CN118020719B - 一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物模型构建技术领域，公开了一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，包括：对动物结肠进行电击，所述电击包括：将动物放置在电极板上，将dual刀头端从动物肛门伸入动物结肠内，使dual刀头端产生瞬时高频电流对结肠的预定位置进行电击；间隔一段时间再次对动物结肠进行电击，重复多次。现有的肠纤维化模型的构建主要有化学剂诱导、微生物诱导、免疫介导、基因修饰等方法，均存在一些缺陷，且均不能形成爬行脂肪，本发明构建的动物模型解决了这个问题。

Description

一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法及系统

技术领域

本发明涉及动物模型构建技术领域，尤其涉及一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法及系统。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。

肠纤维化是一种以黏膜层、黏膜下层及肌层出现细胞外基质(主要为胶原纤维)过度沉积并取代正常组织为特征的疾病，常引起的肠道狭窄和结构破坏，是克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)的重要并发症。在首次确诊十年后有近70％的CD患者因肠纤维化肠狭窄而出现腹痛、胀气、恶心、呕吐、便秘等临床症状，有超过30％需要接受内镜或手术治疗。爬行脂肪是CD特有的典型肠外表现，定义为肠系膜脂肪组织包裹在炎症及纤维化肠壁周围，与CD肠纤维化、肠狭窄密切相关。

目前CD肠道纤维化机制尚不明确且临床尚无有效的治疗方案，药物治疗的效果仍不理想。为了研究及发病机制及治疗方法，适宜的动物模型不可或缺。现有的肠纤维化模型主要有化学剂诱导的模型、微生物诱导的模型、免疫介导的模型、基因修饰模型、自发性结肠炎模型、小肠异位移植模型等，上述模型分别存在一些缺点，如存在难度高、稳定性差、可控性低、不能观察疾病的发展过程、时间长、或易受微生物影响等问题，且均不能形成爬行脂肪。现有的唯一的形成爬行脂肪的动物模型为用小鼠结肠镜反复活检结肠固定位置，这种方法造价昂贵，且需要专门的技术培训，不容易推广。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明实施例的目的是提供一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法及系统，通过高频电流对动物肠道产生电击，使结肠黏膜、黏膜下层及对应肌层出现胶原纤维的增生和沉积，进而产生包绕炎症及纤维化肠道的肠系膜脂肪，模拟CD患者的肠纤维化及爬行脂肪。

为了实现上述目的，本发明实施例提供了如下技术方案：

一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，包括：对动物结肠进行电击，所述电击包括：

将动物放置在电极板上，将dual刀头端从动物肛门伸入动物结肠内；

使dual刀头端产生瞬时高频电流对结肠的预定位置进行电击；

间隔一段时间再次对动物结肠进行电击，重复多次。

本发明dual刀头端产生瞬时高频电流对动物结肠电击，多次重复上述操作，结肠黏膜、黏膜下层及对应肌层会出现胶原纤维的增生和沉积，同时产生包绕炎症及纤维化肠道的肠系膜脂肪，模拟CD患者的肠纤维化和爬行脂肪。发明dual刀头端产生瞬时高频电流对动物结肠电击得以精准控制，提高了模型建立的可控性和稳定性。

在一些实施方式中，对小鼠的结肠进行电击。

在一些实施方式中，对结肠背侧多处位置进行电击，相邻位置间隔一定距离，结肠背侧为为小鼠平躺后结肠管腔后方。

在一些实施方式中，对结肠背侧多处位置进行电击，所述位置分别为距肛门4cm、3.5cm、3cm、2.5cm及2cm处。

在一些实施方式中，每周电击1次，共进行4个周期。

在一些实施方式中，电极板为中性电极板。

在一些实施方式中，还包括准备操作，所述准备操作包括选择电切模式，调整电压值为4-8V。

在一些实施方式中，所述准备操作为接通高频电刀电源线，连接中性电极板、dual刀和脚踏开关，打开电源开关，选择电切模式，调整电压值为5V。

在一些实施方式中，所述动物为小鼠，优选为8-10周龄的雄性小鼠。

在一些实施方式中，在电击前对小鼠进行预处理，预处理包括对小鼠进行麻醉，清理小鼠结肠粪便。

在一些实施方式中，所述电击采用高频电刀设备和dual刀配合使用。

本发明另一实施例提供了一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的系统，包括:高频电刀设备、脚踏开关、中性电极板、dual刀，高频电刀设备电源线，高频电刀设备和dual刀连接线，高频电刀设备和中性电极板连接线。

在一些实施方式中，dual刀包括手柄、外层鞘管和中间的导丝，导丝可伸缩，并可在伸出和拉回状态下固定，且导丝包括头端，鞘管直径小于小鼠结肠组织内径，导丝头端伸入肛门和结肠时处于缩回状态，刀丝伸出时边电击边退出结肠，因而不会损伤结肠。

所述高频电刀设备用于提供电流，通过dual刀伸入动物的结肠内，头端发出电流对结肠进行电击，所述电流为5V的瞬时高频电流。

本发明实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明采用dual刀头端产生瞬时高频电流对结肠背侧进行电击，进行模型制备，减小了动物手术的创伤，有助于提高动物的康复速度。

2、本发明采用高频电刀技术使得对小鼠肠道组织的电击得以精准控制，相比较目前常用的化学诱导剂引起的肠纤维化模型，提高了模型建立的可控性和稳定性。

3、本发明通过模拟结肠部位炎症和纤维化变化，能够更真实地观察肠道疾病肠纤维化和爬行脂肪的发展过程。

4、本发明采用高频电刀设备和dual刀头配合使用，具有体积小、操作简单、使用方便、价格低廉等优点。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明模型组小鼠结肠切片典型Masson染色图；

图2是本发明模型组小鼠结肠大体观；

图3是本发明对照组小鼠结肠切片典型Masson染色图；

图4为本发明对照组小鼠结肠大体观；

图5为dual刀头端从小鼠肛门伸入小鼠结肠组织的操作示意图。

为显示各部位位置而夸大了互相间间距或尺寸，示意图仅作示意使用。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，现有的肠纤维化模型的构建主要有化学剂诱导、微生物诱导、免疫介导、基因修饰等，现有模型的构建方法存在一些缺陷，且难以形成爬行脂肪，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法。

一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，包括：对动物结肠进行电击，所述电击包括：

将动物放置在电极板上，将dual刀头端从动物肛门伸入动物结肠内，

使dual刀头端产生瞬时高频电流对结肠的预定位置进行电击；

间隔一段时间再次对动物结肠进行电击，重复多次。

为便于对本发明的理解，现提供实施例如下：

下列实施例中，使用的仪器包括：

山东玉华电气有限公司制造的高频电刀设备，设备型号为YH300；

中性电极板，型号为GPD-Ⅱ；

dual刀为奥林巴斯dual刀，型号为KD-650L；

脚踏开关。

下述实施例中涉及的动物为8-10周龄雄性C57BL/6J小鼠，来源于北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量约20-25g。

实施例1

本实施例提供了一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的系统，包括高频电刀设备、脚踏开关、中性电极板和dual刀，脚踏开关、中性电极板和dual刀分别通过接口连接在高频电刀设备上，高频电刀设备通过电源线连接电源，dual刀通过dual刀连接线与高频电刀设备的接口连接，中性电极板通过中性电极板连接线与高频电刀设备的接口连接。

高频电刀设备上还设有电源开关，用于控制高频电刀设备电流的通断。脚踏开关用于控制dual刀高频电流的通断。

dual刀由手柄、外层鞘管和中间的导丝组成，刀丝可伸缩，并可在伸出和拉回状态下固定。鞘管直径约2mm,小于小鼠结肠组织内径，且刀丝头端伸入肛门和结肠时处于缩回状态，刀丝伸出时边电击边退出结肠，因而不会损伤结肠。

实施例2

本实施例构建一种肠纤维化和爬行脂肪动物模型，方法如下：

将所有小鼠置于相同环境中饲养，室温18-25℃，湿度40％-50％，以标准固体饲料喂养。24h自然光暗循环。将小鼠按照体重平均分为2组，分别为对照组和模型组，每组20只。

将dual刀、中性电极板和脚踏开关连接在高频电刀设备上，接通高频电刀电源线，打开电源开关，选择电切模式，调整电压值为5V。

将所有小鼠在电击前禁食24h(不禁水)。

然后，将模型组的小鼠分别进行如下操作处理，对小鼠进行麻醉，并清理小鼠结肠粪便。将模型组麻醉后小鼠放置电极板上，dual刀头端从小鼠肛门伸入小鼠结肠内直至距肛门4cm。控制脚踏开关，使dual刀头端产生瞬时高频电流，对结肠背侧进行电击，电击位置分别为距肛门4cm、3.5cm、3cm、2.5cm及2cm处，共5个点，每周电击1次为一个周期，共进行4个周期。

将对照组的小鼠仅进行如下操作处理，对小鼠进行麻醉，并清理小鼠结肠粪便，将对照组麻醉后小鼠放置电极板上，dual刀头端从小鼠肛门伸入小鼠结肠内直至距肛门4cm，然后直接退出，此过程不进行电击。

所有小鼠处理后自由进食和饮水。

评价试验：

(1)统计学指标：与对照组相比，模型组小鼠结肠组织出现肠纤维化及爬行脂肪比例。

(2)病理学评价：第4周结束后处死小鼠，取材。断颈处死小鼠后，立即剖取结肠，肉眼观察结肠外侧爬行脂肪情况。如发现爬行脂肪则同结肠一块取材，如果没有爬行脂肪，留取整个结肠。所有组织均用4％多聚甲醛固定，常规脱水石蜡包埋，切片后进行组织学染色，通过光学显微镜观察肠纤维化的严重程度。

结果如下：

(1)如图2所示，20只模型组小鼠均存在肠纤维化，大体肉眼观其中有10只出现爬行脂肪(包绕肠管的肠系膜脂肪组织)；如图4所示，对照组均未出现肠纤维化和爬行脂肪。可见，本发明的处理方式，肠纤维化模型构建比例为100％，且爬行脂肪模型构建比例约为50％，具有良好的效果。

(2)病理学评价结果：如图1所示，模型组小鼠结肠Masson染色提示电击部位全层肠纤维化，爬行脂肪出现在肠纤维化部位肠壁的浆膜侧，包绕肠纤维化处的肠壁。如图3所示，对照组未出现肠纤维化及爬行脂肪。可见本发明的电击法具有更高的可控性和稳定性。

本发明通过电击使结肠黏膜、黏膜下层及对应肌层会出现胶原纤维的增生和沉积，模拟肠纤维化的发展过程。我们还发现小鼠结肠纤维化部位出现肠系膜脂肪包绕肠管，能模拟克罗恩病爬行脂肪形成。这一动物模型有助于深入研究肠纤维化相关机制以及爬行脂肪的形成机制及与肠纤维化发生发展的关系。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，包括：对动物结肠进行电击，所述电击包括：

将动物放置在电极板上，将dual刀头端从动物肛门伸入动物结肠内；

使dual刀头端产生瞬时高频电流对结肠的预定位置进行电击；

间隔一段时间再次对动物结肠进行电击，重复多次；

所述动物为小鼠。

2.如权利要求1所述的构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，对结肠背侧位置进行电击，相邻位置间隔一定距离。

3.如权利要求1所述的构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，对结肠背侧多处位置进行电击，所述位置分别为距肛门4cm、3.5cm、3cm、2.5cm及2cm处。

4.如权利要求1所述的构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，每周电击1次，共进行4个周期。

5.如权利要求1所述的构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，电极板为中性电极板。

6.如权利要求1所述的构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，还包括准备操作，所述准备操作包括选择电切模式，调整电压值为4-8V。

7.如权利要求6所述的构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，所述准备操作为接通高频电刀电源线，连接中性电极板、dual刀和脚踏开关，打开电源开关，选择电切模式，调整电压值为5V。

8.如权利要求1所述的构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，所述动物为8-10周龄的雄性小鼠。

9.如权利要求1或8所述的构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法，其特征在于，在电击前对小鼠进行预处理，预处理包括对小鼠进行麻醉，清理小鼠结肠粪便。

10.一种构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的系统，其特征在于，所述系统实现权利要求1-9任一项所述构建肠纤维化和爬行脂肪动物模型的方法；

包括:高频电刀设备、脚踏开关、中性电极板、dual刀，高频电刀设备电源线，dual刀连接线，中性电极板连接线；

所述高频电刀设备用于提供电流，通过dual刀伸入动物的结肠内，发出电流对结肠进行电击，所述电流为4-8V的瞬时高频电流。