CN117940586A - 用于免疫疗法后的疗法应答的生物标志物 - Google Patents

用于免疫疗法后的疗法应答的生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于指导癌症免疫疗法的诊断学领域。更具体地，本发明提供基于生物标志物集的表达水平来预测和/或确定受试者对免疫治疗剂治疗的应答的方法和试剂盒。

Description

用于免疫疗法后的疗法应答的生物标志物
技术领域
本发明涉及用于指导癌症免疫疗法的诊断学领域。更具体地，本发明提供了用于预测和/或确定受试者对免疫治疗剂治疗的应答的方法和试剂盒。
背景技术
癌症是一个重大的公共卫生问题。2015年，欧盟有130万人死于癌症，相当于总死亡人数的四分之一以上(25.4％)。已经针对各种癌症设计出多种治疗方法。
免疫检查点抑制剂(ICI)改变了许多肿瘤类型的治疗形势，特别是在转移性环境中。这些靶向细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)和程序性细胞死亡-1(PD-1/PD-L1)的ICI的开发显著地改善了多种癌症如黑素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗。ICI通过阻断免疫细胞和肿瘤细胞两者上存在的原型免疫检查点受体来增强抗肿瘤免疫力，并且表现出对T细胞功能的负调控。尽管这些抑制剂可以导致显著的应答，但癌症患者对ICI治疗有不同应答。一些患者迅速改善并能够克服疾病，占所治疗患者的约25％至30％，但50％的所治疗患者却未见到持久有益效果。甚至更令人担忧，越来越多的研究显示，免疫疗法可以加速多个组织学中4％至29％范围内的显著患者亚群中的肿瘤进展，并导致所谓的超进展。
目前可用的诊断法不足以有效预后地鉴定哪些患者将要对免疫疗法(如ICI疗法)产生应答，或者鉴定哪些患者将会经历超进展性疾病或是对ICI疗法的无应答者。值得注意的是，可用的生物标志物或生物标志物组的准确度最多也低于52-58％，并且其并未提供对ICI无应答性的根本生物学机制的深入见解。例如，WO2014151006提供了用于癌症中患者选择和预后的生物标志物。然而，该专利申请受限于预测患有疾病的个体对PD-L1轴结合拮抗剂治疗的应答性。WO2019012147提出了一种用于检测肿瘤浸润性CD8 T细胞的存在和密度的基于放射组学的生物标志物，以预测免疫疗法(诸如抗PD-1/PD-L1单一疗法)治疗的癌症患者的存活和/或治疗效率。US20180107786公开了一种基于肿瘤浸润性淋巴细胞、T细胞受体信号转导和突变负荷来生成免疫评分的方法。
因此，需要能够表征免疫肿瘤微环境的测定，以供伴随诊断开发和治疗决策。特别地，高度需要用于鉴定对免疫疗法治疗的应答者和无应答者的生物标志物。
发明内容
通过鉴定能够基于RECIST应答标准来预测受试者对免疫治疗剂的应答的生物标志物，发明人解决了预测和/或确定诊断患有癌症的受试者对免疫治疗剂治疗的应答的挑战。通过本发明，发明人因此鉴定了能够预测受试者是否对免疫治疗剂，更具体地免疫检查点抑制剂或免疫检查点抑制剂的组合的治疗有应答、部分应答或无应答的生物标志物。
因此，本发明的第一方面涉及用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者对免疫治疗剂治疗的应答的方法。所述方法基于对一种或多种生物标志物的表达水平的分析，更具体地基于对一种或多种蛋白编码基因的RNA表达水平的分析，并且其中基于表达水平，预测受试者是否对免疫治疗剂应答。
因此，在本发明的实施方案中，提供了一种用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者对免疫治疗剂治疗的应答的方法，该方法包括分析至少3种生物标志物；优选地至少4种或5种，甚至更优选地至少10种来自由以下组成的列表的生物标志物的表达水平：CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括分析至少3种生物标志物；优选地至少4种或5种，甚至更优选地至少10种来自由以下组成的列表的生物标志物的表达水平：CD247、LAX1、IKZF3、CD3G、ITGAL、CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3以及IGHV4.4。
在另一个实施方案中，在含有或怀疑含有肿瘤细胞的受试者的样本中对生物标志物CD247、LAX1以及IKZF3的表达水平进行分析，并且这些生物标志物的表达水平用于确定和/或预测受试者中对免疫治疗剂治疗的应答。在又一个实施方案中，结合生物标志物CD3G和ITGAL的表达水平，在含有或怀疑含有肿瘤细胞的受试者的样本中对生物标志物CD247、LAX1以及IKZF3的表达水平进行分析。在再一个实施方案中，结合生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4中的至少2种；优选地至少4种；甚至更优选地全部的表达水平，在含有或怀疑含有肿瘤细胞的受试者的样本中对生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G和ITGAL的表达水平进行分析。
在该方法的一些实施方案中，将所分析生物标志物的表达水平与相应的参考值或阈值进行比较，该参考值或阈值是对免疫治疗剂的治疗具有已知应答的受试者的特征。
在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括基于所分析生物标志物的表达水平，获得了风险评分，所述风险评分代表受试者中对免疫治疗剂的治疗产生应答的可能性。
在一些实施方案中，应答是RECIST1.1标准应答，如早期死亡(ED)、进行性疾病(PD)、稳定疾病(SD)、部分应答(PR)，以及完全应答(CR)。
在另一方面，提供了一种用于确定和/或预测受试者对免疫治疗剂的应答的试剂盒。所述试剂盒包含用于测量受试者的样本中至少3种；优选地至少5种，甚至更优选地至少10种选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4组成的列表的生物标志物的表达水平的装置；以及任选地，用于选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4组成的列表的这些生物标志物中的至少3种；优选地至少5种，甚至更优选地至少10种的参考值或阈值。还公开了所述试剂盒在用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者是否易于对免疫治疗剂的治疗产生应答的方法中的用途。
在一些实施方案中，本申请的方法的特征进一步在于，风险评分使用预训练机器学习模型以及使用生物标志物的表达水平作为输入值来获得和计算。特别地，风险评分由机器学习模型产生，该模型使用生物标志物签名的标准化表达水平作为输入数据。更具体地，机器学习模型使用预训练的架构来计算从0到1的风险评分。
在一些实施方案中，提供了一种用于监测、预测或确定诊断患有癌症的受试者对免疫治疗剂的治疗的应答的计算机实现的方法。所述方法包括：(a)提供受试者样本的选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4组成的列表的生物标志物中的至少3种；优选地至少5种；甚至更优选地至少10种的量化表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞；(b)对量化表达水平进行标准化，由此标准化经由与从来自参考集的相应评估和表达水平获得的数据进行比较来进行；(c)对步骤(a)的标准化值是否超过预定阈值进行分类；(d)获得所述标准化值的风险评分，其中所述风险评分使用预训练机器学习模型来计算，并且其中风险评分代表受试者对免疫治疗剂的应答的可能性。
在一些实施方案中，提供了一种用于监测、预测或确定受试者对免疫治疗剂的治疗的应答的计算机实现的方法。所述方法包括：(a)提供受试者的样本的生物标志物CD247、LAX1以及IKZF3的量化表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞；(b)任选地提供受试者的样本的生物标志物CD3G和ITGAL的量化表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞；并且/或者提供生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的量化表达水平；(c)对量化表达水平进行标准化，由此标准化经由与从来自参考集的相应评估和表达水平获得的数据进行比较来进行；(d)对步骤(c)的标准化值是否超过预定阈值进行分类；(e)获得所述标准化值的风险评分，其中所述风险评分使用预训练机器学习模型来计算，并且其中风险评分代表受试者对免疫治疗剂的应答的可能性。
在一些实施方案中，根据本申请的方法的特征在于，免疫治疗剂是免疫检查点抑制剂或几种不同免疫检查点抑制剂的组合。在一些另外优选的实施方案中，免疫治疗剂选自PD-1靶向剂、PD-L1靶向剂，以及CTLA-4靶向剂、或它们的组合。在一些另外优选的实施方案中，PD-1靶向剂或PD-L1靶向剂与CTLA-4靶向剂组合作为免疫治疗性治疗。
如上所概述，在本申请的方法中，对诊断患有癌症的受试者的样本进行分析，以量化一种或多种生物标志物；特别是一种或多种蛋白编码基因的表达水平。样本含有肿瘤细胞或怀疑含有肿瘤细胞。在一些实施方案中，样本含有肿瘤细胞。样本优选地是肿瘤组织样本或包含循环肿瘤细胞或怀疑包含肿瘤细胞的血液样本，如源于受试者；优选地诊断患有癌症的受试者的活检样本或液体活检样本。在一些实施方案中，样本是肿瘤组织样本。在一些实施方案中，样本是包含循环肿瘤细胞的血液样本。在一些实施方案中，样本是分离的循环肿瘤细胞的样本。在一些实施方案中，所述样本是源于诊断患有膀胱癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌的癌症患者；甚至更优选地诊断患有皮肤癌或黑素瘤、肺癌如肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者的肿瘤组织样本。在优选的实施方案中，癌症是黑素瘤；优选地II期、III期或IV期黑素瘤。在一些实施方案中，所述样本是包含循环肿瘤细胞的血液样本或源于诊断患有膀胱癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌的癌症患者；甚至更优选地诊断患有皮肤癌或黑素瘤、肺癌如肺腺癌、肺鳞状细胞癌、或非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者的分离的循环肿瘤细胞的样本。在优选的实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些另外优选的实施方案中，癌症是II期、III期或IV期黑素瘤。
附图说明
图1.(A)源数据集的PCA分析(log2标准化rna-表达值——combat前)。(B)源数据集的PCA分析(log2标准化rna-表达值——comba后)。
图2.发现(DC)与验证队列(VC)之间的combat标准化后RNA-表达水平(基于LASSO-学习器机器学习模型的前10个生物标志物)。ED—早期死亡；PD—进行性疾病；SD—稳定疾病；PR—部分应答；CR—完全应答。
图3.(A)发现队列：基于LASSO-学习器机器学习模型的前10种标志物。ED—早期死亡；CR—完全应答；(B)发现队列：基于LASSO-学习器机器学习模型的前3种标志物。ED—早期死亡；CR—完全应答；(C)验证队列：对发现队列鉴定的前10种标志物。ED—早期死亡；CR—完全应答；(D)验证队列：对发现队列鉴定的前3种标志物。ED—早期死亡；CR—完全应答。
图4.基于随机森林二元分类器的ED+PD vs PR+CR预测的ROC AUC曲线。该模型对75％的发现队列进行训练，然后应用于验证队列。队列之间没有进行数据混合，并且数据集是完全独立的。蓝色实线显示3-标志物模型(CD247、LAX1、IKZF3)的ROC AUC；紫色虚线显示25-标志物模型的ROC AUC，并且绿色虚线显示基线模型(仅CD274)的ROC AUC；ED—早期死亡；CR—完全应答。
图5.(A)发现队列中ED vs CR组之间的DEG生物标志物的火山图。突出显示的标志物是由LASSO-学习器ML模型所鉴定的那些。ED—早期死亡；CR—完全应答；(B)验证队列中ED vs CR组之间的DEG生物标志物的火山图。突出显示的标志物是由LASSO-学习器ML模型所鉴定的那些。ED—早期死亡；CR—完全应答。
图6.(A)显示出发现队列的25种生物标志物的成比例log标准化表达的热图。分层聚类揭示了下调的基因表达的显著簇，其在ED和PD患者中富集。(B)显示出验证队列的25种生物标志物的成比例log标准化表达的热图。分层聚类揭示了下调的基因表达的显著簇，其在ED和PD患者中富集。ED—早期死亡；PD—进行性疾病；SD—稳定疾病；PR—部分应答；CR—完全应答。
具体实施方式
除非另有定义，否则在公开本发明中使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。借助于进一步的指导，术语定义被包括在内以更好地理解本发明的教导。
如本文所用，以下术语具有以下含义：
如本文所用，“一个”、“一种”和“所述”是指单数和复数指代两者，除非上下文另有明确规定。以举例的方式，“一个区室”是指一个或多于一个区室。
如本文所用，涉及到可测量的值如参数、量、时间长度等等的“约”意在涵盖指定值的+/-20％或更小，优选地+/-10％或更小，更优选地+/-5％或更小，甚至更优选地+/-1％或更小，并仍更优选地+/-0.1％或更小的变化，在此范围内，这样的变化适于在所公开的本发明中执行。然而，应当理解，修饰语“约”所指的值本身也被具体地公开。
如本文所用，“包含(comprise)””和“由……组成”与“包括(include)”或“含有(contain)”同义，并且是包括性或开放性术语，其指定了所跟随的例如组分的存在，并非不包括或排除本领域已知或其中公开的额外未列举的组分、特征、元素、成员、步骤的存在。
此外，除非指明，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等等用于区分类似的元素，而不一定用于描述先后或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下可互换，并且本文所述的本发明的实施方案能够以除了本文所描述或示出以外的顺序操作。
由端点列举的数值范围包括包含在该范围内的所有数字和分数，以及所列举的端点。
除非另外定义，此处和贯穿本说明书中的表述“按重量计％”、“重量百分比”、“％重量”或“重量％”是指基于制剂的总重量计相应组分的相对重量。
鉴于术语“一个或多个”或“至少一个”，如成员组中的一个或多个或至少一个成员借助于进一步的示例本身是清楚的，该术语尤其涵盖对所述成员中的任何一个、或者对所述成员中的任何两个或更多个，如所述成员中的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等，以及多至所有所述成员的提及。
“基因”在本文中通常用于涵盖编码基因产物的多核苷酸，例如，限定开放阅读框的核酸序列。
如本文所用，“诊断”通常包括确定受试者对疾病或障碍的易感性、确定受试者当前是否受到疾病或障碍的侵袭，以及确定受疾病或障碍侵袭的受试者的预后。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指期望诊断、治疗、或疗法的任何哺乳动物受试者，尤其是人类。
术语“样本”或“生物样本”涵盖从生物体获得的多种样本类型，并且可以用于诊断或监测测定。该术语涵盖生物学来源的血液和其它液体样本、固体组织样本，如活检标本或组织培养物或源自其的细胞及其后代。该术语涵盖在样本获得之后以任何方式进行操纵的样本，如通过试剂处理、溶解、或富集某些组分。该术语涵盖临床样本，并且还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液，以及组织样本。
术语“癌症”、“赘生物”、“肿瘤”，以及“癌”可在本文中互换地用于指表现出相对自主生长的细胞，使得它们表现出以细胞增殖的显著失控为特征的异常生长表型。一般而言，本申请中用于检测的所关注细胞包括肿瘤微环境中的免疫细胞。
术语“差异表达的基因”旨在涵盖代表或对应于与相同细胞类型的另一细胞相比时在肿瘤细胞中差异表达的基因的多核苷酸。这样的差异表达的基因可包括编码基因产物(例如多肽)的开放阅读框，以及这样的基因的内含子，以及牵涉表达调控的相邻5'和3'非编码核苷酸序列，该相邻5'和3'非编码核苷酸序列超出编码区多至约20kb，但可能在任一方向上更远。一般而言，与表达水平降低至少约25％，通常至少约50％至75％，更通常至少约90％或更多相关联的表达水平差异指示了差异表达的关注基因，即，测试样本中相对于对照样本而言下调的基因。此外，与表达提高至少约25％，通常至少约50％至75％，更通常至少约90％相关联并且可为相对于对照样本而言至少约1.5倍，通常至少约2倍至约10倍，并且可为约100倍至约1,000倍提高的表达水平差异指示了差异表达的关注基因，即，过表达或上调的基因。
如本文所用，“差异表达的多核苷酸”意指包含代表差异表达的基因的序列的核酸分子(RNA或DNA)，例如，差异表达的多核苷酸包含独特地标识差异表达的基因的序列(例如，编码基因产物的开放阅读框)，使得样本中差异表达的多核苷酸的检测与样本中差异表达的基因或差异表达的基因的基因产物的存在相关。“差异表达的多核苷酸”还意在涵盖所公开的多核苷酸的片段，例如，保留生物活性的片段，以及与所公开的多核苷酸同源、基本上类似、或基本上相同(例如，具有约90％序列同一性)的核酸。
如本文所用，术语“微环境”可以指作为整体的肿瘤微环境或者微环境内的单独细胞亚群。肿瘤微环境内存在的免疫细胞为巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、髓源性抑制细胞、调节性B细胞、中性粒细胞、树突状细胞，以及成纤维细胞。肿瘤微环境通常被定义为细胞、可溶性因子、信号转导分子、细胞外基质，以及促进致瘤性转化、支持肿瘤生长和侵袭并保护肿瘤免受宿主免疫的机械提示的复杂混合物。
如本文所用，术语“一种或多种标志物”、“一种或多种生物标志物”是指一种或多种基因或由一种或多种基因表达的蛋白质、多肽、或肽，该一种或多种基因的表达水平单独地或与其它基因组合地与免疫治疗性治疗的应答相关。这种相关性可能与基因表达的提高或降低有关(例如，mRNA或由基因编码的肽的水平提高或降低)。
如本文所用，术语“体外”是指人工环境以及在人工环境内发生的过程或应答。体外环境可以包括但不限于试管和细胞培养物。术语“体内”是指自然环境(例如，动物或细胞)以及在自然环境内发生的过程或应答。术语“在硅片(in silico)”是指人工环境，其中程序使用计算机系统执行或建模，由此部分或完全避免物理操纵数据(例如，基因、多核苷酸、蛋白质…)的需求。
本说明书中引用的所有参考文献据此全文以引用方式并入。特别地，本文特别提及的所有参考文献的教导以引用方式并入。
除非另有定义，否则在公开本发明中使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。借助于进一步的指导，说明书中使用的术语的定义被包括在内以更好地理解本发明的教导。本文使用的术语或定义仅仅是为了有助于理解本发明而提供的。
在整个本说明书中提及到的“一个实施方案”或“实施方案”意味着结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都指相同的实施方案，但可以指相同的实施方案。此外，可将特定特征、结构或特性以任何合适的方式在一个或多个实施方案中组合，如对于本领域的技术人员而言从本公开显而易见。此外，虽然本文所述的一些实施方案包括一些特征而非其它实施方案中包括的其它特征，但是不同实施方案的特征的组合意指在本发明的范围内，并且形成不同的实施方案，如本领域技术人员将理解。例如，在以下权利要求中，任何要求保护的实施方案能够以任何组合使用。
通过本发明，发明人鉴定了用于预测和/或确定受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的生物标志物。更具体地，发明人显示，基于至少3种选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4组成的列表的生物标志物的表达水平，可以确定或预测诊断患有癌症的受试者对免疫疗法的应答。更具体地，发明人发现，基于一组仅3种生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平，可以预测对免疫疗法的应答。该组3种生物标志物可以任选地用生物标志物CD3G和ITGAL进行扩展。甚至进一步，5种生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G和ITGAL的组可以进一步用生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4进行扩展，由此形成用于免疫治疗性治疗的应答预测的10种生物标志物签名。
使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法改变了许多肿瘤类型的治疗形势，特别是在转移性环境中。尽管在一些患者中实现了持久应答(虽然有意义)，但大多数患者仅部分应答，或者不应答，或者甚至令人担忧的是，一些患者发展出超进展性疾病，这种现象在临床上被定义为以通过动态参数成像测量的肿瘤动力学的意料不到的加速。免疫疗法如免疫检查点抑制(ICI)治疗后的超进展性疾病(HPD)通常导致患者在ICI治疗后24-65天内死亡(Ferrara等人,2020a)。
迄今为止，由于ICI与免疫微环境之间的动态相互作用以及不同肿瘤类型中免疫环境的异质性，寻求用于预测对免疫治疗性治疗的应答，并甚至预测患者是否会发展HPD的生物标志物一直具有挑战性(Davis和Patel,2019)。通过本申请，发明人鉴定了可预测和/或确定受试者对免疫治疗性治疗的应答的几种生物标志物。
在第一方面，本申请提供了基于几种生物标志物的表达分析来确定和/或预测诊断患有癌症的受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法。更特别地，选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4组成的列表的生物标志物，优选地蛋白编码基因中的至少3种，优选地至少4种或5种，甚至更优选地至少10种或全部的表达水平将在诊断患有癌症的受试者的样本中进行评估，并且在用于确定和/或预测对免疫治疗剂治疗的应答的方法中使用。在另一个实施方案中，至少3种生物标志物，优选地至少4种或5种生物标志物，甚至更优选地所有10种选自由CD247、LAX1、IKZF3、CD3G、ITGAL、CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3和IGHV4.4组成的列表的生物标志物的表达水平将在诊断患有癌症的受试者的样本中进行评估，并且它们的表达水平将在用于确定和/或预测对免疫治疗剂治疗的应答的方法中使用。
在一个优选的实施方案中，提供了一种用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者中对免疫治疗剂治疗的应答或抗性的方法。所述方法包括分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括分析受试者的样本中生物标志物CD3G和ITGAL的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在又一个实施方案中，所述方法进一步还包括分析受试者的样本中生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4中的至少2种、至少3种、至少4种，或优选地全部的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。因此，在一些实施方案中，提供了一种用于确定和/或预测受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在一些实施方案中，提供了一种用于确定和/或预测受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G和ITGAL的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在一些实施方案中，提供了一种用于确定和/或预测受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G、ITGAL、CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3和IGHV4.4的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在一些实施方案中，这些方法中的任一种可进一步补充有受试者的样本中选自由CXCR6、SLAMF7、MYO1G、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、IGLV1.36、的TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV4.28、IGHV4.31组成的列表的生物标志物中的一种或多种的表达水平的分析。
在一个实施方案中，因此提供了一种用于确定和/或预测受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。
在另一个实施方案中，因此提供了一种用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G和ITGAL的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。
在又一个实施方案中，因此提供了一种用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括与生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4中的一种或多种的表达水平组合；优选地与生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4中的至少2种、至少3种或至少4种的表达水平组合；甚至更优选地与所有生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的表达水平组合，分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G和ITGAL的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。
在又一个实施方案中，因此提供了一种用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G、ITGAL、CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的表达水平，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。
在另一个实施方案中，本申请提供了一种用于确定和/或预测受试者中对免疫治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括与选自由CXCR6、SLAMF7、MYO1G、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV4.28、IGHV4.31组成的列表的生物标志物中的一种或多种组合，在含有或怀疑含有肿瘤细胞的样本中分析生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G、ITGAL、CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的表达水平。
在一些实施方案中，将生物标志物的表达水平与相应的参考值或阈值进行比较，该参考值或阈值是对免疫治疗剂，特别是免疫检查点抑制剂的治疗具有已知应答的受试者的特征。
在一些实施方案中，基于所述表达分析之一，获得了风险评分，其中所述风险评分代表对免疫治疗剂应答的可能性。在一些另外的实施方案中，将风险评分与阈值评分进行比较，该阈值评分是基于从对免疫治疗剂的治疗具有已知应答的受试者获得的样本中生物标志物的表达分析来计算的。
生物标志物，优选地蛋白编码基因，包括CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4的列表因此包含本申请的一个方面的预测性生物标志物。优选地，至少3种；至少5种；至少10种、或甚至所有这些预测性生物标志物用于确定受试者是否以及如何对免疫治疗剂的治疗产生应答。
在特定实施方案中，如本文所教导的方法可以包括将生物标志物表达水平与一个或多个相应的参考值或阈值进行比较，该参考值或阈值是对免疫治疗剂，特别是免疫检查点抑制剂的治疗具有已知应答的受试者的特征。所述参考值或阈值可代表用免疫治疗剂治疗后具有已知预后的受试者的一种或多种生物标志物的表达水平。所述已知预后可以是对治疗的应答、对治疗的部分应答、对治疗的无应答、或甚至对治疗应答的超进展性疾病的发展。在特定实施方案中，所述已知预后可以是实体瘤应答评价标准1.1(ResponseEvaluation Criteria in Solid Tumours 1.1，RECIST 1.1；(Eisenhauer等人,2019)应答标准选择的进行性疾病(PD)、稳定疾病(SD)、部分应答(PR)，以及完全应答(CR)中的任一种。进行性疾病(PD)额外分为早期死亡(ED)和非早期死亡队列。ED定义为无进展生存期(PFS)<90天且总生存期(OS)<180天(Ferrara等人,2020b)。在其它实施方案中，所述参考值或阈值可代表健康受试者的一种或多种生物标志物的表达水平。所述比较可通常包括用于确定所比较的值或谱之间是否存在至少一种差异以及任选地这种差异的大小的任何手段。比较可包括视觉检测、测量的算术或统计比较。这样的统计比较包括但不限于应用算法。如果值或生物标志物表达谱包含至少一种标准，则确定所述值或生物标志物表达谱的差异的比较还可包括这些标准的测量，使得生物标志物的测量与内标的测量相关。
任何生物标志物的表达水平的参考值或阈值可以根据先前用于其它生物标志物的已知程序来建立。
通过确定来自以对免疫治疗剂治疗的已知应答为特征的一名个体或个体群体(例如，组)的一个或多个样本中所述生物标志物的量或表达，可以建立用于确定受试者是否易于对如本文所教导的免疫治疗性治疗产生应答的生物标志物的表达水平的参考值。这样的群体可包括但不限于≥2名、≥10名、≥100名、或甚至数百名或更多名个体。
在一个实施方案中，如本文所教导的一个或多个参考值或者一个或多个阈值可以传达如本文所预期的生物标志物的绝对量。在另一个实施方案中，可以相对于参考值而言直接确定来自测试受试者的样本中生物标志物的量(例如，根据增加或减少、或倍数增加或倍数减少)。有利地，这可以允许将受试者的样本中生物标志物的量或表达水平与参考值进行比较(换句话说，测量受试者的样本中生物标志物相对于参考值的相对量)，而无需首先确定生物标志物的相应绝对量。
如所解释，本发明的方法、用途、或产物可以涉及在如本文所教导的受试者的样本中的一种或多种生物标志物的表达水平与给定参考值或阈值之间发现偏差或无偏差。
第一值与第二值的“偏差”或第一值与第二值之间的“差异”可通常涵盖任何方向(例如，增加：第一值>第二值；或减少：第一值<第二值)以及任何程度的改变。
例如，偏差或差异可涵盖但不限于第一值相对于与之进行比较的第二值而言减少至少约10％(约0.9倍或更小)、或至少约20％(约0.8倍或更小)、或至少约30％(约0.7倍或更小)、或至少约40％(约0.6倍或更小)、或至少约50％(约0.5倍或更小)、或至少约60％(约0.4倍或更小)、或至少约70％(约0.3倍或更小)、或至少约80％(约0.2倍或更小)、或至少约90％(约0.1倍或更小)。
例如，偏差或差异可涵盖但不限于第一值相对于与之进行比较的第二值而言增加至少约10％(约1.1倍或更大)、或至少约20％(约1.2倍或更大)、或至少约30％(约1.3倍或更大)、或至少约40％(约1.4倍或更大)、或至少约50％(约1.5倍或更大)、或至少约60％(约1.6倍或更大)、或至少约70％(约1.7倍或更大)、或至少约80％(约1.8倍或更大)、或至少约90％(约1.9倍或更大)、或至少约100％(约2倍或更大)、或至少约150％(约2.5倍或更大)、或至少约200％(约3倍或更大)、或至少约500％(约6倍或更大)、或至少约700％(约8倍或更大)等等。
优选地，偏差或差异可以指统计上显著观察到的改变。例如，偏差或差异可以指在给定群体中落在参考值的误差容限之外的观察到的改变(如例如通过标准偏差或标准误差、或通过其预定倍数所表示，例如，±1xSD或±2xSD或±3xSD、或±1xSE或±2xSE或±3xSE)。偏差或差异也可指落在由给定群体中的值所定义的参考范围之外的值(例如，在包含所述群体中的值的≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥75％或≥80％或≥85％或≥90％或≥95％或甚至≥100％的范围之外)。
在另一个实施方案中，如果观察到的改变超出给定阈值或截止值，则可以推断出偏差或差异。这样的阈值或截止值可以如本领域所公知来选择，以提供预测方法的选定准确度、敏感度和/或特异性，例如至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的准确度、敏感度和/或特异性。
例如，基于可接受的全局准确度、敏感度和/或特异性，或本身公知的相关性能测量如阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(LR+)、阴性似然比(LR-)、约登指数、或类似物，可使用接受者操作特征(ROC)曲线分析来选择给定生物标志物的量的最佳阈值或截止值，以用于本发明诊断测试的临床使用。
例如，可以为每个单独的生物标志物选择最佳阈值或截止值作为接受者操作特征(ROC)曲线的局部极值，即，到对角线的局部最大距离的点，如描述于Robin X.,PanelomiX:a threshold-based algorithm to create panels of biomarkers,2013,TranslationalProteomics,1(1):57-64中。
本领域的技术人员将理解，给出精确的阈值或截止值是无关紧要的。可以通过将敏感度和特异性与任何阈值或截止值的敏感度/特异性相关联来获得相关阈值或截止值。
诊断工程师确定何种水平的阳性预测值/阴性预测值/敏感度/特异性是期望的，以及阳性或阴性预测值的多少损失是可容许的。所选择的阈值或截止水平可以取决于诊断工程师结合本发明方法使用的其它诊断参数。
在一些实施方案中，在如本文所教导的方法、用途或产物中，将生成风险评分。所生成的风险评分代表受试者中对免疫治疗性治疗产生应答的可能性。在一些实施方案中，所述风险评分的范围为0至1，并且代表受试者中对免疫治疗性治疗产生应答的可能性，其中1为受试者中对免疫治疗剂治疗产生应答的100％似然率，并且0为对免疫治疗剂治疗产生应答的0％似然率。
在一些实施方案中，似然值由机器学习模型产生，该模型使用生物标志物签名之一的标准化表达水平作为输入数据。在另一个实施方案中，机器学习模型是使用预训练的架构来计算从0到1的风险评分的预训练机器学习模型。这种预训练的架构是基于针对免疫治疗性治疗的应答具有已经获知的注释的回顾性和前瞻性样本库进行训练和更新的，特别地，这种预训练的架构是基于从针对免疫治疗性治疗的应答具有已经获知的注释的受试者的样本获得的参考值或阈值库进行训练和更新的。
在一些实施方案中，机器学习模型选自(1)具有随机效应的线性混合效应模型、(2)差异表达分析、(3)随机森林机器学习模型、(4)梯度推进机器模型以及(5)基于预训练的架构如VGG-16和ResNet-50架构的新型深度回归模型。在一些实施方案中，可以应用机器学习模型的组合，其中每个模型在每个数据集上独立地运行，然后在聚合数据上共同运行，以确保签名在独立试验中良好重复。在一些另外的实施方案中，可以应用基因和标签引导以及独立队列比较来排除这些模型的随机拟合的概率并确保一种或多种生物标志物不太可能仅仅偶然地出现在数据中。
在一个特别优选的实施方案中，因此使用机器学习，例如使用梯度推进机器(GBM)分类方法以学习负责受试者对免疫治疗剂治疗的应答的生物标志物表达特征的特定模式，对分析，特别是生物标志物表达分析以及风险评分的计算进行训练和更新。
根据一些实施方案，一种或多种选自CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4的生物标志物的表达水平用于梯度推进机器(GBM)分类方法中，以学习负责受试者对一种或多种免疫疗法的应答的所述生物标志物表达特征的特定模式。针对选自早期死亡(ED)、进行性疾病(PD)、部分应答(PR)和完全应答(CR)，以及对免疫疗法的应答的RECIST 1.1标准，对那些GBM模型中的应答变量进一步优化。在特定实施方案中，生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平用于梯度推进机器(GBM)分类方法中，以学习负责受试者对免疫疗法的应答的生物标志物表达特征的特定模式。在其它实施方案中，生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G和ITGAL的表达水平用于梯度推进机器(GBM)分类方法中，以学习负责受试者对免疫疗法的应答的生物标志物表达特征的特定模式。在又一个实施方案中，生物标志物CD247、LAX1、IKZF3、CD3G、ITGAL，结合生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4中的至少2种、至少3种、至少4种或优选地全部的表达水平用于梯度推进机器(GBM)分类方法中，以学习负责受试者对免疫疗法的应答的生物标志物表达特征的特定模式。
在一些实施方案中，其中获得风险评分的本发明的方法进一步使用本领域的技术人员已知的其它癌症诊断法进行补充。
因此，本发明的方法、用途以及产物旨在预测和/或确定受试者对免疫治疗剂治疗的应答。所述受试者的应答可以基于RECIST 1.1.应答标准来确定，并且可以选自早期死亡(ED)、进行性疾病(PD)、稳定疾病(SD)、部分应答(PR)以及完全应答(CR)(https://recist.eortc.org/recist-1-1-2/；Eisenhauer等人,2009)。
如本文所教导的方法、试剂盒、或用途典型地特征在于受试者的样本中一种或多种生物标志物的表达分析，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。如本文所用，“生物标志物”在本领域中很广泛，并且可以广义地表示生物分子和/或其可检测部分，其在受试者中的定性和/或定量评价就受试者的表型和/或基因型的一个或多个方面而言，如例如就受试者关于给定疾病或病症的状态而言是预测性或信息性的(例如，预测性、诊断性和/或预后性)。
在优选的实施方案中，如本文所教导的生物标志物是蛋白编码基因，并且评价了所述蛋白编码基因的表达水平。在甚至更优选的实施方案中，评价了一种或多种蛋白编码基因的基于RNA的表达水平。本文所公开的蛋白编码基因的表达水平可以通过本领域已知的适用于测定样本中的特定基因表达水平的任何方法进行评估。这样的方法是本领域中公知且常规实施的。基因表达分析可以例如通过逆转录酶实时定量PCR、基因表达芯片、TruSeq基因表达分析、原位杂交、染料测序、焦磷酸测序、基于CRISPR-Cas的或任何其它形式的转录组测序(总RNA-Seq、mRNA-Seq、基因表达谱)来执行。
另外，定制形式的TruSeq Targeted RNA表达试剂盒用于测量如本文所列的多种基因的表达水平。TruSeq Targeted RNA表达试剂盒实现了高度可定制的中高度复杂基因表达谱研究，其允许定义12-1,000个测定的组，以靶向单独的外显子、亚型、剪接点、编码SNP(cSNP)、基因融合物，以及非编码RNA转录物，以及多至384个样本的多重检测。
而且，定制形式的TruSeq Custom Amplicon Kit Dx可用于如本文所列的多种基因的定性和/或定量评估。TruSeq Custom Amplicon Kit Dx是经FDA批准监管和CE-IVD标示的扩增子测序试剂盒，使临床实验室能够开发出其自身的下一代测序(NGS)测定，以在FDA监管和CE-IVD标示的MiSeqDx和NextSeq 550dx仪器上使用。
在某些其它实施方案中，如本文所教导的生物标志物可以是基于肽、多肽和/或蛋白质的。提及到的任何标志物(包括任何基因、肽、多肽、蛋白质)对应于本领域中相应名称下众所周知的标志物、基因、肽、多肽、蛋白质。该术语涵盖所存在的任何生物体，并特别是动物，优选地温血动物，更优选地脊椎动物，还更优选地哺乳动物，包括人类和非人类哺乳动物，仍更优选地人类的这样的标志物、基因、肽、多肽、蛋白质。该术语特别涵盖具有天然序列的这样的标志物、基因、肽、多肽、蛋白质，即，其一级序列与存在于或源于自然界的标志物、基因、肽、多肽、蛋白质相同。技术人员应理解，由于不同物种之间的遗传分歧，天然序列可能在不同物种之间有所不同。此外，由于给定物种内的正常遗传多样性(变异)，天然序列可能在同一物种的不同个体之间或之内有所不同。而且，由于遗传变异、转录后或翻译后修饰，天然序列可能在同一物种的不同个体之间或甚至之内有所不同。标志物、基因、肽、多肽、蛋白质的任何这样的变体或亚型均旨在本文中。因此，存在于或源于自然界的标志物、基因、肽、多肽、或蛋白质的所有序列都被认为是“天然的”。该术语涵盖当构成活体生物、器官、组织或细胞的一部分时，当构成生物样本的一部分时，以及当至少部分地从此类来源分离时的标志物、基因、肽、多肽、或蛋白质。该术语还涵盖通过重组或合成手段产生时的标志物、基因、肽、多肽、或蛋白质。
在某些实施方案中，如本文所教导的生物标志物可为人生物标志物，如特别是选自CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31，以及IGHV4.4的任何生物标志物。
提及到的“CD247”表示CD247标志物、肽、多肽、蛋白质、或核酸，如本领域中所述名称下众所周知。借助于额外指导，CD247也称为“CD3-ζ”、“CD3H”、“CD3Q”、“CD3Z”、“IMD25”、“T3Z”、或“TCRZ”。如从上下文中显而易见，该术语表示CD247核酸以及CD247肽、多肽以及蛋白质。
举例来说，人CD247 mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号NM_000734.4(“亚型2前体”)、NM_198053.3(“亚型1前体”)、XM_011510145.2(“亚型X2”)、XM_011510144.3(“亚型X1”)、NM_001378516.1(“亚型4前体”)、NM_001378515.1(“亚型X3前体”)下注释。
NM_000734.4的核苷酸65(起始密码子)至556(终止密码子)构成CD247编码序列(CDS)。举例来说，NM_00734.4的核苷酸65至556重现如下：
举例来说，人CD247蛋白质序列在NCBI Genbank登录号NP_000725.1、NP_932170.1、XP_011508447.1、XP_011508446.1、NP_001365445.1、NP_001365444.1下注释。
作为实例，NP_000725.1的氨基酸序列进一步重现如下：
举例来说，人CD247基因在NCBI Genbank Gene ID 919下注释。
提及到的“LAX1”(“淋巴细胞跨膜衔接因子1”)表示LAX1标志物、肽、多肽、蛋白质、或核酸，如本领域中所述名称下众所周知。借助于额外指导，LAX1也称为“LAX”。如从上下文中显而易见，该术语表示LAX1核酸以及LAX1肽、多肽以及蛋白质。
举例来说，人LAX1 mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号NM_017773.4(“亚型a”)、NM_006711397.4(“亚型X1”)、NM_001136190.2(“亚型b”)、或NM_001282878.1(“亚型c”)下注释。
NM_017773.4的核苷酸384(起始密码子)至1580(终止密码子)构成LAX1编码序列(CDS)。举例来说，NM_017773.4的核苷酸384至1580重现如下：
举例来说，人LAX1蛋白质序列在NCBI Genbank登录号NP_060243.2、NP_00112966.2、NP_001269807下注释。
作为实例，NP_060243.2的氨基酸序列进一步重现如下：
举例来说，人LAX1基因在NCBI Genbank Gene ID 54900下注释。
提及到的“IKZF3”(“IKAROS家族锌指蛋白3”)表示IKZF3标志物、肽、多肽、蛋白质、或核酸，如本领域中所述名称下众所周知。借助于额外指导，IKZF3也称为“AIO”、“AIOLOS”、“IMD84”，以及“ZNFN1A3”。如从上下文中显而易见，该术语表示IKZF3核酸以及IKZF3肽、多肽以及蛋白质。
举例来说，人IKZF3 mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)登录号XM_047435625.1(亚型X1)、NM_001284516.1(亚型14)、NM_001257409.2(亚型8)、NM_001257408.2(亚型7)、NM_001257413.2(亚型12)、NM_001257412.2(亚型11)、NM_001257411.2(亚型10)、NM_001257410.2(亚型9)、NM_001257414.2(亚型13)、NM_183231.3(亚型5)、NM_183228.3(亚型2)、NM_001284515.2(亚型14)、NM_183232.3(亚型6)、NM_183229.3(亚型3)、NM_183230.3(亚型4)、NM_012481.5(亚型1)、NM_001284514.2(亚型14)下注释。
NM_001257409.2的核苷酸187(起始密码子)至1497(终止密码子)构成IKZF3编码序列(CDS)。举例来说，NM_001257409.2的核苷酸187至1497重现如下：
举例来说，人IKZF3蛋白质序列在NCBI Genbank登录号XP_047291581.1、NP_001271445.1、NP_001244338.1、NP_001244337.1、NP_001244342.1、NP_001244340.1、NP_001244339.1、NP_001244343.1、NP_899054.1、NP_899051.1、NP_001271444.1、NP_899055.1、NP_899052.1、NP_899053.1、NP_036613.2、NP_001271443.1下注释。
作为实例，NP_001244338.1的氨基酸序列进一步重现如下：
举例来说，人IKZF3基因在NCBI Genbank Gene ID 22806下注释。
提及到的“ITGAL”(“整合素亚基αL”)表示ITGAL标志物、肽、多肽、蛋白质、或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，ITGAL也称为“CD11A”、“LFA-1”、“LFA1A”。如从上下文中显而易见，该术语表示ITGAL核酸，以及ITGAL肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人ITGAL mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_002209.3、XM_005255.13.1、XM_006721044.2、NM_001114380.2、XM_047434073.1、XM_047434072.1下注释。举例来说，人ITGAL蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_002200.2、XP_005255370.1、XP_006721107.1、NP_001107852.1、XP_047290029.1、XP_047290028.1下注释。
提及到的“CD3G”(“T细胞受体复合物的CD3γ亚基”)表示CD3G标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，CD3G也称为“CD3-γ”、“IMD17”或“T3G”。如从上下文中显而易见，该术语表示CD3G核酸，以及CD3G肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人CD3G mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_000073.3、XM_006718941.4、或XM_005271724.5下注释。举例来说，人CD3G蛋白质在NCBIGenbank登录号NP_000064.1、NP_006719004.1、或XP_005271781.1下注释。举例来说，人CD3G基因在NCBI Genbank ID:917下注释。
提及到的“CD3E”(“T细胞受体复合物的CD3ε亚基”)表示CD3E标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，CD3E也称为“CD3ε”、“IMD18”、“T3E”或“TCRE”。如从上下文中显而易见，该术语表示CD3E核酸，以及CD3E肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人CD3E mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_000733.4下注释。举例来说，人CD3E蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_XXX NP_000724.1下注释。举例来说，人CD3E基因在NCBI Genbank ID:916下注释。
提及到的“CXCR6”(“C-X-C基序趋化因子受体6”)表示CXCR6标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，CXCR6也称为“BONZO”、“CD186”、“CDw186”、“STRL33”、“TYMSTR”。如从上下文中显而易见，该术语表示CXCR6核酸，以及CXCR6肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人CXCR6 mRNA在NCBI Genbank(http:// www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_001386436.1、NM_001386437.1、NM_006564.2、或NM_001386435.1下注释。举例来说，人CXCR6蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_001373365.1、NP_00137336.1、NP_006555.1、或NP_001373364.1下注释。举例来说，人CXCR6基因在NCBIGenbank ID:10663下注释。
提及到的“SLAMF7”(“SLAM家族成员7”)表示SLAMF7标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，SLAMF7也称为“19A”、“CD319”、“CRACC”、“CS1”。如从上下文中显而易见，该术语表示SLAMF7核酸，以及SLAMF7肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人SLAMF7 mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_001282588.2、NM_001282589.2、NM_001282590.2、NM_001282591.2、NM_001282592.2、NM_001282593.2、NM_001282594.2、NM_001282595.1、NM_001282596.2、或NM_021181.5下注释。举例来说，人SLAMF7蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_001269517.1、NP_001269518.1、NP_001269519.1、NP_001269520.1、NP_001269521.1、NP_001269522.1、NP_001269523.1、NP_001269524.1、NP_001269525.1、或NP_067004.3.NP_XXX下注释。举例来说，人SLAMF7基因在NCBI Genbank ID:57823下注释。
提及到的“MYO1G”(“肌球蛋白IG”)表示MYOIG标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，MYOIG也称为“HA”、“HLA-HA2”、或“MHAG”、如从上下文中显而易见，该术语表示MYO1G核酸，以及MYO1G肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人MYO1G mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_033054.3下注释。举例来说，人MYO1G蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_149043.2下注释。举例来说，人MYO1G基因在NCBI Genbank ID:64005下注释。
提及到的“TIGIT”(“含Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”)表示TIGIT标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，TIGIT也称为“VSIG9”、“VSTM3”、或“WUCAM”。如从上下文中显而易见，该术语表示TIGIT核酸，以及TIGIT肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人TIGIT mRNA在NCBI Genbank(http:// www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_173799.4、XM_047447671.1、或XM_047447672.1下注释。举例来说，人TIGIT蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_776160.2、XP_047303627.1、或XP_047303628下注释。举例来说，TIGIT基因在NCBI Genbank ID:201633下注释。
提及到的“ICOS”(“可诱导性T细胞共刺激因子”)表示ICOS标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，ICOS也称为“AILIM”、“CD278”、或“CVID1”。如从上下文中显而易见，该术语表示ICOS核酸，以及ICOS肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人ICOS mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_012092.4、或XM_047444022.1下注释。举例来说，人ICOS蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_036224.1、或XP_047299978.1下注释。举例来说，ICOS基因在NCBI Genbank ID:29851下注释。
提及到的“CLEC4C”(“C型凝集素结构域家族4成员C”)表示CLEC4C标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，CLEC4C也称为“BDCA-2”、“BDCA2”、“CD303”、“CLECSF11”、“CLECSF7”、“DLEC”、“HECL”、或“PRO34150”。如从上下文中显而易见，该术语表示CLEC4C核酸，以及CLEC4肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人CLEC4CmRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_001371390.1、NM_001371391.1、NM_130441.3、或NM_203503.2下注释。举例来说，人CLEC4C蛋白质在NCBIGenbank登录号NP_001358319.1、NP_001358320.1、NP_569708.1、或NP_987099.1下注释。举例来说，人CLEC4C基因在NCBI Genbank ID:170482下注释。
提及到的“CXCR3”(“C-X-C基序趋化因子受体3”)表示CXCR3标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，CXCR3也称为“CD182”、“CD183”、“CKR-L2”、“CMKAR3”、“GPR9”、“IP10-R”、“Mig-R”、或“MigR”。如从上下文中显而易见，该术语表示CXCR3核酸，以及CXCR3肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人CXCR3 mRNA在NCBIGenbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_001504.2、XM_047442010.1、NM_001142797.2、XM_005262257.4、XM_005262256.4、或XM_017029435.2下注释。举例来说，人CXCR3蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_001495.1、XP_047297966.1、NP_001136269.1、XP_005262314.1、XP_00526313.1、XP_016884924.1下注释。举例来说，人CXCR3基因在NCBIGenbank ID:2833下注释。
提及到的“TLR8”(“toll样受体8)表示TLR8标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，TLR8也称为“CD288”、“IMD98”、“hTLR8”。如从上下文中显而易见，该术语表示TLR8核酸，以及TLR8肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人TLR8mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_016610.4、或NM_138636.5下注释。举例来说，人TLR8蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_057694.2或NP_619542.1下注释。举例来说，人TLR8基因在NCBI Genbank ID:51311下注释。
提及到的“FCGR2A”(“Fcγ受体IIa”)表示FCGR2A标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，FCGR2A也称为“CD32”、“CD32A”、“CDw32”、“FCG2”、“FCGR2”、FCGR2A1”、“FcGR”、“FcγRIIa”、或“IGFR2”。如从上下文中显而易见，该术语表示FCGR2A核酸，以及FCGR2A肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人FCFR2AmRNA在NCBIGenbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_001136219.3、NM_001375296.1、NM_001375297.1、或NM_021642.5下注释。举例来说，人FCGR2A蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_001129691.1、NP_001362225.1、NP_001362226.1、或NP_067674.2下注释。举例来说，人FCGR2A基因在NCBI Genbank ID:2212下注释。
提及到的“IDO1”(“吲哚胺2,3-双加氧酶1”)表示IDO1标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，IDO1也称为“IDO”、“IDO-1”、或“INDO”。如从上下文中显而易见，该术语表示IDO核酸，以及IDO肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人IDO mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_002164.6下注释。举例来说，人IDO蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_002155.1下注释。举例来说，人IDO1基因在NCBI Genbank ID:3620下注释。
提及到的“TRAF3IP3”(“TRAF3相互作用蛋白3”)表示TRAF3IP3标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，TRAF3IP3也称为“T3JAM”。如从上下文中显而易见，该术语表示TRAF3IP3核酸，以及TRAF3IP3肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人TRAF3IP3 mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_001287754.2、NM_001320143.2、NM_001320144.2、NM_025228.4下注释。举例来说，人TRAF3IP3蛋白质在NCBI Genbank登录号NP_001274683.1、NP_001307072.1、NP_001307073.1、或NP_079504.2下注释。举例来说，人TRAF3IP3基因在NCBI Genbank ID:80342下注释。
提及到的“PIK3CD”(“磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基δ”)表示PIK3CD标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，PIK3CD也称为“APDS”、“IMD14”、“IMD14A”、“IMD14B”、“P110DELTA”、“PI3K”、“ROCHIS”、或“p110D”。如从上下文中显而易见，该术语表示PIK3CD核酸，以及PIK3CD肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人PIK3CD mRNA在NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nig.gov/)登录号NM_001350234.2、NM_001350235.1、或NM_005026.5下注释。举例来说，人PIK3CD蛋白质在NCBIGenbank登录号NP_001337163.1、NP_001337164.1、NP_005017.3下注释。举例来说，人PIK3CD基因在NCBI Genbank ID:5293下注释。
提及到的“IGLV1.36”(“免疫球蛋白λ可变区1-36)表示IGLV1.36标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，ITGAL也称为“IGLV136”、“V1-11”。如从上下文中显而易见，该术语表示IGLV1.36核酸，以及IGLV1.36肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人IGLV1.36基因在NCBI Genbank ID:28826下注释。
提及到的“TRAV14DV4”(“T细胞受体α可变区14/δ可变区4”)表示TRAV14DV4标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，TRAV14DV4也称为“hADV14S1”、“TRAV14/DV4”、“TCRAV6S1-hDV104S1”。如从上下文中显而易见，该术语表示TRAV14DV4核酸，以及TRAV14DV4肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人TRAV14DV4基因在NCBIGenbank ID:28669下注释。
提及到的“TRAJ16”(T细胞受体α连接区16”)表示ITGAL标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。如从上下文中显而易见，借助于额外指导，该术语表示TRAJ16核酸，以及TRAJ16肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人TRAJ16基因在NCBI GenbankID:28739下注释。
提及到的“IGHV1.3”(“免疫球蛋白重链可变区1-3”)表示IGHV1.3标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，IGHV1.3也称为“IGHV1-3”、“IGHV13”或“VI-3B”。如从上下文中显而易见，该术语表示IGHV1.3核酸，以及IGHV1.3肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人IGHV1.3基因在NCBI Genbank ID:28473下注释。
提及到的“IGHV4.28”(“免疫球蛋白重链可变区4-28”)表示IGHV4.28标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，IGHV4.28也称为“IGHV4-28”、“IGHV428”或“VH”。如从上下文中显而易见，该术语表示IGHV4.28核酸，以及IGHV4.28肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人IGHV4.28基因在NCBI Genbank ID:28400下注释。
提及到的“IGHV4.31”(“免疫球蛋白重链可变区4-31”)表示IGHV4.31标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，IGHV4.31也称为“IGHV4-31”、或“IGHV431”。如从上下文中显而易见，该术语表示IGHV4.31核酸，以及IGHV4.31肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人IGHV4.31基因在NCBI Genbank ID:28396下注释。
提及到的“IGHV4.4”(“免疫球蛋白重链可变区4-4”)表示IGHV4.4标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸，如本领域中的名称下众所周知。借助于额外指导，IGHV4.4也称为“IGHV4-4”、或“IGHV44”。如从上下文中显而易见，该术语表示IGHV4.4核酸，以及IGHV4.4肽、多肽以及蛋白质。举例来说，人IGHV4.4基因在NCBI Genbank ID:28401下注释。
技术人员可理解，序列数据库或本说明书中所表示的任何序列可为标志物、肽、多肽、蛋白质或核酸的前体，并且可包括由成熟分子加工出来的部分。
除非从上下文中另外显而易见，本文提及到的任何标志物、基因、肽、多肽或蛋白质、或其片段通常还可以涵盖所述标志物、基因、肽、多肽、或蛋白质、或其片段的修饰形式，如遗传变异，如突变，或带有表达后修饰，包括例如磷酸化、糖基化、脂化、甲基化、半胱氨酸化、磺化、谷胱甘肽化、乙酰化、氧化等等。
本文提及到的任何标志物、基因、肽、多肽或蛋白质也涵盖其片段。因此，本文提及到的测量(或测量其量)、确定任一种标志物、基因、肽、多肽或蛋白质的存在、或确定任一种标志物、基因、肽、多肽或蛋白质的表达水平可以涵盖测量、确定标志物、基因、肽、多肽、或蛋白质的存在或确定其表达水平，如例如测量其任一种或多种成熟和/或加工的可溶性/分泌形式(例如，一种或多种血浆循环形式)并且/或者测量其一个或多个片段。
例如，任何标志物、基因、肽、多肽或蛋白质，和/或其一个或多个片段可以共同地测量，使得所测量的量对应于共同测量的物类的总量。在另一个实例中，任何标志物、基因、肽、多肽或蛋白质和/或其一个或多个片段可各自单独地测量。
提及到肽、多肽、或蛋白质的术语“片段”通常表示肽、多肽、或蛋白质的N-和/或C-末端截短形式。优选地，片段可包含所述肽、多肽、或10蛋白质的氨基酸序列长度的至少约30％，例如至少约50％或至少约70％，优选地至少约80％，例如至少约85％，更优选地至少约90％，并且还更优选地至少约95％或甚至约99％。例如，只要不超过全长肽、多肽、或蛋白质的长度，片段可以包括相应的全长肽、多肽、或蛋白质的≥5个连续氨基酸、或≥10个连续氨基酸、或≥20个连续氨基酸、或≥30个连续氨基酸，例如，≥40个连续氨基酸，如例如≥50个连续氨基酸，例如≥60、≥70、≥80、≥90、≥100、≥200、≥300或≥400个连续氨基酸的序列。
本文提及到的任何蛋白质、多肽或肽也可以涵盖其变体。蛋白质、多肽或肽的术语“变体”是指其序列(即，氨基酸序列)与所述叙述的蛋白质或多肽的序列基本上相同(即，大部分但不完全相同)的蛋白质、多肽或肽，例如至少约80％相同或至少约85％相同，例如优选地至少约90％相同，例如至少91％相同、92％相同，更优选地至少约93％相同，例如至少94％相同，甚至更优选地至少约95％相同，例如至少96％相同，还更优选地至少约97％相同，例如至少98％相同，并且最优选地至少99％相同。优选地，当在序列比对中查询所叙述蛋白质、多肽或肽的全序列时，变体可以展示出与所叙述蛋白质、多肽或肽的这种同一性程度(即，总体序列同一性)。
蛋白质、多肽或肽的变体可为所述蛋白质、多肽或肽的同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)。如本文所用，术语“同源性”通常表示来自相同或不同分类的大分子之间，特别是两种蛋白质或多肽之间的结构相似性，其中所述相似性归因于共同的祖先。
在本说明书涉及或涵盖蛋白质、多肽或肽的片段和/或变体的情况下，这优选地表示这样的变体和/或片段：其是“功能性的”，即，其至少部分地保留相应的蛋白质、多肽或肽的生物活性或预期功能。优选地，与相应的蛋白质、多肽或肽相比，功能片段和/或变体可以保留预期生物活性或功能的至少约20％，例如至少30％、或至少约40％、或至少约50％，例如至少60％，更优选地至少约70％，例如至少80％，还更优选地至少约85％，仍更优选地至少约90％，并且最优选地至少约95％或甚至约100％或更高。
在一些实施方案中，在本申请的任何方法中所获得的风险评分可以通过受试者肿瘤的免疫组织化学或蛋白质表达数据来进一步改善。例如，Cytokine 30-Plex HumanPanel和免疫组织化学染色可用于对受试者的样本进行额外的定性和/或定量评估。
本发明还提供了一种用于预测和/或确定诊断患有癌症的受试者对免疫治疗剂的治疗的应答的计算机实现的方法，其中对从所述受试者获得的样本进行分析，该方法包括：(a)提供选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31，以及IGHV4.4组成的列表的生物标志物中的至少3种，优选地至少4种或5种，甚至更优选地至少10种的量化表达水平，所述生物标志物在受试者的样本中量化，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞；(b)对量化表达水平进行标准化，由此标准化经由与从来自参考集的相应评估和表达水平获得的数据进行比较来进行，(c)对步骤(b)的标准化值是否超过预定阈值进行分类，(d)获得所述标准化值的风险评分，其中所述评分使用预测算法或机器学习模型来计算，并且其中风险评分代表受试者对免疫治疗剂的应答的可能性。
在另一个实施方案中，提供了一种用于预测和/或确定诊断患有癌症的受试者是否对免疫治疗剂的治疗产生应答的计算机实现的方法，其中对从所述受试者获得的样本进行分析，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞，该方法包括：(a)提供生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的量化表达水平，所述生物标志物在受试者的样本中量化；(b)任选地，提供受试者的样本中生物标志物CD3G和ITGAL和/或选自CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的生物标志物中的一种或多种的量化表达水平，(c)对量化表达水平进行标准化，由此标准化经由与从来自参考集的相应评估和表达水平获得的数据进行比较来进行，(d)对步骤(c)的标准化值是否超过预定阈值进行分类，(e)获得所述标准化值的风险评分，其中所述评分使用预测算法或机器学习模型来计算，并且其中风险评分代表受试者对免疫治疗剂的应答的可能性。
在一些实施方案中，公开了一种用于预测和/或确定受试者对免疫治疗剂的应答的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于测量受试者的样本中选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4组成的列表的生物标志物中的至少3种，优选地至少4种或5种，甚至更优选地至少10种或全部的表达水平的装置。任选地，所述试剂盒进一步包含用于选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4组成的列表的生物标志物中的一种或多种的参考值或阈值。
在一些其它实施方案中，用于预测和/或确定受试者对免疫治疗剂的应答的试剂盒包含用于测量受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平的装置，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞；任选地，用于测量受试者的样本中生物标志物CD3G和ITGAL和/或选自由CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4组成的列表的生物标志物中的一种或多种的表达水平的装置，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。任选地，所述试剂盒进一步包含用于生物标志物CD247、LAX1以及IKZF3的参考值或阈值。所述试剂盒还可进一步包含用于生物标志物CD3G和ITGAL，和/或用于选自由CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4组成的列表的生物标志物中的一种或多种的参考值或阈值。
在又一些另外的实施方案中，本申请的试剂盒可包含即用型底物溶液、洗涤溶液、稀释缓冲液以及说明书。试剂盒还可包含阳性和/或阴性对照样本。在一些实施方案中，试剂盒包含使用说明书。优选地，试剂盒中包括的使用说明书对于本领域的技术人员而言是明确、简明且易于理解的。说明书典型地提供了关于试剂盒内容、如何收集样本、方法、实验读出及其解释以及注意事项和警告的信息。
如贯穿本说明书使用的术语“成套部件”和“试剂盒”是指含有实施指定方法(例如，用于预测和/或确定受试者对免疫治疗剂的应答的方法、用于决定受试者是否有资格接受免疫治疗性治疗的方法、或用于确定受试者是否易于对免疫治疗性治疗产生应答的方法)所需的组分的产品，该产品被包装以允许其运输和储存。适用于包装试剂盒中所包含的组分的材料包括水晶、塑料(例如，聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯)、瓶、烧瓶、小瓶、安瓿、纸材、信封、或其它类型的容器、载体或支撑物。在试剂盒包含多种组分的情况下，至少组分的子集(例如，多种组分中的两种或更多种)或所有的组分可以在物理上分离，例如，包含在单独的容器、载体或支撑物之中或之上。试剂盒中所包含的组分可能足以或可能不足以实施指定的方法，使得外部试剂或物质分别对于执行这些方法可能不是必需的或者可能是必需的。典型地，试剂盒与标准实验室设备结合采用，如液体处理设备、环境(例如温度)控制设备、分析仪器等。试剂盒还可以包括可用于指定方法的溶剂、缓冲液(如例如但不限于组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液、苯甲酸盐缓冲液、TRIS(三(羟甲基)-氨基甲烷)缓冲液或马来酸盐缓冲液、或它们的混合物)、酶(如例如但不限于热稳定DNA聚合酶)、可检测标志物、检测试剂，以及对照制剂(阳性和/或阴性)中的一些或全部。
典型地，试剂盒还可包括其使用说明书，如印刷的插页或计算机可读介质上的使用说明书。这些术语可以与术语“制品”互换使用，该术语“制品”当在本发明的上下文中使用时广泛地涵盖任何人造有形结构产品。
在特定实施方案中，试剂盒进一步包含其上记录有用于实施如本文所教导的方法的一个或多个程序的计算机可读存储介质。
另外，还提供了所述试剂盒特别是用于预测和/或确定受试者对免疫治疗剂的应答、或用于决定受试者是否有资格接受免疫治疗性治疗或用于确定受试者是否易于对免疫治疗性治疗产生应答的用途。
进一步提供了根据本文所公开的任何实施方案的试剂盒的用途。在一个方面，提供了包含用于测量受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平的装置的试剂盒在如本文所教导的用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者对免疫治疗剂治疗的应答或抗性的方法中的用途，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在另一个实施方案中，提供了试剂盒的所述用途，其中试剂盒进一步包含用于测量受试者的样本中生物标志物CD3G和ITGAL的表达水平的装置，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在另一个实施方案中，提供了试剂盒的所述用途，其中试剂盒进一步包含用于测量受试者的样本中生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的表达水平的装置，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在一些实施方案中，提供了试剂盒的所述用途，其中试剂盒进一步包含用于生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的参考值或阈值、和/或用于生物标志物CD3G和ITGAL的参考值或阈值、和/或用于生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3和IGHV4.4的参考值或阈值。
本申请的发明人鉴定了用于预测和/或确定受试者对免疫治疗剂的应答或用于决定受试者是否有资格接受免疫治疗剂治疗的几种生物标志物。更具体地，生物标志物被鉴定为特别适用于预测免疫检查点抑制剂治疗后的应答。在一些实施方案中，因此，免疫治疗剂是免疫检查点抑制剂或几种免疫检查点抑制剂的组合。甚至进一步，免疫检查点抑制剂选自PD-1靶向剂、PD-L1靶向剂、CTLA-4靶向剂，以及它们的组合。在一些另外优选的实施方案中，免疫治疗性治疗是PD-1靶向剂或PD-L1靶向剂与CTLA-4靶向剂的组合。在一些实施方案中，PD-1靶向剂是针对PD-1的单克隆抗体，如例如派姆单抗、纳武单抗或西米普利单抗。在一些实施方案中，PD-L1靶向剂是针对PD-L1的单克隆抗体，如例如阿替利珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、纳武单抗、或派姆单抗。在一些实施方案中，CTLA-4靶向剂是针对CTLA-1的单克隆抗体，如例如易普利姆玛。在又一些另外的实施方案中，PDL-1靶向剂，如阿替利珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、纳武单抗、或派姆单抗与CTLA-4靶向剂，如易普利姆玛组合。
免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂靶向某些需要活化或失活以起始免疫应答的免疫细胞。靶向PD-1或PD-L1的单克隆抗体可以阻断这些分别存在于T细胞和正常(或癌)细胞上的蛋白质，并加强针对癌细胞的免疫应答。这些药物有助于治疗不同类型的癌症，包括膀胱癌、非小细胞肺癌和Merkel细胞皮肤癌。CTLA-4是一些T细胞上的另一种蛋白质，就像PD-1一样，充当用于控制免疫系统的一类开关。抗-CTLA4治疗通常用于治疗皮肤黑素瘤以及一些其它癌症。
PD-1靶向剂、PD-L1靶向剂或CTLA-4靶向剂可以是本领域已知的任何靶向剂，如识别和阻断PD-1、PD-L1或CTLA-4的抗体或其片段。在一些实施方案中，PD-1靶向剂是针对PD-1的单克隆抗体，如例如派姆单抗、纳武单抗或西米普利单抗。在一些实施方案中，PD-L1靶向剂是针对PD-L1的单克隆抗体，如例如阿替利珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、纳武单抗、或派姆单抗。在一些实施方案中，CTLA-4靶向剂是针对CTLA-1的单克隆抗体，如例如易普利姆玛。在又一些另外的实施方案中，PDL-1靶向剂，如阿替利珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、纳武单抗、或派姆单抗与CTLA-4靶向剂，如易普利姆玛组合。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗受试者的癌症的免疫治疗剂，如免疫检查点抑制剂或检查点抑制剂的组合，其中使用如本文所公开的用于分析受试者的样本中一种或多种生物标志物的表达水平的任何方法，发现该受试者对免疫治疗剂的治疗有应答。特别地，提供了一种用于在受试者中治疗癌症，优选地黑素瘤，更优选地II期、III期或IV期黑素瘤的免疫治疗剂，其中使用用于分析受试者的样本中选自由CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4组成的列表的生物标志物中的一种或多种，优选地至少3种，甚至更优选地至少4种或5种的表达水平的任何方法，发现该受试者对免疫治疗剂的治疗有应答，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。在另一个实施方案中，提供了一种用于在受试者中治疗癌症，优选地黑素瘤的免疫治疗剂，其中使用用于分析受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平；任选地组合生物标志物CD3G和ITGAL、和/或选自CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的生物标志物中的一种或多种的表达水平的任何方法，发现该受试者对免疫治疗剂的治疗有应答，其中该样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。
取决于癌症类型，建议另一种ICI治疗。组合疗法或单一疗法是可能的。本发明的预测性生物标志物组优选地用于确定诊断患有癌症的受试者是否将对免疫治疗剂，特别是免疫检查点抑制剂或检查点抑制剂的组合的治疗产生应答。更优选地，本发明的预测性生物标志物组用于确定受试者在接受免疫治疗性治疗如免疫检查点抑制剂的治疗时的应答。最优选地，本发明的预测性生物标志物组用于确定受试者在接受免疫检查点抑制剂时的应答，该免疫检查点抑制剂选自PD-1靶向剂、PD-L1靶向剂、CTLA-4靶向剂，以及它们的组合。
本发明的另一方面涉及一种用免疫治疗剂治疗诊断患有癌症的受试者的方法。该方法包括根据如本文所公开的任何方法来确定受试者是否易于对免疫治疗剂的治疗产生应答，并且当发现受试者对免疫治疗性治疗有应答时，向受试者施用免疫治疗剂。在一些优选的实施方案中，免疫治疗剂是免疫检查点抑制剂，如PD-1靶向剂、PD-L1靶向剂或CTLA-4靶向剂。在一些另外优选的实施方案中，免疫治疗剂是不同的免疫检查点抑制剂的组合，如PD-1靶向剂或PD-L1靶向剂与CTLA-4靶向剂的组合。
本发明的另一个实施方案提供了一种肿瘤应答报告，包括以下步骤：分离一个或多个含有或怀疑含有患者的肿瘤细胞的样本；由一个或多个样本生成表达数据，优选地基因表达数据，甚至更优选地RNA测序数据，包括关于多种生物标志物，优选地蛋白编码基因，特别是关于多种选自CD247、LAX1、IKZF3、ITGAL、CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIK3CD、IGLV1.36、TRAV14DV4、TRAJ16、IGHV1.3、IGHV4.28、IGHV4.31、IGHV4.4的蛋白编码基因；和/或蛋白编码基因CD247、LAX1和IKZF3，任选地与CD3G和ITGAL组合，和/或任选地与多种选自CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的蛋白编码基因组合的信息；以及评估患者的肿瘤对多种可能的治疗；优选地免疫治疗剂的治疗产生应答的可能性。在另一个实施方案中，免疫组织化学数据或任何其它有价值的患者或肿瘤数据可以添加到肿瘤应答报告中。
在一些实施方案中，样本是含有或怀疑含有肿瘤细胞的样本。在一些实施方案中，样本含有肿瘤细胞。在一些实施方案中，样本是肿瘤组织样本或包含肿瘤细胞的流体样本。在一些实施方案中，样本是源于诊断患有癌症的受试者的肿瘤组织样本。在一些实施方案中，样本是流体样本，如包含肿瘤细胞，特别是循环肿瘤细胞的血液样本。在一些实施方案中，样本是包含循环肿瘤细胞的样本。生物标志物的表达水平因此在含有或怀疑含有癌细胞的生物样本中进行评估。组织样本可为例如从患有、怀疑患有、或诊断患有癌症的患者获得的组织切除物、组织活检、或转移性病灶。优选地，样本是组织样本、肿瘤的切除物或活检、已知或疑似转移性癌症病灶或切片。
获得生物样本(包括组织切除物、活检，以及体液，例如包含癌细胞/肿瘤细胞的血液样本)的方法是本领域众所周知的。
在一些实施方案中，样本是肿瘤组织样本，如新鲜冷冻的肿瘤组织样本、新鲜的肿瘤组织样本、或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织样本。可以使用本领域已知的任何技术来执行从肿瘤组织样本中分离核酸，如RNA或DNA。例如，可以按照制造商的说明书(Qiagen)使用QIAGEN RNeasy FFPE试剂盒(标准试剂盒)来执行从肿瘤组织样本(如FFPE肿瘤组织样本)中分离RNA。
在一些实施方案中，样本是包含肿瘤细胞，特别是循环肿瘤细胞的流体样本。在一些实施方案中，流体样本是血液样本，例如，已知或怀疑包含循环癌细胞的外周血液样本。样本可包含癌细胞(即，肿瘤细胞)以及非癌性细胞两者，并且在某些实施方案中，包含癌性和非癌性细胞两者。在一些实施方案中，样本是分离的循环肿瘤细胞的样本。可以使用本领域已知的任何技术来执行从液体样本如血液样本中分离循环肿瘤细胞。例如，可以使用EasySepTM Direct Human CTC富集试剂盒(Stemcell Technologies)、或Qiagen的CTC即用型CTC AdnaTest(Qiagen)来执行循环肿瘤的分离。例如，可以使用AllPrep RNA/mRNANano试剂盒(Qiagan)、或RNAeasy Tissue/Cells Advances mini试剂盒(Qiagen)来执行从分离的CTC中分离RNA和/或DNA。
在一些实施方案中，在开始任何免疫疗法或其它治疗方案或疗法，例如用于治疗癌症或管理或改善其症状的化学疗法、或放射疗法之前，收集从患者获得的样本。因此，在一些实施方案中，在施用免疫治疗剂或其它试剂、或者开始免疫疗法或其它治疗方案之前收集样本。
在一些实施方案中，受试者是诊断患有癌症的受试者。癌症可以选自膀胱癌、肾癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌；甚至更优选地诊断患有皮肤癌或黑素瘤、肺癌如肺腺癌、肺鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者。在一个优选的实施方案中，受试者是诊断患有黑素瘤和/或肺癌的受试者。在另一个优选的实施方案中，受试者诊断患有黑素瘤。在一些实施方案中，受试者诊断患有II期、III期或IV期黑素瘤。
本发明优选地针对诊断患有黑素瘤的患者来描绘。这些患者可能已经经历过抗PD-1、抗PD-L1和/或抗CTLA-4治疗、正在经历这样的治疗或者计划用这样的药物治疗。预测性生物标志物组针对这样的患者进行了优化，并以高特异性和敏感度预测患者的肿瘤针对这样的治疗的应答或者发展为进行性疾病或早期死亡的机会。
在一个优选的实施方案中，本发明的不同生物标志物组用于开发新型免疫治疗药物。
本发明的一个方面涉及一种用于开发在接受免疫治疗性治疗时牵涉进行性疾病的预测性生物标志物的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)用免疫治疗性治疗来治疗动物模型；(b)分析牵涉发展出对免疫治疗性治疗的应答性的生物标志物，优选地蛋白编码基因的表达水平；(c)选择差异表达的生物标志物，优选地蛋白编码基因，其中所述差异表达的生物标志物与受试者针对免疫治疗性治疗有应答、部分应答、或无应答的易感性相关。
本发明的另一方面提供了一种用于测试用以预测对免疫治疗性治疗的应答性的生物标志物的方法，其中该方法包括以下步骤：(a)用免疫治疗性治疗来治疗动物模型；(b)分析牵涉发展出对免疫治疗性治疗的应答性的生物标志物，优选地蛋白编码基因的表达水平；(c)选择差异表达的生物标志物，优选地蛋白编码基因，其中认定出与动物模型针对免疫治疗性治疗有应答、部分应答、或无应答的易感性相关的所述差异表达的生物标志物。
优选地，动物模型选自小鼠、大鼠、兔、猫、狗、蛙。这些动物模型可用于预测性生物标志物的开发和测试。优选的动物模型是小鼠模型。
在另一个优选的实施方案中，本发明的生物标志物是在动物模型中开发的。本发明的预测性生物标志物是在小鼠模型中开发的。优选的小鼠模型是MISTRG、NSG-SGM3、NOG-EXL、BRG hIL-3hGM-CSF。在本发明的另一个且进一步的实施方案中，在动物模型，优选地小鼠模型中测试预测性生物标志物。
本申请的一些实施方案涉及此前所描述的方法用于预测经历一种或多种免疫治疗性治疗的受试者的应答性或无应答性的用途。优选地，用于预测经历抗PD-1/PD-L1单一疗法、或联合抗CTLA-4疗法的受试者的应答性或无应答性。
预后性地鉴定哪些患者将经历进展或者是对这样的免疫治疗性治疗的无应答者具有医学和经济意义。可以确定最佳的患者特异性疗法，这确保了更好且更安全的疗法。
本发明进一步提供了一种用于确定肿瘤对免疫治疗性治疗的应答的方法；该方法包括以下步骤：定量评估牵涉对免疫治疗性治疗的应答性或抗性的多种生物标志物，优选地蛋白编码基因的表达水平；以及基于该定量评估，将肿瘤分类为对疗法的应答者、部分应答者或无应答者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括确定肿瘤的免疫组织化学数据的步骤。
优选地，免疫组织化学数据包括在肿瘤和肿瘤微环境的表征中。该额外数据集使得肿瘤是应答者、部分应答者或无应答者的鉴定更加可靠和有效，因为重复的测量生成了类似输出。
在一个更优选的实施方案中，该方法还包括确定一种或多种可能的免疫治疗性治疗疗法的步骤。
除了靶向ICI治疗之外，还可以在癌症患者的治疗中提出其它免疫治疗性治疗疗法，从而导致癌症患者治疗的积极结果。
如果确定患者具有如本文所公开的一种或多种基因签名的表达水平的变化，则本申请进一步提供了用于向患有癌症的患者施用活化或抑制免疫治疗性治疗的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括告知患者他们对疗法应答的可能性增加的步骤。在另一个实施方案中，本发明的方法包括向患者推荐特定治疗性治疗的步骤。在其它实施方案中，本发明的方法进一步包括如果确定患者可受益于疗法，特别是免疫疗法，则向患者施用疗法的步骤。
在另一个实施方案中，免疫治疗剂包含检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞疗法、溶瘤疫苗、细胞因子激动剂或细胞因子拮抗剂、或它们的组合、或本领域可用的任何其它免疫疗法。活化免疫疗法可进一步包含检查点抑制剂的使用。检查点抑制剂是本领域中易得的，且包括但不限于PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、PD-L2抑制剂、CTLA-4抑制剂、或它们的组合。
实施例
本发明通过以下非限制性实施例进一步描述，这些实施例进一步说明本发明，而非旨在也不应解释为限制本发明的范围。
方法
研究设计、患者队列，以及应答评估.
选择总共273名经PD1/PD-L1抑制剂或其与CTLA4抑制剂的组合治疗的转移性黑素瘤患者用于分析。这些包括来自GEO和dbGaP数据库中存放的4项介入临床试验(研究356761[doi:10.1016/j.cell.2017.09.028]、522397[doi:10.1016/j.ccell.2019.01.003]、phs000452_01[doi:10.1038/s41591-019-0654-5]和GSE78220[doi:10.1016/ j.cell.2016.02.065])的210名患者，以及来自比利时和奥地利3家医院正在进行的观察回顾性研究的63名患者(NCT04860076)。参与研究的患者接受纳武单抗(Nivolumab)或派姆单抗(Pembrolizumab)、或它们与易普利姆玛(Ipilimumab)的组合的治疗。我们遵守对人类参与者起作用的所有相关伦理规定，并获得了所有患者的知情同意。该方案得到了每个参与中心的独立伦理委员会的批准。应答通过RECIST v1.1来评估(PD—进行性疾病，SD稳定疾病，PR—部分应答，CR—完全应答)。未达到如由CR/PR/SD/PD所定义的可评价RECIST评分的患者被排除在研究之外。具有PFS<90天且OS<180的患者被归类为早期死亡(ED)亚组。为了确保结果的可译性，使用dbGaP数据集作为唯一的发现队列，并且来自NCT04860076临床研究的数据仅充当验证队列。
RNA提取和全转录组测序.
对于NCT04860076，按照制造商的说明书(Qiagen,Hilden,Germany)，使用QIAGENRNeasy FFPE试剂盒(标准试剂盒)从FFPE块中提取总RNA。所有FFPE块均获自在免疫检查点抑制剂治疗开始之前提取的活检。平均使用5-7个FFPE切片进行RNA提取。使用Qubit 2.0荧光计RNA测定(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)对RNA样本进行定量，并使用Agilent 4200TapeStation(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)对RNA完整性进行检查。DV200评分低于30％的样本被排除在进一步分析之外。按照制造商的方案使用TURBO DNA酶(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)处理质量满意的RNA样本以移除DNA。使用QIAGENFastSelect rRNA HMR试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)进行rRNA耗竭。
通过按照制造商的建议(NEB,Ipswich,MA,USA)，使用Illumina的NEBNext UltraII RNA文库制备试剂盒进行RNA测序文库制备。简而言之，富集的RNA在94℃下片段化15分钟。随后合成了第一链和第二链cDNA。对cDNA片段末端修复并在3’端腺苷酸化，并将通用衔接子连接至cDNA片段，继之以索引添加以及通过有限循环PCR的文库富集。测序文库使用Agilent Tapestation 4200(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)进行验证，并且使用Qubit 2.0荧光计(Invitrogen,Carlsbad,CA)以及通过定量PCR(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA,USA)进行定量。
将测序文库多路复用(multiplexed)并聚集在流通池(flowcell)的泳道上，并根据制造商的说明书加载到Illumina NovaSeq S4仪器上。使用2x150配对末端(Paired End，PE)配置，对样本进行目标为约5000万个读段测序。图像分析和碱基识别由HiSeq Control软件(HCS)进行。将Illumina HiSeq生成的原始序列数据(.bcl文件)转换为FASTQ文件，并使用Illumina的bcl2fastq 2.17软件解复用(de-multiplexed)。索引序列鉴定允许一处错配。
在来自GEO和dbGaP数据库的研究356761、522397、phs000452_01和GSE78220[doi:10.1016/j.cell.2017.09.028、10.1016/j.ccell.2019.01.003]、10.1038/s41591-019- 0654-5、10.1016/j.cell.2016.02.065]中，使用类似的程序进行RNA提取和测序。
RNA-seq数据处理和标准化.
生成了来自NCT04860076研究的63名患者的全转录组谱，并且与来自dbGaP数据集的全转录组谱结合。使用定制内部流水线处理所获得的FASTQ文件。简而言之，使用nf-core/rnaseq流水线处理原始批量RNA-seq读段，以转换原始RNA读段并获得基因表达矩阵。工作流程包括读段质量控制和读段修剪(FastQC,Trim Galore！)、针对人类参考基因组GRCh38的比对读段(STAR)、计算相对于基因的计数(featureCounts)，以及对结果的质量控制(RSeQC,Qualimap,Preseq,edgeR,MultiQC)的一系列步骤。流水线被调整和微调成最适合下游分析和可用资源的需求。ComBat-seq[doi:10.1093/nargab/lqaa078]用于对所有数据集的数据进行标准化。
主成分分析(PCA)和主方差成分分析(PVCA).
使用prcomp()函数，对数据集内检测到的24,3769种基因进行了PCA。还对dbGaP和NCT04860076研究的MM队列进行了PCA分析。PVCA是一种混合方法，其结合了PCA和VCA以量化已知变量对转录数据中观察到的全局方差的贡献。PVCA分析使用pvca软件包(v1.18.0.Bioconductor)进行。主成分分析用于验证combat标准化后数据的可比性，并且鉴定可能影响分析的潜在混杂变量。
使用机器学习进行预测性签名发现和验证.
对发现队列(dbGaP)使用具有基于LASSO的学习器的集成模型，以鉴定对治疗的应答的预测性标志物。已知集成模型更加稳健，并且受初始种子的影响较小。这种回归分析方法同时执行变量选择和正则化以改善准确度。为了构建基础学习器，使用不同的种子构建了1000个LASSO模型。在每个模型中，超参数选择都是通过五重交叉验证进行的。最终的集成模型是通过取1000个LASSO模型的系数平均值来构建的。更详细地，在每个LASSO模型中，每种基因均被分配一个系数(如果某个基因没有被该模型选择，则系数将为0)。然后，通过取每个单独LASSO模型中基因系数的平均值，获得了最终集成模型中的基因的系数。使用R软件包glmnet(v2.0-13)。
然后，使用由LASSO模型鉴定的最具预测性的参数对发现队列训练随机森林分类器(RFC)。对于RFC，来自发现队列的数据的75％被用作模型训练的训练集，并且来自发现队列的数据的25％被用于测试。CD274(仅PD-L1)模型被用作基线模型以比较生物标志物签名的预测性能。分类器被训练为二元结果模型，并且使用以下结果类别的组合：(ED+PD)vs(PR+CR)、(ED+PD+PR)vs CR、(ED+PD)vs CR、ED vs CR。通过使用一系列二元结果，可以探索各个标志物对每个RECIST 1.1状态类别的特定影响，并且评价对类别定义本身的模型性能敏感性。
然后，对验证队列—NCT04860076研究数据验证了具有最佳表现生物标志物的训练模型。如上所提及，模型训练的程序就验证队列而言是全盲的：模型在75％的发现队列(dbGaP)上进行训练，然后“按原样”应用以对NCT04860076数据(验证数据集)进行预测调用。然后将预测的调用与从医院获得的真实注释进行比较。模型训练、测试和验证期间的模型性能始终使用ROC AUC指标进行评价。
生物信息学分析
在对作图到注释基因外显子的读段进行计数之后(Ensembl release 100[doi:10.1093/nar/gkaa942])，基因命中计数表被用于下游差异基因表达分析。使用DESeq2(v1.26.0)[doi:10.1186/s13059-014-0550-8]R软件包，执行了客户定义的样本组之间的基因表达比较。Wald测试被用于生成p值，并计算了log2倍数变化值。使用Benjamini-Hochberg方法，对多重测试的P值进行了校正。对于各个比较，调整后的p值<0.05的基因被称为差异表达的基因。
通过实施来自clusterProfiler(v 3.16.1)[doi:10.1016/j.xinn.2021.100141]R软件包的过表征分析(Over Representation Analysis，ORA)，对差异表达的基因组执行了功能富集分析。功能注释针对Gene Ontology[doi:10.1038/75556,10.1093/nar/ gkaa1113]和KEGG[doi:10.1093/nar/28.1.27]数据库执行。
箱线图和小提琴图被用于可视化各组中log2转换的标准化基因表达。预测的重要基因组的成比例log2转换的标准化表达用热图进行可视化。
统计学和再现性.
除非另行指出，连续变量的所有两组比较均使用双侧学生t检验(R函数t.test)。除非另行指出，报告FDR校正的p值。
结果
研究设计、患者队列，以及应答评估.
在队列中，15％的患者接受PD1/L1与CTLA4的联合治疗，85％接受PD1/L1作为单一疗法(表1)。除PR类别(部分应答)之外，表现特定类型的治疗应答(RECIST)的患者分布在发现集与验证集之间是相当的(表2)。与验证队列相比，发现数据集含有近3倍的更多PR患者。对于其它RECIST 1.1类别，患者分布是相当的。
表1.发现和验证队列中按治疗类型的患者分布
表2.发现和验证队列中按RECIST 1.1.类别的患者分布；ED—早期死亡；PD—进行性疾病；SD—稳定疾病；PR—部分应答；CR—完全应答.
RNA提取和RNA质量.
总体而言，来自NCT04860076临床研究的大部分RNA样本均通过了质量阈值(DV200>30％)，并且所提取RNA的量足以用于下游全转录组测序。然而，我们观察到高水平的DNA污染，这通过单一DNA酶处理不能成功地消除。剩余的DNA污染导致高于预期的内含子的(intronic)和基因间读段覆盖率。尽管如此，仍实现了代表转录物丰度的足够外显子读段覆盖率。
RNA-seq数据处理、标准化和PCA分析.
发现队列与验证队列之间的数据分布的基于PCA的检查揭示了不同研究之间沿PC1轴的相当大的可变性以及沿PC2轴的部分可变性(图1A)。combat标准化后值允许相当大地降低了研究特异性差异，并实现了不同数据集之间可接受的标准化水平(图1B)。此外，所选生物标志物的统计检查(参见下面的结果)证实了发现队列与验证队列之间log 2标准化表达值的分布之间的良好一致性水平(图2)。
使用机器学习进行预测性签名发现和验证.
基于LASSO的学习器鉴定了25种基因的签名，其中10种基因(TIGIT、PIK3CD、IKZF3、ITGAL、CD247、LAX1、CD3G、CD3E、IGHV1.3、IGHV4.4)占大部分解释力(表3)，其中另外3种基因(CD247、LAX1和IKZF3)在机器学习模型中最具预测性。无论我们进行何种类型的统计分析和组间比较，这些标志物都展示出最高的区分能力(图3A和3B)。重要地，仅由发现队列鉴定标志物，然后对验证队列进行探索以确认(图3C和3D)。
发现(测试集)和验证集上的CRF模型性能允许实现RECIST 1.1类别之间的高区分性能(表4)，并且取决于分类，完整的25种标志物集的验证队列中的范围为73％至78％(图4A)，并且3-标志物模型的验证队列中为64％至77％(图4B)。在所有情况下，3-标志物模型(CD247、LAX1和IKZF3)和完整模型(25种生物标志物)均优于具有CD274(仅PD-L1抑制剂)标志物的基线模型(图4C)。ROC AUC的最大预测性增长(+15％)是用3-标志物模型(CD247、LAX1和IKZF3)实现的，并且另外22种生物标志物(CD3G、CD3E、CXCR6、SLAMF7、MYO1G、TIGIT、ICOS、CLEC4C、CXCR3、TLR8、ITGAL、FCGR2A、IDO1、TRAF3IP3、PIKCD、IGLV1.36、TRBJ2.7、TRAV14DV4、TRAJ16、IGH1.3、IGH4.28、IGHV4.31、IGHV4.4)导致进一步模型改善约5％ROCAUC。
表3.用CRF模型对验证队列的不同二重分类的变量重要性的汇总.显示了每种分类的前10种标志物；标志物基于CRF的100CV运行.
ED vs CR ED+PD vs CR ED+PD vs PR+CR ED+PD+PR vs CR
IGHV1.3 IKZF3 PIK3CD IGHV4.4
CD247 CD3G LAX1 LAX1
TIGIT CD247 CXCR6 IGHV1.3
CD3G TIGIT SLAMF7 CD3G
IKZF3 CD3E CD247 CD247
CD3E PIK3CD ITGAL TRAF3IP3
TLR8 ITGAL TIGIT CD3E
PIK3CD CXCR3 MYO1G ITGAL
CLEC4C FCGR2A CD3G IDO1
FCGR2A IGHV1.3 CD3E IGHV4.28
表4.通过将对发现队列(训练集)训练的CRF模型应用于验证队列所获得的ROCAUC性能评分；在25种生物标志物签名模型、前3种生物标志物签名以及CD274(基线，仅PD-L1)模型之间给出比较.
生物信息学分析
差异表达分析揭示，大多数DEG基因在应答较差的亚组中有所下调。由LASSO学习器ML模型鉴定的顶端生物标志物绝大多数通过FDR校正的0.05的显著性阈值，并且得到了发现和验证队列两者的支持(图5A和5B)。与PR和CR亚组相比，所有标志物在ED、PD、SD亚组中均有所下调。
生物标志物组的热图显示了发现队列中关于RECICT组的患者的合理聚类(图6A)以及验证队列的甚至更一致的聚类(图6B)。
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Claims (22)

1.用于确定和/或预测诊断患有癌症的受试者中对免疫治疗剂治疗的应答或抗性的方法，所述方法包括分析所述受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平，其中所述样本含有或怀疑含有肿瘤细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述免疫治疗剂是免疫检查点抑制剂或免疫检查点抑制剂的组合。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述免疫治疗剂选自由PD-1靶向剂、PD-L1靶向剂、CTLA-1靶向剂以及它们的组合组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样本是肿瘤组织样本或包含肿瘤细胞的流体样本。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述样本是肿瘤组织样本。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述样本是包含循环肿瘤细胞的血液样本。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其进一步包括分析所述受试者的样本中生物标志物CD3G和ITGAL的表达水平。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述受试者的样本中的生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3和IGHV4.4中的至少2种，优选至少4种，甚至更优选全部的表达水平进行分析。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述生物标志物的表达水平与相应的参考值或阈值进行比较，所述参考值或阈值是对所述免疫治疗剂的治疗具有已知应答的受试者的特征。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于所述生物标志物的表达水平获得风险评分，所述风险评分代表对所述免疫治疗剂应答的可能性。
11.根据权利要求10所述的方法，其中使用预训练机器学习模型以及所述生物标志物的表达水平作为输入值来获得和计算所述风险评分。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述应答选自RECIST 1.1应答标准。
13.试剂盒在根据权利要求1至12中任一项所述的方法中的用途，所述试剂盒包含：
-用于测量所述受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的表达水平的手段；
-任选地，用于测量所述受试者的样本中生物标志物CD3G和ITGAL的表达水平的手段；
-任选地，用于测量所述受试者的样本中生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的表达水平的手段；
-任选地，针对生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的参考值或阈值；
-任选地，针对生物标志物CD3G和ITGAL的参考值或阈值；
-任选地，针对生物标志物CD3E、TIGIT、PIK3CD、IGHV1.3、IGHV4.4的参考值或阈值。
14.用免疫治疗剂治疗诊断患有癌症的受试者的方法，所述方法包括通过根据权利要求1至12中任一项所述的方法确定或预测所述受试者对所述免疫治疗剂的应答，并且如果发现所述受试者对所述免疫治疗剂的治疗有应答，则向所述受试者施用所述免疫治疗剂。
15.用于监测、预测或确定诊断患有癌症的受试者对免疫治疗剂治疗的应答的计算机实现方法，所述方法包括：
(a)提供所述受试者的样本中生物标志物CD247、LAX1和IKZF3的量化表达水平，其中所述样本含有或怀疑含有肿瘤细胞；
(b)任选地提供所述受试者的样本中生物标志物CD3G和ITGAL的量化表达水平，其中所述样本含有或怀疑含有肿瘤细胞；
(c)将所述量化表达水平标准化，由此标准化经由与从来自参考集的相应评估和表达水平获得的数据进行比较来进行；
(d)对步骤(c)的所述标准化值是否超过预定阈值进行分类；
(d)获得所述标准化值的风险评分，其中所述风险评分使用预训练机器学习模型来计算，并且其中所述风险评分代表所述受试者对所述免疫治疗剂应答的可能性。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述免疫治疗剂是免疫检查点抑制剂或免疫检查点抑制剂的组合。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述免疫治疗剂选自由PD-1靶向剂、PD-L1靶向剂、CTLA-4靶向剂及它们的组合组成的组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述样本是肿瘤组织样本或包含肿瘤细胞的流体样本。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述样本是肿瘤组织样本。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述样本是包含循环肿瘤细胞的血液样本。
21.根据前述权利要求1至12、或14至20中任一项所述的方法，或权利要求13所述的用途，其中所述生物标志物是蛋白编码基因，特别地其中所述生物标志物的表达水平是基于RNA的所述蛋白编码基因的表达水平。
22.根据前述权利要求1至12、或14至20中任一项所述的方法，或权利要求13或21所述的用途，其中所述受试者诊断患有黑素瘤；优选地诊断患有II期、III期或IV期黑素瘤。
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