CN117062908A - 靶向金黄色葡萄球菌α-毒素的抗原结合蛋白及其应用 - Google Patents

靶向金黄色葡萄球菌α-毒素的抗原结合蛋白及其应用 Download PDF

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陈思敏
郭诗雨
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Abstract

涉及生物医药领域，提供一种分离的抗原结合蛋白及其衍生蛋白，其能够特异性结合金黄色葡萄球菌α‑毒素，并且中和其生物学活性。还提供上述分离的抗原结合蛋白及其衍生蛋白在治疗和/或预防金黄色葡萄球菌感染领域的用途。

Description

靶向金黄色葡萄球菌α-毒素的抗原结合蛋白及其应用 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向金黄色葡萄球菌α-毒素的抗原结合蛋白。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)属于葡萄球菌属，是一种重要的革兰阳性致病菌，既可以引起社区获得性呼吸系统感染、皮肤及软组织感染，也可以引起医院内呼吸机相关性肺炎、手术及各种侵入性操作(如气管切开、静脉置管等)后的各种感染。2019年全国耐药监测网(http://www.carss.cn/)数据表明，金黄色葡萄球菌临床检出率位居所有病原菌的第四位，位居G +病原菌检出率的首位。由于抗菌药物的不断开发与大量应用，金黄色葡萄球菌不断发生变异，耐药现象日益严重。
α-毒素是金黄色葡萄球菌释放的最主要的外毒素，其中α-毒素(alpha hemolysis，Hla)在其致病过程中的作用最为重要。α-毒素是由金黄色葡萄球菌HLA基因编码的分泌性毒素蛋白，在几乎所有菌株中均有表达，是影响金黄色葡萄球菌致病性最为关键的毒力因子。α-毒素能够与宿主细胞膜上的胆固醇和鞘磷脂结合之后聚集形成七聚体，然后再通过折叠形成一个直径约1.5nm的β桶状跨膜结构，快速裂解宿主红细胞及其他组织细胞。同时，α-毒素还可以破坏感染组织内的白细胞，阻碍宿主清除感染的金黄色葡萄球菌。在宿主免疫系统以及抗生素的压力下，感染部位的金黄色葡萄球菌释放大量α-毒素，入血后可激活宿主免疫系统释放过量的炎症因子，形成脓毒症。
当前，金黄色葡萄球菌对抗生素抗性的增加已经使金黄色葡萄球菌感染的问题复杂化，小分子抗感染药物在临床治疗金黄色葡萄球菌感染过程中，对于毒素导致的机体损伤和脓毒症也不能很好地解决，因此，亟需开发诊断和治疗金黄色葡萄球菌感染的有效替代方法。
发明内容
本申请提供了一种靶向金黄色葡萄球菌α-毒素的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：1)能够特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素；2)能够中和金黄色葡萄球菌α-毒素的生物学活性；3)能够对金黄色葡萄球菌感染引起的疾病和病症具有药效学作用；4)生物学功能优于目前已经公开的金黄色葡萄球菌抗体分子。本申请还提供编码所述分离的抗 原结合蛋白的核酸分子、表达载体、宿主细胞、包含所述抗原结合蛋白的免疫缀合物、药物组合物、制备所述分离的抗原结合蛋白的方法以及本申请所述分离的抗原结合蛋白的用途。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27中任一项所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:26中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含选自下述任一组的HCDR1，HCDR2和HCDR3：
1)所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
2)所述HCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；以及
3)所述HCDR1包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述 HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR3包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33中任一项所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含选自下述任一组的H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4：
1)所述H-FR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
2)所述H-FR1包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
3)所述H-FR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含那SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；
4)所述H-FR1包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
5)所述H-FR1包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；以及
6)所述H-FR1包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括VHH。
在某些实施方式中，所述VHH包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VHH包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含抗体重链恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区源自人IgG恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区源自人IgG1恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，Bs-Fv，F(ab’) 2，F(ab) 2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组中的一种或多种：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白能够特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白能够中和金黄色葡萄球菌α-毒素的生物学活性。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白能够预防和/或治疗疾病和/或病症及其并发症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症及其并发症由金黄色葡萄球菌引起或介导。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症及其并发症包括菌血症和/或脓毒症。
另一方面，本申请还提供了多肽分子，其包含所述分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述多肽分子包含融合蛋白。
在某些实施方式中，所述多肽分子包含两个或两个以上所述分离的抗原结合蛋白以及与抗体重链恒定区组成的融合蛋白。
在某些实施方式中，所述多肽分子包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请还提供了免疫缀合物，其包含所述分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请还提供了核酸分子，其编码所述分离的抗原结合蛋白或所述多肽分子。
另一方面，本申请还提供了载体，其包含所述核酸分子。
另一方面，本申请还提供了细胞，其包含所述核酸分子或所述载体。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述免疫缀合物、所述核酸分子、所述载体和/或所述细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请还提供了制备所述分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述细胞。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述免疫缀合物、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症及其并发症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症及其并发症由金黄色葡萄球菌引起或介导。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症及其并发症包括脓毒症和/或菌血症。
另一方面，本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述免疫缀合物、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物单独使用或与其它分子联合使用。
另一方面，本申请还提供了检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法，所述方法包括使用所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述免疫缀合物、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请还提供了检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的试剂或试剂盒，其包含所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述免疫缀合物、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述免疫缀合物、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的存在和/或含量。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是ELISA检测本申请所述抗原结合蛋白与金黄色葡萄球菌α-毒素蛋白的结合能力。
图2显示的是本申请所述抗原结合蛋白对重组金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性的中和作用。
图3显示的是本申请所述抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素导致的小鼠脓毒症的治 疗作用。
图4显示的是本申请所述抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌导致的小鼠菌血症的治疗作用。
图5显示的是ELISA检测本申请所述的抗原结合蛋白与金黄色葡萄球菌α-毒素蛋白的结合能力。
图6显示的是本申请所述的抗原结合蛋白对重组金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性的中和作用。
图7显示的是本申请所述的抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素导致的小鼠脓毒症的治疗作用。
图8显示的是本申请所述的抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌导致的小鼠菌血症的治疗作用。
图9显示的是本申请所述四价抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性的中和作用。
图10显示的是本申请所述四价抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性的中和作用。
图11显示的是本申请所述的四价抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性的中和作用。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“金黄色葡萄球菌”可以与“Staphylococcus aureus”、“S.aureus”、“金黄色酿脓葡萄球菌”、“金葡菌”互换使用，其通常属于革兰氏阳性菌。在本申请中，该术语可以涵盖任何种类和形式的金黄色葡萄球菌及其变体、同源物以及功能活性片段。
在本申请中，术语“金黄色葡萄球菌α-毒素”也称“α-毒素”、“α-溶血素”、“溶血素A”、“Hla”、“溶血素A毒素”，通常指一种由金黄色葡萄球菌产生的成孔蛋白类溶血素。在本申请中，所述金黄色葡萄球菌α-毒素可以包括野生型金黄色葡萄球菌α-毒素及其变体、衍生物、同源物、重组蛋白、单聚体、寡聚体等形式。所述寡聚体形式可以包括与α-毒素的单体形式不同的形式，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体等或多聚体形式，例如七聚体前孔形式的α-毒素。
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常指脱离了其天然存在状态的具有抗原结合能力的蛋白。该“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。参见例如Korndorfer等,2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque等,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。抗原结合蛋白的实例包括但不限于：人抗体；人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab，Fab’，Fv片段，Bs-Fv，F(ab’) 2，F(ab) 2，scFv，di-scFv，dAb，IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体以及其片段。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常指抗体可变结构域中的区域，其序列是高度可变的和/或形成结构定义环。通常，抗体包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。参见，例如，Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、AbM、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。例如，所述抗原结合蛋白的氨基酸序列编号可以按照IMGT编号方案(IMGT,the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr；http：//imgt.cines.fr；Lefranc等,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212；Ruiz等,2000Nucleic Acids Res.28:219-221；Lefranc等,2001,Nucleic Acids Res.29:207-209；Lefranc等,2003,Nucleic Acids Res.31:307-310；Lefranc等,2005,DevComp Immunol 29:185-203)。例如，所述抗原结合蛋白的CDR可以根据Kabat编号系统确定(参见例如Kabat EA &Wu TT(1971)Ann NY AcadSci 190:382-391和Kabat EA et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。
在本申请中，术语“FR”通常指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。通常，天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，即在VH中四个(H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4)，和在VL中四个(L-FR1，L-FR2，L-FR3和L-FR4)。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“V H”和“V L”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且包含抗原结合位点。
在本申请中，术语“可变”通常指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab') 2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素)的其它抗体片段。通常，这样的片段应当包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。 每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对应，且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)相对应。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。根据重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常指具有特异结合抗原(例如，金黄色葡萄球菌α-毒素)能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab) 2、Fv片段、F(ab’) 2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“Fab”通常指抗体的抗原结合片段。如上所述，可以使用木瓜蛋白酶消化完整的抗体。抗体经木瓜蛋白酶消化后产生两个相同的抗原结合片段，即“Fab”片段，和残余的“Fc”片段(即Fc区，同上)。Fab片段可以由一条完整的L链与一条重链的可变区和该H链(VH)的第一恒定区(CH1)组成。
在本申请中，术语“Fab′片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，该片段比Fab片段稍大。例如，Fab′片段可以包括所有轻链，所有重链可变区以及重链的所有或部分第一和第二恒定区。例如，Fab′片段还可包括重链的部分或所有的220-330个氨基酸残基。
在本申请中，术语“F(ab')2”通常指通过胃蛋白酶消化完整抗体所产生的抗体片段。F(ab')2片段含有由二硫键维持在一起的两个Fab片段和部分铰链区。F(ab')2片段具有二价抗原结合活性并且能够交联抗原。
在本申请中，术语“Fv片段”通常指人单克隆抗体的单价抗原结合片段，包括所有或部分重链可变区和轻链可变区，并且缺乏重链恒定区和轻链恒定区。重链可变区和轻链可变区包括例如CDR。例如，Fv片段包括重链和轻链的约110个氨基酸的所有或部分氨基端可变区。
在本申请中，术语“scFv”通常指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合 成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“dAb”通常是指具有VH域、VL域或具有VH域或VL域的抗原结合片段，参考例如Ward等人(Nature,1989Oct 12；341(6242)：544-6)，参考Holt等人,Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；以及参考例如WO 06/030220、WO 06/003388和DomantisLtd的其它公布的专利申请。术语“dAb”通常包括sdAb。术语“sdAb”通常指单域抗体。单域抗体通常指仅由抗体重链可变区(VH结构域)或抗体轻链的可变区(VL)组成的抗体片段。
在本申请中，术语“VHH”通常涉及来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼等)重链抗体的可变抗原结合结构域(参见Nguyen V.K.等人，2000，The EMBO Journal，19，921-930；Muyldermans S.，2001，J Biotechnol.，74，277-302以及综述Vanlandschoot P.等人，2011，Antiviral Research 92，389-407)。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如羊驼来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如羊驼抗体)的CDR区以外的部分或全部氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如羊驼)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体) 中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如羊驼，小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
术语“全人源抗体”通常指仅包含人类免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果其是在小鼠中、在小鼠细胞中或在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中生产，那么全人源抗体可能含有鼠糖链。类似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”分别指仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。可通过噬菌体展示或其它分子生物学方法，在人体内、在具有人类免疫球蛋白种系序列的转基因动物体内生成全人源抗体。可用于制造抗体的示例性技术在美国专利：6,150,584、6,458,592、6,420,140中描述。其它技术，如使用文库，是本领域已知的。
在本申请中，术语“多肽分子”和“多肽”、“肽”可以互换使用，通常指氨基酸残基的聚合物。术语“融合蛋白”通常指具有至少两个共价连接在一起的部分的多肽。其中每个部分可以是具有不同特性的多肽。该特性可以是生物学性质，例如体外或体内活性。该性质也可以是简单的化学或物理性质，例如与靶分子的结合，反应的催化等。这两个部分可以通过单个肽键或通过肽接头直接连接。
在本申请中，术语“核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体可以包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类可以包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本申请中，术语“细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包 括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常指所述其他试剂(例如，化疗剂、放射性元素、细胞生长抑制剂和细胞毒性剂)与所述抗体或其抗原结合片段缀合(例如，通过连接分子共价相连)而形成的缀合物，该缀合物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，例如钠，和/或非离子表面活性剂。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更长的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。
在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如 在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
分离的抗原结合蛋白
抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、AbM、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见，例如，http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，本申请所述分离的抗原结合蛋白通过Chothia编码系统定义。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3。在某些情形中，所述HCDR3可以包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含HCDR2。在某些情形中，所述HCDR2可以包含如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含HCDR1。在某些情形中，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述HCDR1可以 包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含HCDR1，HCDR2和HCDR3。例如，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且HCDR3可以包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27中任一项所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:26中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
例如，所述HCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
例如，所述HCDR1包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中的至少一个CDR，所述CDR可以包括以任何方式划分得到的CDR，其不限于由下表的划分方式划分得到的CDR。通过任何一种方式划定的CDR，如果序列与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38相同，则均落入本申请权利要求的保护范围。
例如，通过表1中的方法划分SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，本申请中分离的抗原结合蛋白可以包含如下表所示的CDR。
表1 不同方式划分SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列得到的CDR序列
例如通过表2中的方法划分SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，本申请中分离的抗原结合蛋白可以包含如下表所示的CDR。
表2 不同方式划分SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列得到的CDR序列
例如通过表3中的方法划分SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，本申请中分离的抗原结合蛋白可以包含如下表所示的CDR。
表3 不同方式划分SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列得到的CDR序列
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含VHH。在某些情形中，所述VHH的CDR3可以包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述VHH的CDR2可以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述VHH的CDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH的CDR3可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述VHH的CDR2可以包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述VHH的CDR1可以包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH的CDR3可以包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，所述VHH的CDR2可以包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述VHH的CDR1可以包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，所述H-FR1的C末端可以与所述HCDR1的N末端直接或间接相连。在某些情形中，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR2，所述H-FR2可以位于所述HCDR1与所述HCDR2之间。在某些情形中，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR2可以包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR3，所述H-FR3可以位于所述HCDR2与所述HCDR3之间。在某些情形中，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:31所示 的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR3可以包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR4，所述H-FR4的N末端可以与所述HCDR3的C末端相连。在某些情形中，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述H-FR4可以包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。例如，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33中任一项所示的氨基酸序列，所述H-FR2可以包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列，所述H-FR3可以包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列，且所述H-FR4可以包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3 和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白的H-FR1，H-FR2，H-FR3和H-FR4可分别依次包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VH。在某些情形中，所述VH可以包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VH可以包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述VH可以包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VH可以包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VH可以包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VH可以包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VH可以包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VH可以包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VHH。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括抗体重链恒定区。在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区可以源自任一种免疫球蛋白的重链恒定区，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。例如，所述抗体重链恒定区可以源自人IgG重链恒定区。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白的重链恒定区包含其突变体。在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区可以源自人IgG1-4中任一种的重链恒定区。在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白可以源自人IgG1重链恒定区。例如，所述人IgG1重链恒定区可以包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含 如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含如SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’) 2，F(ab) 2，scFv，bs-Fv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含VHH。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在某些情形中，所述VHH可以包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗体可以包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
例如，所述人源化抗原结合蛋白的VH可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗原结合蛋白的VH可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。例如，所述人源化抗原结合蛋白的VH可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包括四价抗原结合蛋白和/或四价抗原结合蛋白Fc融合蛋白。例如，可以串联两个抗α-毒素抗原结合蛋白可变区编码序列(例如本申请所述的2个huA3分子或者2个huG1分子或者1个huA3分子和1个huG1分子；例如本申请所述的2个A3分子或者2个G1分子或者1个A3分子和1个G1分子)和人IgG1Fc片段融合。例如，可以将第一个VHH的C端与第二个VHH的N端相连，将第二个VHH的C端与Fc片段的N端相连，得到二价Fc融合蛋白，二价Fc融合蛋白亚克隆至质粒，转染至细胞重组表达，可得到本申请所述四价抗原结合蛋白。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包括huA3-huG1-Fc抗原结合蛋白。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包括huA3-huA3-Fc抗原结合蛋白。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包括huG1-huG1-Fc抗原结合蛋白。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含如SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。例如，所述分离的抗原结合蛋白可以包含如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
此外，需要说明的是，本申请所述分离的抗原结合蛋白可以包含与其存在一个或多个保 守序列修饰的重链和/或轻链序列。所谓“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请所述分离的抗原结合蛋白中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在某些实施方式中，本申请所述分离的抗原结合蛋白的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换。本领域内的技术人员知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失，具体可以参见，例如，Brummell et al.,(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt et al.,(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov et al.,(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall et al.,(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley and O'Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy et al.,(1998)Int.Immunol.10:341-6and Beers et al.,(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
可以通过本领域已知的各种测定鉴别、筛选或表征本申请所述的金黄色葡萄球菌α-毒素抗原结合蛋白。
例如，可通过已知方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FACS)、免疫组织化学、免疫荧光等来测试本申请抗原结合蛋白或融合蛋白的抗原结合活性。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素。在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白与金黄色葡萄球菌α-毒素的结合可以通过ELISA方法进行检测。例如，本申请所述抗原结合蛋白可以以小于或等于约0.010μg/mL，小于或等于约0.009μg/mL，小于或等于约0.008μg/mL，小于或等于约0.007μg/mL，小于或等于约0.006μg/mL，小于或等于约0.005μg/mL，小于或等于约0.004μg/mL，小于或等于约0.003μg/mL，小于或等于约0.002μg/mL以及小于或等于约0.001μg/mL的EC 50值与金黄色葡萄球菌α-毒素结合。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够中和金黄色葡萄球菌α-毒素的生物学活性。例如，可以通过在金黄色葡萄球菌α-毒素与抗原结合蛋白中加入兔红细胞，使用酶标仪检测其抗溶血活性。例如，本申请所述抗原结合蛋白可以以小于等于约200ng，小于等于约100ng， 小于等于约75ng，小于等于约60ng，小于等于约50ng，小于等于约45ng，小于等于约40ng，小于等于约35ng的量对18.75ng的重组金黄色葡萄球菌α-毒素完全中和。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白能够预防和/或治疗疾病和/或病症及其并发症。在某些实施方式中，所述疾病和/或病症及其并发症可以由金黄色葡萄球菌引起或介导。在某些实施方式中，所述疾病和/或病症及其并发症可以包括脓毒症和/或菌血症。
多肽分子、核酸分子、载体、细胞、免疫缀合物和药物组合物
另一方面，本申请提供了多肽分子，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述多肽分子可以包含融合蛋白。在某些实施方式中，所述多肽分子可以为融合蛋白。
在某些实施方式中，所述多肽分子包含两个或两个以上本申请任一项所述的分离的抗原结合蛋白以及与抗体重链恒定区组成的融合蛋白。
例如，所述多肽分子可以包含两个抗原结合域以及抗体重链恒定区。其中第一抗原结合域可以包含本申请中任一项所述分离的抗原结合蛋白，第二抗原结合域可以包含本申请中任一项所述分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述多肽分子可以包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了分离的核酸分子，其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离；或者(iv)合成的，例如通过化学合成。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的 载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、293T细胞、COS-1细胞、SP2/0细胞、NS0细胞或骨髓瘤细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
另一方面，本申请还提供了免疫缀合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，可以将本申请所述的分离的抗原结合蛋白或其片段与另一试剂，如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针、分光镜探针等的连接。该连接可以通过一个或多个共价键，或非共价相互作用，并且可以包括螯合作用。可以使用多种接头(所述接头可以为本领域所知)以形成免疫缀合物。此外，可以以融合蛋白质的形式提供免疫缀合物，其可以由编码免疫缀合物的多核苷酸表达。所述免疫缀合物还可以包含例如抗体-药物缀合物(ADC)。合适的药物可以包括细胞毒素、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂可以通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽分子、本申请所述的免疫缀合物、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。
制备方法
另一方面，本申请提供了制备所述分离的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本申请的抗原结合蛋白。例如，可以用连接或天然存在的金黄色葡萄球菌α-毒素或其片段，免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。在某些实施方式中，可以通过提取免疫羊驼外周血淋巴细胞，提取细胞核酸片段克隆至载体，通过噬菌体表面展示系统筛选并富集针对金黄色葡萄球菌α-毒素的分离的抗原结合蛋白。
任何合适形式的金黄色葡萄球菌α-毒素都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对金黄色葡萄球菌α-毒素特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。例如，激发免疫原可以是全长的金黄色葡萄球菌α-毒素，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。
方法和用途
另一方面，本申请提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症及其并发症。
另一方面，本申请还提供了预防和/或治疗疾病和/或病症及其并发症的方法，所述方法可以包括向有需要的受试者施用本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物可以单独使用，也可以与其他药物联合使用预防和/或治疗疾病和/或病症。在某些实施方式中，所述其他药物可以是目前已知的任何具有抗菌作用的药物。所述疾病和/或病症可以是由于金黄色葡萄球菌感染引起的，也可以是由其他 感染引起的相关疾病。
在本申请中，所述施用可以通过不同方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
另一方面，本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物，其可以用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以由金黄色葡萄球菌引起或介导。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以是金黄色葡萄球菌引起或介导的疾病和/或病症的并发症。
在本申请中，所述疾病和/或病症及其并发症包括细菌感染。
在本申请中，所述疾病和/或病症及其并发症包括菌血症和/或脓毒症。
在某些情形中，本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物可以单独使用，也可以与其他药物联合使用。
另一方面，本申请还提供了检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法，所述方法包括施用所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。
在某些情形中，所述检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法可以是体外方法。例如，使本申请所述的分离的抗原结合蛋白和离体的样品接触，检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的存在和/或含量。在某些情形中，所述检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法为非治疗目的。在某些情形中，所述检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法不是诊断方法。
另一方面，本申请还提供了检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的试剂或试剂盒，其包含所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述多肽分子、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的存在和/或含量。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1 重组表达金黄色葡萄球菌α-毒素免疫羊驼
采用制备的金黄色葡萄球菌α-毒素免疫一只Alpaca羊驼，皮下多点免疫4次。免疫流程如表4所示。
表4 羊驼免疫方案
实施例2 金黄色葡萄球菌α-毒素抗原结合蛋白的文库的构建及筛选
提取免疫羊驼100ml外周血淋巴细胞，使用Qigen公司试剂盒提取细胞总RNA。利用反转录试剂盒(Qigen)将RNA反转录成cDNA。利用PCR扩增编码抗体的可变区核酸片段。并使用限制性内切酶SfilI(Takara)酶切PCR产物及克隆载体pComb3Xss，利用T4连接酶将克隆载体连接到噬菌体载体pComb3Xss中。产物随后通过电转化至大肠杆菌电转感受态细胞Top10中。
实施例3 针对金黄色葡萄球菌α-毒素的抗原结合蛋白的淘选
利用α-毒素融合蛋白包被96孔板，4℃放置过夜。第二天以5％的BSA进行封闭，随后加入100μL噬菌体。室温作用1h，用PBST淘洗去掉不结合的噬菌体。最后用三乙氨基将与α-毒素特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。相同筛选过程重复3-4轮。由此，阳性的克隆被富集，达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中α-毒素特异抗体的目的。
实施例4 用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆
将获得的金黄色葡萄球菌α-毒素结合阳性的噬菌体感染大肠杆菌涂板。随后挑选210个单菌落分别培养，生产并纯化噬菌体。用α-毒素融合蛋白包被96孔板4℃过夜，将获得的样品噬菌体(对照组为空白噬菌体)加入，室温下反应1小时。洗涤之后加入小鼠抗HA标签 抗体，室温反应1小时。洗涤之后加入山羊抗小鼠HRP抗体(北京鼎国生物科技有限公司)，室温反应l小时。洗涤之后加入TMB显色液，405nm波长读取吸收值。当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，标记为阳性克隆孔。将阳性克隆孔的菌转移至含有100μL氨苄青霉素的LB液体中培养以便提取质粒并进行测序。最终获得抗原结合蛋白序列。
其中，所述抗原结合蛋白的序列测得如下：
A3 SEQ ID NO:12
G1 SEQ ID NO:24
F6 SEQ ID NO:37
其中，下划线部分表示使用Chothia编号方案划分的CDR区域。
实施例5 融合Fc的抗原结合蛋白在Expi293细胞中进行表达、纯化
将测序分析所获得的抗原结合蛋白A3、G1和F6的可变区编码序列分别融合人免疫球蛋白γ1(IgG1)的Fc片段并亚克隆至表达载体PCDNA3.4。利用PEI转染Expi293细胞进行重组表达，7天后，收集细胞上清液，并利用ProteinA磁珠进行纯化。收集到纯度达到95％以上的抗原结合蛋白，得到A3-Fc抗原结合蛋白、G1-Fc抗原结合蛋白和F6-Fc抗原结合蛋白。其中A3-Fc抗原结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示，G1-Fc抗原结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示，F6-Fc抗原结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示。
实施例6 ELISA方法检测抗原结合蛋白与金黄色葡萄球菌α-毒素的结合
将金黄色葡萄球菌α-毒素蛋白用PBS缓冲液稀释至1μg/mL，每孔100μL包被于96孔板(Thermo)4℃孵育过夜；次日取出96孔板，用PBST(含0.5％PBS)洗板，每次浸润1min后彻底甩干残余水分。样品孔中分别加入200μL的含5％BSA的PBST，置于37℃封闭1h；然后用PBST洗板，并甩干孔中水分。分别向96孔板中加入待测样品100μL，4℃ 孵育过夜。取出96孔板后用PBST洗板后每孔加入山羊抗人IgG二抗100μL(thermo，31413，Goat anti-Human IgG Fc Cross-Adsorbed Secondary Antibody，HRP)，并置于37℃孵育1h。再用PBST洗5次，每孔加入100μL底物溶液(Substrate Solution，Invitrogen)，于37℃孵育10min；每孔加入1mol硫酸50μL终止反应后于酶标仪(Multiskcin FC，Thermo)450nm波长处检测吸光度。其中使用人IgG作为阴性对照。
A3-Fc抗原结合蛋白、G1-Fc抗原结合蛋白、F6-Fc抗原结合蛋白与金黄色葡萄球菌α-毒素的结合检测结果如图1所示，结果表明，上述三种抗原结合蛋白与金黄色葡萄球菌α-毒素具有较强的亲和力，其中，A3-Fc抗原结合蛋白的EC 50值为0.009μg/mL，G1-Fc抗原结合蛋白的EC 50值为0.007μg/mL，F6-Fc抗原结合蛋白的EC 50值为0.003μg/mL。
实施例7 抗原结合蛋白中和金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性评价
AR-301是Aridis制药公司开发的靶向α-毒素的全人源抗体药物(Salvecin，tosatoxumab)。利用α-毒素导致的兔红细胞溶血模型评价AR301中和金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性：将18.75ng重组金黄色葡萄球菌α-毒素蛋白与抗原结合蛋白或AR-301以一定比例混合加入到96孔板(Thermo)，37℃孵育10min,加入5％兔红细胞，37℃孵育1h。将样品3000rpm离心5min，利用酶标仪(Multiskcin FC，Thermo)405nm波长处检测吸光度，测得其抗溶血活性。
利用以上α-毒素导致的兔红细胞溶血模型检测A3-Fc抗原结合蛋白、G1-Fc抗原结合蛋白和F6-Fc抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素的中和作用的结果如图2所示，结果表明，对于18.75ng的重组α-毒素，50ng的A3-Fc抗原结合蛋白(A)、G1-Fc抗原结合蛋白(B)、F6-Fc抗原结合蛋白(C)具有完全中和作用；50ng的对照抗体AR-301不能完全中和18.75ng的重组金黄色葡萄球菌α-毒素(D)，表明本发明公布的A3-Fc抗原结合蛋白、G1-Fc抗原结合蛋白和F6-Fc抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素的中和作用显著优于对照抗体AR-301。
实施例8 金黄色葡萄球菌α-毒素导致小鼠脓毒症模型复制及抗原结合蛋白药效学作用评价
预先向C57BL/6小鼠注射不同剂量的抗原结合蛋白，30min后尾静脉注射2.5μg金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白，使用人IgG作为对照。观察小鼠生存时间。
利用金黄色葡萄球菌α-毒素导致的小鼠脓毒症模型检测A3-Fc抗原结合蛋白、G1-Fc抗原结合蛋白和F6-Fc抗原结合蛋白的治疗作用的结果如图3所示。结果表明，本申请所述的 三种抗原结合蛋白：A3-Fc抗原结合蛋白(187.5μg/kg，A)、G1-Fc抗原结合蛋白(125μg/kg，B)、F6-Fc抗原结合蛋白(250μg/kg，C)具有完全保护作用。
实施例9 金黄色葡萄球菌感染小鼠导致菌血症模型复制及抗原结合蛋白治疗作用评价
从-80度冰箱活化金黄色葡萄球菌USA300，在TSA培养基活化两代，并接种至2ml TSB培养12h。利用PBS清洗3次后，向小鼠尾静脉感染6×10 7CFU。感染2h后注射抗原结合蛋白，使用人IgG作为对照，观察小鼠生存情况。
利用金黄色葡萄球菌导致的小鼠菌血症模型评价A3-Fc抗原结合蛋白和G1-Fc抗原结合蛋白的抗感染药效学作用的结果如图4所示。结果表明，A3-Fc抗原结合蛋白和G1-Fc抗原结合蛋白对于金黄色葡萄球菌导致的小鼠菌血症模型具有显著的保护作用，且药效学作用优于对照抗体AR-301。
实施例10 金黄色葡萄球菌α-毒素抗原结合蛋白的人源化
通过NCBI数据库比对(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，选取与驼源抗体最接近的人germline序列为模板，对A3、G1和F6进行人源化，并对抗原结合蛋白翻译后修饰位点进行优化。
其中，获得的抗原结合蛋白的人源化序列分别如下：
huA3 SEQ ID NO:13
huG1 SEQ ID NO:25
huF6 SEQ ID NO:38
其中，下划线部分表示使用Chothia编号方案划分的CDR区域。
将以上抗原结合蛋白huA3、huG1和huF6的可变区编码序列分别融合人免疫球蛋白γ1(IgG1)的Fc片段并亚克隆至表达载体PCDNA3.4。利用PEI转染Expi293细胞进行重组表达，7天后，收集细胞上清液，并利用ProteinA磁珠进行纯化。收集到纯度达到95％以上的 抗原结合蛋白，得到huA3-Fc抗原结合蛋白、huG1-Fc抗原结合蛋白和huF6-Fc抗原结合蛋白。以上各抗原结合蛋白的人源化序列分别如下：
huA3-Fc SEQ ID NO:68
huG1-Fc SEQ ID NO:69
huF6-Fc SEQ ID NO:70
用实施例6的方法对以上抗原结合蛋白与金黄色葡萄球菌α-毒素的结合活性进行检测。实验结果如图5所示，表明上述三种抗原结合蛋白与金黄色葡萄球菌α-毒素具有较强的亲和力，其中，huA3-Fc抗原结合蛋白的EC 50值为0.005970μg/mL，huG1-Fc抗原结合蛋白的EC 50值为0.006353μg/mL，huF6-Fc抗原结合蛋白的EC 50值为0.002721μg/mL。
用实施例7中的α-毒素导致的兔红细胞溶血模型评价以上抗原结合蛋白中和金黄色葡萄球菌α-毒素溶血活性。实验结果如图6所示，表明huA3-Fc，huG1-Fc，huF6-Fc对金黄色葡萄球菌α-毒素的中和作用均显著优于对照抗体AR-301。
利用金黄色葡萄球菌α-毒素导致小鼠脓毒症模型对抗原结合蛋白的药效进行评价。预先 向C57BL/6小鼠注射不同剂量的抗原结合蛋白，30min后尾静脉注射2.5μg金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白，使用人IgG作为对照。观察小鼠生存时间。利用金黄色葡萄球菌α-毒素导致的小鼠脓毒症模型检测huA3-Fc抗原结合蛋白和huG1-Fc抗原结合蛋白的治疗作用的结果如图7所示。结果表明，本申请所述的三种抗原结合蛋白：A3-Fc抗原结合蛋白、G1-Fc抗原结合蛋白的保护作用均优于AR301。
利用金黄色葡萄球菌感染小鼠导致菌血症模型对抗原结合蛋白的治疗作用进行评价。从-80度冰箱活化金黄色葡萄球菌USA300，在TSA培养基活化两代，并接种至2ml TSB培养12h。利用PBS清洗3次后，向小鼠尾静脉感染6×107CFU。感染2h后注射抗原结合蛋白，使用人IgG作为对照，观察小鼠生存情况。利用金黄色葡萄球菌导致的小鼠菌血症模型评价huA3-Fc抗原结合蛋白和huG1-Fc抗原结合蛋白的抗感染药效学作用的结果如图8所示。结果表明，huA3-Fc抗原结合蛋白和huG1-Fc抗原结合蛋白对于金黄色葡萄球菌导致的小鼠菌血症模型具有显著的保护作用，且药效学作用优于对照抗体AR-301。
实施例11 制备四价金黄色葡萄球菌α-毒素抗原结合蛋白的Fc融合蛋白
串联两个抗金黄色葡萄球菌α-毒素抗原结合蛋白序列(例如：2个huA3分子或者2个huG1分子或者1个huA3分子和huG1分子)与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc的编码核酸片段，并且亚克隆至pcDNA3.4质粒，利用实施例5中的方法进行表达、纯化。重组表达得到的分子包含4个与金黄色葡萄球菌α-毒素的结合域，因此称为四价抗金黄色葡萄球菌α-毒素Fc抗原结合蛋白。其中huA3-huA3-Fc抗原结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:65所示，huG1-huG1-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示，huA3-huG1-Fc抗原结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:67所示。
利用实验例7中的金黄色葡萄球菌α-毒素导致的兔红细胞溶血模型检测四价huA3-huG1-Fc抗原结合蛋白、huA3-Fc抗原结合蛋白和huG1-Fc抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素的中和作用，结果如图9所示。结果表明，对于18.75ng的重组金黄色葡萄球菌α-毒素，相同剂量的四价huA3-huG1-Fc融合蛋白的中和效应优于二价的huA3-Fc抗原结合蛋白和huG1-Fc抗原结合蛋白。
利用实验例7中的金黄色葡萄球菌α-毒素导致的兔红细胞溶血模型检测四价huA3-huA3-Fc抗原结合蛋白、huA3-Fc抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素的中和作用，结果如图10所示。结果表明，对于18.75ng的重组金黄色葡萄球菌α-毒素，相同剂量的四价huA3-huA3-Fc融合蛋白的中和效应优于二价的huA3-Fc抗原结合蛋白。
利用实验例7中的金黄色葡萄球菌α-毒素导致的兔红细胞溶血模型检测四价huG1-huG1- Fc抗原结合蛋白、huG1-Fc抗原结合蛋白对金黄色葡萄球菌α-毒素的中和作用，结果如图11所示。结果表明，对于18.75ng的重组金黄色葡萄球菌α-毒素，相同剂量的四价huG1-huG1-Fc融合蛋白的中和效应优于二价的huG1-Fc抗原结合蛋白。

Claims (54)

  1. 分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR3，所述HCDR3包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR2，所述HCDR2包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求2所述的分离的抗原结合蛋白，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，所述HCDR1包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求4所述的分离的抗原结合蛋白，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
  7. 根据权利要求1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:28中任一项所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:27中任一项所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:26中任一项所示的氨基酸序列。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含选自下述任一组的HCDR1，HCDR2和HCDR3：
    1)所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
    2)所述HCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；以及
    3)所述HCDR1包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。
  9. 根据权利要求4-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:54所 示的氨基酸序列。
  10. 根据权利要求9所述的分离的抗原结合蛋白，所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33中任一项所示的氨基酸序列。
  11. 根据权利要求4-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR2，所述H-FR2位于所述HCDR1和HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
  12. 根据权利要求11所述的分离的抗原结合蛋白，所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
  13. 根据权利要求2-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR3，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
  14. 根据权利要求13所述的分离的抗原结合蛋白，所述H-FR3包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列。
  15. 根据权利要求1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR4，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
  16. 根据权利要求15所述的分离的抗原结合蛋白，所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36中任一项所示的氨基酸序列。
  17. 根据权利要求1-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
  18. 根据权利要求1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，所述H-FR1包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:33中任一项所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:34 中任一项所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:35中任一项所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36中任一项所示的氨基酸序列。
  19. 根据权利要求1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含选自下述任一组的H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4：
    1)所述H-FR1包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
    2)所述H-FR1包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；
    3)所述H-FR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含那SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列；
    4)所述H-FR1包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；
    5)所述H-FR1包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；以及
    6)所述H-FR1包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，所述H-FR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述H-FR3包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
  20. 根据权利要求1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含VH，所述VH包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
  21. 根据权利要求20所述的分离的抗原结合蛋白，所述VH包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。
  22. 根据权利要求1-21中任一项所述分离的抗原结合蛋白，其包括VHH。
  23. 根据权利要求22所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VHH包含SEQ ID NO:60或 SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
  24. 根据权利要求22-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VHH包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38中任一项所示的氨基酸序列。
  25. 根据权利要求1-24中任一项所述的分离抗原结合蛋白，其包含抗体重链恒定区。
  26. 根据权利要求25所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区源自人IgG恒定区。
  27. 根据权利要求25-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区源自人IgG1恒定区。
  28. 根据权利要求25-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
  29. 根据权利要求1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70中任一项所示的氨基酸序列。
  30. 根据权利要求1-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
  31. 根据权利要求30所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，Bs-Fv，F(ab’) 2，F(ab) 2，scFv，di-scFv和/或dAb。
  32. 根据权利要求30-31中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组中的一种或多种：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
  33. 根据权利要求1-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其能够特异性结合金黄色葡萄球菌α-毒素。
  34. 根据权利要求1-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其能够中和金黄色葡萄球菌α-毒素的生物学活性。
  35. 根据权利要求1-34中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其能够预防和/或治疗疾病和/或病症及其并发症。
  36. 根据权利要求35所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述疾病和/或病症及其并发症由金黄色葡萄球菌引起或介导。
  37. 根据权利要求35-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述疾病和/或病症及其并发症包括菌血症和/或脓毒症。
  38. 多肽分子，其包含权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
  39. 根据权利要求38所述的多肽分子，其包含融合蛋白。
  40. 根据权利要求38-39中任一项所述的多肽分子，其包含两个或者两个以上权利要求1-37中任一项所述分离的抗原结合蛋白以及与权利要求25-28中任一项所述的抗体重链恒定区组成的融合蛋白。
  41. 根据权利要求38-40中任一项所述的多肽分子，其包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67中任一项所示的氨基酸序列。
  42. 免疫缀合物，其包含权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
  43. 核酸分子，其编码权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白或权利要求38-41中任一项所述的多肽分子。
  44. 载体，其包含权利要求43所述的核酸分子。
  45. 细胞，其包含权利要求43所述的核酸分子或权利要求44所述的载体。
  46. 药物组合物，其包含权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求38-41中任一项所述的多肽分子、权利要求42所述的免疫缀合物、权利要求43所述的核酸分子、权利要求44所述的载体和/或权利要求45所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
  47. 制备权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述抗原结合蛋白表达的条件下，培养权利要求45所述的细胞。
  48. 权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求38-41中任一项所述的多肽分子、权利要求42所述的免疫缀合物、权利要求43所述的核酸分子、权利要求44所述的载体、权利要求45所述的细胞和/或权利要求46所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症及其并发症。
  49. 根据权利要求48所述的用途，其中所述疾病和/或病症及其并发症由金黄色葡萄球菌引起或介导。
  50. 根据权利要求48-49中任一项所述的用途，其中所述疾病和/或病症及其并发症包括脓毒症和/或菌血症。
  51. 权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求38-41中任一项所述的多肽分子、权利要求42所述的免疫缀合物、权利要求43所述的核酸分子、权利要求44所述的载体、权利要求45所述的细胞和/或权利要求46所述的药物组合物单独使用或与其他药物联合使用。
  52. 检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的方法，所述方法包括施用权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求38-41中任一项所述的多肽分子、权利要求42所 述的免疫缀合物、权利要求43所述的核酸分子、权利要求44所述的载体、权利要求45所述的细胞和/或权利要求46所述的药物组合物。
  53. 检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的试剂或试剂盒，其包含权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求38-41中任一项所述的多肽分子、权利要求42所述的免疫缀合物、权利要求43所述的核酸分子、权利要求44所述的载体、权利要求45所述的细胞和/或权利要求46所述的药物组合物。
  54. 权利要求1-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求38-41中任一项所述的多肽分子、权利要求42所述的免疫缀合物、权利要求43所述的核酸分子、权利要求44所述的载体、权利要求45所述的细胞和/或权利要求46所述的药物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中金黄色葡萄球菌α-毒素的存在和/或含量。
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