CN118043456A - 在同源染色体的一方具有特异性的dna缺失的细胞的制造方法 - Google Patents

在同源染色体的一方具有特异性的dna缺失的细胞的制造方法 Download PDF

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Abstract

发现了通过在同源染色体的特定位点的附近DNA区域产生多个切口，从而能够在同源染色体的一方使超过100bp的DNA缺失。

Description

在同源染色体的一方具有特异性的DNA缺失的细胞的制造 方法
技术领域
本发明涉及利用位点特异性切口酶，制造在同源染色体的一方具有特异性的DNA缺失的细胞的方法。另外，本发明涉及以该DNA缺失为指标评价细胞的同源重组功能的方法。
背景技术
随着TALENs、CRISPR-Cas系统等可编程的核酸酶的出现，现在，基因组编辑技术正在呈现迅速的发展。Cas蛋白质与指导RNA形成复合体，该复合体与具有指导RNA的互补序列的基因组上的靶标位点结合，切割DNA双链的双方。作为上一代的基因组编辑技术的TALENs是以DNA为靶标的TALE蛋白质与切割DNA的核酸酶(主要为FokI)的融合蛋白质，但与CRISPR-Cas系统同样地，在基因组上的靶标位点产生DNA的双链切割。
该DNA的双链切割在通过非同源末端接合而被修复时，产生核苷酸的插入/缺失(insertion/deletion:indel(得失位))，通过移码等而可以进行基因敲除。另一方面，在从细胞外导入成为修复模板的供者DNA的情况下，通过基因组与供者DNA之间的同源重组，可以进行基因敲入。在该基因敲入中，不仅可以产生DNA的插入，还可以产生1～数核苷酸的替换、缺失。
然而，从基因组稳定性的观点考虑，使用可编程的核酸酶的基因组编辑存在大问题。其一是由DNA的双链切割造成的目的外的基因突变的发生。在体细胞中，与利用同源重组的修复相比，利用非同源末端接合的修复是优势的，因而在被基因组编辑系统进行了双链切割的靶标位点，与利用修复模板的敲入相比，更容易产生目的外的突变(indel，得失位)。因此，在实施了基因组编辑的细胞集团中，除了实现了按照目的的敲入的细胞、完全没有发生基因序列的变化的细胞之外，还包含不少发生了由非同源末端接合引起的目的外的突变的细胞。另外，如果从单细胞水平来看，则即使常染色体的等位基因中的1个按照计划被敲入，另一个也有可能发生了目的外的突变。另外，有可编程的核酸酶在与靶标序列类似性高的DNA序列(脱靶)中也产生DNA双链切割，从而产生基因组突变的报告。
于是，本发明者们通过使用使Cas9的2个核酸酶部位中的一个失活了的切口酶型Cas9，利用DNA的单链切割来诱导同源重组，从而开发了与现有的利用DNA的双链切割的方法相比，能够抑制由非同源末端接合造成的目的外的突变(indel，得失位)的发生的方法。其一是通过使用切口酶，在作为靶标的基因组导入2个位置的切口、在包含修复模板的供者质粒导入1个位置的切口，从而利用随机切口法的基因组编辑法(非专利文献1、专利文献1)。另外，本发明者们使该方法进一步发展，还开发了在作为靶标的基因组导入1个位置的切口、在包含修复模板的供者质粒导入1个位置的切口的SNGD法(a combination ofsingle nicks in the target gene and donor plasmid)(专利文献1)。
另一方面，在基因组编辑中，还存在向作为修复模板使用的供者DNA的基因组中的随机整合这样的问题。于是，本发明者们还开发了以细胞中本来存在的同源染色体作为修复模板进行基因组编辑的方法(专利文献2)。通过该基因组编辑，在细胞内的染色体中存在杂合子突变或者复合杂合子突变的情况下，通过在同源染色体之间诱导同源重组，从而可以以不存在该突变的一方的同源染色体作为修复模板，将在另一方的同源染色体中存在的突变修复成正常序列。
在治疗在染色体中存在的杂合子突变中，来自突变等位基因的基因产物阻碍来自正常等位基因的基因产物的功能这样的疾病的目的下，除了利用了这样的同源重组的向正常序列的修复以外，还可考虑使包含这些突变的DNA区域特异性地缺失。
因此，期望开发在抑制目的外的突变发生的同时有效地使同源染色体的一方的特定DNA区域缺失的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2018-11525号公报
专利文献2：国际公开2020/100361号公报
非专利文献
非专利文献1:Nakajima K,et al.,Genome Res.28,223-230,2018
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于这样的状况而做出的，其目的在于提供不进行DNA的双链切割、并且不使用外来的供者DNA、有效地在同源染色体的一方产生特异性的DNA缺失的方法。另外，本发明的目的还在于以该DNA缺失作为指标，提供评价细胞的同源重组功能的方法。
用于解决课题的手段
在细胞内的基因存在杂合子突变的情况下，在同源染色体的一方(将此称为“染色体A”)中存在的基因突变，在同源染色体的另一方(将此称为“染色体B”)不存在。这里，如果能够使染色体A上的包含突变的DNA区域特异性地缺失，则可能治疗由该突变引起的疾病。
本发明者们在同源染色体的突变位点周围以各种方式导入DNA的单链切割，结果发现，通过对于染色体A的突变位点的附近DNA区域的多个位置在DNA两条链或同一DNA链上产生切口，并且对于染色体B，在与染色体A上产生切口的位置对应的位置的1个位置产生切口，从而能够有效地从染色体A使超过100bp的DNA区域缺失(将该方式的切口导入的例子示于图2、图4)。另外，本发明者们发现，在上述方式中，即使在染色体B不产生切口的情况下，也能够有效地从染色体A使超过100bp的DNA区域缺失(将该方式的切口导入的例子示于图3、5)。进而，本发明者们发现，通过使用抑制了参与同源重组的基因(例如，各FANC基因)的功能的细胞，能够使DNA区域的缺失的效率提高。
根据本发明的方法的原理，能够广泛地以在同源染色体之间不同的碱基作为靶标，仅在同源染色体的一方使超过100bp的DNA缺失。另外，根据细胞中的同源重组功能的抑制使DNA缺失的效率提高这样的事实，也能够以该DNA缺失作为指标，评价细胞中的同源重组功能。
本发明是基于这些见解而做出的，更详细地提供以下发明。
(1)在由染色体A和染色体B构成的同源染色体中染色体A具有特异性的DNA缺失的细胞的制造方法，
该方法包括对同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。
(2)根据(1)所述的方法，同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞是FANC基因的功能被抑制了的细胞。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，在同源染色体之间不同的碱基是突变位点的碱基。
(4)根据(1)～(3)的任一项所述的方法，位点特异性切口酶是CRISPR-Cas系统。
(5)用于在(1)所述的方法中使用的试剂盒，
该试剂盒包含对于同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。
(6)根据(5)所述的试剂盒，同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞是FANC基因的功能被抑制了的细胞。
(7)细胞的同源重组功能的评价方法，
该方法包括对由染色体A和染色体B构成的同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，检测由此产生的对染色体A特异性的DNA缺失，
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割，
在对染色体A特异性的DNA缺失产生的频率高于对照的情况下，评价为该细胞的同源重组功能被抑制。
(8)根据(7)所述的方法，细胞是癌细胞。
(9)根据(7)或(8)所述的方法，位点特异性切口酶是CRISPR-Cas系统。
(10)用于在(7)所述的方法中使用的试剂盒，
该试剂盒包含对于由染色体A和染色体B构成的同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。
发明的效果
根据本发明，能够有效地在同源染色体的一方产生特异性的DNA缺失。在本发明的方法中，由于进行DNA的双链切割，因而不易在包含染色体B在内的基因组全体产生的目的外的突变。另外，由于不使用外来的供者DNA，因而也不产生供者DNA的随机整合这样的问题。因此，即使将本发明应用于基因治疗等医疗的情况下，安全性也高。另外，根据本发明，以在同源染色体的一方特异性的DNA缺失作为指标，能够进行细胞的同源重组功能的评价。
附图说明
图1是本发明的方法的概念图(一例)。染色体A的靶标部位a的碱基与染色体B的靶标部位b的碱基是不同的碱基。该例子中，对于染色体A的靶标部位a的附近区域在DNA两条链各一个位置产生切口，对于染色体B在与在染色体A中产生切口的位置对应的位置的一个位置产生切口。由此，在染色体A中DNA片段缺失。
图2是显示在本发明的方法中，对于染色体A的靶标部位a的附近区域在DNA两条链各一个位置产生切口，对于染色体B，在与染色体A中产生切口的位置对应的位置的一个位置产生切口的方式(本发明的第一方式)的例子的图。
图3是显示在本发明的方法中，对于染色体A的靶标部位a的附近区域在DNA两条链各一个位置产生切口，对于染色体B，在与染色体A中产生切口的位置对应的位置不产生切口的方式(本发明的第二方式)的例子的图。
图4是显示在本发明的方法中，对于染色体A的靶标部位a的附近区域在同一DNA链上两位置产生切口，对于染色体B，在与染色体A中产生切口的位置对应的位置的一个位置产生切口的方式(本发明的第三方式)的例子的图。
图5是显示在本发明的方法中，对于染色体A的靶标部位a的附近区域在同一DNA链上两位置产生切口，对于染色体B，在与染色体A中产生切口的位置对应的位置不产生切口的方式(本发明的第四方式)的例子的图。
图6A是显示使用PCR引物组L-AS15s或PCR引物组L-AS15s而得的PCR产物与切口的位置关系的图。(a)显示PCR引物组L-AS15s与sgRNA TKex4_20s和sgRNA AS15的切口，(b)显示PCR引物组L-AS15s与sgRNA TKex4_20s和sgRNA S8的切口，(c)显示PCR引物组L-AS15l与sgRNA TKex4_20s和sgRNA AS15的切口，(d)显示PCR引物组L-AS15l与sgRNA TKex4_20s和sgRNA S8的切口。(a)和(c)的切口是图2中显示的方式(本发明的第一方式)的例子，(b)和(d)的切口是图4中显示的方式(本发明的第三方式)的例子。
图6B是使用PCR引物组L-AS15s，鉴定了DNA缺失产生了的细胞克隆时的电泳图像。(a)显示用sgRNA TKex4_20s和sgRNA AS15导入了切口的结果，(b)显示用sgRNA TKex4_20s和sgRNA S8导入了切口的结果。
图6C是显示仅在一方的同源染色体检测到了600bp以上的缺失的细胞克隆的比例的图。各实验每个使用94克隆，重复三次进行实验。
图7A是显示使用PCR引物组L-TKex57而得的PCR产物与切口的位置关系的图。(a)显示PCR引物组L-TKex57与sgRNA TKex5_m4s和sgRNA TKex7_105s的切口，(b)显示PCR引物组L-TKex57与sgRNA TKex5_m4s和sgRNA TKex7_mut121s的切口。(a)的切口是图4中显示的方式(本发明的第三方式)的例子，(b)的切口是图5中显示的方式(本发明的第四方式)的例子。
图7B是仅在一方的同源染色体上检测到了500bp以上的缺失的细胞克隆的比例的图。各实验每个使用94克隆，重复三次进行实验。
图8A是显示使用PCR引物组L-S14而得的PCR产物与切口的位置关系的图。显示PCR引物组L-S14与sgRNA S14和sgRNA TKex4_20s的切口。本图的切口是图4中显示的方式(本发明的第三方式)的例子。
图8B是使用PCR引物组L-S14鉴定了DNA缺失产生了的细胞克隆时的电泳图像。(a)显示在FANCA突变细胞中用sgRNA TKex4_20s和sgRNA S14导入了切口的结果，(b)显示在作为亲代细胞的TK6261中用sgRNA TKex4_20s、sgRNA S14导入了切口的结果。
图8C是显示仅在一方的同源染色体中检测到了1000bp以上的缺失的细胞克隆的比例的图。各实验每个使用94克隆，重复三次进行实验。
图9A是使用PCR引物组L-S14鉴定了DNA缺失产生了的细胞克隆时的电泳图像。(a)上显示在通过植物生长素诱导而使FANCS蛋白质消失了的细胞中，用sgRNA TKex4_20s和sgRNA S14导入了切口的结果，下显示未进行植物生长素诱导的细胞(对照)中的结果。(b)上显示在通过植物生长素诱导而使FANCS蛋白质消失了的细胞中，用sgRNA TKex4_20s和sgRNA S14导入了切口的结果，下显示未进行植物生长素诱导的细胞(对照)中的结果。
图9B是显示仅在一方的同源染色体中检测到了1000bp以上的缺失的细胞克隆的比例的图。(a)显示通过植物生长素诱导而使FANCS蛋白质消失了的细胞(AUX(+))或未进行植物生长素诱导的细胞(AUX(-))(对照)中的结果。(b)显示通过植物生长素诱导而使FANCD1蛋白质消失了的细胞(AUX(+))或未进行植物生长素诱导的细胞(AUX(-))(对照)中的结果。各实验每个使用94克隆，重复三次进行实验。
具体实施方式
1.制造具有DNA缺失的细胞的方法、和试剂盒
本发明提供制造在由染色体A和染色体B构成的同源染色体中，染色体A具有特异性的DNA缺失的细胞的方法。
在本发明的方法中，包括对同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合。
在本发明中，同源染色体的特定位点中的“在同源染色体之间不同的碱基”可以是一个碱基，也可以是多个碱基(碱基序列)。另外，可以是突变，也可以是多态性。作为突变，可列举例如，替换、缺失、插入、或它们的组合，作为多态性，可列举例如，单碱基多态性、微卫星多态性。另外，该碱基既可以存在基因编码区域，也可以存在于基因非编码区域。
另外，在本发明中，既可以对于同源染色体中特定部位具有突变、多态性的染色体，产生包含该突变、多态性的DNA的缺失，也可以在另一方的染色体中产生对应的DNA的缺失。
从医疗上的有用性的观点考虑的典型的本发明的利用方案是，为了治疗或预防由杂合子突变引起的人的疾病，而使人细胞中的包含该突变的DNA缺失。作为成为治疗或预防的对象的杂合子突变，例如，优选功能获得型突变或显性负性型突变。这里作为“由杂合子突变引起的疾病”，可列举例如，采取常染色体显性遗传形式的通过常染色体杂合子突变而发病的疾病(例如，先天性免疫缺陷病中的OAS1异常症、由ELANE突产生的重症先天性中性粒细胞减少症、慢性皮肤粘膜念珠菌病、遗传性运动感觉和自主神经病IIC型、后突触性慢通道型先天性肌无力症、帕金森病8型、微管聚集性肌病、甲状腺素抵抗综合征、高IgE症候群、勒斯-当洛斯(Ehlers-Danlos)综合征、胶原蛋白异常症(成骨不全病、营养不良型表皮水疱症、II型胶原蛋白异常症等)、视网膜色素变性症、软骨发育不全症等)、采取常染色体显性遗传形式的三联体重复病(例如，亨廷顿病、脊髓小脑失调症、强直性肌营养不良、弗里德赖希共济失调症、眼咽型肌营养不良等)等，但不限于这些。
作为本发明中使用的“位点特异性切口酶”，只要是能够在基因组上位点特异性地对DNA进行单链切割的就不限制，但优选以切口酶型Cas蛋白质作为构成要素的CRISPR-Cas系统。Cas蛋白质通常包含参与靶标链的切割的结构域(RuvC结构域)和参与非靶标链的切割的结构域(HNH结构域)，但切口酶型Cas蛋白质典型地通过这2个结构域的任一结构域的突变而丧失其切割活性。作为这样的突变，在spCas9蛋白质(酿脓链球菌(S.pyogenes)来源的Cas9蛋白质)的情况下，可列举例如，N末端起第10位的氨基酸(天冬氨酸)向丙氨酸的突变(D10A：RuvC结构域内的突变)、N末端起第840位的氨基酸(组氨酸)向丙氨酸的突变(H840A：HNH结构域内的突变)、N末端起第863位的氨基酸(天冬酰胺)向丙氨酸的突变(N863A：HNH结构域内的突变)、N末端起第762位的氨基酸(谷氨酸)向丙氨酸的突变(E762A：RuvCII结构域内的突变)、N末端起第986位的氨基酸(天冬氨酸)向丙氨酸的突变(D986A：RuvCIII结构域内的突变)。此外，各种来源的Cas9蛋白质是公知的(例如，WO2014/131833)，可以利用它们的切口酶型。此外，Cas9蛋白质的氨基酸序列和碱基序列在公开的数据库、例如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中登记(例如，登记号：Q99ZW2.1等)，本发明中可以利用这些序列。
另外，本发明中还可以利用除Cas9以外的Cas蛋白质，例如，Cpf1(Cas12a)、Cas12b、CasX(Cas12e)、Cas14等。作为切口酶型Cpf1蛋白质中的突变，例如，在AsCpf1(Cas12)中，可列举N末端起第1226位的氨基酸(精氨酸)向丙氨酸的突变(R1226A：Nuc结构域内的突变)。Cpf1的氨基酸序列在公开的数据库、例如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中登记(例如，登记号：WP_021736722、WP_035635841等)。
作为构成CRISPR-Cas系统的蛋白质，例如，可以使用添加了核定位信号的。
在以切口酶型Cas蛋白质为构成要素的CRISPR-Cas系统中，切口酶型Cas蛋白质与指导RNA结合而形成复合体，以靶标DNA序列为靶标而将DNA单链切割。在CRISPR-Cas9系统中，指导RNA包含crRNA和tracrRNA，但在CRISPR-Cpf1系统中不需要tracrRNA。CRISPR-Cas9系统中的指导RNA可以是包含crRNA和tracrRNA的单分子指导RNA，也可以是由crRNA片段和tracrRNA片段组成的双分子指导RNA。
crRNA包含相对于靶标DNA序列互补的碱基序列。靶标DNA序列通常是由12～50碱基、优选17～30碱基、更优选17～25碱基组成的碱基序列，优选从与PAM(proto-spaceradjacent motif，前间区序列临近基序)序列邻接的区域选择。典型地，DNA的位点特异性切割在通过crRNA与靶标DNA序列的之间的碱基对形成的互补性、和与其邻接而存在的PAM双方决定的位置产生。
在大量的CRISPR-Cas系统中，crRNA进一步在3’侧包含能与tracrRNA片段相互作用(杂交)的碱基序列。另一方面，tracrRNA在5’侧包含能与crRNA的一部分碱基序列相互作用(杂交)的碱基序列。通过这些碱基序列的相互作用，crRNA/tracrRNA(单分子或双分子)形成双链RNA，所形成的双链RNA与Cas蛋白质相互作用。
PAM根据Cas蛋白质的种类、来源不同而不同。典型的PAM序列例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)来源的Cas9蛋白质(II型)中为“5’-NGG”，在硫矿硫化叶菌(S.solfataricus)来源的Cas9蛋白质(I-A1型)中为“5’-CCN”，在硫矿硫化叶菌(S.solfataricus)来源的Cas9蛋白质(I-A2型)中为“5’-TCN”，在H.walsbyl来源的Cas9蛋白质(I-B型)中为“5’-TTC”，在大肠杆菌(E.coli)来源的Cas9蛋白质(I-E型)中为“5’-AWG”，在大肠杆菌(E.coli)来源的Cas9蛋白质(I-F型)中为“5’-CC”，在绿脓杆菌(p.aeruginosa)来源的Cas9蛋白质(I-F型)中为“5’-CC”，在嗜热乳链球菌(S.Thermophilus)来源的Cas9蛋白质(II-A型)中为“5’-NNAGAA”，在无乳链球菌(S.agalactiae)来源的Cas9蛋白质(II-A型)中为“5’-NGG”，在金黄色葡萄球菌(S.aureus)来源的Cas9蛋白质中为“5’-NGRRT”或“5’-NGRRN”，在脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)来源的Cas9蛋白质中为“5’-NNNNGATT”，在龋垢密螺旋体(T.denticola)来源的Cas9蛋白质中为“5’-NAAAAC”。在Cpf1中典型地为“5’-TTN”或“5’-TTTN”。此外，也可以通过改变蛋白质(例如，突变的导入)，来改变PAM识别(Benjamin,P.等,Nature 523,481-485(2015)、Hirano,S.等,Molecular Cell 61,886-894(2016)、Walton,R.T.等，Science368，290-296(2020))。
本发明中，也可以利用除了CRISPR-Cas系统以外的位点特异性切口酶。作为这样的位点特异性切口酶，可列举例如，与具有切口酶活性的酶融合而成的人工核酸酶。作为人工核酸酶，可以利用例如，TALE(转录激活因子样效应物，transcription activator-likeeffector)、ZF(锌指，zinc finger)、PPR(三角状五肽重复，pentatricopeptide repeat)。作为能够通过与这些人工核酸酶的融合而发挥切口酶活性的酶，可列举例如，TevI(NatCommun.2013；4:1762.doi:10.1038/ncomms2782)。这些人工核酸酶通过与识别特定的碱基(或者特定的碱基序列)的模件(肽)连接而构建的DNA结合结构域，从而以靶标DNA序列作为靶标，通过融合于该DNA结合结构域的切口酶，将DNA单链切割。也可以在人工核酸酶中的DNA结合结构域与切口酶的之间导入适当的间隔肽。
在本发明中，对于同源染色体的一方(即，染色体A)在上述特定位点(在同源染色体之间不同的碱基)的附近DNA区域的多个位置进行单链切割。在一个方式中，将上述附近DNA区域的DNA两条链进行单链切割，在其他方式中，将上述附近DNA区域的同一DNA链上的多个位置进行单链切割。另外，在本发明中，对于同源染色体的另一方(即，染色体B)，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置(以下，仅称为“对应位置”)的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。因此，本发明包含以下的方式。
第一方式：对于染色体A，在上述附近DNA区域的DNA两条链进行单链切割，对于染色体B，在对应位置的1个位置进行单链切割(图2)。
第二方式：对于染色体A，将上述附近DNA区域的DNA两条链进行单链切割，对于染色体B，在对应位置不进行单链切割(图3)。
第三方式：对于染色体A，将上述附近DNA区域的同一DNA链在多个位置进行单链切割，对于染色体B，在对应位置的1个位置进行单链切割(图4)。
第四方式：对于染色体A，将上述附近DNA区域的同一DNA链在多个位置进行单链切割，对于染色体B，在对应位置不进行单链切割(图5)。
这里所谓“附近DNA区域”，是指距离特定位点通常100000碱基以内(例如，10000碱基以内、5000碱基以内、2000碱基以内、1000碱基以内、600碱基以内)的区域。另外，导入的切口之间的距离通常为100碱基以上(例如，200碱基以上、300碱基以上、500以上、700碱基以上、1000碱基以上、1500碱基以上)。导入染色体的切口中的一个优选在该特定位点的最近。这里所谓“最近”，通常为100碱基位内、更优选为50碱基以内(例如，40碱基以内、30碱基以内、20碱基以内、10碱基以内)。
作为具体的方式的例子，对于染色体A，可列举夹着上述特定位点而在DNA两条链各1个位置进行单链切割的方式(图2的2-1、2-2、2-7、2-8)、夹着上述特定位点在同一DNA链上各1个位置进行单链切割的方式(图4的4-3～4-6)、在上述特定位点的单侧的DNA两条链各1个位置进行单链切割的方式(图2的2-3～2-6)、和在上述特定位点的单侧的同一DNA链上2位置进行单链切割的方式(图4的4-1、4-2、4-7、4-8)。另外，在1个特定位点的附近DNA区域也可以存在其他特定位点(在同源染色体之间不同的碱基)(图3、图5)。在这种情况下，如果以加入多个特定位点的方式导入切口，则可以在染色体A中使包含多个特定位点的DNA缺失。另外，在染色体A中，被单链切割的位置可以为3个位置以上。
在构成同源染色体的2条染色体(即，染色体A和染色体B)中，将对应的位置同时进行单链切割的情况下，可以将与染色体A的靶标DNA序列结合的位点特异性切口酶设计成与染色体B的对应DNA序列也结合那样。这种情况下，染色体A的靶标DNA序列与染色体B的对应DNA序列典型地是相同的DNA序列。
在构成同源染色体的2条染色体中，在染色体A产生被特异性地单链切割的位置的情况下，可以以不与染色体B的对应DNA序列结合的方式，设计与染色体A的靶标DNA序列结合的位点特异性切口酶。该情况下，染色体A的靶标DNA序列与染色体B的对应DNA序列是不同的DNA序列。例如，如果以染色体A中包含特定位点的碱基(在同源染色体之间不同的碱基)的方式，设计位点特异性切口酶的靶标DNA序列，则该靶标DNA序列成为与染色体B的对应DNA序列不同的DNA序列。在位点特异性切口酶是CRISPR-Cas系统的情况下，可以以与染色体A的靶标DNA序列特异性地结合的方式设计指导RNA。另外，在位点特异性切口酶是与具有切口酶活性的酶融合而成的人工核酸酶的情况下，可以以对染色体A的靶标DNA序列具有结合特异性的方式设计DNA结合结构域。在该方式中，位点特异性切口酶的设计上，被单链切割的位点距离上述特定位点(在同源染色体之间不同的碱基)通常为100碱基位内、更优选为50碱基以内(例如，40碱基以内、30碱基以内、20碱基以内、10碱基以内)。
在本发明中，通过组合上述位点特异性核酸酶，从而可以以各种各样的模式(在图2～5中例示)进行同源染色体的单链切割。
此外，在本发明中，对于染色体A在DNA的两条链进行单链切割的情况(本发明的第一方式和第二方式、图2、3)下，如果单链切割的距离过近则会产生双链切割。因此，位于不同的DNA链上的单链切割位置的距离通常为100碱基以上、优选为200碱基以上。
在本发明中，将上述位点特异性切口酶的组合导入细胞。在被导入细胞的“位点特异性切口酶”是CRISPR-Cas系统的情况下，例如，可以是指导RNA与Cas蛋白质的组合的方式，也可以是指导RNA与被翻译成Cas蛋白质的信使RNA的组合的方式，也可以是表达它们的载体的组合的方式。指导RNA也可以进行用于抑制分解的修饰(化学修饰等)。在被导入细胞的“位点特异性切口酶”是与具有切口酶活性的酶融合而成的人工核酸酶的情况下，例如，可以是蛋白质的方式，也可以是被翻译成该蛋白质的信使RNA的方式，也可以是表达该蛋白质的载体的方式。
在采用表达载体的方式的情况下，包含与要表达的DNA可工作地结合的1种以上的调节元件。这里，“可工作地结合”是指上述DNA能够表达地与调节元件结合。作为“调节元件”，可列举启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如，转录终止信号、例如，多聚腺苷化信号和多聚U序列)。作为调节元件，根据目的，例如，可以是指向多样的宿主细胞中的DNA的结构性表达的，也可以是仅指向特定的细胞、组织、或者器官中的DNA的表达的。另外，可以是仅在特定的时期指向DNA的表达的，也可以是指向能人工地诱导的DNA的表达的。作为启动子，可列举例如，polIII启动子(例如，U6和H1启动子)、polII启动子(例如，作为反转录病毒的劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、和EF1α启动子)、polI启动子、或它们的组合。只要是本领域技术人员，就能够根据要导入的细胞的种类等选择适当的表达载体。
作为应用本发明的方法的“细胞”，只要具有同源染色体，就不特别限定，可以以各种各样的真核细胞作为对象。
作为“真核细胞”，可列举例如，动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞。另外作为动物细胞，可列举例如，哺乳动物细胞，以及鱼类、鸟类、爬行类、两栖类、昆虫类的细胞。
“动物细胞”包括例如，构成动物的个体的细胞、构成由动物摘出的器官或组织的细胞、来源于动物的组织的培养细胞等。具体地，可列举例如，各阶段的胚的胚细胞(例如，1个细胞期胚、2细胞期胚、4细胞期胚、8细胞期胚、16细胞期胚、桑葚期胚等)；诱导多能性干(iPS)细胞、胚胎干(ES)细胞、造血干细胞等干细胞；成纤维细胞、造血细胞、神经元、肌肉细胞、骨细胞、肝细胞、胰脏细胞、脑细胞、肾细胞等体细胞等。基因组编辑动物的制成中可以使用受精后的卵母细胞、即受精卵。特别优选受精卵为原核期胚的。受精前的卵母细胞可以将冷冻保存的解冻使用。
本发明中“哺乳动物”是包含人和非人哺乳动物的概念。作为非人哺乳动物的例子，可列举牛、野猪、家猪、绵羊、山羊等偶蹄类、马等奇蹄类、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、松鼠等啮齿类、兔等兔目、狗、猫、鼬等食肉类等。上述非人哺乳动物可以是家畜或伴侣动物(宠物)，也可以是野生动物。
作为“植物细胞”，可列举例如，谷物类、油料作物、饲料作物、水果、蔬菜类的细胞。“植物细胞”包含例如，构成植物的个体的细胞、构成从植物分离的器官或组织的细胞、来源于植物的组织的培养细胞等。作为植物的器官或组织，可列举例如，叶、茎、茎尖(生长点)、根、块茎、块根、种子、愈伤组织等。作为植物的例子，可列举稻、玉米、香蕉、花生、向日葵、番茄、拟南芥、烟草、小麦、大麦、马铃薯、大豆、棉花、康乃馨等。
作为在本发明的方法(特别是后述的本发明的第三方式(图4)和第四方式(图5))中使用的细胞，优选使用FANC基因的功能被抑制了的细胞。作为FANC基因，除了FANCA基因之外，可列举FANCB基因、FANCC基因、FANCD1(BRCA2)基因、FANCD2基因、FANCS(BRCA1)基因等家族基因。典型的人来源的FANCA基因的碱基序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列在数据库(登记号：NM_000135、NP_000126)中公开，典型的人来源的FANCB基因的碱基序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列在数据库(登记号：NM_001018113、NP_001018123)中公开，典型的人来源的FANCC基因的碱基序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列在数据库(登记号：NM_000136、NP_000127)中公开，典型的人来源的FANCD1基因的碱基序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列在数据库(登记号：NM_000059、NP_000050)中公开，典型的人来源的FANCD2基因的碱基序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列在数据库(登记号：NM_001018115、NP_001018125)中公开，典型的人来源的FANCS基因的碱基序列和由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列在数据库(登记号：NM_007294、NP_009225)中公开。
本发明中的“FANC基因的功能的抑制”，其机制可以是基因的翻译产物(蛋白质)的活性的抑制，也可以是基因的表达的抑制。基因的翻译产物(蛋白质)的活性的抑制可以通过例如，向该基因的突变(缺失、替换、插入等)的导入、抑制剂处理来进行。
向FANC基因的突变导入，例如，可以利用基因组编辑系统来进行。作为基因组编辑系统，可列举例如，以FANC基因作为靶标的CRISPR-Cas(例如，CRISPR-Cas9)、TALENs、ZFNs等位点特异性人工核酸酶等。通过基因组编辑系统的作用，基因在靶标部位被切割，介由细胞的DNA修复机制而在基因中导入突变(碱基的缺失、插入等)。在通过突变的导入而使基因缺损的情况下，缺损可以是基因全体的缺损，也可以是部分的缺损。
作为FANC抑制剂，可考虑例如，具有抑制FANC的单链退火活性、链交换活性的分子(关于FANC的活性，请参照例如，Benitez，A.等，Mol Cell 16；71(4),621-628(2018))。
“FANC基因的功能的抑制”另外可以通过该基因的表达的抑制来进行。FANC基因的表达的抑制既可以是基因的翻译的抑制，也可以是转录的抑制。FANC基因的翻译的抑制例如，可以利用结合于FANC基因的转录产物的双链RNA(dsRNA)来进行。作为双链RNA，可列举例如，siRNA、shRNA(short haipin RNA，短发夹RNA)、miRNA等。FANC基因的转录的抑制例如，可以通过向FANC基因的表达控制区域的突变导入来进行。突变的导入可以利用以该表达控制区域为靶标的上述的基因组编辑系统。FANC基因的表达是否被抑制，在翻译水平上可以通过例如利用了与翻译产物结合的抗体的免疫测定法来评价，在转录水平上可以通过例如RT-PCR法、RNA印迹法来评价。
对于这些用于抑制FANC基因的功能的分子，可以将该分子自身导入细胞，另外在该分子是核酸的情况下，为了使其在细胞内表达，也可以将编码该分子的DNA(典型地为插入有该DNA的载体)导入细胞。
位点特异性切口酶、抑制FANC基因的功能的分子向细胞的导入可以通过例如，电穿孔、显微注射、DEAE-葡聚糖处理、脂质体转染、纳米颗粒介导的转染、病毒介导的核酸递送等公知的方法来进行。
向细胞的导入之后，位点特异性切口酶的组合对于染色体A的特定部位的附近DNA区域在多个位置进行单链切割，该染色体中包含特定部位的DNA缺失。根据本发明，可以高效率地制造产生了这样的DNA缺失的细胞。这里所谓“高效率”，优选为3％以上、更优选为5％以上、特别优选为10％以上(例如，20％以上、30％以上、35％以上)。
另外，本发明提供用于在上述本发明的方法中使用的试剂盒，该试剂盒包含上述位点特异性切口酶的组合。有时该试剂盒进一步包含一种或多种追加的试剂，作为追加的试剂，可列举例如，稀释缓冲液、再构成溶液、洗涤缓冲液、核酸导入试剂、蛋白质导入试剂、对照试剂(例如，对照的指导RNA)，但不限于这些。该试剂盒还可以包含用于实施本发明的方法的使用说明书。
2.评价细胞的同源重组功能的方法、和试剂盒
本发明另外提供评价细胞的同源重组功能的方法。
在本发明中判明了，通过使用抑制了参与同源重组的基因的功能的细胞，从而DNA区域的缺失的效率显著提高。因此，以该DNA缺失作为指标，能够评价细胞中的同源重组功能。
在本发明的方法中，与上述“1.”同样地，包括对由染色体A和染色体B构成的同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，在由此产生的染色体A中检测特异性的DNA缺失。
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。
位点特异性切口酶的组合优选为，对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割的方式(第三方式、图4)；和对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割为该附近DNA区域的同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置不进行单链切割的方式(第四方式、图5)。
此外，评价本发明中的细胞的同源重组功能的方法，对于由染色体A和染色体B构成的同源染色体，也可以通过在染色体A的同一DNA链上的多个位置进行单链切割，在染色体B上与染色体A中被单链切割的位置对应的多个位置进行单链切割的方式实施。这种情况下，单链切割未必要在同源染色体之间不同的碱基的附近DNA区域导入，可以在任意的DNA区域导入。
在本发明的方法中，在对染色体A特异性的DNA缺失产生的频率高于对照的情况下，评价为该细胞的同源重组功能被抑制。这里所谓“高于对照的情况”，优选为对照的2倍以上、更优选为5倍以上、特别优选为10倍以上(例如，20倍以上)的频率。如果用绝对的频率显示，则优选为4％以上、更优选为10％以上、特别优选为20％以上(例如，40％以上)的频率(请参照实施例(2)(b)、图9B)。作为对照，可以使用同源重组功能未被抑制的细胞中的频率。
同源重组功能的抑制例如，可以通过参与同源重组的基因的功能的抑制(例如，基因突变)而产生。因此，在通过本发明评价为同源重组功能被抑制了的细胞中，参与同源重组的基因的功能的抑制被怀疑。作为参与同源重组的基因，可列举例如，上述的FANC基因。
已知同源重组功能的抑制成为癌的原因，因此本发明的方法可以以各种各样的癌细胞(例如，乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胰癌等细胞)作为对象。
FANCS/FANCD1(BRCA1/BRCA2)是遗传性青年性乳癌、卵巢癌的致病基因，另外，在生殖细胞系列中不具有FANCS/FANCD1突变的乳癌患者、卵巢癌患者的癌细胞中大量确认了FANCS/FANCD1的功能异常、表达降低。FANCS/FANCD1的功能异常、表达降低不仅由于基因突变而产生，也由于由启动子甲基化造成的表达抑制等而产生，因此仅仅基因检查是不充分的。本发明无论同源重组功能被抑制的原因如何，都能够作为结果评价同源重组功能是否被抑制，这点比以往的基因检查优异。另一方面，同源重组功能的抑制的评价可以使用利用了报告基因的评价系统，但将这样的评价系统在患者来源的癌细胞中实施是困难的。本发明的方法在不需要报告基因、能够直接利用患者来源的癌细胞的方面也是优异的。
现在，组合了同源重组缺失特征性的基因组变化的频率测定与上述FANC基因(BRCA基因)的突变检查的称为MyChoice(Myriad社)的检查法已经实用化，基于该检查结果判断可否使用药剂(PARP抑制剂)。因此，利用本发明的方法的癌细胞中的同源重组功能的评价，也可以作为患者中的抗癌剂的有效性的评价利用。
另外，本发明提供用于在上述本发明的方法中使用的试剂盒，是包含上述位点特异性切口酶的组合的试剂盒。该试剂盒有时进一步包含一个或多个追加的试剂，作为追加的试剂，可列举例如，稀释缓冲液、再构成溶液、洗涤缓冲液、核酸导入试剂、蛋白质导入试剂、对照试剂(例如，对照的指导RNA)，但不限于这些。该试剂盒可以包含用于实施本发明的方法的使用说明书。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
[材料与方法]
A.材料
(1)TK6261细胞
是TK6细胞来源的淋巴母细胞。包含：具有由胸苷激酶1基因(17号染色体)的exon4上的1bp插入产生的功能丧失型移码的等位基因A(染色体A)；和具有由exon5上的8bp缺失产生的功能丧失型移码和不影响功能的exon7上的1bp插入的等位基因B(染色体B)。
(2)FANCA突变TK6261细胞
是TK6261细胞的FANCA基因exon27的两等位基因发生缺失突变，使FANCA功能消失了的细胞。
(3)TSCER2(TIR)细胞
是胸苷激酶1(TK1)基因形成了复合杂合子的TK6来源的细胞。TK1exon4的突变与TK6261细胞相同。通过植物生长素添加而TIR1表达，添加有AID标签的蛋白质被分解。
(4)FANCS蛋白质消失TSCER2(TIR)细胞
TSCER2(TIR)-FANCSAID/AID是以在两等位基因的FANCS(BRCA1)基因C末敲入植物生长素诱导降解子(AID)标签，表达FANCS-AID的方式进行了改变的细胞。通过植物生长素(AUX)添加能够使FANCS(BRCA1)蛋白表达消失。
(5)FANCD1蛋白质消失TSCER2(TIR)细胞
TSCER2(TIR)-FANCD1AID/AID是以在两等位基因的FANCD1(BRCA2)基因C末敲入植物生长素诱导降解子(AID)标签，表达FANCD1-AID的方式进行了改变的细胞。通过植物生长素(AUX)添加能够使FANCD1(BRCA2)蛋白表达消失。
B.方法
将1.0mg/mL Cas9D10A mRNA(TriLink CleanCap Cas9 Nickase mRNA(5moU)-(L-7207))0.9μL、2种100nmol/mL的sgRNA各0.45μL、和Neon Transfection System R buffer2.2μL混合，进而混合悬浮在R buffer中的14×104个/μL的TK6261细胞10μL。对其中10μL，使用Neon Transfection System，在Voltage 1500V、Width 10ms Pulse 3pulses的条件下实施电穿孔。
使用的sgRNA是以下的(名称：靶标序列。[]内显示PAM序列)。
TKex4_20s：CGTCTCGGAGCAGGCAGGCG[GGG]/序列号1
S8：AGCTTCCCATCTATACCTCC[TGG]/序列号2
AS15：GAGGTAGGTTGATCTTGTGT[GGG]/序列号3
S14：TCCCACCGAAGGCCACACGC[CGG]/序列号4
TKex5_mut4s：CTCGCAGAACTCCAGGGAAC[TGG]/序列号5
TKex7_105s：CCCCTGGCTTTCCTGGCACT[GGG]/序列号6
TKex7_mut121s：TGGCAGCCACGGCTTCCCCC[TGG]/序列号7
此外，TKex4_20s是仅以等位基因A上的exon4为靶标的sgRNA，S8是以两等位基因的intron4为靶标的sgRNA，AS15是以两等位基因的intron4为靶标的sgRNA，S14是以两等位基因的intron3为靶标的sgRNA，TKex5_mut4s是仅以等位基因B上的exon5为靶标的sgRNA，TKex7_105s是以两等位基因的exon7为靶标的sgRNA，TKex7_mut121s是仅以等位基因B上的exon7为靶标的sgRNA。
电穿孔后的细胞在10％马血清+200μg/ml丙酮酸钠/RPMI1640培养基中以37℃、5％CO2过夜培养，然后在5％马血清+200μg/ml丙酮酸钠/RPMI1640培养基(基本培养基)中以37℃、5％CO2进行1周培养。
以培养后的细胞作为对象，使用FACS AriaIII(BD)，在每1孔分注了200μL的基本培养基的96孔板以1个细胞/孔的方式进行了分拣。在约1周的培养之后，采集增殖了的1个细胞来源的克隆94克隆，使用简易DNA提取试剂盒Version 2(カネカ)提取基因组DNA。另外，与此不同地，从不进行分拣而继续培养而得的细胞中，使用培养细胞基因组DNA提取试剂盒VI(ANIMOS)提取基因组DNA。
以从1个细胞来源的克隆提取的DNA作为模板，利用KOD FX Neo(TOYOBO)进行PCR。在以sgRNA TKex4_20s、sgRNA S8和sgRNA AS15的靶标序列包含在PCR产物(全长约2.1kbp)中的方式设计出的PCR中使用引物组L-AS15s；在以sgRNA TKex4_20s、sgRNA S8和sgRNAAS15的靶标序列包含在PCR产物(全长约4.3kbp)中的方式设计出的PCR中使用引物组L-AS15l；在以sgRNA TKex4_20s和sgRNA S14的靶标序列包含在PCR产物(全长约约5.4kbp)中的方式设计出的PCR中使用引物组L-S14，以及在以sgRNA TKex5_mut4s、sgRNA TKex7_105s和sgRNA TKex7_mut121s的靶标序列包含在PCR产物(全长约1.9kbp)中的方式设计出的PCR中引物组L-TKex57。PCR中使用的引物的序列如下。
L-AS15s(正向)：GCCTTTCCCATAGGTGCTAACT/序列号8
L-AS15s(反向)：AACAAAACACACTCTGGAAGATGGAACC/序列号9
L-AS15l(正向)：CACAAGGCACAGGACACACTGTTAG/序列号10
L-AS15l(反向)：AACAAAACACACTCTGGAAGATGGAACC/序列号11
L-S14(正向)：GAGTACTCGGGTTCGTGAACTT/序列号12
L-S14(反向)：GCAGCTTCCCATCTATACCTCC/序列号13
L-TKex57(正向)：AAGCCCTCACGTCTCAATAACC/序列号14
L-TKex57(反向)：GCTTTAAGCAGACCAGTGGGTA/序列号15
PCR产物在0.9％TAE凝胶中进行电泳，将PCR产物的碱基长可视化。
将显示数100bp以上的缺失的PCR产物的一部进行切胶纯化，进行exon4区域的DNA序列分析。
首先，以从1个细胞来源的克隆提取的DNA作为模板，利用KOD plus neo(TOYOBO)进行PCR。对以sgRNA TKex4_20s的靶标序列为中心的344bp的区域(Exon4区域)使用引物组S-EX4，对以sgRNA S8和sgRNA AS15的靶标序列作为中心的297bp的区域(S8/AS15区域)使用引物组S-AS15。
S-EX4(正向)：TTTTCTGGACGAGGGCCTTTC/序列号16
S-EX4(反向)：CTTCCAAGTCAGCGAGGGAAAA/序列号17
S-AS15(正向)：CCTCATGGTTCCTTTTGCTTG/序列号18
S-AS15(反向)：GGTGGGAAAATCGCTTGAAT/序列号19
接着，通过桑格尔测序法分析PCR产物的DNA序列。序列引物的序列如下。
Exon 4区域：TGAACACTGAGCCTGCTT/序列号20
S8/AS15区域：CGTTTATTTTCTTGTTG/序列号21
[实施例]
(1)切口的导入模式对大规模DNA缺失的影响的分析
(a)作为已知的方法，在使用sgRNA TKex4_20s与sgRNA_AS15的组合和Cas9，在等位基因A中引入了DNA双链切割2处，在等位基因B中引入了DNA双链切割1处的情况下，仅在1等位基因中发生了600bp以上的缺失的细胞为32.3％±5.4％(以n＝94进行三重实验)(图6C“TKex4_20s/AS15(DSB)”)。在使用sgRNA TKex4_20s与sgRNA_AS15的组合和Cas9D10A，在等位基因A的各DNA链引入了1处切口、在等位基因B的反义链引入了1处切口的情况下，仅在1等位基因中发生了600bp以上的缺失细胞为39.4％±2.8％(以n＝94进行三重实验)，与使用了DNA双链切割2处的方法为同等(图6A(a)、B(a)、C“TKex4_20s/AS15(Nick)”)。另一方面，使用sgRNA TKex4_20s与sgRNA_S8的组合和Cas9D10A，在等位基因A的正义链上随机引入了2处切口、在等位基因B的正义链引入了1处切口的情况下，仅在1等位基因中发生了600bp以上的缺失细胞为0.35％±0.61％(以n＝94进行三重实验)，缺失的频率低(图6A(b)、B(b)、C“TKex4_20s/S8(Nick)”)。显示了在使用切口的情况下，通过使DNA双链的两方发生切口，能够高效率地实现达到数100bp的DNA删除。
在使用了sgRNA TKex4_20s与sgRNA_AS15的组合物、和Cas9D10A的情况下得到的111克隆中，通过Exon4区域的桑格尔测序仅检测到野生型序列(等位基因B的序列)的克隆为100克隆。对于剩余的11克隆进行了使用引物组L-AS15s进行的PCR，将显示数100bp以上的缺失的PCR产物切胶纯化。分析了该PCR产物所包含的exon4区域的DNA序列。在全部11克隆中确认了仅包含exon4的突变型序列(等位基因A的序列)。由这些结果显示，缺失在发生了2个切口的等位基因A中特异性地发生了。
实施了仅1个等位基因检测到了＞600bp以上的缺失的细胞中的exon4区域和S8/AS15区域的桑格尔测序分析。在使用了sgRNA TKex4_20s与sgRNA_AS15的组合和Cas9D10A的情况下，Exon4区域、S8/AS15区域均完全检测不到突变。另一方面，在使用了sgRNATKex4_20s与sgRNA_AS15的组合和野生型Cas9的情况下，在Exon4区域4.44±1.84％的细胞中检测到突变，在S8/AS15区域在100±0.0％的细胞中检测到突变。由这些结果显示，在使用DSB的情况下，正常保持不引起缺失的等位基因非常难，在使用了切口的情况下可以将正确性保持得非常高。
(b)对TK6261细胞，在使用sgRNA TKex5_mut4s与sgRNA TKex7_105s的组合和Cas9D10A在等位基因A的正义链中随机引入了2处切口、在等位基因B的正义链中引入了1处切口的情况下，仅在1个等位基因发生了500bp以上的缺失的细胞为0.71±0.61％(以n＝94进行三重实验)(图7A(a)、B“TKex5_mut4s/TKex7_105s”)。另一方面，对TK6261细胞，使用sgRNA TKex5_mut4s与sgRNA TKex7_mut121s的组合和Cas9D10A在等位基因A的正义链随即引入了2处切口、在等位基因B不引入切口的情况下仅在1个等位基因发生了500bp以上的缺失的细胞达到2.84±1.62％(以n＝94进行三重实验)(图7A(b)、B“TKex5_mut4s/TKex7_mut121s”)。由此，在等位基因A中随机导入切口的情况下，通过在等位基因B中不导入切口，从而使切口之间的长的缺失的发生率大幅提高。
(2)FANC基因的功能抑制的影响的分析
(a)对敲除了FANCA的TK6261细胞，在使用sgRNA TKex4_20s与sgRNA_S14的组合和Cas9D10A在等位基因A的正义链中随机引入了2处切口、在等位基因B的正义链中引入了1处切口的情况下，仅在1等位基因发生了1,000bp以上的缺失的细胞达到15.2％±2.68％(以n＝94进行三重实验)(图8A、B(a)、C“FANCA缺损”)。另一方面，在FANCA表达着的TK62621细胞(亲本株)中发生了1,000bp以上的缺失的细胞只不过1.42％±0.61％(以n＝94进行三重实验)(图8A、B(b)、C“TK6261”)。由此显示了，通过FANCA的功能抑制，能够大幅提高切口之间的长的缺失的发生率。
(b)对能够植物生长素诱导地使FANCS蛋白质消失的TSCER2(TIR)细胞(TSCER2(TIR)-FANCSAID/AID)和能够植物生长素诱导地使FANCD1蛋白质消失的TSCER2(TIR)细胞(TSCER2(TIR)-FANCD1AID/AID)，与上述(a)同样地导入切口。其结果是仅在1等位基因发生了1,000bp以上的缺失的细胞，在FANCS蛋白质消失细胞中为45.4％±1.6％，在FANCD1蛋白质消失细胞中为47.5％±11.3％(以n＝94进行三重实验)(图9A、B)。此外，在不添加植物生长素且不使FANCS蛋白质消失的情况下的值为1.77％±1.23％，在不添加植物生长素且不使FANCD1蛋白质消失的情况下的值为2.12％±1.06％(以n＝94进行三重实验)。由此显示了，与FANCA同样地，通过FANCS和FANCD1的功能抑制而能够大幅提高切口之间的长的缺失的发生率。
产业可利用性
如以上说明的那样，根据本发明，利用由位点特异性切口酶产生的单链切割，能够在同源染色体的一方使包含特定位点(在同源染色体之间不同的碱基)的DNA缺失。不使用双链切割、外来的供者DNA的本发明由于其安全性高，因而特别能够较大地贡献于由杂合突变引起的疾病的基因治疗。另外，根据本发明，以对同源染色体的一方特异性的DNA缺失作为指标，能够进行细胞的同源重组功能的评价，也能够较大地贡献于癌等疾病的诊断。

Claims (10)

1.在由染色体A和染色体B构成的同源染色体中染色体A具有特异性的DNA缺失的细胞的制造方法，
该方法包括对同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。
2.根据权利要求1所述的方法，同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞是FANC基因的功能被抑制了的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，在同源染色体之间不同的碱基是突变位点的碱基。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的方法，位点特异性切口酶是CRISPR-Cas系统。
5.用于在权利要求1所述的方法中使用的试剂盒，
该试剂盒包含对于同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞是FANC基因的功能被抑制了的细胞。
7.细胞的同源重组功能的评价方法，
该方法包括对由染色体A和染色体B构成的同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，检测由此产生的对染色体A特异性的DNA缺失，
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割，
在对染色体A特异性的DNA缺失产生的频率高于对照的情况下，评价为该细胞的同源重组功能被抑制。
8.根据权利要求7所述的方法，细胞是癌细胞。
9.根据权利要求7或8所述的方法，位点特异性切口酶是CRISPR-Cas系统。
10.用于在权利要求7所述的方法中使用的试剂盒，
该试剂盒包含对于由染色体A和染色体B构成的同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，在该特定位点的附近DNA区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，
该位点特异性切口酶的组合对于染色体A，在该特定位点的附近DNA区域的多个位置进行单链切割，并且该单链切割是该附近DNA区域的DNA两条链或同一DNA链上的单链切割，对于染色体B，在与染色体A中被单链切割的位置对应的位置的1个位置进行单链切割，或在该对应的位置不进行单链切割。
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