料组允许测定基因(例如，T细胞功能生物标志物基因)的表达水平，包括但不限于RNA材料的提取、相应RNA的水平的测定等、用于合成相应cDNA的引物、用于扩增DNA的引物和/或能够与由基因编码的RNA(或相应cDNA)特异性杂交的探针、TaqMan探针、邻近测定探针、连接酶、抗体等。
试剂盒还可任选地包括用于检测标记的适当试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微量滴定板、稀释缓冲液等。例如，基于核酸的检测试剂盒可以包括(i)T细胞功能生物标志物多核苷酸(其可以用作阳性对照)，(ii)与T细胞功能生物标志物多核苷酸特异性杂交的引物或探针。还可以包括适用于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(逆转录酶、Taq、SequenaseTM、DNA连接酶等，取决于所采用的核酸扩增技术)、脱氧核苷酸和缓冲液，以提供扩增所需的反应混合物。这样的试剂盒通常还将以合适的方式包含用于每种单独的试剂和酶以及用于每种引物或探针的不同容器。可选地，基于蛋白质的检测试剂盒可以包括(i)T细胞功能生物标志物多肽(其可以用作阳性对照)，(ii)特异性结合T细胞功能生物标志物多肽的抗体。试剂盒的特征还可以在于用于进行本文所述的测定之一的各种装置(例如，一种或多种)和试剂(例如，一种或多种)；和/或使用所述试剂盒定量T细胞功能生物标志物基因的表达的印刷说明材料。本文所述的试剂(其可以任选地与可检测标记相关联)可以以微流体卡、芯片或腔室、微阵列或试剂盒的形式呈现，所述形式适于与实施例或下文中所述的测定(例如，本文所述的RT-PCR或qPCR技术)一起使用。
适于包装诊断试剂盒组分的材料可包括晶体、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小瓶、纸、信封等。另外，本发明的试剂盒可以包含用于同时、顺序或分开使用试剂盒中包含的不同组分的说明材料。说明材料可以是印刷材料的形式或能够存储说明使得它们可以被受试者读取的电子载体的形式，如电子存储介质(磁盘、磁带等)、光学介质(CD-ROM、DVD)等。可选地或另外地，介质可以包含提供指导材料的互联网地址。
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将通过以下非限制性实施例描述特别优选的实施方案。
实施例
实施例1
靶向PD-L1核翻译后修饰的双环抑制剂的开发
本发明人进行丙氨酸步进(walk)以鉴定PD-L1的乙酰化/去甲基化和核定位序列内的关键残基。鉴定了在突变为丙氨酸时降低对转移起始细胞(MIC)数量有效抑制超过50％的一系列残基(参见，表1)。本发明人还鉴定了在突变为丙氨酸时与对照相比增加对MIC数量的有效抑制的两个残基。基于优化的序列，产生了三种环肽抑制剂(DL-1、DL-2和DL-3)。DL-1和2被认为是可行的，因为这两种构建体都保留了NLS基序和进行翻译后修饰(PTM)的关键K263残基，而DL-3破坏了核心NLS基序，且因此被认为是不可行的。DL-2构建体在NLS基序的前部含有接头残基Ala-Cys，这使得核心关键残基在双环肽的3D维度结构中是可接近的(参见，图2B)。DL-1在序列末端具有Cys-Gly接头残基，其从根本上改变了双环肽的3D结构，使前端和NLS中的关键残基难以接近。因此，本发明人假设DL-2应该起作用，而DL-1可能不如DL-2有效，因为序列C-末端的接头区破坏了整体3D结构和对关键基序/残基的可及性。
表5
丙氨酸步进 抑制％
TFIFRLRKGRMADVKK 100
TFIFRLRKGRMMAVKK 100
TFIFRLRKGRMMDAKK 81.9
AFIFRLRKGRMMDVKK 80.13
TAIFRLRKGRMMDVKK 74.35
TFIFRLRKGRAMDVKK 74.35
TFIFALRKGRMMDVKK 71.67
TFIFRLRKGAMMDVKK 62.69
TFIFRLRKGRMMDVKA 58.03
TFIFRLRKGRMMDVAK 48.7
TFIFRLAKGRMMDVKK 43.98
TFIFRLRKARMMDVKK 41.38
TFIFRARKGRMMDVKK 35.6
TFAFRLRKGRMMDVKK 30.2
TFIARLRKGRMMDVKK 4.4
TFIFRLRAGRMMDVKK 0
材料&方法
流式细胞术测定丙氨酸步进
对用一系列丙氨酸步进肽抑制剂处理的单细胞悬液进行FACS(荧光激活细胞分选)。将细胞用抗体阵列染色以靶向转移起始细胞(MIC)标签，包括CD44、CD24、SNAIL、ABCB5、CSV和Hoechst染料，以监测细胞活力。采用所使用的FACS门控策略并且从我们的转移起始细胞(MIC)标签进行修饰，其基于MIC(治疗抗性表型)分选细胞，显示与转移性和侵袭性癌细胞相关。在分析中总是包括流式细胞术门控策略以排除死细胞(Hoechst阴性细胞)。使用BLSR II对单细胞悬液进行流式细胞术采集。使用FlowJo软件进行分析。
实施例2
PD-L1 NLS PTM基序指示癌症治疗反应性
本发明人接下来采用了他们的新型生物标志物发现，一种新型PD-L1乙酰化/甲基化生物标志物，其将免疫疗法抗性和反应性转移性癌症患者进行分层。许多细胞信号蛋白最近被描述为具有核基因调节作用。许多涉及癌症发展和进展的蛋白质受到PTM的精确调节，这些PTM决定了不同的转录结果。先前的数据表明PTM还控制免疫检查点蛋白的活性以介导对免疫疗法和化学疗法的抗性。为了鉴定潜在的免疫检查点调节剂，本发明人进行了多种免疫检查点蛋白的计算机筛选，所述免疫检查点蛋白含有：
(i)推定的核定位序列(NLS)；和
(ii)基于表观遗传的PTM标签。
基于PD-L1基序分析，本发明人鉴定了高分NLS内赖氨酸263处的特定乙酰化/甲基化基序。用靶向这些基序的抗体进行的细胞染色研究确定了PDL1-PTMl(乙酰化)和PDL1-PTM2(甲基化)的存在，所述PDL1-PTM1(乙酰化)在免疫抗性癌细胞核中富集，所述PDL1-PTM2(甲基化)在细胞质中/细胞表面处的免疫反应癌细胞中富集(图2A)。这些新型nPD-L1-PTM变体仅在固有抗性侵袭性“冷肿瘤”(如TNBC和前列腺癌)以及抗性“热肿瘤”(如黑色素瘤和肺癌)中富集，并且与免疫疗法反应相关(图2B)。最近的研究还支持PD-L1在控制肿瘤生长和增殖中的核作用。
基于这些数据，本发明人开发了液体活组织检查nPD-L1诊断生物标志物，以鉴定可能对免疫疗法有反应的免疫疗法患者(图2)。已经产生了靶向PD-L1中的PTM1(263-赖氨酸-乙酰化)和PTM2(263-赖氨酸-三甲基化)的五种新型亲和纯化的抗体。值得注意的是，这个区域不被市售PD-L1诊断抗体(例如，73-10、28-8、SP142、CAL-10)靶向。通过广泛ELISA测定证实了对靶序列的特异性，其显示靶向PTM1(263-赖氨酸-乙酰化)或PTM2(263-赖氨酸-三甲基化)的定制抗体未检测到未修饰的基序。另外，用针对特定PTM的肽模拟物进行的体外肽阻断测定阻断了我们相应的新型PD-L1靶向抗体，而针对特定PTM的肽模拟物不影响商业抗体结合。我们已经在我们的高通量筛选(图3A)和免疫印迹分析(图3B))中证明了我们的抗体在我们的诱导型间充质模型(MCF7)中的特异性。这些数据表明PD-L1的乙酰化形式确实是核偏向变体。
为了进一步证实我们的PD-L1-PTM1特异性抗体的核定位，本发明人使用ANDOR旋转盘超分辨率显微镜进行了超分辨率成像。该成像数据(图4)清楚地描绘了PD-L1-PTM1在TNBC细胞系MDA-MB-231和诱导型间充质MCF7模型中的核定位。
实施例3
TNBC脑转移瘤病变中PD-L1-ME3和PD-L1-AC表达
本发明人还证实了在转移性TNBC患者的脑转移病变中存在细胞核PD-L1-PTM1(PD-L1-Ac)和细胞质PD-L1-PTM2(PD-L1-Me3)。这些数据表明PD-L1-PTM1或PTM2在治疗患有脑转移性疾病的TNBC患者(难以治疗且对免疫疗法有抗性的患者队列)中的潜在治疗靶标(图5)。另外，本发明人还观察到TNBC患者脑中肿瘤转移病变内的浸润性CD8+T细胞对PD-L1-PTM1(PD-L1-Ac)表达呈阳性(参见图6)。这些结果表明这些数据也可以指示功能失调的CD8+T细胞。
总结
PD-L1以多种翻译后修饰形式存在。我们已经鉴定了两种关键的PTM：赖氨酸263处的三甲基化和乙酰化。
乙酰化(Ac)主要发生在细胞核PD-L1亚型上，几乎没有细胞质表达，且没有细胞表面表达。患者队列中的表征：主要与对免疫疗法和进行性疾病有抗性的患者相关。
甲基化(Me3)主要发生在细胞质和细胞表面亚型上，几乎没有核表达。患者队列中的表征：主要与对免疫疗法有反应的患者相关。因此，PD-L1三甲基化提供了将PD-L1靶向细胞表面以进行有效免疫疗法的新机会的途径。
本发明人开发了能够竞争性靶向该核轴的双环抑制剂。
此外，本发明人确定了PD-L1核定位基序在多个物种中是保守的，并且对于PD-L1是唯一的：
＞sp|Q9NZQ7|PD1L1_HUMAN Programmed cell death l ligand 1 OS＝Homosapiens
OX＝9606 GN＝CD274 PE＝1 SV＝1
Human：LTFIFRLRKG-RMMDVKKCGIQDTNSKK
Mouse：LLF---LRKQVRMLDVEKCGVEDTSSKN(Identities：50％，Positives：79％)
Pig：TAIFCLKRNV-RMMDVEKCGSRDMKSEK(Identities：58％，Positives：75％)
Marmot：LTILFCLRKNVRMLDVENGGIQDINSRK(Identities：62％，Positives：75％)
Cat：LKKRDGISFIAVVPTGHMGKRMGGCCCH(Identities：0％，Positives：0％)
Dog：LAVTFCLKKHGRMMDVEKCCTRDRNSKK(Identities：61％，P。sitives：75％)
Gorilla：LTFIFCLRKG-RMMDVKKCGIQDTNSKK(Identities：85％，Positives：90％)
Rhesus：LTFIFYLRKG-RMMDMKKSGIRVTNSKK(Identities：85％，Positives：90％)
Chimp：LTFIFCLRKG-RMMDVKKCGIQDTNSKK(Identities：97％，Positives：97％)
实施例4
双环肽抑制剂的功效
本发明人接下来利用他们定制的新型抗体工具来探测靶向PD-L1-PTMl的细胞核形式的候选双环抑制剂的有效性。首先，发明人检查了DL-l和DL-2对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDA-MB-231或其脑癌克隆MDA-MB-231-Br的增殖的影响。引人注目的是，尽管两种双环肽抑制剂(DL-1和DL-2)都能够抑制TNBC癌细胞系的增殖，但DL-2能够以比DL-1高2-3倍的效力抑制(图7)。
接着，在用双环抑制剂DL-1或DL-2处理后，通过高分辨率数字病理学检查转移负荷的间充质调节物和抗性的干细胞样标签(图9)。
分析揭示了DL-2能够显著抑制MDA-MB-231和MDA-MB-231-Br TNBC细胞系中的所有间充质干细胞样抗性蛋白标志物。这些数据证明了用先导双环肽候选物DL-2靶向核PD-L1-AC(PTM1)的明确功效。有趣的是，本发明人发现用DL-2和(较小程度的DL-1)处理也能够在MDA-MB-231和MDA-MB-231-Br TNBC细胞系中诱导上皮标志物E-钙粘蛋白的表达(图10)。
接着，本发明人检查了DL-2诱导PD-L1-Me3的细胞表面或细胞质表达的能力。假设诱导PD-L1-Me3的细胞表面/细胞质表达也将通过细胞表面PD-L1-Me3的表达增加而与免疫疗法反应性标签相关，所述细胞表面PD-L1-Me3提供抗PD-L1免疫疗法命中的靶标。这也与上述数据一致。
本发明人首先检查了在非透化细胞中用HDAC2i抑制DL-2的效果，这将阻止PD-L1的脱乙酰化，并在理论上增加PD-L1在赖氨酸263PTM-NLS基序处的乙酰化(并减少PD-L1的甲基化)。使用高分辨率数字病理学，我们发现用DL-2处理诱导细胞表面PD-L1-Me3表达的显著上调(图11)。在透化细胞中观察到几乎相同的模式，其中在透化MDA-MB-231细胞中DL-2消除核PD-L1-Me3的表达并显著上调细胞质/细胞表面P-DL1-Me3(图12)。
总结
本发明人已经鉴定了一种新型双环抑制剂DL-2，其能够靶向并抑制转移性癌症的增殖，以及抑制间充质标志物的表达，包括CSV(细胞表面波形蛋白)、EGFR、FOXQ1和ABCB5表达。DL-2还能够诱导上皮标志物E-钙粘蛋白的表达。该数据集表明，通过用我们的新型双环抑制剂靶向PD-L1的核轴，DL-2抑制能够将间充质抗性标签癌细胞重新编程为上皮反应性癌细胞。这也表明，由于DL-2将诱导PD-L1的细胞表面表达(P-DL1-PTM2/PD-L1-Me3)，经处理的细胞将适合于顺序的组合免疫疗法，其中细胞表面PD-L1的增加为抗PD-L1免疫疗法提供了作用的靶标。这结合我们的TNBC脑转移数据表明，靶向核PDL1轴可以消除对免疫疗法的抗性，并适用于具有重转移负担的患者，如在脑转移性疾病的情况下。
实施例5
先前的研究已经揭示了对免疫疗法有抗性的患者具有内化至细胞核的PD-L1形式。为了给这些患者提供替代性治疗，本发明人已经用新型双环肽模拟物DL-2成功且特异性地靶向核PD-L1，其阻止PD-L1进入细胞核。
RNA-测序(RNA seq)数据获自经过和未经过DL-2处理的人乳腺癌细胞系MCF-7。如下收集来自4个实验组的总共9个样品：
·对照(非刺激对照，Ctrl)(n＝3)；
·刺激的(PMA刺激的对照)(n＝3)；
·DL-2(用DL-2处理并用PMA刺激的)(n＝3)；
对于DL-2处理组，首先将MCF-7细胞暴露于DL-2，然后用PMA刺激。
该计划(script)的目的是在以下之间进行差异表达分析和途径分析：
·刺激vs.对照，以确定哪些基因受到PMA刺激的影响。
·DL-2vs.刺激的：以确定哪些基因受到DL-2PD-L2双环肽模拟物的影响。
本发明人确定了在DL-2组和刺激对照组之间差异表达的基因。
刺激组和对照组之间的差异表达分析
刺激组和对照组的差异表达分析产生以下数目的差异表达基因(DEG)：
·2219个具有FDR＜0.01和绝对logFC＞1的基因；
·2222个具有FDR＜0.05和绝对logFC＞1的基因；
·4072个具有FDR＜0.05和绝对logFC＞0.584963(FC 1.5)的基因；
·6385个具有FDR＜0.05和绝对logFC＞0.321928(FC 1.25)的基因；
·8096个具有FDR＜0.01的基因(无logFC过滤)；
·8779个具有FDR＜0.05的基因(无logFC过滤)。
通过将结果限于FDR＜0.05的DEG，本发明人进一步阐明了
·2191个具有logFC＞0.584963的基因(在刺激的样品中上调，FC 1.5)；
·1881个具有logFC＜-0.584963的基因(在刺激样品中下调，FC -1.5)。
DL-2和刺激组之间的差异表达分析
DL-2和刺激组的差异表达分析产生了以下数目的差异表达基因(DEG)：
·48个具有FDR＜1和绝对logFC＞1的基因；
·49个具有FDR＜0.05和绝对logFC＞1的基因；
·779个具有FDR＜0.05和绝对logFC＞0.584963(FC 1.5)的基因；
·3439个具有FDR＜0.05和绝对logFC＞0.321928(FC 1.25)的基因；
·6094个具有FDR＜0.01的基因(无logFC过滤)；
·7305个具有FDR＜0.05的基因(无1ogFC过滤)。
此外，通过将结果限于FDR＜0.05的DEG，本发明人发现：
·385个具有logFC＞0.584963的基因(在DL-2样品中上调，FC 1.5)；
·394个具有logFC＜-0.584963的基因(在DL-2样品中下调，FC -1.5)。
这些结果列于下表6和7中。
材料和方法
IFA显微镜检查
为了检测MDA-MB-231 TNBC细胞/TNBC脑癌克隆细胞(未处理或用靶向细胞核PD-L1-PTM1的双环抑制剂处理)中CD8、CSV、EGFR、ABCB5、FOXQ1、商业化PD-L1-28-8、细胞核PD-L1、细胞质PDL1的标签，MDA-MB-231/MDA-MB-231-Br细胞通过与0.5％Triton X-100一起孵育15min来透化，用PBS中的1％BSA封闭，并用CSV(小鼠宿主)、CD8(小鼠宿主)、EGFR(兔宿主)、ABCB5(山羊宿主)、ALDH1A(兔宿主)、NODAL(山羊宿主)、细胞核PDL1(兔宿主)、细胞质PD-L1(兔宿主)进行探测，以及用驴抗兔AF 488、抗小鼠AF 568、驴抗山羊647进行可视化。将盖玻片安装在具有ProLong玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)的玻璃显微镜载玻片上。通过数字病理学激光扫描显微镜定位蛋白质靶标。使用运行ASI软件的使用100x油浸透镜的ASI数字病理学显微镜获得单个0.5μm切片。对同一切片的四个连续图像求平均获得最终图像。使用自动化ASI软件(Applied Spectral Imaging，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))分析数字图像，以利用平均核荧光强度(NFI)的自动阈值和背景校正自动确定分布和强度，从而允许特异性靶向目的蛋白质的表达。还使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了数字图像，以测定未透化细胞的总细胞荧光或仅细胞表面荧光。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了数字图像，以测定总核荧光强度(TNFI)、总细胞质荧光强度(TCFI)。使用ImageJ软件，所述软件具有自动阈值，并且手动选择对细胞核特异性的目标区域(ROI)以计算每对抗体的皮尔逊系数相关性(PCC)。PCC值的范围为：-1＝共定位的倒数，0＝无共定位，+1＝完全共定位。将Mann-Whitney非参数检验(GraphPad Prism，加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad Software公司(GraphPadSoftware，San Diego，CA))用于确定数据集之间的显著差异。
Andor旋转盘超分辨率显微镜检查
按照IFA显微镜检查制备样品，用于在油浸下用ANDOR旋转盘显微镜成像以获得超分辨率。
Opal组织显微镜检查
为了检查核PD-L1-PTM1、PTM2、PD-L1-28-8、CSV(癌细胞标志物)的标签，使用自动bondrx平台的用于自动染色的OPAL染色试剂盒按照其制造商的指导来使用。然后如IFA显微镜检查中所述的固定和定位蛋白质。
细胞培养方法
使用的所有乳腺癌细胞系均来自ATCC。在补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和1％PSN的DMEM(Invitrogen)中维持和培养MDA-MB-231或MDB-MB-231-Br细胞系。用1.29ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma-A1drich)或5ng/ml重组TGF-β1(R&DSystems)刺激MCF-7细胞60小时。对于抑制剂研究，将2×105个细胞接种在6孔板中的2mL完全培养基中，并在37℃/5％CO2下孵育过夜。用靶向核轴PD-L1的PD-L1双环肽、HDAC2i或载剂对照处理细胞。对于qPCR分析，在每个时间点，将贴壁细胞胰蛋白酶化，洗涤并将细胞沉淀储存在-80℃直至进一步处理。对于显微镜检查研究，将4×104个细胞接种在盖玻片上并用如上所述的抑制剂处理。在每个时间点，洗涤盖玻片，用3.7％甲醛(Sigma)固定，并在4℃下储存直至处理。对于qPCR，将细胞在1mL三试剂(Sigma)中裂解，而对于显微镜检查研究，将细胞固定在3.7％甲醛中并通过胰蛋白酶消化和细胞刮擦收集。
WST-1方法
将MDA-MB-231细胞以4×103细胞/孔接种到96孔平底组织培养板中，最终体积为100μl，并在37℃和5％CO2下粘附附着24小时。然后用终浓度为200、100、50、25、12.5或6.25μM的抑制剂处理细胞72小时。抑制后，除去培养基并用100μL/孔的最终稀释度为1∶10的WST-1细胞增殖试剂(Sigma-Aldrich，货号11644807001)替换。使用微孔板分光光度计(混合时间30秒)在1、2、3和4小时孵育期在450nm处记录吸光度。数据代表一式三份进行的单个独立实验，结果绘制为平均值+/-标准误差(SE)。
RNA-Seq文库制备：TruSEQ Stranded mRNA(polyA捕获)
生成RNA-seq数据，将fastq数据下载到QIMR Berghofer服务器，然后由ScottWood存档到HSM。使用Cutadapt(1.9版；Martin(2011))修剪适体序列的序列读段，并使用STAR(2.5.2a版；Dobin等人(2013))与具有Ensembl(Release 70)基因模型的基因、转录物和外显子特征的GRCh37组装体进行比对。使用RNA-SeQC(1.1.8版；DeLuca等人(2012))计算质量控制度量，并使用RSEM(1.2.30版；Li和Dewey(2011))估计表达。
质量控制
RNA-seq样品的质量控制是保证质量和可再现的分析结果的重要步骤。为此目的运行RNA-SeQC。
数据归一化
归一化的目的是去除基于系统技术效应的样品之间的差异，以保证这些技术偏差对结果的影响最小。文库大小对于校正是重要的，因为测序的初始RNA量的差异将对测序的读段的数量具有影响。与其他样品相比，RNA在一个样品中过度表现时，产生RNA序列组成的差异。在这些样品中，其他RNA将欠采样(under-sampled)，这在预测差异表达的基因时将导致更高的假阳性率。
归一化方法
在我们的分析中，我们通过将每个样品的基因计数除以映射的百万个读段来校正文库大小。该过程是称为每百万计数(CPM)的常见方法。我们使用Robinson和Oshiack(2010a)提出的称为M值的修剪平均值(TMM)的方法进一步校正RNA组成的差异。我们使用来自edgeR包(Robinson，McCarthy和Smyth(20l0b))的函数calcNormFactors()来获得TMM因子，并使用这些因子来校正RNA组成的差异。
主成分分析
主成分分析(PCA)是一种降维方法，它将原始的通常相关的变量(这里是读段计数)分解成一组独立的(不相关的)变量，称为主成分(PC)。第一PC尽可能地考虑可变性，第二PC独立于第一PC并且考虑数据中的第二最大可变性。这同样适用于保留的PC。我们使用来自函数prcomp()的PCA实现。进行PCA分析以识别数据中变化的主要原因。理想地，我们希望看到通过实验分组聚类的样品。蛋白质编码基因的提取留下17329个用于后续分析。在＞2个样品中仅保留＞5CPM的基因后，我们留下10733个基因用于分析。
差异表达分析
使用R软件包edgeR(Robinson，McCarthy和Smyth(2010b))进行了差异表达(DE)分析。注意，DE分析的输入是过滤但未归一化的读段计数，因为edgeR在内部进行归一化(文库大小和RNA组成)。glmQLFit()函数用于将拟似然负二项广义对数线性模型(quasi-likelihood negative binomial generalised log-linear model)拟合到每个基因的读段计数。使用glmQLFtest()函数，我们对给定的对比度进行了逐基因的经验贝叶斯拟似然F-检验。根据edgeR用户指南，“拟似然法被高度推荐用于批量RNA-seq数据的差异表达分析[相对于似然比检验]，因为它通过考虑分散估计中的不确定性而给出更严格的错误率控制”。
实施例5
PDL1和输入蛋白作用机制
上述数据清楚地证明PDL1-PTM1主要位于免疫疗法抗性癌症的细胞核中，而PDL1-PTM2位于对免疫疗法有反应的癌症的细胞质中。为了进一步证实PDLl-PTM1(即乙酰化)和PDL1-PTM2(即甲基化)的作用机制，发明人进行了结构建模以确定这些PTM对与PD1和输入蛋白核机制的相互作用的潜力。图3A描绘了PDL1 PTM形式在癌症进展或对免疫疗法有反应中的作用模式。该结构分析显示PDL1(PDL1-PTM2)的甲基化阻止了PD1和PDL1之间的相互作用，其作用类似于免疫疗法。结构分析还揭示了这个NLS基序在位置赖氨酸263处的甲基化抑制与输入蛋白途径的相互作用，而PDL1-PTM1富集在进行性或免疫疗法抗性癌症的细胞核中。
本发明人设计了通过干扰输入蛋白途径来抑制PDL1的核易位的DL-2。通过监测PDL1-PTM1和IMPα1的共定位(PCC)，DL-2的能力干扰TNBC人癌细胞系中PDL1-PTM1和输入蛋白-α(IMPa)相互作用。在测定结束时，DL-2能够显著损害PCC或PDL1-PTM1和IMPα1的共定位程度长达96小时(图14A)。没有观察到DL-2对IMPα1的细胞核表达的显著影响(参见，图14A)。表明这对于PDL1-PTM1和IMPα1的相互作用是特异性的。
考虑到这些数据显示DL-2成功地抑制PDL1-PTM1和IMPα1的共定位，发明人然后用检测紧密相互作用的蛋白质的DUOLINK分析证实了该复合物的抑制。引人注目的是，DL-2能够以剂量依赖性方式消除PDL1和IMPα1的复合物，显著影响该复合物和随后的核PDL1-PTM1(图14B)。
因此，发明人随后确定双环肽结构相对于天然线性亚型的重要性。引人注目的是，DL-2能够消除人MDA-MB-231细胞系(转移性、免疫疗法抗性)中PDL1-PTM1和IMPα1的复合物。与DL-2一起孵育显著影响复合物并降低PDL1-PTM1和IMPα1的相互作用(图15)。相反，线性肽亚型(“PDL1-L1”，序列参见表10)不能显著防止PDL1-PTM1和IMPα1的复合物。
发明人接下来评估了DL-2双环肽干扰人CT26细胞系(免疫疗法反应细胞)中PDL1-PTM1和IMPα1复合物的能力(图16)。DL-2双环肽能够成功地消除CT26免疫疗法反应细胞系中PDL1-PTM1和IMPα1的复合物，显著影响该复合物并减少PDL1-PTM1和IMPα1的相互作用。
考虑到这些数据有力地证明了DL-2成功地抑制PDL1-PTML/IMPα1复合物，本发明人接下来研究了DL-2抑制未修饰的PDL1和IMPα1之间相互作用的能力。DL-2能够在MDA-MB-231细胞中消除PDL1(未修饰的)和IMPα1的复合物，显著影响该复合物并减少PDL1-AC和IMPα1的相互作用(图17)。再次，线性PDL1肽亚型抑制剂不能显著抑制该复合物。
本发明人接下来评估了双环肽DL-2在人CT26细胞系(免疫疗法反应细胞)中干扰PDL1(未修饰的)和IMPα1复合物的能力，类似于图17。DL-2能够消除CT26细胞中PDL1(未修饰的)和IMPα1的复合物，显著影响该复合物并减少PDL1和IMPα1的相互作用(图18)。
这些结果证明DL-2能够通过阻断PDL1和输入蛋白途径之间的相互作用成功地抑制PDL1的核易位。基于这些数据，发明人研究了阻断PDL1的核轴对PDL1的细胞质偏向性PTM(PDL1-PTM2)的影响。细胞质级分中PDL1-PTM2的富集类似于癌症对免疫疗法的反应，并且我们的上述结构分析支持这种形式降低了输入蛋白途径及其配体PD1中的效率(图19)。DL-2能够抑制间充质标志物CSV，并诱导PDL1-PTM2(PDL1-Me3)的细胞质表达增加。线性PDL1肽能够以低得多的显著性降低CSV的表达，并且不能诱导任何增加的PDL1-PTM2表达。
本发明人随后着眼于评估DL-2靶向PDL1的特异性。因此，研究了DL-2是否能够干扰PDL2和输入蛋白途径的相互作用。引人注目的是，DL-2在任何浓度下对PDL2:IMPα1复合物没有显著影响，证明了DL-2对其靶标PDL1/PDL1-PTM1的特异性以及与IMPα1的相互作用(图20)。
基于图20的数据，本发明人试图通过检查DL-2对核PDL2表达的影响来进一步证实DL-2的特异性。DL-2对PDL2的核表达完全没有影响(图21)。
为了进一步研究DL-2的特异性，本发明人研究了DL-2对一系列核相关蛋白的影响。DL-2对任何分析的核蛋白均未观察到脱靶效应(图21)。这提供了明确的证据证明DL-2仅对PDL1/PDL1-PTM1及其与IMPα1的相互作用具有特异性，未证明脱靶效应。
材料和方法
确定PD-1/PD-L1途径
使用iMosflm93和Aimless94中的合并和缩放进行所有的数据缩减和整合。使用PhaserMR95中的分子替换，search model90构建结构，并使用Coot96中的手动构建和PheniX97，98中的精修的迭代循环产生最终结构。Camilla二分基质用于密度。在该建模中使用的蛋白质如下所列。
表8
输入蛋白-α途径筛选测定
MDA-MB-231细胞用DL-2处理4至96小时或用对照肽快速处理，将细胞透化并用小鼠抗-IMPα1、兔抗-PDL1进行探测，并利用与Alexa Fluor 647缀合的驴抗-兔二抗或与Alexa Fluor 568缀合的驴抗-小鼠二抗进行可视化。用Prolong nucleus玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1和IMPα1数字图像以测定平均荧光强度(平均FI)。图表表示IMPα1的平均FI。图表还使用ImageJ软件描绘了PDL1/IMPα1的PCC，所述软件具有自动阈值，并且手动选择对细胞核特异性的目标区域(ROI)以计算每对抗体的皮尔逊系数相关性(PCC)。PCC值的范围为：-1＝共定位的倒数。
DUOLINK临近测定
用DL-2处理MDA-MB-23l细胞；浓度范围为10μM至0.00975μM。用DL-2或对照处理MDA-MB-231细胞，将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测。用Prolong nucleus玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1-Ac和IMPα1 DUOLINK图像，并且图表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，具有按照Kruskal-Wallis单向ANOVA计算的显著差异。IC50用红色虚线标记并对应于0.039μM的DL-2。
为了表征未修饰的PDL1和IMPα1，用载剂对照、DL-2-批次1、DL-2-批次2或线性PDL1处理MDA-MB-231细胞或CT26细胞。将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测。用ProLong nucblue玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1(未修饰的)和IMPα1 DUOLINK数字图像，并且图表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，具有根据单向ANOVA比较计算的显著差异。
PDL1-PTM1-IMPα1结合测定
用载剂对照、DL-2-批次1、DL-2-批次2或线性PDL1肽处理MDA-MB-231。将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测。用Prolong nucleus核玻璃抗淬灭试剂(LifeTechnologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，NIH，Bethesda，MD，USA)分析了PDL1Ac和IMPα1 DUOLINK数字图像，并且图表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，具有根据单向ANOVA比较计算的显著差异。
高分辨率数字病理学-CSV表达
将MDA-MB-231透化并用载剂对照或DL-2(当前储备溶液)或线性PDL1(PDL1-L1)处理。用高分辨率数字病理学表征CSV或PDL1-Me3表达的变化。将显著差异计算为与载剂对照的单向ANOVA Kruskal-wallis检验比较。CFI＝细胞质荧光强度。
结合特异性测定
用DL-2处理MDA-MB-23l细胞；浓度范围为10μM至0.00975μM。用Prolong nucleus玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL2和IMPα1 DUOLINK数字图像，并且图表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，具有根据Kruskal-Wallis单向ANOVA计算的显著差异。
免疫荧光显微镜检查
通过MDA-MB-231脑癌细胞系中的荧光强度证明对PDL2表达完全没有影响。固定细胞并进行免疫荧光显微镜检查。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析数字图像来测定细胞中的平均核荧光强度(TNFI)，使用ImageJ选择细胞核减去背景(n＝＞500个细胞/样品)来测量。
核相关蛋白的确定
用浓度为10μM的DL-2处理MDA-MB-231细胞。用DL-2或对照处理MDA-MB-231细胞，并进行透化，然后用PKCθ、LSD1、p65、C-Rel、SET、pSTAT3特异性的抗体进行探测。用ProLongnucblue玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了数字图像，并且图表表示细胞核或细胞质区室中的平均荧光强度，具有根据Mann-Whitney成对比较计算的显著差异。
实施例6
DL-2使用替代性双环支架维持效力
考虑到对于DL-2肽双环结构影响其靶标的重要性，本发明人试图研究替代性分子支架对其活性的任何影响。因此，在TBAB分子支架上产生与DL-2等同的多肽序列，并评估其活性。引人注目的是，如图23所示，DL-2-TBMB和DL-2-TBAB都能够有效地抑制对免疫疗法有反应或有抗性的人转移癌细胞系的增殖(图23A)。此外，在MDA-MB-231和CT26细胞系中，两种分子支架都能抑制PDL1-PTM1和IMPα1的复合物(图23B)以及PDL1-未修饰的和IMPα1的复合物(图23C)。这显示了对该复合物的显著影响，提供了PDL1-未修饰的和IMPα1的相互作用显著减少的进一步证据。这与线性PDL1(PDL1-L1)肽抑制剂形成鲜明对比，线性PDL1(PDL1-L1)肽抑制剂不能显著影响PDL1-未修饰的和IMPα1的复合物(图23A和B)。
材料&方法
(A)用抑制剂处理CT26、4T1或MDA-MB-231细胞72小时。抑制后，除去培养基并替换为WST-1细胞增殖试剂。1小时后记录450nm处的吸光度。数据代表一式三份进行的单个独立实验。结果绘制为平均值+/-标准误差(SE)。B)用载剂对照、DL-2-批次1(原始储备溶液)、DL-2-批次2(当前储备溶液)、DL-2-TBAB或线性PDL1处理MDA-MB-231或CT26癌细胞。将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测。用ProLong nucblue玻璃抗淬灭试剂(LifeTechnologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1Ac和IMPα1 DUOLINK数字图像，并且图表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，具有根据单向ANOVA比较计算的显著差异。(C)用载剂对照、DL-2-批次1(原始储备溶液)、DL-2-批次2(当前储备溶液)、DL-2-TBAB或线性PDL1处理MDA-MB-231或CT26癌细胞。将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测。用ProLong nucblue玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1-未修饰的和IMPα1 DUOLINK数字图像，并且图表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，具有根据单向ANOVA比较计算的显著差异。
实施例7
DL-2的D-氨基酸亚型的功能表征
DL-2-D代表DL-2肽抑制剂的D-异构体形式，其中双环肽DL-2的所有氨基酸由D-异构体形式组成(除了没有D-异构体形式的甘氨酸)(如表9所示)。简而言之，通过镜子反射L-氨基酸的是它们的对映异构体，D-氨基酸，除了它们在相反方向上旋转平面偏振光的能力之外，它们具有L-氨基酸相同的化学和物理性质。虽然L-氨基酸用作核糖体中翻译的天然蛋白质的元件，但D-氨基酸存在于细菌的一些翻译后修饰和肽聚糖细胞壁中。与L-氨基酸不同，D-氨基酸很少充当内源性蛋白酶的底物，导致D-肽对蛋白水解的抗性。
为了确定是否可以增加DL-2的稳定性(同时保留结合亲和力和功效)，设计了DL-2的D-异构体形式，称为“DL-2-D”(表9)。
表9
为了研究DL-2-D与DL-2相比的稳定性，在大鼠血浆中测定两种双环肽的血浆稳定性(图24)。这些稳定性数据清楚地表明DL-2-D双环肽比DL-2双环肽显著更稳定(图24A)。如所预期的，两种双环肽均比PDL1的天然线性NLS序列更稳定(图24B)。
基于该证实的稳定性数据，显示D-氨基酸制剂的稳定性增强，然后分析DL-2-D抑制癌细胞增殖的能力(图25)。DL-2和DL-2-D双环肽均显著抑制三种不同癌细胞系的增殖。
本发明人接下来试图使用DUOLINK测定来确定DL-2-D是否保留靶向PDL1-PTM1和IMPα1的复合物以及PDL1(未修饰的)和IMPα1的复合物的能力，所述测定检测如已经针对DL-2建立的紧密相互作用的蛋白质(图26)。通过用两种形式(即D-异构体和L-异构体)的双环肽处理，两种复合物均显著抑制复合物形成，而线性原型PDL1-L1没有变化。
接着，为了证实DL-2-D和DL-2支架富集PDL1-PTM2(如上对DL-2所证明的)，研究了阻断PDL1的核轴对PDL1、PDL1-PTM2的细胞质偏向性PTM的影响。细胞质级分中PDL1-PTM2的富集指示对免疫疗法有反应的癌症，并且上述结构原理支持这种形式在输入蛋白途径及其配体PD1中具有降低的效率。两种双环肽抑制剂都能够抑制间充质标志物CSV，并诱导PDL1-PTM2的细胞质表达的表达增加(图27)。形成鲜明对比的是，线性PDL1肽能够降低CSV的表达，但不诱导PDL1-PTM2的任何增加的表达。
总结
下表10-12提供了上述每种候选肽的功效的简要总结。
表10 DL-2线性肽衍生物
表11 DL-2线性环肽衍生物
表12 DL-2双环肽衍生物
材料&方法
大鼠血浆稳定性测定
按照CRO的方案(Creative Peptides)进行稳定性测定。简言之，使用具有以下步骤的大鼠血浆模型进行肽稳定性测定：
-3.6mL人血浆和大鼠血浆在室温下解冻并以3000rpm离心15分钟，除去沉淀。
-制备20mL终止溶液(20mL乙腈+20mL甲酸)并在4℃预冷却。
-制备以下溶液：
-在37℃下孵育管。分别在长达24小时的所需时间点(例如，在0、15、30、60、120分钟等)取出200μL血浆样品。加入400μL预冷却的终止溶液，在3000rpm，4℃下离心15分钟，并小心地吸出上清液。
-用0.22μm滤膜过滤上清液样品，然后通过LC-MS分析以确定保留的测试化合物的百分比。
细胞增殖测定
用DL-2或DL-2-D双环抑制剂处理4T1、CT26或MDA-MB-231癌细胞系72小时。抑制后，除去培养基并用WST-1细胞增殖试剂替换。1小时后记录450nm处的吸光度。数据代表一式三份进行的单个独立实验；结果绘制为平均值+/-标准误差(SE)。
PDL1-输入蛋白结合测定
用载剂对照、DL-2-批次1、DL-2-批次2、DL-2-TBAB(TBAB支架)、DL-2-D(D-异构体)或线性PDL1处理MDA-MB-231和CT26细胞。该图描绘了通过使用ASI数字病理学系统利用100x物镜的高分辨率成像对用PDL1(未修饰的)和IMPα1以及PDL1-PTM1和IMPα1染色的DOULINK细胞的比较。将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测。用ProLng nucblue玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1(未修饰的)和IMPα1以及PDL1-PTM1和IMPα1 DUOLINKE数字图像，并且图表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，具有根据单向ANOVA比较计算的显著差异。红色截止值代表PDL1-PTM1和IMPα1复合物的最高表达水平。
细胞质PDL1-PTM2和CSV的检测
用载剂对照或DL-2-批次1(原始储备溶液)、DL-2-批次2(当前储备溶液)、DL-2-TBAB(TBAB支架)、DL-2-D(D-异构体)或线性PDL1处理MDA-MB-231乳腺癌细胞系。分析两个批次以确保结果的再现性。将样品透化并用PDL1-PTM2和CSV的抗体标记。使用ASI数字病理学系统使样品可视化。用高分辨率数字病理学表征CSV或PLD1-Me3表达的变化。将显著差异计算为与载剂对照的单向ANOVA Kruskal-Wallis检验比较。CFI＝细胞质荧光强度。
实施例8
“头对尾(head-to-tail)”环肽抑制剂不抑制间充质癌标志物
为了确定DL-2的双环结构的重要性，与任何替代方法相反，产生了传统的“头对尾”环化PDL1-P1肽。环状PDL1肽不能影响PDL1-PTM1的核表达水平，或影响CSV或ALDH1A的表达(图28)。
这些数据证实了具有双环结构对于靶向PDL1的核途径的重要性。
材料&方法
考虑了肽的“头对尾”环化，其将C-末端氨基酸连接到N-末端氨基酸(即，这是环化的经典方法)，并通过制造商的方案进行。这种环化肽的合成是非常成问题的，并且收率低。达到的最大收率仅为1-2mg。
用载剂对照或浓度为50μM的环状PDL1肽(环状PDL1)处理乳腺癌细胞系4Tl。将细胞透化并用针对PDLl-PTMl、CSV和ALDHlAl的一抗进行探测。用ProLong nucblue玻璃抗淬灭试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1-PTM1、CSV和ALDH1A1数字图像。图表表示细胞核或细胞质区室中的平均荧光强度，具有根据Mann-Whitney分析计算的显著差异；或表示使用公式F(n-b)/(c-b)计算的PDL1-PTM1的细胞核与细胞质染色的比率，其中n＝细胞核染色，b＝背景，c＝细胞质。1或更高的比率表示细胞核偏倚，1以下表示细胞质偏倚。
实施例10
DL-2的体内研究
在8天的治疗期内，DL-2单一疗法(20和30mg/kg)减少了转移性乳腺癌4T1模型中的原发性肿瘤体积。在8天后，在20和30mg/kg下肿瘤重量也显著降低。用DL-2治疗未观察到体重变化，单一疗法不改变肺、肝或脾重量。
在10天的治疗期内，DL-2治疗与抗PDL抗体的组合显著降低了4T1模型中的原发性肿瘤体积。用DL-2和抗PDL组合疗法观察到体重无变化。DL-2与抗PDL组合不改变肺、肝或脾重量(图30)。
基于该数据，发明人分析了DL-2-D治疗作为单一疗法或与抗PDL组合治疗是否在10天治疗期内显著减少4T1模型中的原发性肿瘤体积以及肺转移。用DL-2-D和抗PDL组合疗法或DL-2-D单一疗法未观察到体重变化。DL-2-D单独使用或与抗PDL组合不改变肺、肝或脾重量(图31)。
为了评估DL-2相对于DL-2-D的并行功效，发明人比较了上述等效给药方案下的DL-2和DL-2-D。图32中呈现的这些数据清楚地显示DL-2-D作为单一治疗剂显著抑制肿瘤体积。该发现提供了DL-2-D具有改善的稳定性和消除半衰期的证据，因此可以导致甚至更有效的治疗。通过FACS检查DL-2-D或DL-2对来自4T1 TNBC肿瘤小鼠模型的免疫疗法抗性CD8+TIM3+T细胞的影响。令人惊讶的是，DL-2-D比DL-2能更有效地消除CD8+T细胞中的TIM3+免疫疗法抗性标签，将它们重编程为功能性效应物标签。
材料&方法
体内小鼠模型
4T1金标准免疫疗法抗性小鼠模型小鼠获自ARC，Perth，给小鼠接种4T1 TNBC转移癌细胞。在玻璃小瓶中冻干提供DL-2，并使用氯化钠注射液BP(0.9％盐水)重构，以使用针头/注射器制备10mg/mL的储备溶液，通过倒置混合DL-2。然后通过腹膜内注射以每天10、20或30mg/kg注射动物，并在周末休息。随时间的推移监测小鼠的体重和肿瘤体积。
PD1免疫疗法组合治疗
4T1金标准免疫疗法抗性小鼠模型小鼠获自珀斯(Perth)的ARC，用4T1 TNBC转移癌细胞接种小鼠。利用针头/注射器，将在玻璃小瓶中冻干的DL-2或DL-2-D用氯化钠注射液BP(0.9％盐水)重构，以制备10mg/mL的储备溶液，通过倒置混合DL-2。然后通过腹膜内注射对动物进行注射，每隔一天注射20mg/kg的DL-2，在周末休息，联合注射αPD1或同型对照(10mg/kg)，并随时间推移监测小鼠的体重和肿瘤体积。
通过倒置混合DL-2-D。然后通过腹膜内注射对动物进行注射，浓度为每两天20mg/kg的DL-2-D(与αPD1相同的方案)，联合注射αPD1或同型对照(10mg/k)，并随时间推移监测小鼠的体重和肿瘤体积。
实施例12
DL-2对MIC的间充质标签的影响
基于DL-2抑制间充质标签的功效，本发明人试图探测DL-2在抑制从IV期转移性癌症患者分离的转移起始细胞(MIC)中的免疫疗法抗性间充质标签中的有效性。在来自患有侵袭性癌症的患者的液体活组织检查中发现MIC，并且这些癌细胞(MIC)可以表达间充质表型，包括抗性和转移性标志物(如ABCB5和ALDHA1A1以及新型PDL1-PTM1)的表达。MIC也是转移事件的关键介质并且对免疫疗法具有抗性。
本发明人在上述实施例中证明了DL-2抑制免疫疗法抗性转移标签。这些发现导致发明人假设DL-2将潜在地抑制来自患者液体活组织检查的MIC中的这些标签。研究后，发现DL-2抑制来自NSCLC、TNBC和黑色素瘤患者的癌细胞中免疫疗法抗性间充质标志物ABCB5和ADLHA1A1以及PDL1-PTM1的表达。因此，DL-2还将通过靶向和抑制这些MIC来抑制转移的接种。
材料&方法
从TNBC、肺癌和黑色素瘤患者液体活组织检查中分离间充质MIC(对RECIST v1.1的免疫疗法/治疗抗性或反应性(完全反应、部分反应或进行性疾病)进行评分)，并用载剂对照或核PDL1抑制剂DL-2进行临床前筛选。将样品固定，并用靶向CSV、PDL1-PTM1(乙酰化核PDL1)、ALDH1A1和ABCB5的一抗对这些细胞进行免疫荧光显微镜检查。图表表示使用ASI数字病理学自动化系统测量的CSV的CFI值、PDL1-PTM1、ALDH1A1的NFI和ABCB5的FI，以选择细胞核减去背景(n≥40个细胞/样品/5名患者/组)。
实施例11
纳米颗粒包封方法
为了优化和增强DL-2双环肽的稳定性和功效，本发明人使用了NanoprecisionSystems纳米颗粒递送系统。对于这种方法，我们将DL-2肽抑制剂包装到基于脂质的纳米颗粒中。简言之，产生脂质混合物，将肽以10mg/ml的浓度溶解在PBS pH 7.4中，然后使用Precision Nanosystems NanoAssemblr Ignite在纳米沉淀方法中以各种肽与脂质的比率和流速来运行。在此之后，我们在Malvern Panalytical Zetasizer Ultra DLS系统上通过强度表征它们的尺寸分布。
在纳米颗粒和DL-2双环肽的纯化过程中，显然绝大多数DL-2已被成功包封(图33A，B)。参考图34A-B，表明在绘制的数据中，约100nm处的峰是具有肽贡献的脂质纳米颗粒，而对照(中空颗粒)的尺寸较小。
纯化后，进行稳定性研究，以了解包封的双环肽制剂在体内是否比未包封的DL-2双环肽具有更高的稳定性。DL-2纳米颗粒(DL-2-NP)和DL-2-D均比裸DL-2双环肽显著更稳定(图34C)。
材料&方法
脂质纳米颗粒的制备
使用本领域的标准方法产生纳米颗粒。为了简要总结该过程，使用POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)、胆固醇和DSPE-PEG(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000])产生脂质混合物。将DL-2双环抑制剂以10mg/mL浓度溶解于pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。然后使用Precision NanosystemsNanoAssemblr Ignite在纳米沉淀方法中以各种流速比和相对于脂质的流速运行肽。此后，在Malvern PANalytical Zetasizer Ultra DLS系统上评估尺寸。
大鼠稳定性测定
使用与上述实施例7中所述相同的方案进行稳定性测定。
实施例12
DL-2-NP抑制癌细胞增殖
比较每种化合物抑制MDA-MB-231增殖的IC50时，DL-2-NP功效比DL-2强800倍以上(图35A)。
DL-2-NP能够在纳摩尔范围内消除TNBC癌细胞系MDA-MB-231的增殖，其浓度显著低于没有脂质包封的DL-2。DL-2-NP能够以剂量依赖性方式消除核PDL1-PTM和DLL4(涉及癌干细胞(CSC)的维持和增殖并与患者存活率低相关)(图35B)。DL-2-NP还在所有测试浓度下显著消除CSV(细胞表面波形蛋白，侵袭性癌症的间充质标志物)(图35B)。用DL-2-NP处理也能够以剂量依赖性方式使PDL1-PTM1的表达偏向细胞质(红色虚线表示Fn/c为1)。
发明人还发现DL-2-NP在消除PDL1和IMPα1复合物方面比裸DL-2更有效，DL-2-NP的IC50仅为1nM(与DL-2的39nM相比，表明～39倍)。
材料和方法
细胞增殖测定
用抑制剂处理细胞48小时。抑制后，除去培养基并用WST-1细胞增殖试剂替换。1小时后记录450nm处的吸光度。
PDL1-IMPα1结合测定
用载剂对照(中空纳米颗粒)、浓度为10nM至0.3nM的DL-2-NP处理MDA-MB-231细胞。将细胞透化并用DUOLINK连接测定进行探测。用ProLong nucblue玻璃抗淬灭试剂(LifeTechnologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。使用ImageJ软件(ImageJ，美国马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院(NIH，Bethesda，MD，USA))分析了PDL1(未修饰的)&IMPα1DUOLINK数字图像，并且图表表表示细胞核或细胞质区室中的平均DOT荧光强度，具有根据单向ANOVA比较计算的显著差异。
本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的全部公开内容通过引用并入本文。
本文对任何参考文献的引用不应被解释为承认这样的参考文献可作为本申请的“现有技术”。
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或特定的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对示例的具体的实施方案进行各种修改和改变。所有这些修改和变化都旨在包括在所附权利要求的范围内。

Claims (71)

1.PD-L1双环肽模拟物或其修饰的衍生物或药学上可接受的盐，所述PD-L1双环肽模拟物包含多肽和分子支架，所述多肽包含由至少两个环序列分开的至少三个半胱氨酸残基，所述分子支架与所述多肽的半胱氨酸残基形成共价键，使得在所述分子支架上形成至少两个多肽环，其中所述PD-L1双环肽模拟物包含以下氨基酸序列：
X1C1LX2X3IFC2X4LRKGX5C3X6X7X8X9KX10
其中：
Cl、C2和C3分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X1不存在或是丙氨酸；
X2选自任何小的氨基酸(任选地，苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸)
X3选自任何氨基酸；
X4选自任何氨基酸；
X5选自任何氨基酸；
X6选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X7选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X8选自任何氨基酸；
X9选自任何非极性/中性氨基酸(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和正亮氨酸)；以及
X10选自任何氨基酸。
2.根据权利要求1所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X2选自苏氨酸和丙氨酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X2是苏氨酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X3选自苯丙氨酸和丙氨酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X3是苯丙氨酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X4选自精氨酸和丙氨酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X4是精氨酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X5选自精氨酸和丙氨酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X5是精氨酸。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X6选自甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X6是甲硫氨酸。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X7选自甲硫氨酸、丙氨酸和脯氨酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X7是甲硫氨酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X7是丙氨酸。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X8选自天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X8是天冬氨酸。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X9选自缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X9是缬氨酸。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X10选自赖氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和甲硫氨酸。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中X10是赖氨酸。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述肽与输入蛋白结合。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述肽模拟物防止或破坏PD-L1和输入蛋白之间的复合物。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其包含氨基酸序列：ACLTFIFCRLRKGRCMMDVKK[SEQ ID NO:1]。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述分子支架是1,3,5-(三溴甲基)苯)或TBAB。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其还包含N-末端细胞穿透肽。
26.根据权利要求25所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述细胞穿透肽是Myr。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述修饰的衍生物包括选自以下的一种或多种修饰：N-末端和/或C-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基(如用一个或多个电子等排或等电子氨基酸替换一个或多个极性氨基酸；用其他非天然电子等排或等电子氨基酸替换一个或多个疏水性氨基酸残基)；添加间隔基团；替换一个或多个抗氧化氨基酸残基；用丙氨酸替换一个或多个氨基酸残基，用一个或多个D-氨基酸残基替换一个或多个L-氨基酸残基；双环肽配体内的一个或多个酰胺键的N-烷基化；用替代键替换一个或多个肽键；肽主链长度修饰；用另一种化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，以及用合适的胺、硫醇、羧酸和酚反应性试剂对氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和酪氨酸)的合成后双正交修饰。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述修饰的衍生物包含N-末端修饰，如N-末端乙酰基团。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述修饰的衍生物包含C-末端修饰，如C-末端酰胺基团。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述修饰的衍生物包含用一个或多个非天然氨基酸残基替换一个或多个氨基酸残基。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述修饰的衍生物包含一个或多个D-氨基酸。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述氨基酸基本上是D-氨基酸。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中所述肽配制在脂质纳米颗粒中。
34.根据权利要求1-28中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物，其中药学上可接受的盐选自盐酸盐或乙酸盐。
35.药物组合物，其包含与一种或多种赋形剂组合的权利要求1-29中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物。
36.减少PD-L1过表达细胞中PD-L1核定位的方法，所述方法包含使细胞与具有以下氨基酸序列的PD-L1双环肽模拟物或其修饰的衍生物或药学上可接受的盐接触：
X1C1LX2X3IFC2X4LRKGX5C3X6X7X8X9KX10
其中：
Cl、C2和C3分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X1不存在或是丙氨酸；
X2选自任何小的氨基酸(任选地，苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸)
X3选自任何氨基酸；
X4选自任何氨基酸；
X5选自任何氨基酸；
X6选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X7选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X8选自任何氨基酸；
X9选自任何非极性/中性氨基酸(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和正亮氨酸)；以及
X10选自任何氨基酸。
37.根据权利要求36所述的方法，其中X2选自苏氨酸和丙氨酸。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中X2是苏氨酸。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中X3选自苯丙氨酸和丙氨酸。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中X3是苯丙氨酸。
41.根据权利要求36-40中任一项所述的方法，其中X4选自精氨酸和丙氨酸。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中X4是精氨酸。
43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中X5选自精氨酸和丙氨酸。
44.根据权利要求36-43中任一项所述的方法，其中X5是精氨酸。
45.根据权利要求36-44中任一项所述的方法，其中X6选自甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸和脯氨酸。
46.根据权利要求36-45中任一项所述的方法，其中X6是甲硫氨酸。
47.根据权利要求36-46中任一项所述的方法，其中X7选自甲硫氨酸、丙氨酸和脯氨酸。
48.根据权利要求36-47中任一项所述的方法，其中X7是甲硫氨酸。
49.根据权利要求36-48中任一项所述的方法，其中X7是丙氨酸。
50.根据权利要求36-49中任一项所述的方法，其中X8选自天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸和缬氨酸。
51.根据权利要求36-50中任一项所述的方法，其中X8是天冬氨酸。
52.根据权利要求36-51中任一项所述的方法，其中X9选自缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸。
53.根据权利要求36-52中任一项所述的方法，其中X8为缬氨酸。
54.根据权利要求36-53中任一项所述的方法，其中X10选自赖氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和甲硫氨酸。
55.根据权利要求36-54中任一项所述的方法，其中X10为赖氨酸。
56.根据权利要求36-55中任一项所述的方法，其包含以下氨基酸序列：
ACLTFIFCRLRKGRCMMDVKK[SEQ ID NO:1]。
57.根据权利要求36-56中任一项所述的方法，其中所述分子支架是1,3,5-(三溴甲基)苯)或TBAB。
58.根据权利要求36-57中任一项所述的方法，其中所述修饰的衍生物包含一个或多个D-氨基酸。
59.根据权利要求36-58中任一项所述的方法，其中所述氨基酸基本上是D-氨基酸。
60.根据权利要求36-59中任一项所述的方法，其中肽配制在脂质纳米颗粒中。
61.根据权利要求36-60中任一项所述的方法，其还包含N-末端细胞穿透肽。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞穿透肽是肉豆蔻酸。
63.治疗或预防受试者癌症的方法，其中癌症包含至少一种PD-L1过表达细胞，所述方法包含向受试者施用根据权利要求1-35中任一项所述的PD-L1双环肽模拟物。
64.根据权利要求36-63中任一项所述的方法，其中所述PD-L1过表达细胞是癌细胞、癌干细胞或非癌干细胞肿瘤细胞。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述PD-L1过表达细胞是癌干细胞肿瘤细胞。
66.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌或脑癌、或黑色素瘤或视网膜母细胞瘤。
67.根据权利要求36-66中任一项所述的方法，还包括施用至少一种另外的癌症疗法。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述另外的癌症疗法是化学治疗剂。
69.组合物，其包含具有以下氨基酸序列的PD-L1双环肽模拟物或其修饰的衍生物，或药学上可接受的盐：
X1C1LX2X3IFC2X4LRKGX5C3X6X7X8X9KX10
其用于疗法；
其中：
Cl、C2和C3分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X1不存在或是丙氨酸；
X2选自任何小的氨基酸(任选地，苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸)
X3选自任何氨基酸；
X4选自任何氨基酸；
X5选自任何氨基酸；
X6选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X7选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X8选自任何氨基酸；
X9选自任何非极性/中性氨基酸(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和正亮氨酸)；以及
X10选自任何氨基酸。
70.组合物，其包含具有以下氨基酸序列的PD-L1双环肽模拟物或其修饰的衍生物或药学上可接受的盐：
X1C1LX2X3IFC2X4LRKGX5C3X6X7X8X9KX10
其用于治疗癌症；其中：
Cl、C2和C3分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X1不存在或是丙氨酸；
X2选自任何小的氨基酸(任选地，苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸)
X3选自任何氨基酸；
X4选自任何氨基酸；
X5选自任何氨基酸；
X6选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X7选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X8选自任何氨基酸；
X9选自任何非极性/中性氨基酸(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和正亮氨酸)；以及
X10选自任何氨基酸。
71.组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述组合物包含具有以下氨基酸序列的PD-L1双环肽模拟物或其修饰的衍生物或药学上可接受的盐：
X1C1LX2X3IFC2X4LRKGX5C3X6X7X8X9KX10
其中：
Cl、C2和C3分别代表第一、第二和第三半胱氨酸残基；
X1不存在或是丙氨酸；
X2选自任何小的氨基酸(任选地，苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸)
X3选自任何氨基酸；
X4选自任何氨基酸；
X5选自任何氨基酸；
X6选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X7选自任何非极性/中性氨基酸(例如，甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和正亮氨酸)；
X8选自任何氨基酸；
X9选自任何非极性/中性氨基酸(例如，缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和正亮氨酸)；以及
X10选自任何氨基酸。
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