CN117062905A - 新的乳酸菌菌株及包含新的乳酸菌菌株的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了新的乳酸菌菌株，特别是新的乳脂FC菌株，及其应用。所述乳酸菌菌株为乳酸乳球菌乳脂亚种FC46菌株(登记号：NITE BP‑03310)或其传代菌株。

Description

新的乳酸菌菌株及包含新的乳酸菌菌株的组合物
技术领域
本发明涉及新的乳酸菌菌株。本发明还涉及该乳酸菌菌株的多种应用，例如包含该乳酸菌菌株的组合物(引子(starter)和经口组合物)，以及使用该乳酸菌菌株来产生发酵食品或饮品的方法。
背景技术
近年来，随着消费者健康意识的增长，对包含乳酸菌的食品和饮品(飲食物)的需求一直在提高，并且乳酸菌被广泛用于生产发酵乳、乳酸菌饮料(乳酸菌飲料)等。乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)是一种乳酸菌，其长期以来被用作生产发酵乳制品(例如酸乳和干酪)的细菌。已知存在产生黏性多糖的乳酸乳球菌乳脂亚种物种。通过使用本申请人在这样的物种中分离的乳酸乳球菌乳脂亚种(L.cremoris)菌株(以下称为“乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株”)作为主要的发酵乳酸菌进行发酵而获得的酸乳(商品名：Caspian Sea Yogurt，申请人注册商标，注册NO.5761425)具有与常规发酵乳完全不同的独特黏性。已报道了乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株和由乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株产生的黏性多糖具有多种生理作用，例如调节肠道功能、抑制血糖水平提高、免疫刺激、防止流感病毒感染、变态反应抑制、以及改善运动性调节(参见非专利文献(Non-patentLiterature，NPL)1至NPL 6)。
因此，已开发了包含乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的产品(例如发酵乳，以及发酵用引子和补充剂)以预期上述生理作用，并且需要乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的连续摄入以在肠道中充分发挥这样的生理作用。然而，乳酸菌是兼性厌氧菌，已知在有氧条件或酸性(低pH)条件下会降低其生存力，并且乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株也不例外。出于这个原因，需要开发包含乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的产品，所述产品保持有用的生理作用，同时抑制在酸性食品和饮品(例如酸乳)以及干粉剂(例如乳酸菌补充剂)中长期储存期间导致的活菌数降低。
引用列表
非专利文献
非专利文献1：T.Toda et al.，“Effects of fermented milk with Lactococcus lactis subsp.cremoris FC on defecation frequency and fecal micr of lorain healthy elderly volunteers”J.Jpn.Soc.Food.Sci.52(6)，243-250(2005)
非专利文献2：M.M0ri et al.，“Beneficial effect of viscous fermentedmilk on blood glucose and insulin responses to carbohydrates in mice andhealthy volunteers：preventive geriatrics approach by“slow cal orie””Geriatrics.141-152(2012)
非专利文献3：A.Kosaka et al.，“Lactococcus lactis subsp.cremoris FCtriggers IFN-γ production from NK and T cells via IL-12 and IL-18”Int.Immunopharmacol.14(4)，729-733(2012)
非专利文献4：T.Maruo et al.，“Oral administration of milk fermentedwith Lactococcus lactis subsp.cremoris FC protects mice against inf luenzavirus infection”Lett.Appl.Microbiol.55(2)，135-140(2012)
非专利文献5：Y.Gotoh et al.，“Effect of orally administered exopolyssccharides produced by Lactococcus lactis subsp.cremoris FC on a mo usemodel of dermatitis induced by repeated exposure to 2，4，6-trinitro-1-chlorobenzene”J.Funct.Foods.35，43-50(2017)
非专利文献6：Y.Gotoh et al.，“Effect of yogurt fermented with Lactococcus lactis subsp.cremoris FC on salivary secretory IgA levels in highschool-student long-distance runners”Japanese J.Phys.Fit.Sports Med.68(6)，407-414(2019)
发明内容
技术问题
鉴于现有技术的上述问题，本发明的一个目的是提供新的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株，其具有改善的酸耐受性(对低pH的耐受性)以及在有氧条件和干燥条件下的改善的生存力，换言之，在酸性食品和饮品中(例如发酵乳)以及在干粉形式中具有良好的生存力的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株。本发明的另一目的是提供用于发酵的引子、经口组合物例如补充剂或者发酵食品或饮品、以及用于产生发酵食品或饮品的方法，其中每一种均使用了在有氧条件和干燥条件下具有优异的酸耐受性和优异的生存力的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株。
问题的解决方案
为了实现上述目的，本发明人进行了广泛的研究，并发现了具有与申请人拥有的作为乳酸乳球菌乳脂亚种菌株的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株(乳酸乳球菌乳脂亚种FC，Lactococcus lactis subsp.cremoris FC，FERM P-20185)相同的细菌学特征的新的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株，并且其在有氧条件和干燥条件下就酸耐受性和生存力二者而言具有比乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株(乳酸乳球菌乳脂亚种FC，FERM P-20185)更优异的特征。本发明通过进行进一步研究来完成。
在下文中，已知的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株称为“乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株”、“现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株”或“亲本FC菌株”，并且本发明新发现的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株称为“本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株”、“乳酸乳球菌乳脂亚种FC46菌株”或“FC46菌株”，以将其区别于已知的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株。
本发明包括以下实施方案。
(I)新的乳酸乳球菌乳脂亚种(本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株)
(I-1)乳酸菌是乳酸乳球菌乳脂亚种FC46(登记号：NITE BP-03310)或其传代培养的菌株。
(I-2)根据(I-1)所述的乳酸菌，其处于干燥状态。
(II)用于发酵的引子
(II-1)用于发酵的引子，其包含乳酸乳球菌乳脂亚种FC46(登记号：NITE BP-03310)或其传代培养的菌株。
(II-2)根据(II-1)所述的用于发酵的引子，其还包含嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。
(II-3)根据(II-2)所述的用于发酵的引子，其为乳酸乳球菌乳脂亚种FC46(登记号：NITE BP-03310)或其传代培养菌株与嗜热链球菌的共生体。
(II-4)根据(II-1)至(II-3)中任一项所述的用于发酵的引子，其处于干燥状态。
(III)经口组合物
(III-1)经口组合物，其包含根据(I-1)或(I-2)所述的乳酸菌。
(III-2)根据(III-1)所述的经口组合物，其为食品或饮品、经口产品、或经口准药品。
(III-3)根据(III-1)或(III-2)所述的经口组合物，其为发酵食品或饮品。
(IV)用于产生发酵食品或饮品的方法，以及发酵食品或饮品
(IV-1)用于产生发酵食品或饮品的方法，其包括将根据(I-1)或(I-2)所述的乳酸菌或者根据(II-1)至(II-4)中任一项所述的用于发酵的引子接种到发酵食品或饮品的原材料中，并使该原材料进行发酵。
发明的有利作用
本发明的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株具有与现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株相同的细菌学特征和有用的生理作用，并且在约pH4的低pH条件下，其表现出比现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株更高的生存力、更高的黏度维持作用以及更优异的酸耐受性。在干燥条件和有氧条件下本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株还表现出更高的生存力，并且比现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株对干燥条件和有氧条件更耐受。因此，本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株在经口组合物例如酸性食品和饮品(例如酸乳和乳酸菌饮品)以及处于干燥状态中的补充剂中具有优异的稳定性，并且可以以经口组合物的形式长期维持和表现出其有用的生理作用。
附图说明
图1示出了在实施例2中随时间推移的酸性培养基中的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株(FC46菌株和亲本FC菌株)的活菌数(cfu/ml)的测量结果。
具体实施方式
(I)新的乳酸乳球菌乳脂亚种(本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株)
本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株属于乳酸乳球菌乳脂亚种并具有以下细菌学特征。一些本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株于2020年11月6日以身份标示“乳酸乳球菌乳脂亚种FC46”以登记号NITE BP-03310国际保藏于国家技术评估学会(NITE，NationalInstitute of Technology and Evaluation)的专利微生物保藏中心(122室，2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan)。
(a)细菌学特征
当本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株使用TY-Glu培养基(1％葡萄糖、0.5％Bacto(TM)胰蛋白胨(Thermo Fisher Scientific)、0.5％ Bacto(TM)酵母提取物(ThermoFisher Scientific)、0.5％ NaCl)(pH 7.0)或MRS培养基(Difco)在有氧条件下静置培养时，其细菌学特征(形态学和生理学特征以及碳源同化特征)在下表1和表2中示出。
表1
细胞形状 球菌
革兰氏染色 +
移动性 -
孢子形成 -
过氧化氢酶活性 -
在10℃下生长 +
在45℃下生长 -
由葡萄糖产生的气体 -
乳酸的旋光性 L
表2
(b)形态学特征
细胞形态：(链)球菌
菌落形状：圆形(半球形)，直径为0.5至1.0mm
菌落颜色：白色
孢子形成：无
(c)生理学特征
革兰氏染色：阳性
移动性：无
过氧化氢酶活性：无
由葡萄糖产生的气体：无
乳酸的旋光性：L
在10℃下生长：可存活
在45℃下生长：不可存活
最佳温度：25至30℃
最佳pH：pH 6至7
乳酸发酵：同型
(d)碳源同化特征(糖发酵特征)
本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株同化以下碳源：
D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-乳糖、N-乙酰葡糖胺以及七叶苷。
(e)表征微生物的其他特征
根据K.H.Schleifer et al.,“Transfer of Streptococcus lactis andRelated Streptococci to the Genus Lactococcus gen.nov.”System.Appl.Microbiol.6,183-195(1985)，基于上述特征以及使用16S rRNA进行同源性检索的结果，本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株与现有的经注册乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株(乳酸乳球菌乳脂亚种FC，FERM P-20185)具有100％同源性并且被鉴定为属于乳酸乳球菌乳脂亚种的菌株。本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的16S rRNA基因的碱基序列在序列表中以SEQ ID NO:1示出。
除上述细菌学特征之外，本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株像现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株一样产生多种黏性多糖。因此，本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株像现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株一样被认为具有多种有用的生理作用，例如调节肠道功能、抑制血糖水平提高、免疫刺激、防止流感病毒感染、变态反应抑制以及改善运动性调节。
此外，如后述的实施例2和实施例3所示，在约pH 4的低pH条件下，本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株与现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株相比表现出更高的生存力、更高的黏度维持作用以及更优异的酸耐受性。而且，如后述的实施例4所示，本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株与现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株相比在干燥条件和需氧条件下表现出更高的生存力，并且对干燥条件和需氧条件更具耐受性。因此，本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株在经口组合物例如酸性食品和饮品(例如酸乳和乳酸菌饮料)以及干燥状态的补充剂中具有优异的稳定性，并能够以经口组合物的形式长期维持和表现出其有用的生理作用。
本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株不仅包含以登记号NITE BP-03310在国际上保藏的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株(保藏菌株)和其原始菌株，还包含其传代培养菌株。
本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的传代培养可根据通常用于乳酸菌传代培养的普通方法来进行并且不被特别限制。实例包括其中将本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株接种到含有上述TY-Glu培养基(pH为7.0)的试管中并在约25至30℃的最佳温度下培养约12至48小时的方法。可向传代培养的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株中添加丙三醇，使其最终浓度为10w/v％至30w/v％，并可将其在-80℃下储存直至使用。
除上述TY-Glu培养基之外，可将包含碳源、氮源、无机离子和另外的(如有必要的话)有机微量营养素的普通培养基用作本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的培养基。碳源可以是包含可同化碳源的任何碳源，并且例如糖类，例如D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖、D-甘露糖和D-乳糖，可被优选地使用。氮源可以是这样的的任何氮源，其是可同化氮化合物或包含可同化氮化合物，并且例如硫酸铵、酪蛋白氨基酸、蛋白胨等可被使用。另外，也可合适地使用磷酸、铁、钾、镁、锌、锰、铜、钙等的无机盐。此外，必要时可向培养基添加细菌生长所需的氨基酸、维生素例如生物素、核黄素、吡哆醇、烟酸、泛酸、叶酸和硫胺等。
本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株可在15℃或更高、优选约25至30℃的温度下并且在pH为5或更高、优选pH为约6至7下培养以增强增殖。本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株可在有氧条件下静置培养，但优选在无氧条件下静态培养以增强增殖。
本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株，其在如上所述的干燥和有氧条件下表现出高生存力，可通过在从培养基中分离之后对该菌株进行干燥处理(例如真空干燥或喷雾干燥)来将其制备为干燥的产品，或通过将所述菌株连同其他组分(例如培养基组分和赋形剂)一起进行干燥来将其制备为干燥的产品。
(II)用于发酵的引子
本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株可用作引子(用于发酵的引子，其可被称为“乳酸菌的引子培养物”)，用于通过利用其发酵性来产生发酵食品和饮品。
发酵食品和饮品的实例包括主要由乳制成的发酵乳食品和饮品(酸乳、乳酸菌饮料、干酪等)、主要由大豆制成的发酵豆乳食品或饮品(酸乳、乳酸菌饮料等)、主要由谷物(稻米、小麦等)制成的发酵谷物食品和饮品(日本甘酒(由发酵的稻米制成的一种甜饮料)、面包等)、以及发酵的蔬菜和水果食品以及饮料(腌制蔬菜等)。
本发明用于发酵的引子优选用于主要由乳或豆乳构成的原材料的发酵，并且通过该原材料的发酵产生了发酵乳食品或饮品或者发酵豆乳食品或饮品，例如酸乳或乳酸菌饮料。主要由乳或豆乳构成的原材料(乳原材料或豆乳原材料)可以是包含来源于乳或豆类(优选大豆)的蛋白质的任何材料，并且可以是例如乳或豆乳本身或者已经去除或降低脂质的乳原材料或豆乳原材料。
在本说明书中，本发明中使用的“乳”包括动物乳，例如牛乳、山羊乳、绵羊乳以及马乳。乳的形式是不受特别限制的并且可以以任何形式使用，包括生乳、浓缩全脂乳、脱脂乳、浓缩全脂乳粉或脱脂乳粉。本发明中使用的“豆乳”包括但不限于通过将大豆和水研磨，随后进行压榨而获得的豆乳。“豆乳”是由豆类和水制成的乳化液体(大豆乳状液)。用作原材料的豆的类型是不受特别限制的，并且可使用任意豆类例如大豆、小豆、豌豆、蚕豆、普通豆以及绿豆。
本发明用于发酵的引子优选接种使得本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株在产生发酵乳食品或饮品或者发酵豆乳食品和饮品中的活菌数为约1×105至1×109(cfu/g)。因此，对于使用，优选将本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株使用例如乳原材料或豆乳原材料预先培养并进行制备使得所述培养物的活菌数为约1×107至1×109(cfu/g)(大量引子)。特别地，尽管不受限制，例如，可将本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株接种到预先灭菌的发酵用原材料(乳原材料或豆乳原材料)或包含酵母提取物的这样的发酵用原材料(例如5％至10％的脱脂乳粉)中，并在最佳温度下培养以达到上述细菌浓度。通过对使用倾注平板培养法(25℃)使用TY-Glu培养基(pH为7.0)形成的菌落进行计数可确定本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的活菌数(菌落计数)。细胞计数与浊度彼此相关。因此，如果预先确定细胞计数与浊度(在600nm波长下的吸光度)之间的相关性，则可通过测量浊度来计算细胞计数。
本发明用于发酵的引子可仅由本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株组成，或可包含本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株与具有可发酵性的一种或更多种其他微生物的组合，只要不损害本发明的效果即可。其他微生物的实例包括但不限于属于乳球菌(Lactococcus)属的乳酸菌，例如乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌乳亚种双乙酰变种(Lactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)；属于链球菌(Streptococcus)属的乳酸菌，例如嗜热链球菌；以及属于乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌，例如干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、格氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)以及嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)。可使用这些乳酸菌中的一种，或者可以以任意组合使用这些乳酸菌中的两种或更多种。
与本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株组合使用的微生物优选为嗜热链球菌(以下称为“嗜热链球菌(S.thermophilus)”)。如后述的实施例3中所示，在低pH条件下，与单独使用本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的发酵相比，使用本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株与嗜热链球菌的发酵维持了高活菌数(改善生存力)并抑制了储存之后黏度的降低。在包含组合的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株与嗜热链球菌(本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株与嗜热链球菌的共生体)的本发明用于发酵的引子中，二者之间的活菌数比率不受限制。例如，活菌数比率使得本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株:嗜热链球菌为1:0.001至1000，优选1:0.01至100，并且更优选1:0.1至10。
嗜热链球菌的活菌数可通过使用倾注平板培养法(37℃)使用包含BCP的平板计数琼脂培养基(Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd.)进行菌落计数来确定。
醋酸细菌还可用作与本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株组合使用的微生物。醋酸细菌的实例包括但不限于属于醋酸杆菌(Acetobacter)属、葡糖酸杆菌(Gluconobacter)属、葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)属等的醋酸细菌。
本发明用于发酵的引子可以是任何形式，只要其在用于产生发酵食品和饮品时表现出可发酵性即可。就卫生、质量保持、易于处理等而言，本发明用于发酵的引子优选为干燥固体形式，更优选为干粉形式或干燥颗粒形式。本发明用于发酵的引子也可通过对引子与其他组分(例如培养基组分或赋形剂)一起进行干燥处理而制备成干燥制品。
使用本发明用于发酵的引子的发酵条件(培养条件)为例如以下：培养温度为15℃或更高，优选为约25至30℃；培养pH为5或更高，优选pH为约6至7；以及培养时间为3小时或更长，优选为8至24小时。
(III)经口组合物
本发明的经口组合物的特征在于包含本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株。通过使用合适的可食用载体(食品或饮品材料)以与往常食品和饮品相同的方式来制备食品或饮品的形式的经口组合物。所述经口组合物还通过使用合适的制剂原材料(例如可药用赋形剂或稀释剂)以药物形式(补充剂形式、药品形式或准药品形式)来制备。
与现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株一样，当经口摄入时，预期本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株在体内发挥多种生理作用(调节肠道功能、抑制血糖水平提高、免疫刺激、防止流感病毒感染、变态反应抑制、改善运动性调节等)。该作用被认为是本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株本身和/或由本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株产生的黏性多糖的作用。因此，本发明的经口组合物优选包含处于活的状态的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株。本发明的经口组合物包含大量作为活菌的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株是期望的，但这并不排除包含处于死亡状态的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株。
只要本发明的经口组合物包含本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株，该经口组合物可以是本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的培养物、该培养物的粗产物或经纯化产物、或者其冷冻干燥产物或喷雾干燥产物。该培养物不受限制并且可通过例如使用适合于本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的培养基(例如TY-Glu培养基，pH为7.0)在约25至30℃的最佳温度下培养约12至48小时来获得。本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的细胞可通过在培养之后将培养物例如在3,000rpm下离心约10分钟以收集细胞来获得。这些也可根据普通方法进行纯化。此外，该细胞可被冷冻干燥或喷雾干燥。由此获得的干燥细胞也可用作本发明的经口组合物的活性成分。在本说明书中，本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株、其培养物、培养物的粗产物或经纯化产物、及其干燥产物统称为“本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株及其培养物”。
本发明的经口组合物必要时还可包含适量的营养组分，其适合于本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的维持和增殖。营养组分的具体实例包括在用于培养微生物的培养基中使用的那些，例如碳源，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖和甘露糖；氮源，例如酵母提取物和蛋白胨；维生素；矿物质；微量金属元素；以及其他营养组分。
本发明的经口组合物可根据普通方法配制成食品或饮品、药学产品和准药品的形式。在产生这些形式中使用的载体可以是可食用载体或可药用载体，例如赋形剂和稀释剂。产生食品或饮品形式的细节和在产生食品或饮品形式中使用的可食用载体的细节稍后在以下“食品或饮品形式的经口组合物”部分中进行描述。
通常可选择本发明的经口组合物中包含的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的量使得本发明经口组合物中的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的活菌数为约1×107至1×1011(cfu)。本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的量可使用上述量作为指导，根据待制备的本发明的经口组合物的形式、期望的作用等进行合适地改变。
食品或饮品形式的经口组合物
食品或饮品形式的本发明经口组合物作为食品或饮品被摄入。优选的具体实例包括但不限于使用乳作为原材料产生的发酵乳食品和饮品，例如发酵乳(例如酸乳)和乳酸菌饮料；以及使用大豆作为原材料产生的发酵豆乳食品和饮品，例如大豆酸乳和发酵豆乳饮料。实例还包括包含本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的药物形式的食品和饮品，例如固体制剂(例如片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、微囊剂和胶囊剂)和液体制剂(例如流体剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂)。实例还包括包含本发明的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的那些，例如甜食，例如口香糖、焦糖、软糖、牛轧糖和巧克力；发酵食品和饮品，例如发酵蔬菜饮料和发酵水果饮料；除上述发酵食品和饮品之外的乳制品，例如布丁和巴伐露斯等。本说明书中使用的术语“发酵乳”和“乳酸菌饮料”符合前日本厚生劳动省(Japanese Ministry ofHealth and Welfare)“关于乳和乳制品的组成标准等的部级条例”中条款2-40“发酵乳”和条款2-41“乳酸菌饮料”中的定义。即，“发酵乳”是指通过用乳酸菌来发酵乳或乳制品而制备的糊状或液体产品。因此，“发酵乳”不仅包括饮料形式的产品，还包括酸乳形式的产品。“乳酸菌饮料”是指通过使用糊状或液体产品作为主要原材料而制成的饮料，所述糊状或液体产品通过用乳酸菌来发酵乳或乳制品并用水稀释来制备。
(IV)用于产生发酵食品或饮品的方法，以及发酵食品或饮品
用于产生本发明的发酵食品或饮品的方法的特征在于该发酵食品或饮品包含本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株。发酵食品或饮品可根据普通方法来产生。例如，可通过将本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株接种到包含本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的营养源的发酵用的合适原材料(例如，包含乳、豆乳(大豆乳状液)、谷物、蔬菜或水果的原材料)中并培养其以引起原材料发酵来产生发酵食品或饮品。
使用本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株用于发酵的优选方法是预先制备引子并将其接种到用于发酵的原材料中，并使该原材料发酵。引子可以是，例如上述本发明的用于发酵的引子。引子优选包含本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株，使得本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的活菌数为约1×107至1×109(cfu/ml)。
用于发酵的原材料可任选地使用用于本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株良好生长的发酵促进物质(例如碳源，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、乳糖以及甘露糖；氮源，例如酵母提取物和蛋白胨；维生素；矿物质；痕量金属元素；以及其他营养组分)进行补充。
例如，当使用乳作为用于发酵的原材料时，选择接种的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的量使得该乳中包含的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的量为1×105(cfu/ml)或更多(优选为约1×107至1×109(cfu/ml))是合适的。对于培养条件，发酵温度通常选自15℃或更高的范围，优选约25至30℃并且发酵时间通常选自约3至24小时的范围。
由此获得的发酵产物可以是凝乳形式(酸乳样或布丁样形式)，并且这样的产物可作为固体食物直接摄入。可将凝乳形式中的发酵产物进一步均质化以制备成期望的饮料形式。该均质化可使用普通的乳化机(均质器)来进行。通过这样的均质化，可获得具有醇和感的饮料。在该均质化过程中，如果有必要的话，还可进行适当的稀释，添加有机酸以调节pH，或添加饮料的产生中常用的多种添加剂，例如糖、果汁、增稠剂、表面活性剂和矫味剂。由此获得的饮料可无菌地倒入合适的容器中以提供最终产品。
发酵食品或饮品(经口组合物)的摄入(剂量)根据摄入该组合物的生物体的年龄、性别、体重、疾病的严重程度等合适地确定，并且是不受特别限制的。经口组合物的摄入(剂量)通常选自本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的量为约1×107至1×1011(cfu/ml)的范围。可制备该经口组合物使得该组合物通常以每人每天约50至1,000mL的量摄入。
食品或饮品形式的本发明经口组合物的具体优选实例包括补充剂形式的食品和饮品，特别是药物形式的食品和饮品，例如固体制剂，例如片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、微囊剂和胶囊剂；以及液体制剂，例如流体剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂。药物形式的食品或饮品优选为干燥的固体制剂。
补充剂形式的食品或饮品可通过使用本领域中通常使用的稀释剂或赋形剂作为药物载体来产生，所述稀释剂或赋形剂例如填充剂、增容剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂。
食品或饮品形式的经口组合物中包含的本发明的乳酸菌量可从广泛的范围合适地选择，只要其足以发挥乳酸菌的作用即可。优选的是，通常包含所述乳酸菌的量为约1×107至1×1011(cfu)/每摄入单位(剂量)。
用于施用所述组合物的方法是不受特别限制的，只要该组合物是经口摄入的即可，并且所述方法根据形式、患者的年龄、性别和其他条件、疾病的严重程度等来确定。
组合物的摄入量根据使用方法、患者的年龄、性别和其他条件等合适地选择。如上所述，优选本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株以约1×107至1×1011(cfu)/每次摄入(剂量)的量来服用。本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株作为活性成分，其摄入优选为约1×107(cfu)或更多/天，并且可一天多份摄入。优选连续摄入本发明的经口组合物以有效地获得其作用。例如，可在2周或更多的时间内连续地或间歇地摄入本发明的经口组合物。
与现有的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株一样，在摄入(施用)包含处于活的状态的本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的经口组合物时，预期其在体内发挥有用的生理作用。因此，本发明的经口组合物基于其生理作用可有效地用作健康增强剂。因此，本发明的经口组合物包含具有特定功能并被摄入用于健康维持等的食品和饮品。特别地，本发明的经口组合物包含这样的食品和饮品，其具有例如调节肠道功能的作用、抑制血糖水平提高的作用、免疫刺激作用、防止流感病毒感染的作用、变态反应抑制作用、和/或改善运动性调节的作用。这些食品和饮品包括，例如，与上述作用或用途的标签或声明一起生产和销售的食品和饮品，例如具有健康声明的食品(具有营养功能声明的食品、具有功能声明的食品和用于特定健康用途的食品)、用于特殊膳食用途的食品(用于特定健康用途的食品)以及类似的健康食品。
在本说明书中，术语“包括”和“包含”涵盖含义“基本上由......组成”和“由......组成”。
实施例
为了促进理解本发明的结构和作用，以下参照实施例描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。除非另有说明，否则以下实验均在室温(25±5℃)和大气压条件下进行。在以下中，除非另有说明，否则“％”意指“质量％”，以及“份”意指“按质量计的份”。
实施例1：新的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株的分离和鉴定
将乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株(FERM P-20185)接种(1％)到灭菌的8％脱脂乳粉液体中，并在其最佳温度(25℃)下放置约10小时以活化乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株(引子1)。将嗜热链球菌(以下称为“嗜热链球菌(S.thermophilus)”)(1％)接种到灭菌的8％脱脂乳粉液体中，并在其最佳温度(37℃)下放置约10小时以活化嗜热链球菌(引子2)。随后，将上述制备的引子1和2接种到单独制备的灭菌乳中，并在30℃下进行发酵。当观察到凝乳形成时，开始冷却(4℃)。
将所得发酵乳在黑暗中在4℃下储存46天，以4％的比例接种到3L的TY-Gal培养基(1％半乳糖、0.5％ Bacto(TM)胰蛋白胨(Thermo Fisher Scientific)、0.5％ Bacto(TM)酵母提取物(Thermo Fisher Scientific)、0.5％NaCl)(pH为7.0)中，并然后在26℃下培养72小时。将该培养液在TY-Gal琼脂培养基(pH为7.0)上划线，并在25℃下培养48小时，并将生长的菌落各自培养在灭菌的8％脱脂乳粉液体中并储存。
其中，获得了通过实施例1所述的方法筛选的对低pH具有高的耐受性(酸耐受性)的菌株，并根据普通方法评价其细菌学特征。表1示出了结果。此外，使用API 50CHL(由bioMérieux Japan Ltd.生产)评价该菌株同化49种碳源的能力(糖发酵能力)。表2示出了结果。表1如段[0015]所述，并且表2如段[0016]所述。
这些结果证明了获得的菌株具有与用作亲本菌株的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株(以下简称为“亲本FC菌株”)相同的细菌学特征和糖同化特征。因此，该菌株被鉴定为属于乳酸乳球菌乳脂亚种的菌株并命名为乳酸乳球菌乳脂亚种FC46菌株(以下称为“乳酸乳球菌乳脂亚种FC46菌株”或简称为“FC46菌株”)。乳酸乳球菌乳脂亚种FC46菌株于2020年11月6日(保藏证书的颁发日期：2020年11月30日)以身份标示“乳酸乳球菌乳脂亚种FC46”以登记号NITE BP-03310国际保藏于国家技术评估学会的专利微生物保藏中心(122室，2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,Japan)。
实施例2：酸耐受性评价
将上述获得的FC46菌株以4％的比例接种到TY-Glu培养基(1％葡萄糖、0.5％Bacto(TM)胰蛋白胨、0.5％ Bacto(TM)酵母提取物、0.5％ NaCl)(pH为7.0)中并在25℃下培养15小时以制备预培养液。将所得预培养液接种到用乳酸调节至pH 4.0的40mL TY-Glu培养基中以达到1％的终浓度，随后在26℃下静置培养27小时。通过倾注平板培养法使用包含BCP的平板计数琼脂培养基(Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd.)随时间测量培养液中的FC46菌株的活菌数(cfu/ml)，并计算在27小时之后的生存率。作为比较测试，将FC亲本菌株用于替代FC46菌株并以同样的方式进行培养，随时间测量培养液中亲本FC菌株的活菌数(cfu/ml)，并计算在27小时之后的生存率(％)。
图1示出了随时间推移的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株(FC46菌株和亲本FC菌株)的活菌数(cfu/ml)测量结果。如图1所示，亲本FC菌株在pH 4.0的低pH条件下被快速杀伤，并且在培养27小时之后活菌数降低至6.6×103(cfu/ml)(生存率：0.2％)。相比之下，FC46菌株甚至在pH 4.0的低pH条件下表现出高生存力，并且甚至在该pH条件下培养27小时之后维持1.9×106(cfu/ml)的高活菌数(生存率：33.6％)。该结果证实了与亲本FC菌株相比FC46菌株是具有优异的酸耐受性的乳酸乳球菌乳脂亚种菌株。
实施例3：发酵乳中的稳定性评价
使用FC46菌株制备发酵乳，并评价其在发酵乳中的稳定性。作为对照，使用亲本FC菌株以相同的方式制备发酵乳，并评价在发酵乳中的稳定性。
1.发酵乳的制备
使用以下活化细菌的菌株作为引子制备四种发酵乳(发酵乳1至4)：
(1)发酵乳1：亲本FC菌株(引子1)
(2)发酵乳2：FC46菌株(引子3)
(3)发酵乳3：亲本FC菌株(引子1)+嗜热链球菌(ST菌株)(引子2)
(4)发酵乳4：FC46菌株(引子3)+嗜热链球菌(引子2)。
通过将亲本FC菌株(1％)接种到灭菌的8％脱脂乳粉液体中并使其在30℃下放置约10小时进行活化来制备引子1。通过将FC46菌株(1％)接种到灭菌的8％脱脂乳粉液体中并使他们在30℃下静置约10小时进行活化来制备引子3。通过将嗜热链球菌(1％)接种到灭菌的8％脱脂乳粉液体中并使他们在最佳温度(37℃)下静置约10小时进行活化来制备引子2。
将上述制备的每种引子接种到灭菌乳中，并在30℃下进行发酵。当观察到凝乳形成时，开始冷却(4℃)以抑制发酵，从而获得发酵乳。
2.发酵乳中的细菌稳定性评价
在制备发酵乳1至4之后，将其在黑暗中在10℃下储存30天。在储存之后确定发酵乳中的活菌数(cfu/ml)(发酵乳1和发酵乳2中乳酸乳球菌乳脂亚种的活菌数，以及发酵乳3和发酵乳4中乳酸乳球菌乳脂亚种的活菌数和嗜热链球菌的活菌数)。通过倾注平板培养法(25℃)使用TY-Gal培养基(pH 7.0)来确定乳酸乳球菌乳脂亚种的活菌数，并通过倾注平板培养法(37℃)使用包含BCP的平板计数琼脂培养基(pH 7.0)来确定嗜热链球菌的活菌数。
通过以下方法来测量每种发酵乳的pH、酸度、黏度。
pH的测量
在将发酵产物调节至10℃之后，使用F-52pH计(由Horiba，Ltd.生产)测量每种发酵产物的pH。
酸度的测量
精确称重10g每种发酵产物，并用相同量的蒸馏水稀释。添加0.5ml酚酞溶液作为指示剂，并用0.1mol/L氢氧化钠水溶液进行滴定直到淡粉色持续30秒。将每100g样品中乳酸的百分比确定为酸度。注意，1mL的0.1mol/L的氢氧化钠水溶液相当于9mg乳酸。
黏度的测量
将发酵产物调节至10℃之后，使用B型黏度计(由Brookfield生产，主轴No.4)测量每种发酵产物的绝对黏度。该转子旋转时间为1分钟。
表3示出了在储存开始之后第1天的结果，并且表4示出了在储存开始之后第30天的结果。
表3
表4
如表3和表4所示，在储存期间亲本FC菌株被快速杀伤，并在30天之后仅剩余数个活菌数/每mL(发酵乳1)。相比之下，FC46菌株甚至在30天之后维持1.1×104(cfu/ml)的高活菌数(生存率：0.0026％)(发酵乳2)。当与嗜热链球菌一起进行发酵时，亲本FC菌株和FC46菌株二者均维持了比单独使用亲本FC菌株或FC46菌株进行发酵时更高的活菌数(发酵乳3和发酵乳4)，并且特别地，FC46菌株显示出非常高的活菌数5.8×106(cfu/ml)(生存率：2.8％)(发酵乳4)。
此外，在储存30天之后亲本FC菌株显示出黏度降低，而与亲本FC菌株相比，FC46菌株中的黏度降低受到抑制。当与嗜热链球菌一起进行发酵时，观察到相同的趋势。
本实施例中产生的发酵乳1至4均具有良好的外观(颜色、存在或不存在脱水收缩)、良好的气味和良好的味道，并且在这些方面没有差异。
实施例4：包含乳酸菌的组合物的制备及稳定性的评价
使用FC46菌株制备包含乳酸菌的组合物，并在干燥状态下评价其储存稳定性。为了比较，使用亲本FC菌株替代FC46菌株来制备包含乳酸菌的组合物，并且还评价了其在干燥状态中的储存稳定性。
1.乳酸菌液的制备
将FC46菌株或亲本FC菌株以4％的比例接种到补充有葡萄糖的Difco M17培养基(BD)中以达到最终浓度为0.5％，并在25℃下培养16小时以制备预培养液。将4％的预培养液接种到与上述培养基相同种类的培养基中，并在25℃下培养16小时以获得10L培养液。将该培养液离心(3,000rpm，10分钟)，并通过倾析去除产生的上清液。此后，将剩余物用生理盐水洗涤两次以制备其中FC46菌株或亲本FC菌株被浓缩的乳酸菌液体。
向每种制备的乳酸菌液体中添加10％比例的脱脂乳粉，随后使用冷冻干燥机(FD-81，Tokyo Rikakikai Co.,Ltd.)根据普通方法进行冷冻干燥处理，从而获得冷冻干燥的乳酸菌(FC46菌株和亲本FC菌株，各约50g)。
将获得的冷冻干燥的乳酸菌(FC46菌株和亲本FC菌株，各约0.5g)置于灭菌的层压薄膜拉链袋(LAMIZIP(注册商标)；由Seisannipponsha Ltd.生产)中，并在黑暗条件下在37℃下储存(加速劣化测试)。从测试开始(第1天)起随时间测量冷冻干燥的乳酸菌中FC46菌株或亲本FC菌株的活菌数，并计算生存率(％)。
表5示出了结果。
表5在37℃下储存之后的生存率(％)
第一天 在3周之后 在4周之后
FC46菌株 100.0 14.67 6.03
亲本FC菌株 100.0 1.58 0.07
亲本FC菌株在37℃的温度下的储存期间被快速杀伤，并且亲本FC菌株在3周之后的活菌数为3.2×109(cfu/g)(生存率：约1.6％)。相比之下，FC46菌株显示出非常高的活菌数1.1×1010(cfu/g)(生存率：约14.7％)。这些结果证实了与亲本FC菌株相比，干粉形式的FC46菌株甚至在有氧条件下具有优异的储存稳定性。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1示出了本发明的乳酸乳球菌乳脂亚种FC菌株16S rRNA的碱基序列。
序列表
<110> FUJICCO CO., LTD.
<120> 新的乳酸菌菌株及包含新的乳酸菌菌株的组合物
<130> P21-046WO
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1507
<212> DNA
<213> 乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp. cremoris）
<220>
<221>
<222>
<223> 16S rRNA 基因
<400> 1
gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagttgagcg 60
atgaagattg gtgcttgcac caatttgaag agcagcgaac gggtgagtaa cgcgtgggga 120
atctgccttt gagcggggga caacatttgg aaacgaatgc taataccgca taacaacttt 180
aaacataagt tttaagtttg aaagatgcaa ttgcatcact caaagatgat cccgcgttgt 240
attagctagt tggtgaggta aaggctcacc aaggcgatga tacatagccg acctgagagg 300
gtgatcggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg 360
aatcttcggc aatggacgaa agtctgaccg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc 420
ggatcgtaaa actctgttgg tagagaagaa cgttggtgag agtggaaagc tcatcaagtg 480
acggtaacta cccagaaagg gacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540
tcccgagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggtggttt attaagtctg 600
gtgtaaaagg cagtggctca accattgtat gcattggaaa ctggtagact tgagtgcagg 660
agaggagagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga ggaacaccgg 720
tggcgaaagc ggctctctgg cctgtaactg acactgaggc tcgaaagcgt ggggagcaaa 780
caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctagatg tagggagcta 840
taagttctct gtatcgcagc taacgcaata agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag 900
gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960
gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactcg tgctattcct agagatagga 1020
agttccttcg ggacacggga tacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctattgtt agttgccatc attaagttgg 1140
gcactctaac gagactgccg gtgataaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200
atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agtcgcgaga 1260
cagtgatgtt tagctaatct cttaaaacca ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg 1320
cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc 1380
cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgggagttgg gagtacccga agtaggttgc 1440
ctaaccgcaa ggagggcgct tcctaaggta agaccgatga ctggggtgaa gtcgtaacaa 1500
ggtagcc 1507
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.乳酸菌，其为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)FC46(登记号：NITE BP-03310)或其传代培养菌株，
所述传代培养菌株是这样的乳酸菌：其属于乳酸乳球菌乳脂亚种，并具有与所述乳酸乳球菌乳脂亚种FC46的那些乳酸菌相同的细菌学特征、形态学特征、生理学特征、碳源同化特征、黏性多糖产生特征、酸耐受性以及干燥条件和有氧条件下的生存力。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌，其处于干燥状态。
3.用于发酵的引子，其包含根据权利要求1或2所述的乳酸菌。
4.根据权利要求3所述的用于发酵的引子，其还包含嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。
5.根据权利要求4所述的用于发酵的引子，其为乳酸乳球菌乳脂亚种FC46(登记号：NITE BP-03310)或其传代培养菌株与嗜热链球菌的共生体。
6.根据权利要求4或5所述的用于发酵的引子，其处于干燥状态。
7.经口组合物，其包含根据权利要求1或2所述的乳酸菌。
8.根据权利要求7所述的经口组合物，其为发酵食品或饮品。
9.用于产生发酵食品或饮品的方法，其包括将根据权利要求1或2所述的乳酸菌或者根据权利要求3至6中任一项所述的用于发酵的引子接种到所述发酵食品或饮品的原材料中，并使所述原材料发酵。

Claims (9)

1.乳酸菌，其为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)FC46(登记号：NITE BP-03310)或其传代培养菌株。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌，其处于干燥状态。
3.用于发酵的引子，其包含根据权利要求1或2所述的乳酸菌。
4.根据权利要求3所述的用于发酵的引子，其还包含嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。
5.根据权利要求4所述的用于发酵的引子，其为乳酸乳球菌乳脂亚种FC46(登记号：NITE BP-03310)或其传代培养菌株与嗜热链球菌的共生体。
6.根据权利要求4或5所述的用于发酵的引子，其处于干燥状态。
7.经口组合物，其包含根据权利要求1或2所述的乳酸菌。
8.根据权利要求7所述的经口组合物，其为发酵食品或饮品。
9.用于产生发酵食品或饮品的方法，其包括将根据权利要求1或2所述的乳酸菌或者根据权利要求3至6中任一项所述的用于发酵的引子接种到所述发酵食品或饮品的原材料中，并使所述原材料发酵。
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